PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN LIGAN BRUSEIN-D dari FRAKSI ETANOLIK BUAH MAKASAR (Brucea javanica (L.) Merr) DENGAN GEMCITABINE TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN SEL KARSINOMA PANKREAS PANC-1 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN LIGAN BRUSEIN-D dari FRAKSI
ETANOLIK BUAH MAKASAR (Brucea javanica (L.) Merr) DENGAN
GEMCITABINE TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN SEL
KARSINOMA PANKREAS PANC-1 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
Disusun oleh :
Jody Hernanto
NIM.S561302004
Pembimbing :
Dr.dr.Ida Bagus Budi, SpB(K)BD
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS ILMU BEDAH FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET / RSUD Dr MOEWARDI SURAKARTA 2018
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ...................................................................................... i PERNYATAAN KEASLIAN DAN PUBLIKASI.................................................... ii KATA PENGANTAR .............................................................................................. iii DAFTAR ISI ............................................................................................................. v DAFTAR GAMBAR ................................................................................................viii DAFTAR TABEL ..................................................................................................... ix DAFTAR SINGKATAN .......................................................................................... x
BAB I PENDAHULUAN A. LatarBelakangMasalah ............................................................................ 1 B. PerumusanMasalah .................................................................................. 3 C. TujuanPenelitian ...................................................................................... 4 D. ManfaatPenelitian .................................................................................... 4
1. ManfaatTeoritik ................................................................................. 4
2. ManfaatPraktis ................................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. KajianTeori .............................................................................................. 5
1. Kanker................................................................................................ 5
2. Siklussel ............................................................................................. 9
3. Apoptosis PadaKanker....................................................................... 13
4. KarsinomaPankreas............................................................................ 18
a. Definisi......................................................................................... 18
b. Anatomi........................................................................................ 18
c. Insidensi ....................................................................................... 19
d. EtiologidanFaktorPredisposisi ..................................................... 19
e. Perubahan Genetik pada Karsinoma Pankreas ............................ 20
1) K-Ras Proto-oncogen............................................................. 21
2) p16 (CDKN2, p16INK4a, MTS1) ......................................... 21
3) Gene Deleted in Pancreatic Carcinoma, Locus 4 (DPC4/SMAD4) ..................................................................... 22
4) p53 ......................................................................................... 22
5) Growth factors and their receptors........................................ 23 6) Epidermal Growth Factor...................................................... 23 7) Transforming Growth
Factor-β ............................................. 23 8) Vascular Endothelial Growth Factor .................................... 23 9) Raf/Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Cascade..... 24 10) Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K)/AKT/Mammalian Target of
Rapamycin (mTOR) Signaling Cascade ................................ 24 11) Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) Signaling Cascade .......... 24 12) Developmental Cascades ....................................................... 25
13) Telomerase............................................................................. 25
f. Histopatologi................................................................................ 25
g. Diagnosis ..................................................................................... 25
h. Stadium Klinik dan Management ................................................ 28 i. Cell line Karsinoma Pankreas PANC-1....................................... 30
5. BuahMakasar ..................................................................................... 30
a. Morfologi ..................................................................................... 31
b. Kandungan bahan kimia Buah Makasar ...................................... 32
c. Brusein D .................................................................................... 34
6. Gemcitabine ...................................................................................... 36
B. KerangkaTeori ......................................................................................... 38
C. Hipotesis .................................................................................................. 39
BAB III METODE PENELITIAN A. Rancangan Penelitian............................................................................... 40 B. Tempat dan Waktu Penelitian.................................................................. 40 C. Populasi Penelitian................................................................................... 40 D. Besar Sampel ........................................................................................... 40 E. Variabel Penelitian................................................................................... 40
1. Variabel Bebas ................................................................................... 40
2. Variabel Terikat ................................................................................. 41
F. Definisi Operasional Variabel.................................................................. 41
G. Alat dan Bahan ........................................................................................ 41
1. Alat..................................................................................................... 41
2. Bahan ................................................................................................. 42
