STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 M133LV203AN239YN268D DAN PENGARUH PRIMA-1 TERHADAP WILD TYPE P53

Disusun oleh : ANITA KUSUMA DEWI

M0303018

SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

Februari, 2011

commit to user

commit to user

KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 M133L/V203A/N239Y/N268D DAN PENGARUH PRIMA-1 TERHADAP WILD TYPE P53 ‖ belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga belum pernah ditulis atau dipublikasikan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Februari 2011

ANITA KUSUMA DEWI

commit to user

ANITA KUSUMA DEWI

Jurusan Kimia. Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret.

ABSTRAK

Quadruple mutan p53 M133L/V203A/N239Y/N268D mampu

meningkatkan stabilitas termodinamika ikatan residu-residu yang mengalami mutasi [Joerger, A. C., Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, J. Biochem., 279: pp. 1291-1296]. Selain itu, struktur kristalografi sinar-x quadruple mutan ini mirip dengan struktur wild type p53 ( kode PDB : wt-p53). Kemiripan struktur ini melandasi studi dinamika konformasinya. Studi tersebut telah dilakukan dengan menggunakan simulasi dinamika molekuler. Dinamika konformasi quadruple mutan (kode PDB : QMT) mengungkap adanya pergeseran struktur yang ditunjukkan oleh perubahan nilai RMSD selama simulasi 5ns berlangsung. Pergeseran ini terutama disebabkan oleh fluktuasi pada loop L2 dan loop S7-S8. Fluktuasi pada loop S7-S8 lebih signifikan dibanding dengan loop L2. Selain itu, dinamika konformasi residu-residu penting p53 untuk berikatan dengan DNA (yaitu lysin 120 dan arginin 248) tidak dapat membedakan quadruple mutan dan wild type p53. Simulasi dinamika molekuler ini juga dapat menunjukkan pengaruh PRIMA-1 terhadap wild type p53. Berdasarkan hasil dockingnya, PRIMA-1 tidak cukup spesifik berinteraksi pada wild type p53. PRIMA-1 cukup stabil menempel pada wild type p53 di area β-sandwich. Keberadaan PRIMA-1 memberikan dinamika konformasi yang berbeda antara wild type p53 kompleks dan tunggalnya. Perbedaannya terletak pada residu histidin 116, glysin 245, dan arginin 248. Menariknya lagi residu 186 yang terletak jauh dari penempelan PRIMA-1 juga mengalami pergeseran.

Kata kunci : dinamika molekul, mutan p53 QMT, PRIMA-1.

commit to user

ANITA KUSUMA DEWI

Department of Chemistry. Faculty of Mathematics and Natural Sciences. Sebelas Maret University.

ABSTRACT

M133L/V203A/N239Y/N268D quadruple mutant p53 was able to increase the thermodynamic stability of mutated residue bonds [Joerger, A. C., Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, J. Biochem., 279: pp. 1291-1296]. In additions, x-ray crystallography structure of quadruple mutant similar to the wild type structure ( PDB code: wt-p53). This similarity was underlying to study its conformational dynamics. The study was done by means molecular dynamics simulations. Conformational dynamics of quadruple mutant (PDB code: QMT) reveal a shifted structure which was demonstrated by RMSD value changes during 5ns of simulation. This shift was mainly caused fluctuations in L2 loops and S7-S8 loops. the last was showing more significant fluctuations. In additions, conformational dynamics of p53 important residues for DNA binding (i.e lysine 120 and arginine 248) could not distinguish quadruple mutant and wild type p53. This molecular dynamic simulation can also show effects of PRIMA-1 against wild type p53. According to its docking results, PRIMA-1 was not specific enough to interact in wild type p53. PRIMA-1 was quite stable against wild type p53 in β-sandwich area. The existence of PRIMA-1 distinguished conformational dynamics between un-complex and complex wild type p53. The discrepancy was located at residues of histidine 116, glycine 245, and arginine 248. Interestingly, residue of 186 which is far from PRIMA-1 binding site, was also shifted due to the bind.

Key words : molecular dynamic, mutant p53 QMT, PRIMA-1.

commit to user

Setiap kenikmatan akan lebih terasa manakala kita tahu bagaimana rasa pahit. Untuk itu syukuri setiap pahit yang terasa hari ini untuk nikmat esok hari. (Anita Kusuma Dewi)

Sebuah kegagalan bisa jadi sebuah keberhasilan menemukan hal baru asal kita mampu melihat sisi positifnya. (Fajar R. Wibowo)

Sabar dan Syukurlah niscaya Allah akan menambah nikmatmu setiap hari (Suami tercinta)

Kebenaran bukan untuk dipaksakan tetapi diakui keberadaannya (Achdiat Kartamihardja)

You do not really understand something unless you can explain it to your

grandmother (Albert Einstein)

commit to user

Untuk Allah Yang Maha Cerdas, Maha Bijaksana, dan Maha Segalanya

Untuk Bapak dan Ibu yan paling pengertian

Untuk adik-adikku tersayang

Untuk suami tercinta yang selalu sabar dan support

Dan untuk my baby EZA M.I. AL BARRA …

commit to user

jalan yang indah bagi penulis sehingga skripsi ini dapat penulis selesaikan dengan baik sebagai salah satu persyaratan dalam memperoleh gelar sarjana sains Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. Atas segala karuniaNya pulalah penulis menyadari bahwa segala sesuatu memiliki proses dan waktunya masing-masing.

Dalam menyusun skripsi ini penulis menemui berbagai hambatan dan permasalahan yang beragam. Namun, atas bimbingan, kritikan, saran, dan dorongan semangat yang bermanfaat dari berbagai pihak, semua hambatan dan permasalahan tersebut dapat penulis atasi dengan baik. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis, yaitu sebagai berikut.

1. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D. selaku dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D., selaku ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Soerya Dewi Marliyana, M.Si., selaku pembimbing akademik yang dengan sabar telah membimbing penulis dalam penyelesaian studi di Jurusan Kimia.

