Application of Indonesian local bacteria for bioremediation of soil contaminated with heavy oil, light oil and used lubricant

APLIKASI BAKTERI LOKAL INDONESIA DALAM BIOREMEDIASI
TANAH TERKONTAMINASI MINYAK BERAT, MINYAK RINGAN
DAN LIMBAH OLI BEKAS

ROSARIO TRIJULIAMOS MANALU

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aplikasi Bakteri Lokal
Indonesia dalam Bioremediasi Tanah Terkontaminasi Minyak Berat, Minyak
Ringan dan Limbah Oli Bekas adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Rosario Trijuliamos Manalu
NIM A15410021

RINGKASAN
ROSARIO TRIJULIAMOS MANALU. Aplikasi Bakteri Lokal Indonesia
dalam Bioremediasi Tanah Terkontaminasi Minyak Berat, Minyak Ringan dan
Limbah Oli Bekas. Dibimbing oleh DWI ANDREAS SANTOSA dan UNTUNG
SUDADI.
Aktivitas industri minyak dan gas (migas) berpotensi mengontaminasi
lingkungan tanah. Salah satu jenis limbah kegiatan industri migas adalah oil sludge.
Sampai saat ini, pengelolaan limbah oil sludge masih merupakan salah satu
masalah utama industri migas. Hal ini terutama disebabkan oleh jumlahnya yang
relatif besar. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efektivitas aplikasi
isolat-isolat bakteri lokal Indonesia dalam bioremediasi tanah terkontaminasi
minyak berat, minyak ringan dan oli bekas pada skala laboratorium.
Penelitian diawali dengan peremajaan 15 kultur bakteri perombak
hidrokarbon dalam media tumbuh LB (Luria Bertani). Masing-masing isolat
biakan induk dibiarkan beberapa menit, setelah itu satu persatu dipindahkan ke

dalam 20 ml media LB dalam Erlenmeyer menggunakan jarum ose. Selanjutnya
biakan diinkubasi di atas shaker selama 24 jam pada suhu ruang. Biakan murni
dari 15 isolat tersebut kemudian diseleksi kemampuannya dalam mendegradasi
minyak berat dengan cara pengamatan visual terhadap perubahan kondisi minyak
dalam Erlenmeyer. Dari tahapan ini dipilih tiga isolat perombak senyawa
hidrokarbon oil sludge yang terbaik yaitu Bacillus sp ICBB 7859, Bacillus sp.
ICBB 9461 dan Bacillus sp. ICBB 5071. Selanjutnya dilakukan karakterisasi isolat
melalui uji patogenitas hypersensitive response dan uji haemolysis, interpretasi
kurva pertumbuhan serta uji antagonis isolat.
Pada percobaan biodegradasi, ketiga isolat bakteri terseleksi diaplikasikan
baik secara tunggal maupun kombinasi pada tanah terkontaminasi minyak berat,
minyak ringan dan limbah oli bekas. Kemudian setiap minggu ditetapkan nilai pH,
laju respirasi dan konsentrasi TPH (Total Petroleum Hydrocarbon) tanah sebagai
parameter uji kapasitas biodegradasi.
Perlakuan aplikasi isolat bakteri yang paling efektif dalam menurunkan
konsentrasi rata-rata TPH tanah terkontaminasi minyak berat, minyak ringan atau
pun oli bekas adalah mixed culture kombinasi tiga isolat Bacillus sp ICBB 7859,
Bacillus sp. ICBB 9461 dan Bacillus sp. ICBB 5071. Nilai TPH tanah
terkontaminasi minyak berat, minyak ringan dan oli bekas dengan aplikasi
kombinasi ketiga isolat tersebut berturut-turut 0,40, 0,70, dan 0,41% pada akhir

masa inkubasi selama 9, 6 dan 4 minggu. Nilai ini terendah dibandingkan
perlakuan lainnya meskipun tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%. Nilai ini juga
telah memenuhi baku mutu yang dipersyaratkan Keputusan Menteri Lingkungan
Hidup No. 128 Tahun 2003, yaitu 1%.
Berdasarkan semua parameter yang dievaluasi dalam penelitian ini,
perlakuan yang boleh dicobakan untuk aplikasi skala lapang adalah Bacillus sp
ICBB 7859 karena berdasarkan hasil uji haemolisis, bakteri ini tidak dapat
melisiskan darah sehingga dikategorikan tidak patogen dan aman diaplikasikan di
lapangan.
Kata kunci: Bioremediasi, Bacillus Indonesia, tanah terkontaminasi, hidrokarbon
minyak

SUMMARY
ROSARIO TRIJULIAMOS MANALU. Application of Indonesian local
bacteria for bioremediation of soil contaminated with heavy oil, light oil and used
lubricant. Supervised by DWI ANDREAS SANTOSA and UNTUNG SUDADI.
Oil and gas industrial activity has a potency to contaminate soil. One of the
waste released by oil and gas industry is oil sludge. Until now, oil sludge is still a
major problem in oil and gas industry especially due to its huge amount. This
research was aimed to study the effectiveness of Indonesian local bacteria in

bioremediation of soil contaminated with heavy oil, light oil and used
lubricant at bench scale.
This research was begun by cultivation of 15 strains of hydrocarbon
degrading bacteria in Luria Bertani (LB) medium. Each of the cultured isolate was
left in a few minutes for thawing, then it was transfered to 20 ml LB medium in
erlemeyer using ose. Then, the cultures were incubated in a shaker for 24 hour at
ambient temperature. The 15 isolates were selected of their potency in degrading
heavy oil by visual assay based on the changes in oil condition in the erlemeyer.
The best three heavy oil degrading bacteria selected were Bacillus sp ICBB 7859,
Bacillus sp. ICBB 9461 and Bacillus sp. ICBB 5071. The three selected isolates
were further characterized by hypersensitive response test, growth curves
characteristic, haemolysis test, and antagonistm test.
In the main experiment, the three isolates were applicated to soil
contaminated with heavy oil, light oil and used lubricant as a single or in
combination culture. Parameters used to evaluate their effectiveness in the
degradation were soil respiration, pH value, and TPH (Total Petroleum
Hydrocarbon).
The combination of the three isolates (Bacillus sp ICBB 7859, Bacillus sp.
ICBB 9461, and Bacillus sp. ICBB 5071) was the most effective treatment for
reducing TPH value of all tested materials (heavy oil, light oil and used lubricant)

although statistically was not significantly different with other treatment at 5% test
level. The TPH values of soil contaminated with heavy oil, light oil and used
lubricant were respectively 0,40, 0,70, dan 0,41% at the end incubation period for
9, 6 and 4 weeks. Based on the GOI Environment Ministerial Decree No.
128/2003, the TPH value of the oil contaminated soil have to be reduced below 1%,
before being used for other purposes.
Although the combination of the three isolates was the best treatment, it can
not be applied in the field due to the patogenicity of the two isolates (Bacillus sp.
ICBB 9461 and Bacillus sp. ICBB 5071). Only one isolate, Bacillus sp. ICBB
7859, that has been proven as nonpathogenic one and, therefore, can be used for
bioremediation of oil contaminated soil in the large scale.