H. Alur Penelitian ......................................................................................... 44
I. Cara Kerja ................................................................................................ 45
1. Kultur Sel ........................................................................................... 45
2. Starvasi............................................................................................... 45
3. Uji Sitotoksisitas ................................................................................ 46
4. Imunohistokimia ................................................................................ 47 J. Analisa Data............................................................................................. 48
BAB IV HASIL DAN ANALISA DATA A. Hasil Penelitian ........................................................................................ 50 B. Analisa Data............................................................................................. 54 BAB V PEMBAHASAN A. Ekspresi P53 Mutan ................................................................................. 57 B. Sifat sitostatik ligan Brusein D dari fraksi etanolik Buah Makasar (Brucea
javanica (L.) Merr) .................................................................................. 62
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan .............................................................................................. 67 B. Saran ........................................................................................................ 67 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 68 LAMPIRAN............................................................................................................... 69
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.Kelainan allele pada gen penekan tumor .................................................. 7 Gambar 2.Skema karsinogenesis ............................................................................... 9 Gambar 3.Siklus sel. .................................................................................................. 10 Gambar 4.Siklus sel kanker. ...................................................................................... 11 Gambar 5.Alur kerja p53. .......................................................................................... 12 Gambar 6 Alur kerja apoptosis. ................................................................................. 16 Gambar 7.Perubahan sel akibat apoptosis dan nekrosis ............................................ 17 Gambar 8.Anatomi pankreas. .................................................................................... 19 Gambar 9.Model progresifitas karsinoma pankreas. ................................................. 21 Gambar 10.Pohon buah makasar. ............................................................................. 32 Gambar 11.Skema ekstrasi ligan Brusein D ............................................................. 33 Gambar 12.Struktur kimia Brusein D. ....................................................................... 34 Gambar 13.Struktur kimia Gemcitabine. ................................................................... 36 Gambar 14.Kerangka teori......................................................................................... 38 Gambar 15.Alur penelitian......................................................................................... 43
DAFTAR TABEL
Tabel 1.Perbedaan Apoptosis dan nekrose. ............................................................... 17 Tabel 2.Prevalensi lesi genetic karsinoma pankreas.................................................. 22 Tabel 3.Prevalensi gejala karsinoma pankreas. ......................................................... 26 Tabel 4.Tingkat toksisitas ligan berdasarkan nilai LD50. ......................................... 34
DAFTAR SINGKATAN
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase DNA : DeoxiriboNuclide Acid RB : Retinoblastoma DCC : Deleted in CellColorectal Carcinoma APC : Adenomatous Polyposis Coli WT-1 : Wilm’s Tumor-1 NF-1 : Neurofibromatosis type-1 NF-2 : Neurofibromatosis type-2 RNA : RiboNukleid Acid CDK : Cyclin Dependent Kinase CDKI : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor DR5 : Death Reseptor 5
IGF-BP3 : Insulin Like Growth Fator-Binding Protein 3 c-IAP2 : Celluler inhibitor ofApoptosis Protein 2 NAIP1 : Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1 DR : Death Receptor Mdm2 : Murine double minute-2 TNFR : Tumor necrosis factor receptor MAP : Mitogen activating protein kinase PTP : Permeability transition pore ATP : Adenosine Triphospat PanINs : Pankreas intraepitel neoplasias DPC4 : Gene Deleted in Pancreatic Carcinoma, Locus 4 CDK : Cyclin- dependant kinase TGF-b : Transforming Growth
Factor-β
EGFR : Epidermal growth factor receptors
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor PI3K : Phosphoinositide 3-Kinase NF-Kb : Nuclear Factor Kappa B CT Scan : Computed Tomo Scan 5-FU : 5 Fluorouracil TEST : Toxicity Estimation Software Tool LD50 : Lethal Dose 50% dFdCTP : Deoxycytidinetriphosphate hNT : human Nucleoside transporter hCNT : Human Concentrative Nucleoside Transporter hENT : Human Equilibrate Nucleoside Transporter DCK : Deoxycytidine kinase dFdCMP : Deoxy cytidine monophosphate dFdCDP : Deoxy cytidine diphosphate LC50 : Lethal concentration
PENDAHULUAN
Karsinoma pankreas adalah salah satu kanker yang jarang ditemukan, namun salah satu jenis kanker yang paling mematikan, peringkat keempat dalam daftar kematian akibat kanker terkait dengan tingkat 5 tahun bertahan hidup hanya 6%. Pada tahun 2010 diperkirakan 43,140 kasus baru sedangkan 36.800 pasien meninggal akibat penyakit ini di Amerika Serikat. Di seluruh dunia, angka kejadian kasus baru adalah 278,684 dan 266,669 kematian. Di Belanda 2481 pasien meninggal karena karsinoma pankreas pada tahun 2010. Menariknya, angka kematian seluruh pasien kanker telah menurun selama beberapa tahun terakhir, namun angka kematian akibat karsinoma pankreas tetap relatif stabil.(J.A. van der Zee, 2012)
Di Indonesia, karsinoma pankreas merupakan tumor ganas ketiga terbanyak pada pria setelah tumor paru dan tumor kolon. Insidensi tertinggi terjadi pada usia 50- 60 tahun. Namun, data kepustakaan karsinoma pankreas di Indonesia masih sangat sedikit. Data di RSUP Dr. Kariadi Semarang pada tahun 1997-2004 terdapat 53 kasus. (Guntur Darmawan, Marcellus Simadibrata, 2011). Di RS Dokter Moewardi Surakarta terdapat 82 kasus karsinoma pankreas pada periode januari 2015 sampai November 2016 yang dilakukan tindakan bypass biliodigest.