4. Dr. rer. nat. Fajar R. Wibowo, M.Si., selaku dosen pembimbing I, yang dengan penuh kesabaran dan ketulusan membimbing penulis dari titik nol, membuka mata penulis bahwa segala sesuatu itu memiliki berbagai kemungkinan dengan alasannya masing-masing.

5. Yuniawan Hidayat, M.Si., selaku dosen pembimbing II, yang dengan ketulusan membimbing penulis mengenai cara penulisan yang baik dan sesuai aturan. Atas bimbingan beliau pulalah penulis mendapatkan dorongan semangat untuk menyelesaikan skripsi ini dengan efektif.

6. I.F. Nurcahyo, M. Si. selaku ketua laboratorium Kimia Dasar yang telah memberikan akses bagi penulis melakukan penelitian di laboratorium Kimia Dasar bagian Komputasi Kimia.

commit to user

9. Semua pihak yang tidak dapat penulis tuliskan satu per satu yang telah memberikan bantuannya.

Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi yang penulis lakukan masih jauh dari sempurna sehingga membutuhkan saran dan kritik yang membangun dari para pembaca. Namun, lepas dari semua itu, semoga para pembaca mendapatkan manfaat setelah membaca skripsi ini.

Surakarta, Februari 2011

Penulis

commit to user

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 46 DAFTAR PUSTAKA. ......................................................................................... 47 LAMPIRAN-LAMPIRAN .................................................................................. 51

commit to user

Tabel 2. Kode Atom, Tipe Atom, dan Muatan PRIMA-1 yang Diperoleh

dengan RESP ......................................................................................... 24

commit to user

Gambar 2. Distribusi elemen dan skema ribbon struktur sekunder p53 .......... 7 Gambar 3. Siklus sel ......................................................................................... 8 Gambar 4. Superposisi bentuk stereo dari backbone wt-p53 tanpa DNA, wt-

p53 dengan DNA dan quadruple mutan p53 .................................. 9

Gambar 5. Hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT ........................... 10 Gambar 6. Struktur PRIMA-1 ........................................................................... 10 Gambar 7. Struktur Umum Asam Amino ........................................................ 17 Gambar 8. 20 asam amino protein yang dikelompokkan menurut gugus

fungsinya ........................................................................................ 17

Gambar 9. Beberapa struktur protein ................................................................ 18 Gambar 10. Sudut dihedral psi dan phi pada backbone protein ........................ 19 Gambar 11. Struktur PRIMA-1 Terparameterisasi ............................................ 24 Gambar 12. Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil

simulasi DM untuk quadruple mutan QMT_1 (simulasi QMT yang pertama), QMT_2 (simulasi QMT yang kedua), dan wild type p53 ......................................................................................... 26

Gambar 13. Perbandingan profil B-factor (Å 2 ) terhadap nomor residu untuk quadruple mutan QMT_1, QMT_2, rerata QMT_1 dan QMT_2 dan wild type p53 . .......................................................................... 26

Gambar 14. Grafik fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 118-

123 (melibatkan residu lisin 120) dan perbedaan posisi sudut dihedral selama simulasi. ................................................................ 28

Gambar 15. Grafik fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 244-

248 (melibatkan residu arginin 248) dan perbedaan posisi sudut dihedral selama simulasi ................................................................ 30

Gambar 16. Perbandingan struktur hasil kristalografi sinar-x wt-p53 dan

QMT dalam bentuk stereo dari backbone wild type-p53 tanpa DNA , wild type p53 dengan DNA dan quadruple mutan p53 ......... 31

commit to user

amino 185-187 ................................................................................ 34

Gambar 19. Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil

simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 dan kompleks p53 dengan PRIMA_1 ............................................................................ 35

Gambar 20. Perbandingan profil B-factor (Å 2 ) terhadap nomor residu hasil simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 dan kompleks wt-p53 dengan PRIMA-1 ............................................................................. 36

Gambar 21. Perbandingan posisi PRIMA-1 pada p53 selama simulasi .............. 37 Gambar 22. Posisi PRIMA-1 terhadap dua residu yang diperkirakan mampu

membentuk ikatan hidrogen antara keduanya berturut-turut .......... 38

Gambar 23. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 114-118

komplekss p53 dengan PRIMA-1 dan perbedaan posisinya selama simulasi ............................................................................... 39

Gambar 24. Posisi PRIMA-1 terhadap wt-p53 dengan beberapa residu

terdekatnya valin 178, ileusin 157, arginin 248, dan glysin 245. ... 40

Gambar 25. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara

komplekss p53 dengan PRIMA-1 dengan pembanding wt-p53 sudut Ф dan ψ untuk rentang residu 242-246 yang memuat residu 245 dan rentang residu 244-248 ...................................................... 41

Gambar 26. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 dihimpitkan

dengan wt-p53 sebagai untuk residu 244-249 selama simulasi ..... 42

Gambar 27. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara

komplekss p53 dengan PRIMA-1 dengan pembanding wt-p53 sudut Ф dan ψ untuk rentang residu 183-187 ................................. 43

Gambar 28. Dinamika posisi komplekss p53 dengan PRIMA-1 dihimpitkan

dengan wt-p53 sebagai pembanding residu 183-187 selama simulasi ........................................................................................... 44

commit to user

setelah disimulasi, setelah diequilibrasi, dan setelah simulasi berjalan. Warna hitam adalah sistem yaitu protein p53 dan warna biru adalah molekul air. .................................................................. 51