Keywords:

Bioremediation, Indonesian
contaminated soil

Bacillus,

petroleum

hydrocarbon,

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

APLIKASI BAKTERI LOKAL INDONESIA DALAM BIOREMEDIASI
TANAH TERKONTAMINASI MINYAK BERAT, MINYAK RINGAN
DAN LIMBAH OLI BEKAS

ROSARIO TRIJULIAMOS MANALU

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi Tanah dan Lingkungan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji pada Ujian: Dr Dra Rahayu Widyastuti, MSc

Judul Tesis : Aplikasi Bakteri Lokal Indonesia dalam Bioremediasi Tanah
Terkontaminasi Minyak Berat, Minyak Ringan dan Limbah Oli
Bekas
Nama
: Rosario Trijuliamos Manalu
NIM
: A154100021

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Dwi Andreas Santosa, MS
Ketua

Dr Ir Untung Sudadi, MSc
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Bioteknologi Tanah dan Lingkungan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dwi Andreas Santosa, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MSc. Agr

Tanggal Ujian:

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Yesus Kristus atas berkat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul “Aplikasi Bakteri
Lokal Indonesia dalam Bioremediasi Tanah Terkontaminasi Minyak Berat,
Minyak Ringan dan Limbah Oli Bekas”. Penelitian ini merupakan salah satu
persyaratan dalam menyelesaikan studi di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian
Bogor.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa,
M.S dan Bapak Dr. Ir. Untung Sudadi, M.Sc yang telah membimbing penulis
menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini. Terima kasih yang spesial penulis
sampaikan kepada Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB)
yang telah memberi dukungan dana dan fasilitas selama pelaksanaan penelitian.
Isolat yang dipakai dalam penelitian ini merupakan isolat koleksi dari ICBBCulture Collection of Microorganisms. Penulis juga berterima kasih kepada
kepala dan staf Laboratorium ICBB atas perhatian dan bantuannya selama
pelaksanaan penelitian ini. Selain itu, ucapan terima kasih juga penulis ucapkan
kepada ayahanda Drs. H.T.B. Manalu, MM dan almarhumah ibunda Gloria
Rajagukguk atas segala kasih sayangnya, doa, serta dukungannya. Saudaraku

Dewi Y.L Manalu, Waisaktini M Manalu, Tenti H.S Manalu, Matheus E.G
Manalu atas semangat dan kasih sayangnya selama ini serta terkasih Ferawati N
Sinaga, SP yang selalu memberikan motivasi dan pengertian dalam setiap
kesulitan yang penulis hadapi dalam menyelesaikan karya ilmiah ini, juga
diucapkan terima kasih kepada Agung P Sinaga dan Wildan Dhea G atas
kerjasamanya selama penelitian.
Akhirnya, semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi penulis,
civitas academic, peneliti, pemerintah dan semua pihak yang terkait, sehingga
mampu memperkaya khasanah keilmuan di masa mendatang.
Bogor, Mei 2013

Rosario Trijuliamos Manalu

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Minyak Bumi
Tanah Terkontaminasi Minyak Bumi
Pengaruh Kontaminasi Minyak Bumi terhadap Lingkungan
Bioremediasi Minyak Bumi
Mikrob Pendegradasi Minyak Bumi
Peranan Mikrob dalam Bioremediasi

3
3
4
6
7
9
9

3 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan dan Alat Penelitian
Metode Penelitian

10
10
10
11

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi dan Karakterisasi
Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Kurva Standard
Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon pada Tanah
Terkontaminasi Minyak Bumi

18
18
23

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

38
38
38

DAFTAR PUSTAKA

39

LAMPIRAN

43

RIWAYAT HIDUP

25

DAFTAR TABEL
1 Hasil seleksi bakteri
2 Morfologi isolat bakteri
3 Nilai pH selama proses bioremediasi tanah terkontaminasi minyak berat,
oli bekas dan minyak ringan
4 Pengaruh aplikasi isolat bakteri terhadap konsentrasi TPH pada akhir
inkubasi

18
19
26
37

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

17

18

19

20

Peremajaan bakteri
Proses tahapan pengujian Hipersensitive Response
Metode uji antagonis 2 isolat bakteri
Metode uji Antagonis 3 isolat bakteri
Diagram alir kegiatan percobaan
Hasil seleksi bakteri pendegradasi hidrokarbon selama dua minggu
Bakteri hasil seleksi selama dua minggu
Hasil uji Hipersensitive Response
Hasil uji Haemolysis
Hasil uji antagonis isolat bakteri
Kurva pertumbuhan bakteri selama masa inkubasi 48 jam
Kurva standar populasi bakteri
Rata-rata respirasi pada tanah terkontaminasi minyak berat
Rata-rata respirasi pada tanah terkontaminasi limbah oli bekas
Rata-rata respirasi pada tanah terkontaminasi minyak ringan
Kurva TPH tanah terkontaminasi limbah minyak berat dengan
perlakuan bakteri Bacillus sp. ICBB 7859 danBacillus sp ICBB 9461
(A) serta perlakuan bakteri Bacillus sp.ICBB 7859 dan Bacillus sp.
ICBB 5071 (B)
Kurva TPH tanah terkontaminasi minyak beratdengan perlakuan bakteri
Bacillus sp. ICBB 9461 danBacillus sp ICBB 5071 (A) serta perlakuan
bakteri Bacillus sp.ICBB 7859, Bacillus sp. ICBB 9461 dan Bacillus sp.
5071 (B)
Kurva TPH tanah terkontaminasi limbah oli bekasdengan perlakuan
bakteri Bacillus sp. ICBB 7859 danBacillus sp ICBB 9461 (A) serta
perlakuan bakteri Bacillus sp.ICBB 7859 dan Bacillus sp. ICBB 5071
(B)
Kurva TPH tanah terkontaminasi limbah oli bekasdengan perlakuan
bakteri Bacillus sp. ICBB 9461 danBacillus sp ICBB 5071 (A) serta
perlakuan bakteri Bacillus sp.ICBB 7859, Bacillus sp. ICBB 9461 dan
Bacillus sp. 5071 (B)
Kurva TPH tanah terkontaminasi minyak ringandengan perlakuan
bakteri Bacillus sp. ICBB 7859 danBacillus sp ICBB 9461 (A) serta
perlakuan bakteri Bacillus sp.ICBB 7859 dan Bacillus sp. ICBB 5071
(B)

11
12
13
13
17
18
19
20
22
23
24
25
28
28
29

30

31

33

34

35

21 Kurva TPH tanah terkontaminasi minyak ringandengan perlakuan
bakteri Bacillus sp. ICBB 9461 danBacillus sp ICBB 5071 (A) serta
perlakuan bakteri Bacillus sp.ICBB 7859, Bacillus sp. ICBB 9461 dan
Bacillus sp. 5071 (B)

36

DAFTAR LAMPIRAN
1 Dosis dan komposisi media tumbuh mikrob tanah yang dipergunakan
pada penelitian
2 Hasil Pertumbuhan Bakteri
3 Data TPH mingguan perlakuan minyak berat
4 Data TPH mingguan perlakuan minyak ringan
5 Data TPH mingguan perlakuan limbah oli bekas
6 Data respirasi mingguan perlakuan minyak berat
7 Data respirasi mingguan perlakuan minyak ringan
8 Data respirasi mingguan perlakuan limbah oli bekas