Manajemen karsinoma pankreas saat ini memiliki 3 modalitas terapi, yaitu operasi, kemoterapi dan radioterapi. Total pancreatectomy adalah terapi yang paling efektif, tetapi hanya dapat diterapkan untuk sekitar 10-20% kasus saja. Metastasis telah terjadi pada sebagian besar kasus karsinoma pankreas saat diagnosis ditegakkan, yaitu 40% telah pada tahap stadium lanjut, baik dioperasi atau tidak, 40% mengalami metastasis visceral. Namun, tingkat 5 tahun bertahan hidup setelah reseksi total hanya 10%. Terapi adjuvan dapat diberikan sebelum atau setelah operasi, yang bertujuan untuk mengecilkan ukuran tumor sehingga mempermudah proses operasi dan pengobatan metastasis mikro. Modalitas opsional yang mungkin tersedia adalah kemoradioterapi, yang biasanya diterapkan dalam kasus tahap locally advance, dan kemoterapi, serta kasus dengan metastasis. (Guntur Darmawan, Marcellus Simadibrata,
2011) Karsinoma pankreas memiliki dua karakteristik khusus. Pertama, kanker jenis ini sangat invasif dan tahan terhadap kemoterapi konvensional dan radioterapi, dan kedua, menghasilkan stroma padat, kaya serat kolagen, protein matriks ekstraselular, fibroblas dan sel-sel inflamasi disebut reaksi desmoplastic. Karakteristik pertama tampaknya menjadi konsekuensi dari karakteristik kedua, yang berarti bahwa hambatan mekanis disekitar tumor adalah salah satu alasan mengapa karsinoma pankreas adalah salah satu kanker yang paling resisten terhadap kemoterapi. (Anca Barau, 2013)
Selain prosedur baku secara medis, banyak cara yang dilakukan penderita untuk mencari kesembuhan dari penyakit kanker, salah satunya dengan menggunakan tanaman obat. (Tannock, I.E. Hil, R.P, 1998) Banyak jenis tanaman obat yang sudah lama dikenal sebagai obat anti kanker, beberapa sudah diisolasi kandungannya menjadi obat kemoterapi. Obat-obat kemoterapi berkembang dari empirik klinik, ditunjukkan dengan kenyataan bahwa banyak bahan-bahan sitostatika telah mendapat tempat yang tetap di klinik. Hal serupa juga terjadi dalam penggunaan tanaman obat untuk pengobatan kanker,meskipun efek dari tanaman obat tersebut dalam menghambat proliferasi sel kanker belum teruji secara ilmiah.(Tannock, I.E. Hil, R.P, 1998)
Tanaman obat Indonesia telah secara sporadis diteliti di berbagai Universitas dan lembaga penelitian di Indonesia. Tujuan beberapa penelitian ini umumnya untuk membuktikan apakah penggunaan suatu tanaman obat terhadap penyakit kanker bisa dibuktikan secara ilmiah. (Alfred, M, C,. Bruce,D, M, 1997) Penelitian-penelitian yang pernah ada sebelumnya lebih bersifat pembuktian atas rasionalitas atau irrasionalitas penggunaan tanaman tersebut sebagai obat dan bukan suatu pencarian obat baru. Tanaman-tanaman obat tersebut memang sudah biasa digunakan sebagai obat dan dirasakan efektivitasnya secara empiris, sehingga penelitian yang dilakukan adalah upaya untuk memahaminya.(Alfred, M, C,. Bruce,D, M, 1997)
Secara in silico, buah makasar (Brucea javanica (L.) Merr.) memiliki ligan Brusein D yang sangat toksik terhadap sel karsinoma pankreas dibandingkan gemcitabine. Sitotoksisitasnya yang sangat tinggi mampu menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis sel karsinoma pankreas, terutama pada ekstrak etanol dari buah makasar (Brucea javanica (L.) Merr.) namun sitotoksisitasnya terhadap sel normal sangat kecil.(Muhamad S. M. I., 2015)