Gambar 30. Densitas, volume, energi total, dan temperatur sistem selama

proses 500 ps equilibrasi dan 7000 ps simulasi. Dari atas ke bawah masing-masing adalah grafik densitas, volume, energi total, dan temperatur sistem saat equilibrasi (A) dan simulasi (B). Grafik berwarna hitam, merah, hijau, dan kuning berturut-turut adalah wt-p53, QMT_1, QMT_2, dan wt-p53 yang berinteraksi dengan PRIMA-1 ............................................................................. 52

commit to user

Awal, Minimisasi, Equilibrasi, dan Simulasi ................................. 51

Lampiran 2. Densitas, Volume, Energi Total, dan Temperatur Sistem Selama

Proses 500 ps Equilibrasi da n 7000 ps Simulasi ............................ 52

Lampiran 3. Glosarium ........................................................................................ 53

commit to user

A. Latar Belakang

Kanker telah lama menjadi masalah utama dalam bidang kedokteran dan menjadi fokus penelitian untuk mencari penyebab, mekanisme, sampai cara pengobatannya. Sofyan (2002) menyebutkan ―kebanyakan kanker bisa disebabkan oleh salah satu atau lebih dari tiga kategori gen; onkogen, gen yang mengatur replikasi atau perbaikan DNA , dan gen suppressor tumor. Salah satu produk gen suppressor tumor dikenal dengan nama p53.

Protein p53 bekerja mencegah replikasi DNA yang rusak dengan memperbaiki kerusakan yang ada. Protein ini mampu menginduksi kematian sel terprogram (apoptosis) jika upaya perbaikan tidak dapat dilakukan (Murray et al., 1998). Adanya mutasi p53 dapat mengakibatkan disfungsi p53. Mutasi p53 menurut Vousden dan Lu (2002) terjadi 95% pada domain inti. Sebanyak 40% diantaranya ditemukan pada enam hotspot (Arg 175, Gly 245, Arg 248, Arg 249, Arg 273, dan Arg 282 (Wright dan Lim, 2007).

Banyak studi struktur dasar mutasi p53 dilakukan untuk mengetahui pengaruh mutasi terhadap stabilitas molekul secara keseluruhan dan perubahan struktur lokal p53 berikatan dengan DNA. Kebanyakan studi ini melibatkan quadruple mutan (QMT) p53 M133L/V203A/N239Y/N268D (Joerger et al., 2006). Joerger dkk (2004) menyatakan quadruple mutan ini sangat stabil (superstable mutan) pada sistem kristalnya, sedangkan kebanyakan mutasi lain meyebabkan penurunan stabilitas termodinamika ikatan masing-masing residu yang mengalami mutasi. Selain itu, kristalografi sinar-x menunjukkan perpaduan QMT p53 ini hanya mengubah sedikit struktur lokalnya tanpa merubah struktur global p53 (inti β-Sandwich dan surface ikatan dengan DNA). Melalui fakta diatas QMT p53 ini dapat dikatakan memiliki kemiripan struktur dengan p53 normalmya (wild type p53).

Kemiripan struktur QMT p53 dengan wild type p53 (wt-p53) sejalan dengan studi pengembalian fungsi p53 termutasi yang dilakukan oleh Bykov dkk

commit to user

pendek pada mutan p53. Peptida pendek yang digunakan adalah PRIMA-1 (p53 Reactivation and Induction Massive Apoptosis ). Menindaklanjuti penelitian Bykov dkk (2002a), Warsino (2008) melakukan docking (penempelan ligan pada makromolekul protein) antara PRIMA-1 dengan QMT p53 dan wt-p53. Hasil docking menunjukkan situs potensial PRIMA-1 menempel pada QMT p53 dan wt- p53. Posisi PRIMA-1 yang paling potensial ditemukan pada area yang sama yaitu terletak pada daerah loop. Kedua posisi tersebut menghasilkan besar energi docking yang relatif sama. PRIMA-1 dikatakan tidak cukup spesifik berinteraksi pada wt-p53 dan QMT p53 karena beda energi saat dilakukan docking awal dan lanjutan kurang dari 2 kkal/mol sebagai batas residual error autodock (Morris et al., 1998).

Kemiripan struktur QMT p53 dan wt-p53, serta ketidakspesifikan PRIMA-1 menempel pada wt-p53 mendorong studi dinamika molekul QMT p53 dan wt-p53 serta dinamika molekul PRIMA-1 menempel pada wt-p53. Sebuah metode yang sangat tepat untuk mengamati dinamika molekul level atomik adalah simulasi dinamika molekuler (DM). Simulasi DM cukup baik dalam menentukan kontribusi dominan terjadinya fluktuasi atomik suatu protein (Pikkemaat et al., 2002). Ada beberapa karakter dinamika molekul yang dapat diamati melalui simulasi DM diantaranya adalah; fleksibilitas docking ligan, alur difusi temporal, konformasi sisi aktif, spesifitas ikatan, transisi allosteric, dll. Tambahan informasi hasil simulasi DM ini diharapkan dapat menunjang studi karakteristik dinamika molekul QMT p53 dan wt-p53.

B. Perumusan Masalah

1. Identifikasi Masalah

Sebagian besar kanker pada manusia disebabkan oleh mutasi p53 (Sofyan, 2000). Mutasi p53 95% terjadi pada domain intinya (Vousden et al., 2002), dan 40% diantaranya ditemukan pada enam hotspot 175, 245, 248, 249,

commit to user

(Joerger et al., 2004). Selain itu, struktur kristal QMT p53 ini memiliki kemiripan dengan wt-p53.

Kemiripan struktur QMT dan wt-p53 sejalan dengan hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT. PRIMA-1 menempel pada posisi yang sama dengan energi yang relatif sama. Namun pengamatan terhadap dinamika molekul QMT p53 dan wt-p53 serta pengaruh PRIMA-1 terhadap keduanya belum diketahui. Oleh karena itu simulasi DM dapat dilakukan untuk mengamati lebih lanjut dinamika molekul QMT dan wt-p53 serta pengaruh PRIMA-1 terhadap dinamika molekul keduanya.