42
43
44
49
52
56
56
56

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Aktivitas industri minyak dan gas (migas) sangat berpotensi
mengontaminasi lingkungan tanah. Salah satu jenis limbah kegiatan industri
migas adalah oil sludge. Sampai saat ini,pengelolaan limbah oil sludge masih
merupakan salah satu masalah utama industri migas. Hal ini terutama disebabkan
oleh jumlahnya yang relatif besar (Okoro 2010).
Matthew (2006) menyatakan Oil sludge mengandung senyawa
hidrokarbon dan logam berat yang dapat menurunkan kualitas kimia-fisik
lingkungan, meracuni biota dan mengganggu rantai makanan. Oleh karena itu,
oil sludge dikategorikan sebagai bahan berbahaya dan beracun sesuai dengan PP
No. 18 Tahun 1999 tentang pengelolaan limbah bahan berbahaya dan beracun,
sehingga menurut Simons dan Saginor (2010) pengelolaannya harus mampu
mengurangi sifat berbahaya dan beracun tersebut agar tidak membahayakan
kesehatan manusia dan lingkungan.
Pencemaran lingkungan oleh minyak telah menimbulkan masalah serius.
Penelitian di Jerman menunjukkan bahwa 0,5 – 0,75 ton minyak hilang untuk
setiap 1000 ton minyak yang dihasilkan. Kehilangan tersebut terjadi selama
proses produksi dan pengilangan sebesar 0,1 ton, selama pengangkutan sebanyak
0,1 ton dan kehilangan terbesar 0,4 ton terjadi selama penyimpanan. Kehilangan
minyak ini menyebabkan terjadi pencemaran di lingkungan sekitarnya (Gadd
1998).
Pengendalian secara mikrobiologi merupakan salah satu alternatif untuk
mengatasi kontaminasi tanah akibat limbah oil sludge. Kandungan senyawa
hidrokarbon dan logam berat dalam oil sludge menentukan kepekaannya terhadap
biodegradasi oleh mikrob. Menurut Schaad et al. (2001) salah satu upaya untuk
meningkatkan kecepatan biodegradasi senyawa hidrokarbon oil sludge adalah
melalui rekayasa proses untuk mencapai kondisi media dan tingkat metabolisme
mikrob yang optimal.
Dengan biodiversitas sangat besar,alam Indonesia menyediakan sumber
melimpah isolat mikrob yang dapat dimanfaatkan dalam proses bioremediasi
tanah terkontaminasi limbah oil sludge. Salah satu upaya yang dapat dilakukan
untuk memanfaatkan isolat-isolat tersebut adalah dengan mengisolasi dan
mengeksplorasi kapasitas metabolismenya terhadap senyawa hidrokarbon oil
sludge. Dari hasil isolasi dan identifikasi bakteri di kawasan perairan pantai
Surabaya dan sekitarnya yang tercemar minyak diperoleh beberapa genus yang
meliputi Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Arthrobacter, Moraxella,
Pediococcus, Flavobacterium dan Micrococcus. Genus bakteri tersebut diduga
berpotensi dalam mendegradasi berbagai komponen hidrokarbon sehingga dapat
dikembangkan dan dimanfaatkan untuk bioremediasi lingkungan (Ni’matuzahroh
2005).
Menurut Toccalino (2003), bakteri pendegradasi hidrokarbon menguraikan
komponen minyak bumi melalu proses oksidasi hidrokarbon. Dalam reaksi

2

oksidasi tersebut, hidrokarbon sebagai salah satu donor elektronnya. Artinya
mikrob berperan dalam pembersihan tumpahan minyak dengan mengoksidasi
minyak bumi menjadi gas karbondioksida (CO 2 ).
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efektivitas aplikasi isolatisolat bakteri lokal Indonesia dalam bioremediasi tanah terkontaminasi minyak
berat, minyak ringan dan oli bekas pada skala laboratorium.
Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan sebelumnya, maka tujuan
yang ingin dicapai dalam penilitian ini adalah:
1. Untuk menyeleksi 15 isolat bakteri lokal Indonesia yang mempunyai
kemampuan dalam mendegradasi hidrokarbon minyak bumi.
2. Untuk mengkarakterisasi tiga isolat bakteri lokal Indonesia terpilih yang
mempunyai kemampuan dalam mendegradasi hidrokarbon minyak bumi.
3. Untuk mengevaluasi efektivitas aplikasi tiga isolat bakteri lokal Indonesia
terseleksi dalam bioremediasi tanah terkontaminasi minyak berat, minyak
ringan dan oli bekas pada skala laboratorium.
Hipotesis Penelitian
1.
2.

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:
Diperoleh bakteri hasil eksplorasi dari ekosistem alami di Indonesia yang
mampu mendegradasi hidrokarbon minyak bumi.
Isolat bakteri yang sudah diseleksi mampu mendegradasi hidrokarbon
pada tanah terkontaminasi minyak bumi dengan berbagai konsentrasi
hidrokarbon.
Ruang Lingkup Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap dengan ruang
lingkupkegiatan penelitian sebagai berikut:
1. Mengkarakterisasi dan menyeleksi bakteri yang berpotensi sebagai
pendegradasi hidrokarbon minyak bumi.
2. Menguji efektivitas bakteri yang terseleksi dalam mendegradasi
hidrokarbon minyak bumi.
3. Melakukan uji kemampuan bakteri pendegradasi hidrokarbon yang
diaplikasikan baik secara tunggal maupun kombinasinya dalam
bioremediasi tanah terkontaminasi minyak bumi dengan berbagai
konsentrasi hidrokarbon
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan sebagai pengembangan bioteknologi
lingkungan mengenai isolat bakteri yang dapat dimanfaatkan dalam penanganan
limbah dan rehabilitasi lingkungan yang terkontaminasi hidrokarbon minyak
bumi.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Minyak Bumi
Minyak bumi terbentuk sebagai hasil akhir dari penguraian bahan-bahan
organik (sel-sel dan jaringan hewan/tumbuhan) yang tertimbun selama berjuta
tahun di dalam tanah, baik di daerah daratan atau pun di daerah lepas pantai. Hal
ini menunjukkan bahwa minyak bumi merupakan sumber daya alam yang tidak
dapat diperbaharui. Terbentuknya minyak bumi sangat lambat, oleh karena itu
perlu penghematan dalam penggunaannya.
Di Indonesia, minyak bumi banyak terdapat di bagian utara Pulau Jawa,
bagian timur Kalimantan dan Sumatera, daerah kepala burung Papua serta bagian
timur Seram. Minyak bumi juga diperoleh di lepas pantai Jawa dan timur
Kalimantan.
Minyak bumi kasar (baru keluar dari sumur eksplorasi) mengandung
ribuan macam zat kimia baik dalam bentuk gas, cair maupun padatan. Bahan
utama yang terkandung di dalam minyak bumi adalah hidrokarbon alifatik dan
aromatik. Minyak bumi mengandung senyawa nitrogen antara 0-0,5%, belerang 06%dan oksigen 0-3,5%. Terdapat sedikitnya empat seri hidrokarbon yang
terkandung di dalam minyak bumi, yaitu seri n-paraffin (n-alkana) yang terdiri
atas metana (CH 4 ) sampai aspal yang memiliki atom karbon (C) lebih dari 25
pada rantainya, seri iso-paraffin (isoalkana) yang terdapat hanya sedikit dalam
minyak bumi, seri neptana (sikloalkana) yang merupakan komponen kedua
terbanyak setelah n-alkana dan seri aromatik (benzenoid).
Komposisi senyawa hidrokarbon pada minyak bumi tidak sama,
bergantung pada sumber penghasil minyak bumi tersebut. Misalnya, minyak bumi
Amerika komponen utamanya ialah hidrokarbon jenuh, yang ditambang di Rusia
banyak mengandung hidrokarbon siklik, sedangkan yang terdapat di Indonesia
banyak mengandung senyawa aromatik dan kadar belerangnya sangat rendah.
Sifat Fisik Minyak Bumi
Berat Jenis (Density, Specific Gravity atau API Gravity)
Berat jenis, Specific Gravity atau API Gravity merupakan satuan yang
digunakan untuk menyatakan berat jenis minyak dan digunakan sebagai dasar
klasifikasi minyak bumi yang paling sederhana.Makin tinggi berat jenis atau SG
(Specific Gravity) minyak tersebut, makin besar APInya, makin bagus
kualitasnya, semakin banyak mengandung fraksi ringan sehingga harga jualnya
akan semakin tinggi. Begitu pula sebaliknya jika SG rendah maka akan semakin
buruk kualitas minyak bumi tersebut.
Tinggi rendahnya berat jenis minyak bumi juga berpengaruh pada
viskositasnya. Pada umumnya semakin tinggi derajat API atau makin ringan
minyak bumi tersebut, makin kecil viskositasnya.Tinggi rendahnya derajat API
juga berpengaruh pada titik didih minyak bumi, kalau API Gravity minyak bumi
rendah, maka titik didihnya tinggi. Demikian sebaliknya kalau derajat APInya