Senyawa bahan alam brusein D sangat berpotensi menginhibisi protein antiapoptosis mitogen-activated protein kinases (MAPK) yang berfungsi sebagai pengatur proliferasi, diferensiasi, transformasi, dan kelangsungan hidup sel karsinoma pankreas. Interaksi antara MAPK dengan brusein D merupakan interaksi yang lebih baik berdasarkan nilai energi bebas Gibbs
(ΔG), tetapan inhibisi, interaksi hidrogen, serta toksisitas dibandingkan dengan interaksi dari standar gemcitabine secara in
silico.( Muhamad S. M. I., 2015)
Protein 53 (p53) adalah faktor transkripsi yang mendapat julukan dalam dunia genetika sebagai "the guardian of the genome", atau "master watchman" karena peran protein tersebut dalam menjaga sel dari mutasi genetik akibat kerusakan DNA. p53 memiliki ekspresi yang beragam seperti berbagai fungsi selular, regulasi, apoptosis, replikasi DNA dan proliferasi. Dalam kondisi normal, jumlah konsentrasi p53 dalam sitoplasma sangat sedikit dan hanya teraktivasi saat sel mengalami stress.
Rendahnya asupan asam folat dan vitamin B6 dapat meningkatkan risiko mutasi genetik pada p53 dan menginduksi kanker. Upregulasi p53 yang berlebihan, biasanya terjadi pada pasien dalam pengobatan kemoterapi.
Berdasarkan uraian diatas maka dianggap perlu dilakukan penelitian untuk membuktikan adanya kemampuansenyawa bahan alam brusein D dari fraksi etanolik Buah Makasar dalam menghambat proliferasi sel karsinomapankreas sekaligus menekan ekspresi protein p53 mutan secara invitro. Sehingga ekstrak tersebutnantinya dapat digunakan sebagai terapi komplementer atau sebagai terapi substitusi pada pengobatan medis karsinoma pankreas.
1. Apakah Gemcitabine dan ligan Brusein D dari fraksi etanolik Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr) mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma pankreas PANC-1 secara in vitro?
2. Apakah terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara
in vitro antara Gemcitabine dengan ligan Brusein D dari fraksi etanolik Buah
Makasar (Brucea javanica (L.) Merr) pada biakan kultur sel karsinoma pankreas PANC-1 secara in vitro?
C. TUJUAN PENELITIAN
1. Membuktikan potensi Gemcitabine dan ligan Brusein D dari fraksi etanolik Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr) dalam mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma pankreas PANC-1 secara in vitro
2. Membuktikan tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara in vitro antara Gemcitabine dengan ligan Brusein Ddari fraksi etanolik Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr) pada biakan kultur sel karsinoma pankreas PANC-1 secara in vitro.
D. MANFAAT PENELITIAN
1. Manfaat Teoritik
a. Diharapkan dapat memberi informasi ilmiah mengenai kemampuan ligan Brusein D dari fraksi etanolik Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr) dalam menghambat proliferasi sel karsinoma pankreas PANC-1dan penekanan ekspresi P53 mutan secara in vitro.
b. Memberi kontribusi ilmiah terhadap penelitian – penelitian karsinoma pankreas selanjutnya.
2. Manfaat Praktis.
Sebagai dasar ilmiah untuk mengkaji efek klinis lebih lanjut dari senyawa bioaktif anti kanker dan kemopreventif yang terdapat pada Buah Makasar dan diharapkan penelitian lanjutan agar dapat dikembangkan sebagai obat anti karsinomapankreas yang baru ataupun sebagai terapi komplementer dari terapi yang ada saat ini.