Ada beberapa karakter dinamika molekul yang dapat dipilih. Beberapa diantaranya adalah; fleksibilitas docking ligan, alur difusi temporal, konformasi sisi aktif, spesifitas ikatan, transisi allosteric, dll. Selain pemilihan karakter langkah berikutnya adalah memilih program simulasi Dinamika Molekuler (DM) yang sesuai. Berbagai program simulasi DM yang populer seperti AMBER (Assisted Model Building with Energy Refinement), CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics ), Tinker, GROMOS (Groningen Molecular Simulation ), dan NAMD (NAnoscale Molecular Dynamics) dapat digunakan untuk perbaikan molekul (Esposito et al., 2006).

2. Batasan Masalah

Simulasi Dinamika Molekuler (DM) terhadap karakter dinamika konformasi dilakukan untuk tiga sistem. Ketiga sistem tersebut antara lain; mutan p53 yang memuat quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D, wild type p53, serta kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53. Pemilihan kompleks hanya untuk PRIMA-1 dengan wild type p53 saja terutama karena kemiripan struktur yang dimiliki oleh wt-p53 dan QMT p53, serta posisi interaksi PRIMA-1 yang sama sebagaimana hasil penelitian Warsino (2008). Seluruh protein diambil dari RSCB Protein Data Bank file.

commit to user

dilakukan dalam eksplisit solven dengan sistem periodik jangka waktu 9ns untuk wild type p53 serta 5ns untuk quadruple mutan p53 dan kompleks PRIMA-1 dengan wt-p53.

3. Rumusan Masalah

a. Bagaimana perbandingan dinamika konformasi wild type p53 dan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D tanpa ligan PRIMA-1?

b. Apakah terdapat kesamaan karakteristik umum dinamika konformasi wt-p53 dan QMT p53?

c. Bagaimana dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53?

C. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui perbandingan dinamika konformasi wild type p53 pada manusia dan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D.

2. Mengetahui apakah terdapat kesamaan umum dinamika konformasi wt-p53 dan QMT p53.

3. Mengetahui dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53.

D. Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi tentang dinamika konformasi molekul quadruple mutan p53 M133L/V203A/N239Y/N268D dengan dinamika konformasi molekul wt- p53 wt-p53 sebagai pembandingnya.

2. Dengan mengetahui perbandingan dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wt-p53 dan QMT p53 akan memberikan sumbangan bagi ilmu kesehatan dalam terapi kanker berkaitan dengan selektifitas PRIMA-1 terhadap target mutasi diluar hotspot.

commit to user

A. TINJAUAN PUSTAKA

1. Kanker

Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali menjadi sel-sel yang mampu menyerang jaringan biologis lainnya, baik yang bersebelahan (invasi), atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastase) (Murray et al., 1998). Mengenai penyebab kanker, Sofyan (2002) menyebutkan ―kebanyakan kanker bisa disebabkan oleh salah satu atau lebih dari tiga kategori gen; onkogen, gen yang mengatur replikasi atau perbaikan DNA , dan gen suppressor tumor ―.

Pertumbuhan kanker diawali dengan mutasi berangkai. Mutasi tersebut terjadi pada gen penekan tumor dilanjutkan dengan mutasi pada gen yang berfungsi untuk memperbaiki kerusakan DNA (DNA repair gene). Mutasi pada protoonkogen dapat mengaktifkan onkogen dan menonaktifkan gen penekan tumor. Beberapa faktor hereditas dapat meningkatkan perubahan mutasi penyebab kanker, mencakup aktivasi onkogen atau penghambat gen penekan tumor. Fungsi berbagai gen penekan tumor dan onkogen dapat diganggu pada tahapan berbeda pertumbuhan tumor (Hadi dan Nurlalila, 2008).

2. Gen Supressor Tumor - p53

Dari ribuan jumlah gen dalam tubuh manusia, secara umum dibagi menjadi dua kelompok utama yakni onkogen dan gen penekan tumor atau gen supressor tumor (Syaifudin, 2007). Onkogen adalah versi mutan dari gen normal, yang memicu pertumbuhan sel. Gen pada sel normal yang dapat berubah menjadi onkogen aktif akibat mutasi, disebut protoonkogen.

Gen supressor tumor merupakan gen penekan keganasan kanker. Gen ini mengkode salah satu produk protein p53 yang merupakan phosphoprotein dengan berat molekul 53kDa (Murray et al., 1998). Protein p53 terdiri dari 393 asam amino yang terbagi dalam beberapa domain struktur dan fungsinya. Berikut pembagian domain struktur dan fungsi p53; terminal N terdiri dari Residu 1-42

commit to user

oligomerisasi (residu 342-355) dan domain regulator terminal karboksil (residu 363-393), yang disajikan dalam gambar 1 dibawah.

Gambar 1.Skema struktur p53 dengan Arg 175, Gly 245, Arg 248, Arg 249, Arg

273, dan Arg 282 dilaporkan menjadi mutasi hotspot dalam berbagai penyakit kanker (Bai et al., 2006).

Struktur domain inti p53 terdiri dari dua anti parallel β-sheet dengan empat dan lima rantai yang membentuk β-sandwich dan terbagi dalam dua loop besar yaitu loop L2 dan L3 dalam satu loop besar dan daerah loop-sheet-helix dengan distribusi berbagai residu asam amino sebagaimana tampak dalam gambar 2A dan terlihat lebih jelas dalam bentuk pitanya gambar 2B.

commit to user

Gambar 2.Struktur p53.A, distribusi elemen-elemen struktur sekunder wild type

p53 dan mutan quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D yang disimbolkan huruf-huruf yang mewakili asam amino (tabel1), empat titik mutasi ditunjukkan dengan warna yang berbeda.B, skema ribbon struktur protein p53 dengan β-Sandwich dan dua loop besarnya (Joerger et al., 2004).

Protein p53 memiliki peranan penting dalam siklus sel manusia. Tahapan siklus sel (gambar 3) manusia dijelaskan sebagai berikut; terdiri dari keadaan istirahat (fase G0), pertumbuhan sel dan persiapan kromosom untuk replikasi (fase G1). Siklus dilanjutkan dengan sintesis DNA (fase S) dan diikuti dengan persiapan pemisahan sel (fase G2). Siklus disempurnakan dengan mitosis (fase M) hingga dihasilkan sel-sel belahan yang baru (Enten et al., 2005).