4

tinggi, maka titik didihnya rendah, dan juga lebih mudah terbakar atau
mempunyai titik nyala yang lebih rendah daripada yang derajat APInya rendah.
Titik Tuang
Titik tuang (Pour Point) adalah suhu terendah dimana minyak bumi
masih bisa dituangkan atau suhu terendah dimana minyak bumi masih bisa
mengalir oleh beratnya sendiri. Dengan mengetahui titik tuang dari minyak bumi
dapat dihitung pada suhu berapa minyak bumi tersebut masih bisa dipompa, bisa
dihitung berapa jumlah uap air (steam) yang dibutuhkan sebagai pemanas untuk
menjaga agar minyak tetap dapat dipompa.
Titik Nyala (Flash Point)
Titik nyala adalah suhu terendah dimana minyak bumi apabila dipanaskan
sudah memberikan uap yang cukup campurannya dengan udara sehingga akan
menyala sekejap apabila diberi sumber nyala api. Flash point perlu diperhatikan
untuk keamanan transportasi dan penimbunan minyak dan gas bumi. Makin tinggi
derajat APInya makin ringan minyak tersebut maka makin rendah flash pointnya
atau titik nyalanya sehingga makin mudah terbakar.
Sifat Kimia Minyak Bumi
Minyak bumi tersusun dari senyawa hidrokarbon (>90%) dan senyawa
non-hidrokarbon (Udiharto 1996a). Berdasarkan struktur molekulnya
persenyawaan hidrokarbon digolongkan atas 4 jenis, yaitu paraffin, olefin,
naftalen dan aromatic (Kontawa 1993). Senyawa non-hidrokarbon minyak bumi
disusun oleh senyawa organik yang mengandung belerang, nitrogen, oksigen dan
logam organik yang terkonsentrasi dalam minyak fraksi berat dan residu
(Udiharto 1996a).
Menurut Kadarwati et al. (1994), hidrokarbon parafinik dan alifatik adalah
senyawa hidrokarbon yang mempunyai rantai karbon dengan ikatan jenuh dan
terbuka. Hidrokarbon neptana atau sikloparafin adalah senyawa hidrokarbon
dengan ikatan jenuh yang mempunyai rantai tertutup dan berbentuk cincin atau
lingkar. Hidrokarbon aromatik merupakan senyawa hidrokarbon dengan molekul
berbentuk cincin yang terdiri atas 6 atom karbon dengan ikatan rangkap
bergantian.
Suatu persenyawaan hidrokarbon berbeda dari persenyawaan hidrokarbon
lainnya karena perbedaan perbandingan bobot unsur-unsur karbon dan
hidrokarbon yang terdapat di dalamnya atau perbedaan susunan unsur-unsur
karbon dan hidrokarbon di dalam molekul-molekul persenyawaan tersebut
(Kontawa 2003).
Tanah Terkontaminasi Minyak Bumi
Sebagaimana udara dan air, tanah merupakan komponen penting dalam
kehidupan manusia. Tanah berperan penting dalam pertumbuhan mahluk hidup,
pemeliharaan ekosistem dan siklus air. Kasus pencemaran tanah terutama

5

disebabkan oleh pembuangan sampah yang tidak memenuhi syarat (ilegal
dumping), kebocoran limbah cair dari industri atau fasilitas komersial, atau
kecelakaan kendaraaan pengangkut minyak, zat kimia, atau limbah, yang
kemudian tumpah ke permukaan tanah (Gadd 1998)
Ketika suatu zat berbahaya atau beracun telah mencemari permukaan
tanah, maka ia dapat menguap, tersapu air hujan dan atau masuk ke dalam tanah.
Pencemar yang masuk ke dalam tanah kemudian terendap sebagai zat kimia
beracun di tanah. Zat beracun di tanah tersebut dapat berdampak langsung kepada
manusia ketika bersentuhan atau dapat mencemari air tanah dan udara di atasnya
(Sigiura et al. 1997).
Eksplorasi dan eksploitasi produksi minyak bumi melibatkan juga aspek
kegiatan yang berisiko menumpahkan minyak antara lain: distribusi/pengangkutan
minyak bumi dengan menggunakan moda transportasi air, transportasi darat,
marine terminal/pelabuhan khusus minyak bumi, perpipaan, eksplorasi dan
eksploitasi migas (Citrorekso 1996)
Setiap tahun kebutuhan minyak bumi terus mengalami peningkatan
seiring dengan tingginya kebutuhan energi sebagai akibat kemajuan teknologi dan
kebutuhan hidup manusia, sehingga potensi pencemaran oleh minyak bumi
juga meningkat. Tumpahan minyak dan kebocoran pipa dalam jumlah tertentu
dengan luas dan kondisi tertentu, apabila tidak dikendalikan atau ditanggulangi
dengan cepat dan tepat, dapat mengakibatkan terjadinya suatu malapetaka
“pencemaran lingkungan oleh minyak” yang menyebabkan kualitas lingkungan
turun sampai ke tingkat tertentu yang menyebabkannya menjadi kurang atau tidak
dapat berfungsi sesuai dengan peruntukannya (Balba et al. 1998).
Tanah yang terkontaminasi minyak bumi dapat merusak lingkungan serta
menurunkan estetika. Lebih dari itu tanah yang terkontaminasi limbah minyak
dikategorikan sebagai limbah bahan berbahaya dan beracun (B3) sesuai dengan
Kep. MenLH 128 Tahun 2003 tentang tatacara dan persyaratan teknis pengolahan
limbah dan tanah terkontaminasi oleh minyak bumi secara biologis. Oleh karena
itu perlu dilakukan pengelolaan terhadap tanah yang terkontaminasi minyak. Hal
ini dilakukan untuk mencegah penyebaran dan penyerapan minyak kedalam tanah
(Widyastini 2006).
Di dalam minyak bumi terdapat dua macam komponen yang dibagi
berdasarkan kemampuan mikroorganisme menguraikannya, yaitu komponen
minyak bumi yang mudah diuraikan oleh mikrob dan komponen yang sulit
didegradasi oleh mikrob. Komponen minyak bumi yang mudah didegradasi oleh
bakteri merupakan komponen terbesar dalam minyak bumi atau mendominasi,
yaitu alkana yang bersifat lebih mudah larut dalam air dan terdifusi ke dalam
membran sel bakteri (Nugroho 2003). Jumlah bakteri yang mendegradasi
komponen ini relatif banyak karena substratnya yang melimpah di dalam minyak
bumi. Isolat bakteri pendegradasi komponen minyak bumi ini biasanya
merupakan pengoksidasi alkana normal (Mihelcic dan Luthy 1988).