Pada tahapan siklus sel tersebut protein p53 memiliki tiga fungsi utama yaitu bekerja sebagai aktivator transkripsional dengan mengatur gen tertentu yang terlibat dalam pembelahan sel, bekerja sebagai kontrol checkpoint G1 siklus sel bagi kerusakan DNA. Saat terjadi kerusakan yang berlebih dapat meningkatkan aktivitas dengan menghambat pembelahan sel dan memberikan waktu untuk perbaikan agar tidak terjadi replikasi DNA yang rusak. Perbaikan DNA dilakukan dengan menyisipkan mutasi permanen ke dalam genom. Fungsi yang ketiga adalah p53 berpatisipasi dalam mengawali apoptosis (Murray et al., 1998).

commit to user

Gambar 3.Siklus Sel (Mitchison, 1997)

3. Mutasi p53

Mutasi p53 ditemukan pada kurang lebih 50% sel kanker manusia (Bykov et al., 2002). Sebanyak 90% mutasi p53 terjadi pada domain inti dan 40% dari seluruh mutasi yang terjadi ditemukan pada enam hotspots (175, 245, 248, 249, 273, dan 282) (Wright dan Lim, 2007), dan yang lain terjadi diluar hotspot.

Berdasarkan dampak struktur domain inti yang berikatan dengan DNA, Hainaut et al (1997) mengelompokkan mutasi p53 dalam tiga kelas yaitu mutasi kelas I mempengaruhi residu yang berikatan dengan DNA (Arg 248 dan Arg 273) dengan menggangu titik kontak residu-residu tersebut untuk berikatan dengan DNA . Mutasi kelas II domain inti mempengaruhi residu-residu yang penting untuk orientasi permukaan ikatan DNA (Arg 175, Gly 245, Arg 249, dan Arg 282 yang terdapat dalam area penghubung scaffold dan permukaan ikatan DNA) terhadap fleksibilatas protein p53, sedangkan mutasi kelas III mempengaruhi struktur tersier domain inti dan memberikan sifat fungsional protein yang berbeda.

Pengembalian fungsi p53 termutasi tidak dapat dilakukan dengan penambahan konsentrasi p53 melainkan dengan mengatur konformasi dari p53 termutasi sehingga menyerupai wild type p53 (Protein p53 yang tidak mengalami mutasi), melalui penempelan molekul kecil atau peptida pendek pada p53 termutasi. Molekul peptida pendek yang digunakan salah satunya adalah PRIMA-

commit to user

M133L/V203A/N239Y/N268D.

4. Mutan Quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D Hasil kristalografi sinar-X dalam penelitian Joerger et al (2004) menunjukkan bahwa mutan ini dikategorikan sebagai superstable mutan dengan hanya sedikit perubahan struktur lokal tanpa merubah struktur global (inti β- Sandwich dan permukaan yang berikatan dengan DNA) protein p53 sehingga menyerupai bentuk wild type-nya sebagaimana ditunjukkan gambar 4. Studi ini menunjukkan salah satu dampak struktural mutasi yaitu terbentuknya celah besar untuk akses air atau celah internal hidrofobik tanpa perubahan struktur tapi menyebabkan penurunan stabilitas termodinamika.

Gambar 4. Superposisi bentuk stereo dari backbone wt-p53 tanpa DNA(rantai

A,biru), wt-p53 dengan DNA(rantai B, jingga) dan quadruple mutan p53(hitam) (Joerger et al., 2004).

Studi reaktivasi p53 dengan ligan PRIMA-1 telah dilakukan oleh Warsino (2008) menggunakan metode Docking. Metode Docking dilakukan pada wild type p53 (wt-p53) manusia (kode PDB:wt-p53) dan tikus, serta beberapa mutan p53 yakni mutasi pada hotspot 245, mutasi pada 273, serta mutasi diluar hotspot (kode PDB:QMT). Molekul QMT adalah p53 termutasi melibatkan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D.

Pada gambar 5 ditunjukkan situs potensial PRIMA-1 menempel pada wt-p53 dan QMT. Kedua situs penempelan terletak pada area yang sama yaitu

commit to user

dilakukan docking awal dan lanjutan kurang dari 2 kkal/mol (dibawah residual error autodock) (Morris et al., 1998).

Gambar 5. Hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 (kiri) dan QMT (kanan). Situs

penempelan PRIMA-1 dengan energi terendah masing-masing ditunjukkan dengan simbol S.R. Kedua situs potensial tersebut terletak pada daerah yang sama.

5. PRIMA-1

PRIMA-1 (p53 Reaktivation and Induction Massive Apoptosis) atau disebut

dengan 2,2-bis(Hydroxymethyl)-1-azabicyclo[2.2.2}octane-3-one,

memiliki sebuah gugus karbonil, atom N, dan dua gugus OH. PRIMA-1 (Gambar6) memiliki sifat fisik: Kristal putih dengan m.p. 142-144°C, rumus molekul C9H15NO, dan berat molekul 185.2 (Bykov et al., 2002b).

Gambar 6. Struktur PRIMA-1 ( Bykov et al., 2002b)

commit to user

pada tahun 1962 yaitu dengan mengikat beberapa bola karet menggunakan pengikat dengan variasi panjang pengikat, kemudian mengamati interaksi yang terjadi antar bola karet setiap 5 menit sekali. Beberapa percobaan terus dikembangkan hingga tahun 1998, penghargaan nobel diberikan kepada Walter Kohn dan John Pople karena mengaplikasikan mekanika kuantum dalam memecahkan masalah struktur dan reaksi kimia dari molekul kecil (Becker et al., 2001). Mulai dari eksperimen sederhana, studi simulasi kimia menggunakan bantuan komputer, yang disebut dengan teknik simulasi kimia terus dikembangkan sampai saat ini.

Metode simulasi komputer memudahkan kita untuk mempelajari beberapa sistem dan memprediksikan sifat-sifatnya dengan penggunaan teknik yang mempertimbangkan replikasi yang kecil dari sistem makroskopik dengan sejumlah atom atau molekul yang dapat diatur. Simulasi menghasilkan suatu konfigurasi yang representatif dari replikasi yang kecil ini dalam beberapa cara yang nilai akurat dari sifat-sifat struktural dan termodinamiknya dapat diperoleh dengan sejumlah komputasi yang mungkin mudah dikerjakan. Teknik simulasi juga memungkinkan perilaku bergantung-waktu dari sistem atomik dan molekuler untuk didekati, menyediakan suatu gambaran yang detail dari cara di mana sistem berubah dari satu konformasi atau konfigurasi ke yang lain. Teknik simulasi juga digunakan secara luas dalam beberapa prosedur eksperimental, seperti pendekatan struktur protein dari kristalografi sinar X (Leach, 2001).

Menurut Leach (2001) ada dua jenis teknik simulasi yang umum dalam pemodelan molekuler adalah metode Dinamika Molekuler (DM) dan Monte Carlo (MC). Simulasi DM dan Monte Carlo berbeda dalam berbagai hal. Perbedaan signifikan adalah dalam hal DM menyediakan informasi mengenai ketergantungan waktu sifat-sifat sistem sedangkan konfigurasi successive Monte Carlo dibuat seakan-akan tidak ada hubungan waktu.

commit to user

waktu yang akan datang atau waktu-waktu yang sudah terlewati. DM memiliki kontribusi energi kinetik terhadap total energi sedangkan dalam simulasi Monte Carlo total energi ditentukan secara langsung dari fungsi energi potensial (Leach, 2001). Simulasi DM dari beberapa makromolekul biologi yang menarik seperti DNA dan kompleks DNA-protein telah terbukti menjadi cara tepat memahami lebih dalam struktur dan sifat-sifat dinamikanya (Wibowo et al., 2005).

7. Simulasi Dinamika Molekuler (DM)

Simulasi dinamika molekuler merupakan metodologi untuk model mikroskopis secara detil dalam skala atomic dengan mengamati proses ketergantungan waktu sistem molekuler dan secara numeric memecahkan persamaan gerak hukum Newton. Hasilnya adalah suatu trajektori yang menspesifikkan bagaimana posisi dan kecepatan partikel di dalam sistem bervariasi sesuai waktu. Trajektori dihasilkan dengan menyelesaikan persamaan diferensial yang diwujudkan dalam Hukum Newton 2 (F = ma):

(2.7.1)

Persamaan tersebut menggambarkan pergerakan partikel yang bermassa m i sepanjang satu koordinat (x i ) dengan F xi merupakan gaya pada partikel dalam arah

tersebut (Leach, 2001). Terdapat empat tahap utama dalam simulasi DM. Pertama penentuan koordinat awal berkaitan dengan penggunaan solven dan pemilihan kotak simulasi. Penggunaan solven dalam simulasi DM dapat dilakukan dengan eksplisit solven maupun implisit solven. Partikel eksplisit solven seperti TIP3P umum digunakan dalam simulasi biomolekuler (Becker dan Watanabe., 2001). Setelah menemukan konfigurasi awal sistem, fase penyeimbangan dilakukan untuk memperoleh sistem yang stabil. Atom-atom makromolekul dan pelarut di sekitarnya yang mengalami fase relaksasi biasanya menghabiskan 10 atau 100 ps

dt

commit to user

dalam penghitungan sifat-sifat kesetimbangan. Sebelum melakukan simulasi DM, sistem harus diseimbangkan dengan kontrol volume, tekanan, dan temperatur untuk menyesuaikan misalnya densitas pelarut untuk nilai eksperimental dan temperatur sistem untuk temperatur yang dipilih.

Setelah penyeimbangan, fase produksi dimulai, yang akan memproduksi hasil simulasi aktual dengan simulasi DM berdurasi sekitar 1 ns. Pada dasarnya, protokol yang sama seperti pada saat tahap akhir penyeimbangan dapat digunakan. Simulasi DM dapat diteruskan sampai diperoleh konfigurasi molekuler yang memuaskan. Jalannya produksi DM ditampilkan berada pada kondisi jumlah partikel (N), volume (V), dan energi (E) konstan yang mewakili ensembel mikrokanonikal NVE dan memungkinkan pengamatan molekul yang berinteraksi dengan lingkungannya selama interval waktu yang telah ditentukan sebelumnya, biasanya dalam orde nanosekon (Molinelli, 2004).

Makromolekul (protein) memiliki range karakteristik pergerakan yang berbeda-beda.Tipe pergerakan makromolekul menggunakan metode DM menurut Becker Watanabe (2001) dapat dilihat pada tabel dibawah ini:

Tabel 1. Ringkasan Karakteristik Pergerakan dalam Protein

No Tipe Pergerakan

Contoh aplikasi

Skala waktu dan amplitudo

1.

2.

Pergerakan lokal

Fluktuasi atomik Pergerakan side chain

Pergerakan Skala Medium

Pergerakan loop Pergerakan Terminal- arm Pergerakan bidang

Fleksibilitas docking ligan Alur difusi temporal

Adaptasi konformasi sisi aktif Spesifitas ikatan

Femtosecond (fs) - picosecond (ps) (10 -15 -

10 -12 s); kurang dari 1Ǻ.

Nanosecond(ns) - microseconds(µs)

(10 -9 -10 -6 s); 1- 5 Ǻ.

commit to user

4.

Pergerakan domain Pergerakan sub-unit

Pergerakan Global

Transisi Helix-coil Asosiasi subunit folding/unfolding

bending

Aktivasi hormon Fungsionalitas protein

(10 -6 -10 -3 s); 5- 10 Ǻ.

Milliseconds (ms) - jam (10 -3 - 10 4 s); lebih dari

10 Ǻ.