6

Pengaruh Kontaminasi Minyak Bumi terhadap Lingkungan
Pengaruh Kontaminasi Minyak Bumi terhadap Manusia
Menurut Udiharto (2000), tingkat toksisitas hidrokarbon minyak bumi
dapat bersifat akut atau kronik. Toksisitas akut terjadi dalam jangka waktu yang
relatif pendek dengan bahan yang berkontak di lingkungan cukup tinggi
sedangkan toksisitas kronik terjadi dalam jangka waktu lama dengan bahan yang
berkontak relatif lebih rendah. Pengaruh toksik akut pada umumnya menyerang
sistem syaraf pusat. Sifat toksik yang kronik dapat mempengaruhi kerusakan sel
sumsum tulang dan menyebabkan penyakit kanker.
Pengaruh Kontaminasi Minyak Bumi terhadap Tumbuhan
Menurut Bossert dan Bartha (1984), tumpahan minyak bumi di permukaan
tanah memberikan pengaruh negatif terhadap tumbuhan, yaitu toksisitas akibat
kontak langsung atau tidak langsung karena adanya interaksi minyak dengan
komponen abiotik dan mikrob tanah.
Toksisitas kontak terjadi karena hidrokarbon melarutkan struktur membran
lipid sel. Walaupun komponen minyak bumi bertitik didih rendah cepat hilang
melalui evaporasi dan pencucian (pada tanah dengan kondisi lembab dan beraerasi
baik), tetapi menyebabkan toksisitas kontak yang tinggi terhadap akar dan daun.
Tingkatan toksisitas sebagai berikut: monoaromatik > olefin dan naftalen >
paraffin dimana setiap tingkatan berbanding lurus dengan peningkatan polaritas
dan berbanding terbalik dengan penambahan bobot molekul (Bossert dan Bartha
1984). Mason (1996) menyebutkan tumpahan minyak dapat menghambat laju
fotosintensis karena mempengaruhi permeabilitas membran sel tumbuhan dan
mengurangi penyerapan cahaya matahari oleh kloroplas.
Pengaruh tidak langsung terjadi karena adanya kompetisi penggunaan
nutrisi mineral dan oksigen antara akar tumbuhan dan mikrob pendegradasi
hidrokarbon dan mendorong terbentuknya kondisi anaerobsehingga dihasilkan
senyawa fitotoksik seperti H 2 S. Selain itu, minyak dengan sifatnya yang
hidrofobik dapat menyebabkan struktur tanah menjadi buruk sehingga membatasi
kemampuannya dalam menyerap air dan udara (Bossert dan Bartha 1984).
Kontaminasi hidrokarbon minyak bumi di permukaan tanah menyebabkan
terhambatnya perkembangan tumbuhan. Mishra et al. (2001) melaporkan di lokasi
kilang minyak Mathuria-India yang tercemar limbah minyak tidak ada vegetasi
yang tumbuh. Bossert dan Bartha (1984) menyebutkan bahwa tanaman umbiumbian seperti ubi jalar dan singkong sangat sensitif terhadap hidrokarbon
minyak bumi, sedangkan mangga, pisang dan tanaman yang mempunyai rhizome
lebih mampu beradaptasi.
Konsentrasi hidrokarbon minyak bumi dalam jumlah sedang (1-5%) di
atas permukaan tanah umumnya kurang merusak terhadap tumbuhan. Konsentrasi
yang rendah ( 100 mg/l tidak ada berudu yang mengalami
metamorfosa menjadi katak dewasa (Mason 1996).
Tumpahan minyak bumi menyebabkan terganggunya perkembangbiakan
burung karena lingkungan menjadi tidak sesuai untuk penetasan telur dan
terdapatnya unsur beracun. Beberapa percobaan menunjukkan bahwa minyak
yang diberikan pada kulit telur mallard (Anas platyrhynchos) menyebabkan telur
tidak menetas karena terdapat komponen aromatik yang toksik bagi telur. Pada
dosis 10 μl, embrio menjadi abnormal yang ditandai dengan berubahnya bentuk
paruh, susunan tulang dan bulu burung yang tidak lengkap (Mason 1996).
Bioremediasi Minyak Bumi
Bioremediasi berasal dari kata bio dan remediasi atau "remediate" yang
artinya menyelesaikan masalah. Secara umum bioremediasi dimaksudkan sebagai
penggunaan mikrob untuk menyelesaikan masalah-masalah lingkungan atau untuk
menghilangkan senyawa yang tidak diinginkan dari tanah, lumpur, air tanah atau
air permukaan sehingga lingkungan tersebut kembali bersih dan alamiah. Mikrob
yang hidup di tanah dan di air tanah dapat “memakan” bahan kimia berbahaya
tertentu, misalnya berbagai jenis minyak. Mikrob mengubah bahan kimia ini
menjadi air dan gas yang tidak berbahaya misalnya CO 2 (Novotny 1995; Vilchez
et al. 1997).
Bakteri yang secara spesifik menggunakan karbon dari hidrokarbon
minyak bumi sebagai sumber makanannya disebut sebagai bakteri petrofilik.
Bakteri inilah yang memegang peranan penting dalam bioremediasi lingkungan
yang tercemar limbah minyak bumi. Faktor utama agar mikrob dapat
membersihkan bahan kimia berbahaya dari lingkungan, yaitu adanya mikrob yang
sesuai dan tersedia kondisi lingkungan yang ideal seperti suhu, pH, nutrien dan
jumlah oksigen (Colleran 1997).
Aplikasi bioremediasi di Indonesia mengacu pada Keputusan Menteri
Negara Lingkungan Hidup Nomor 128 Tahun 2003 (KepMen LH no. 128/2003)
tentang tatacara dan persyaratan teknis pengolahan limbah dan tanah
terkontaminasi oleh minyak bumi secara biologis. Disini dicantumkan bahwa
bioremediasi dilakukan dengan menggunakan mikrob lokal. Pada umumnya, di
daerah yang tercemar jumlah mikrob yang ada tidak mencukupi untuk terjadinya
bioproses secara alamiah (Harjati 2006).