8. Assisted Model Building with Energy Refinement (AMBER7)

(Case et al., 2002)

DM memiliki beberapa software utama, antara lain AMBER, CHARMM, dan GROMOS. AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement) merupakan kelompok medan gaya untuk biomolekul DM. Paket program AMBER7 terdiri dari 60 program yang beberapa di antaranya dideskripsikan sebagai berikut:

a. Antechamber Antechamber merupakan program yang mengotomatisasi proses pengembangan deskriptor-deskriptor force field khususnya untuk molekul- molekul organik. Antechamber dihidupkan dari masing-masing arsip PDB (format PDB ), arsip (‗prepin’) baru dengan format yang dapat dibaca dalam LEaP untuk digunakan dalam pemodelan molekuler. Deskripsi force field yang dibuat dirancang untuk sesuai dengan force field Amber yang biasa.

b. Parmchk Parmchk dibaca dalam suatu arsip ‗ac’ atau arsip input ‗prep’ sebagaimana suatu arsip force field . Parameter menuliskan arsip ‗frcmod’ untuk parameter-parameter yang hilang.

commit to user

parameter/topologi. Program tersebut meliputi editor molekuler yang memungkinkan pembuatan residu dan memanipulasi molekul.

d. Sander (Simulated Annealing with NMR-derived Energy Restraints)

Sander adalah program utama yang digunakan untuk simulasi DM. Program ini merelaksasi struktur dengan memindahkan atom-atom secara iteratif menurunkan gradien energi sampai gradien rata-rata yang cukup diperoleh. Porsi DM membentuk konfigurasi sistem dengan menggabungkan persamaan Newtonian tentang gerak. DM akan melakukan sampling ruang konfigurasional yang lebih banyak daripada minimisasi dan akan memungkinkan struktur untuk melewati halangan energi potensial yang kecil. Konfigurasi dapat disimpan pada interval tetap selama simulasi untuk analisis lebih lanjut, dan perhitungan energi bebas dasar menggunakan integrasi termodinamik dapat dilaksanakan.

e. Ptraj dan Carnal Ptraj dan Carnal merupakan program-program untuk menganalisa trajektori-trajektori DM, menghitung (misalnya Root Mean Square deviation dari struktur referen), analisis ikatan hidrogen, fungsi korelasi waktu, perilaku difusional, dan sebagainya (Molinelli, 2004).

1) RMSD (Root Mean Square Deviation) Pengukuran kesamaan diperlukan untuk perbandingan kuantitatif suatu struktur dengan lainnya. Kesamaan struktur biasanya diukur dengan root mean square deviation (RMSD) antara dua konformasi (Becker dan Watanabe., 2001).

RMSD menyediakan informasi apakah konformasi telah mencapai suatu keadaan yang stasioner. Deviasi masing-masing frame terhadap frame pertama dalam trajektori dihitung. Harga ini sangat berguna dalam mendekati sejauh mana struktur bergeser selama simulasi DM berjalan (Molinelli, 2004).

commit to user

Di mana N adalah jumlah atom, k adalah indeks atom, dan r (i)k ,r (ij)k adalah koordinat Cartesian dari atom k dalam konformasi i dan j. Harga minimum dari persamaan di atas diperoleh dengan superposisi optimal dari dua struktur (Becker, 2001).

2) B-factor B-factor adalah ukuran termal dari ketidaktentuan (luasan densitas elektron) untuk struktur sebagai factor fluktuasi suatu molekul. B-factor ini ditetapkan terhadap tiap-tiap atom dan dapat dihitung untuk tiap-tiap residu asam amino. Pergerakan termal paling besar biasanya ditemukan pada rantai samping dan loop (Esposito et al., 2006).

B-factor kristalografik dapat digunakan sebagai indikator mobilitas konformasional atau fleksibilitas protein. Analisis distribusi B-factor telah digunakan lebih awal untuk menganalisa karakteristik struktural dan fungsional protein (Kumar et al., 2009)

Fluktuasi atomik simulasi dapat diperkirakan dengan B-factor yang persamaannya sebagai berikut. 𝐵 𝑖 = 8 𝜋 2 3 < ∆𝑟 𝑖 > 2 (2.8.2)

Di mana Δr i adalah akar pangkat dua fluktuasi posisional atom (Karjiban, et al., 2009).

3) Struktur Protein dan Sudut Dihedral Backbone Protein David (2001) dalam buku Lehninger Principles of Biochemistry menjelaskan tentang protein. Protein adalah molekul besar yang komplekss, yang terdapat dalam semua sel. Pada dasarnya protein disusun oleh suatu rangkaian unit asam amino dengan struktur umum sebagai berikut:

commit to user

masing-masing asam amino (David et al., 2001) Dua puluh macam asam amino telah teridentifikasi dan dikelompokkan

sesuai dengan gugus R-nya sebagaimana ditunjukkan gambar 8.

Gambar 8. 20 asam amino protein yang dikelompokkan menurut gugus

fungsinya (David et al., 2001) Struktur protein menurut Jeremy (2007) terbagi dalam empat kategori, yaitu: struktur primer, sekunder, tertier, dan quartener sebagaimana ditunjukkan gambar 9.

commit to user

Gambar 9. Beberapa struktur protein berturut-turut dari kiri ke kanan adalah struktur primer, sekunder, tertier, dan quartener (Jeremy et al., 2007).

Struktur primer protein adalah beberapa asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida membentuk rantai polipepetida. Struktur sekunder protein yaitu rantai polipeptida yang dapat membentuk lipatan beberapa struktur regular seperti alpha helix, beta sheet, serta turn dan loop. Struktur tertier protein sendiri umumnya protein yang larut dalam air dan melipat dalam struktur yang padat dengan inti nonpolar. Struktur quartener disebut juga dengan protein multisubunit.