8

Dalam teknologi bioremediasi dikenal dua cara menstimulasi pertumbuhan
mikrob, yaitu dengan biostimulasi dan bioaugmentasi. Biostimulasi ádalah
memperbanyak dan mempercepat pertumbuhan mikrob yang sudah ada di daerah
tercemar dengan cara memberikan lingkungan pertumbuhan yang diperlukan,
yaitu penambahan nutrien dan oksigen. Jika jumlah mikrob yang ada sangat
sedikit, maka harus ditambahkan mikrob dalam konsentrasi yang tinggi sehingga
bioproses dapat dimulai. Mikrob yang ditambahkan adalah mikrob yang
sebelumnya diisolasi dari lahan tercemar kemudian setelah melalui proses
penyesuaian di laboratorium diperbanyak dan kembalikan ke tempat asalnya
untuk memulai bioproses. Penambahan mikrob dengan cara ini disebut sebagai
bioaugmentasi (Sillia 2003).
Kondisi lingkungan yang memadai akan membantu mikrob tumbuh,
berkembang dan “memakan” polutan. Sebaliknya jika kondisi yang dibutuhkan
tidak terpenuhi, mikrob akan tumbuh dengan lambat atau mati. Secara umum
kondisi yang diperlukan ini tidak dapat ditemukan di area yang tercemar. Dengan
demikian, perencanaan teknis (engineering design) yang benar memegang
peranan penting untuk mendapatkan proses bioremediasi yang efektif. Dalam
aplikasi teknik bioremediasi dikenal dua teknik yang sangat umum diterapkan
yaitu biopile dan landfarming (Cookson 1995)
Pada teknik biopile, tanah tercemar ditimbun diatas lapisan kedap air dan
disuplai dengan udara yang diperlukan oleh mikrob dengan cara memasang
perpipaan untuk aerasi (pemberian udara) dibawah tumpukan tanah tercemar.
Pompa udara dipasang diujung perpipaan sehingga semua bagian tanah yang
mengandung mikrob dan polutan berkontak dengan udara. Dengan teknik ini,
ketinggian tanah timbunan adalah 1 sampai 1,5 meter (Suprihadi 1999).
Teknik landfarming dilakukan dengan menghamparkan tanah tercemar
diatas lapisan kedap air. Ketebalan hamparan tanah 30 – 50 cm memungkinkan
kontak mikrob dengan udara. Untuk menjamin bahwa semua bagian dari tanah
yang diolah terkontak dengan udara maka secara berkala hamparan tanah tersebut
dibalikkan. Nama landfarming digunakan karena proses pembalikan tanah yang
dilakukan sama dengan pembalikan tanah pada saat persiapan lahan untuk
pertanian (Suprihadi 1999).
Beberapa kelebihan bioremediasi menurut Cookson (1995), yaitu :
1. Teknologi ini dapat dilakukan pada tempat yang tercemar.
2. Agen remediator (mikrob) yang berperan pada proses ini relatif murah.
3. Pelaksanaannya dapat dipadukan dengan teknik perlakuan yang lain.
4. Teknologinya dapat diterima oleh mayarakat.
Biodegradasi hidrokarbon oleh mikrob berlangsung pada suasana aerob.
Hidrokarbon tersebut digunakan sebagai nutrisi dan terurai menjadi
karbondioksida dan oksigen. Faktor-faktor yang mempengaruhi biodegradasi
hidrokarbon antara lain (Dwita 2002):
1. Kemampuan adaptasi bakteri terhadap lingkungannya.
2. Temperatur, konsentrasi oksigen dan keberadaan nutrisi di dalam tanah.
3. Jenis dan komposisi hidrokarbon.

9

Mikrob Pendegradasi Minyak Bumi
Bakteri pendegradasi hidrokarbon (hidrokabonoklastik) merupakan bakteri
yang memiliki kapasitas untuk mendegradasi senyawa yang terdapat di dalam
petroleum hydrocarbon. Penanganan pencemaran limbah cair dapat dilakukan
secara biologis, terutama dengan menggunakan mikrob, dalam hal ini adalah
bakteri hidrokabonoklastik, dimana teknik ini merupakan teknik yang paling
ramah lingkungan dan relatif murah. Teknik ini dikenal dengan nama
bioremediasi (Santosa 2003).
Kumpulan bakteri (konsorsium) dari genus Pseudomonas dan Bacillus
yang diisolasi dari tanah-tanah terkontaminasi di Indonesia, diharapkan telah
cukup survive dengan kondisi lingkungan dimana inokulum ini akan
diterapkan.Hal ini penting dikarenakan kondisi lingkungan merupakan salah satu
syarat utama keberhasilan suatu inokulan (Santosa 2003). Bakteri pendegradasi
hidrokarbon harus memiliki sifat non-pathogenic dan tidak mengandung bahanbahan yang berisiko tinggi. Selain sifat tersebut bakteri pendegradasi hidrokarbon
memiliki sifat yang lain seperti tidak mudah terbakar dan tidak membahayakan
lingkungan sekitarnya (Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat ITB
2004).
Jenis mikrob yang sudah diketahui dapat memecah hidrokarbon dengan
berat molekul rendah antara lain Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces,
Pseudomonas, Flavobacterium, kelompok bakteri cocci dan beberapa kapang
berfilamen. Senyawa hidrokarbon dengan berat molekul tinggi dapat didegradasi
oleh berbagai kelompok bakteri seperti Carcynobacterium, Acinetobacter,
Bacillus, kelompok Khamir, Candida,Rhodotorula dan beberapa kelompok
kapang.
Adapun kelompok bakteri yang dapat mendegradasi senyawa
hidrokarbon aromatik adalah Pseudomonas, Mycobacterium,Bacillus, Nocardia,
Acinetobacterdan Arthrobacter (Alexander 1997).
Banyak senyawa hidrokarbon aromatik digunakan sebagai donor elektron
secara aerob oleh mikrob seperti bakteri dari genus Pseudomonas (Chapman et al.
1995). Salah satu jenis dari Pseudomonas antara lain Pseudomonas aeruginosa
yang memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media minimalis yang dilengkapi
dengan minyak mentah sehingga sumber karbon yang menandakan
kemampuannya di dalam proses metabolisme minyak mentah tersebut.
Peranan Mikrob dalam Bioremediasi
Proses biodegradasi dapat menjadi hal yang paling utama dalam
penyusutan petroleum hydrocarbon secara alami terutama yang terdapat pada
lumpur minyak (oil sludge), karena mikrob mampu mendegradasi atau merombak
petroleum hydrocarbon secara signifikan dengan sangat ramah lingkungan (US.
EPA1999).
Kapasitas mikrobdalam mendegradasi secara alami bahan organik yang
telah dilakukan jutaan tahun sekarang ditantang dengan bahan kimia sintetik yang
dengan sengaja ataupun tidak sengaja dimasukkan ke dalam lingkungan (Portier
1991; Semple dan Cain 1996).Bakteri yang digunakan dalam bioremediasi adalah
bakteri konsorsium yang bersifat hidrokarbonoklastik yang berarti bahwa bakteri

10

tersebut memanfaatkan hidrokarbon sebagai sumber karbon dan energi (Muslimin
1995; Suprihadi 1999).
Selain itu keaktifan mikrob pendegradasi hidrokarbon juga dipengaruhi
oleh kondisi lingkungan seperti temperatur dan pH. Kondisi lingkungan yang
tidak sesuai menyebabkan mikrob ini tidak aktif bekerja mendegradasi minyak
bumi. Sebagai contoh, penambahan nutrien anorganik seperti fosfor dan nitrogen
untuk area tumpahan minyak meningkatkan kecepatan bioremediasi secara
signifikan (Balba et al. 1998). Jadi menggubahkan mikrob sebagai pendegradasi
tanah kontaminan oleh minyak merupakan tindakan yang tepat karena bersahabat
terhadap lingkungan sekitarnya.

3 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari sampai dengan September
2012 di Laboratorium Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan
Sumberdaya Lahan, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Bioteknologi
Lingkungan, Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB),
Bogor.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan
Bahan yang digunakan adalah sludge minyak berat (API 21,93), minyak
ringan (API 40-45) dan oli bekas (API 34,9) serta 15 isolat bakteri koleksi ICBBCC (Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology-Culture Collection of
Microorganisms) yang telah teruji berpotensi mendegradasi hidrokarbon. Bahan
lain yang digunakan meliputi larutan fisiologis steril, DCM : n-heksan (1:1),
Na 2 SO 4 , pupuk urea, pupuk SP-36, contoh tanah, KOH, HCl, phenolphtaleine,
metil oranye, aquadest dan alkohol 70%, media NA (Nutrient Agar) dan media
LB (Luria-Bertani) untuk pertumbuhan mikrobserta Media Minimal Cair yang
mengandung bahan-bahan pemasok kebutuhan hidup bakteri dalam jumlah
minimal (10gNaCl, 1g NH 4 NO 3 , 0,5g MgSO 4 , 0,7g K 2 HPO 4 , 0,3g KH 2 PO 4 ,
0,1ml FeCl 3 , 5-10% minyak berat dan 20g Agar) untuk seleksi isolat.
Penambahan minyak berat bertujuan untuk memperoleh bakteri yang benar-benar
mampu beradaptasi dengan lingkungan yang bercampur dengan oil sludge.
Alat
Alat yang digunakan adalah neraca analitik, autoklaf, laminar air flow,
oven, incubator, cawan porselin, tabung reaksi, bunsen, cawan petri, gelas beker,
erlenmeyer, jarum ose, pipet tetes, pH meter, toples kedap udara dan botol film.

11

Metode Penelitian
Peremajaan Isolat, Seleksi dan Karakterisasi
Peremajaan Isolat dan Seleksi
Peremajaan bakteri dilakukan dengan tujuan agar bakteri awal yang
merupakan biakan induk yang masih dalam keadaan dorman menjadi biakan segar
sehingga ketika digunakan, bakteri dalam keadaan yang segar. Terdapat sebanyak
15 biakan bakteri ICBB yang telah teruji mampu mendegradasi hidrokarbon.
Media tumbuh untuk peremajaan isolat yaitu media LB (Luria-Bertani). Biakan
murni dari 15 isolat kemudian diseleksi kemampuannya dalam mendegradasi
minyak berat.
Masing-masing isolat yang ada di biakan induk dibiarkan dahulu beberapa
menit, setelah itu satu persatu biakan dipindahkan ke dalam 20 ml media LB
dalam tabung erlenmeyer dengan menggunakan jarum ose (Gambar 1). Biakan
diinkubasi di atas shaker selama 24 jam pada suhu ruang.

Gambar 1 Peremajaan Bakteri
Bakteri yang telah diremajakan kemudian diseleksi yang bertujuan untuk
memperoleh tiga bakteri terbaik dari ke-15 bakteri yang mampu mendegradasi
hidrokarbon. Media yang digunakan pada proses seleksi ini adalah Media
Minimal Cair yang mengandung minyak mentah (crude oil). Media Minimal Cair
merupakan media yang mengandung bahan-bahan pemasok kebutuhan hidup
bakteri dalam jumlah yang minimal. Penambahan minyak mentah bertujuan
supaya diperoleh bakteri yang benar-benar mampu beradaptasi dengan lingkungan
yang bercampur dengan minyak bumi.
Karakterisasi Bakteri
Isolat terbaik yang telah mampu mengurai komposisi minyak bumi
dimurnikan kemudian dilakukan pengamatan dan pengujian untuk mengetahui

12

karakter bakteri tersebut untuk mendegradasi hidrokarbon. Pengujian yang
dilakukan:
a. Pengamatan morfologi bakteri
Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan mengamati koloni bakteri
yang meliputi warna, bentuk koloni, elevasi (kenampakan dari samping),
bentuk pinggiran dan tekstur permukaan (Hadioetomo 1993).
b. Pengujian Hipersentive Response
Pengujian menurut Schaad et al. (2001) yang dimodifikasi dilakukan
untuk menguji patogenitas bakteri pada tanaman. Bakteri dengan
kerapatan 109 CFU/ml dalam media cair disuntikkan ke daun tanaman
tembakau (Nicotiana tabacum L.) berumur 2 bulan menggunakan syringe
1 ml (tanpa jarum) dan diamati selama 1 minggu. Pengujian menggunakan
kontrol negatif berupa air steril dan kontrol positif bakteri pathogen
tanaman.
Tujuan pengujian ini adalah untuk menguji bakteri yang berpotensi
sebagai patogen pada tanaman, dalam hal ini pengujian menggunakan
tembakau (Schaad et al. 2001). Pada Gambar 2 adalah tahapan dari
pengujian hipersentive response, bakteri yang sudah terseleksi
diremajakan kembali hingga kerapatan 109 CFU/ml, lalu disuntikkan ke
daun tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) berumur 2 bulan
menggunakan syringe 1 ml (tanpa jarum) dan diamati selama 1 minggu.

Gambar 2 Proses tahapan pengujian Hipersentive Response.
Ket: a : Meremajakan isolat selama 24 jam, b : mempersiapkan bahan dan alat:
isolat, tembakau, syringe 1 ml dan masker), c: isolat dimasukan ke dalam
syringe1ml, d: memasukkan isolat ke dalam jaringan daun tembakau

13

c. Pengujian Haemolysis
Pengujian ini untuk menguji patogenitas bakteri pada manusia dan hewan.
Bakteri ditumbuhkan pada media Blood Agar (Difco) yang telah dicampur
darah domba 5%. Pengujian menggunakan kontrol positif bakteri pathogen
pada manusia atau hewan, kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada
suhu ruang. Adanya zona bening sekeliling koloni menunjukkan bakteri
yang diuji termasuk pathogen (Difco 2009).
d. Pengujian Antagonis
Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji antagonis adalah bakteri yang
mampu mendegradasi hidrokarbon. Satu koloni bakteri yang tumbuh
terpisah di cawan petri, diambil menggunakan jarum ose dan digoreskan
pada media NA yang telah disiapkan. Pengujian antagonis empat isolat
bakteri tersebut dilakukan pada media agar (Gambar 3 dan 4).Pengamatan
dilakukan setiap hari terhadap koloni bakteri dengan cara melihat
pertumbuhan empat bakteri bersama-sama.

Isolat
Bakteri 1

Isolat
Bakteri 2

Cawan petri

Gambar 3 Metode uji antagonis 2 isolat bakteri

Isolat
Bakteri 2

Isolat
Bakteri 3

Cawan petri
Isolat
Bakteri1 2

Gambar 4 Metode uji antagonis 3 isolat bakteri

14

Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Kurva Standard
Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri
Kurva pertumbuhan isolat pada media LB ditentukan dengan mengukur
kerapatan optik (620 nm) pada waktu tertentu. Bacillus sp.ICBB 7859, Bacillus
sp. ICBB 9461 dan Bacillus sp. ICBB 5071 masing-masing diambil 1 ose
kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media LB dan dilakukan pengocokan.
Kerapatan optik diukur pada jam ke: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48. Hasil pengukutan
dibuat kurva dengan sumbu x adalah waktu inkubasi dan sumbu y adalah nilai
kerapatan optik.
Penentuan Kurva Standar Populasi Bakteri
Kurva standar populasi menggambarkan hubungan antara nilai kerapatan
optik suspensi bakteri (sumbu x) dengan jumlah satuan pembentuk koloni (SPK)
bekteri per ml biakan (sumbu y).
Kurva baku populasi mikrob terpilih ditentukan untuk memudahkan teknik
inokulasi pada percobaan selanjutnya. Kurva ini menyatakan hubungan antara
nilai kerapatan optik suspensi mikrob dengan Satuan Pembentuk Koloni (SPK)
yang ditentukan dengan metode cawan hitung. Sehingga, inokulasi pada
percobaan selanjutnya dapat menggunakan populasi mikrob yang seragam.
Isolat-isolat yang telah didapatkan diambil menggunakan ose kemudian
ditumbuhkan pada media NB. Setelah 2 hari diinkubasi di atas shaker, suspensi
bakteri di dalam medium NB diencerkan berurut 2,3,4,8dan 10 kali dan diukur
nilai kerapatan optiknya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 620nm. Pada waktu yang bersamaan setiap tingkat pengenceran
ditentukan populasi mikrob dengan metodecawan hitung. Populasi mikrob dan
nilai kerapatan optisnya dihubungkan dengan persamaan regresi linier, yang
digunakan sebagai kurva baku populasi mikrob dalam medium.
Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi pada
Tanah Tercemar Minyak Bumi
Pengukuran pH Tanah
Sebanyak 10 g tanah ditambahkan akuades dengan perbandingan 1:1
kemudian dikocok selama 30 menit. Selanjutnya pH tanah diukur dengan
menggunakan pH meter (SNI 06-6989-2004)
Pengukuran Respirasi Tanah
Pengukuran CO 2 -C bertujuan untuk mengetahui tingkat aktivitas bakteri
dalam menurunkan bobot minyak bumi.Tanah dimasukkan ke dalam toples
kemudian diberi 2 tabung film berisi 5 ml 0,2 N KOH dan 10 ml air dan ditutup
sampai kedap udara. Selanjutnya diinkubasi selama 3 hari pada hari: 7, 14, 21 dan
28 pada suhu ruang di tempat gelap. Hal yang sama dilakukan pada kontrol, yaitu
toples tanpa tanah.

15

Pada akhir inkubasi ditambahkan 2 tetes phenolphtalein ke dalam tabung
film KOH kemudian dititrasi dengan HCl sampai warna merah hilang dan dicatat
volume HCl yang diperlukan. Selanjutnya ditambahkan 2 tetes metil oranye dan
dititrasi lagi dengan HCl sampai warna kuning berubah menjadi pink lalu volume
HCl yang diperlukan dicatat.
Menurut Anas (1989) jumlah CO 2 -C yang dihasilkan per kg tanah lembab
per hari dihitung dengan rumus:
(a െ b)x t x 12 x
r=

ଵ଴଴଴
୆୏୑

n

Dimana: a = HCl contoh tanah (ml), b = HCl control (ml), t = normalitas HCl (N),
n = jumlah hari inkubasi dan BKM = bobot kering mutlak tanah (g).
Pengukuran Total Petroleum Hydrocarbon (TPH)
Pengukuran Total Petroleum Hydrocarbon bertujuan untuk mengetahui
kemampuan bakteri mendegradasi senyawa hidrokarbon.TPH diukur dengan
metode gravimetri. Sampel sedimen kering dimasukkan ke dalam screw cap
sebanyak 5 g. Setelah itu diekstraksi dengan menambahkan DCM : n-heksan
sebanyak 5 ml (perbandingan sampel dengan DCM : n-heksan adalah 1:1) dan
dihomogenkan.
Setelah itu, larutan DCM : n-heksan yang berada di lapisan atas di dalam
screw cap diambil dan disisakan sedikit lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berisi 1,5 g Na 2 SO 4 . Selanjutnya DCM : n-heksan 7 ml dimasukkan lagi ke
dalam screw cap dalam dua tahap ekstraksi (5 ml kemudian 2 ml). Setelah
ekstraksi selesai, tabung reaksi yang berisi hasil ekstrak ditutup dengan aluminium
foil dan didiamkan selama 24 jam. Setelah itu hasil ekstrak dimasukkan ke dalam
cawan porselin yang telah ditimbang beratnya terlebih dahulu. Cawan tersebut
ditutup dengan aluminium foil dan ditunggu hingga hasil ekstrak menguap.
Setelah kering cawan porselin ditimbang kembali.
%TPH =

BPM െ BP
x 100%
BS

Dimana: BPM = Berat cawan Porselin + Minyak (g), BP = Berat Porselin (g), B = Berat Sampel
(g)

Rancangan Percobaan
Pengujian dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap 2 faktor dan 3
ulangan. Untuk faktor yang berpengaruh nyata dilakukan uji lanjut Duncan.
Kedua faktor tersebut adalah:
1. Faktor bakteri (B) terdiri 8 taraf, yaitu
(i)
B 0 = tanpa inokulasi bakteri
(ii) B 1 = inokulasi A
(iii) B 2 = inokulasi B
(iv) B 3 = inokulasi C
(v) B 4 = inokulasi A + B

16

(vi) B 5 = inokulasi B + C
(vii) B 6 = inokulasi A + C
(viii) B 7 = inokulasi A + B + C
Ket :
A = Bacillus sp. ICBB 7859
B = Bacillus sp. ICBB 9461
C = Bacillus sp. ICBB 5071
2. Faktor kontaminan (K) terdiri dari 3 taraf, yaitu;
(i) K 1 = Penambahan minyak berat(API Gravity 21,93)
(ii) K 2 = Penambahan minyak ringan(API Gravity 40,6)
(iii)K 3 = Penambahan limbah oli bekas(API Gravity 34,9)
Sebelum diinokulasikan ke media tanah, Bacillus sp. ICBB 7