Dalam masalah prediksi struktur sekunder protein, inputnya adalah urutan dan outputnya adalah struktur yang diprediksikan (yang juga disebut konformasi, yang merupakan kombinasi dari alfa heliks, beta sheet , dan loop). Suatu protein yang khusus mengandung sekitar 32% alfa heliks, 21% beta sheet, dan 47% loop atau struktur non regular (Branden dan Tooze, 1991).

Gambar 10 menunjukkan suatu unit peptida. Polipeptida adalah suatu struktur tak bercabang dari sejumlah urutan asam amino yang terikat melalui ikatan-ikatan peptida. Satu unit asam amino dalam rantai polipeptida disebut residu. Rantai polipeptida dimulai pada ujung amino dan berakhir pada ujung karboksilnya (Branden dan Tooze, 1991).

commit to user

Gambar 10. Sudut dihedral psi (ψ) dan phi (Ф) pada backbone protein

(Arjunan et al., 2001).

Phi adalah sudut rotasi di sekitar ikatan N –C sedangkan psi merupakan sudut rotasi di sekitar ikatan C –C. Rotasi-rotasi menentukan masing-masing struktur protein (seperti alfa heliks, beta sheet, atau loop). Asam-asam amino yang berada di bagian dalam molekul protein adalah asam-asam amino golongan hidrofobik sedangkan asam-asam amino yang bersifat polar berada di permukaan protein dan biasanya memiliki urutan dan konformasi asam-asam amino yang sama, sehingga memiliki fungsi dan sifat-sifat yang sama pula (Arjunan et al., 2001).

Konfigurasi backbone protein sepenuhnya ditentukan oleh spesifikasi sudut dihedral Ф dan ψ. Korelasi sudut dihedral dalam protein asli dan terdenaturasi sangat penting karena mengandung sumber utama informasi dalam folding dan stabilitas protein (Keskin, 2004).

B. Kerangka Pemikiran

Studi tentang struktur dasar mutasi hotspot seringkali menyertakan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D. Struktur QMT p53 sering digunakan karena dinyatakan sebagai superstable mutan dan memiliki kemiripan dengan struktur normal p53. Berdasarkan kemiripan struktur dan stabilitas struktur yang tinggi, kedua molekul diduga memiliki dinamika konformasi yang sama. Hal ini berkaitan erat dengan fungsi p53 normal dalam berikatan dengan DNA . Permasalahan yang muncul disini adalah apakah benar kedua molekul tersebut tidak berbeda nyata satu sama lain.

commit to user

terhadap wt-p53 dan QMT p53 dikatakan tidak spesifik. Ketidakspesifikan penempelan PRIMA-1 ditandai dengan ditemukannya situs penempelan yang sama antara keduanya dan menghasilkan energi docking yang hampir sama antara keduanya sebelum dan sesudah docking lanjutan. Permasalahan yang muncul disini adalah belum ada pengamatan dinamika konformasi penempelan PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT p53 untuk menunjukkan kespesifikan penempelan PRIMA-

1. Permasalahan ada tidaknya perbedaan yang nyata antara molekul wt-p53

dan QMT p53, serta karakter kespesifikan PRIMA-1 menempel pada wt-p53 dan QMT p53 dapat diselesaikan dengan melihat dinamika konformasi wt-p53, QMT p53, dan kompleks PRIMA-1 dengan wt-p53 saja dengan asumsi ada kemiripan struktur antara wt-p53 dengan QMT p53. Pengamatan dinamika konformasi ketiga molekul tersebut dilakukan dengan simulasi dinamika molekuler (DM) program AMBER7 kurun waktu 5-9 ns.

C. Hipotesis

1. Dinamika konformasi QMT p53 tidak berbeda nyata dengan wt-p53 dengan asumsi adanya kemiripan struktur QMT p53 dan wt-p53.

2. Keberadaan PRIMA-1 pada wt-p53 di situs energi terendah memberikan pengaruh terhadap stabilitas konformasinya.

commit to user

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2009 sampai Desember 2009, bertempat di Laboratorium Kimia Dasar bagian Komputasi Kimia jurusan Kimia FMIPA UNS.

B. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan

1. Alat

Seperangkat komputer dengan spesifikasi : CPU berprosesor AMD Athlon (tm) 64 X2 Dual Core Processor 5200+, 2.60 GHz, RAM 4 GB, dan harddisk 2x250 GB. Perangkat lunak berupa program AMBER7 (Case, et al., 2002), program Molden (Klinsky et al., 2002), MATLAB7 (MathWorks, 2004), CHIMERA (Pettersen et al., 2004), dan VMD (Humphrey et al., 1996).

2. Bahan

Struktur p53 wild type pada manusia kode PDB = 1GZH (Derbyshire et al., 2002), quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D kode PDB = 1UOL (Joerger et al., 2004), dan PRIMA-1.

C. Prosedur Penelitian

1. Parameterisasi PRIMA-1

Parameterisasi PRIMA-1 dilakukan dengan mengambil terlebih dahulu struktur PRIMA-1 teroptimasi dari hasil penelitian Warsino (2008). Densitas elektron (Electrostatic Potensial/ESP) dihitung dengan GAUSSIAN98 (Frisch et al., 1995) metode ab initio pada level teori HF dan basis set 6-31G*. Populasi elektron dihitung dengan metode Mulliken. Arsip log yang dihasilkan kemudian diolah dengan program Antechamber dan parmchk dalam AMBER7 di mana di dalamnya terdapat RESP untuk metode penghitungannya. Hasilnya berupa arsip prep dan arsip frcmod sebagai template dan parameter ligan PRIMA-1 yang akan digunakan dalam proses selanjutnya.

commit to user

memperoleh probabilitas kondisi yang lain. Pada semua sistem ion Cl - sebagai counterion ditambahkan menggunakan modul XLEAP dalam AMBER7. Sistem kemudian disolvasi dengan penambahan eksplisit solvent berupa model air TIP3P (Jorgensen, et al., 1983) yang berupa sekumpulan molekul air yang berbentuk kotak yang melingkupi sistem dengan jarak antara sistem dan model air sebesar

12 Ǻ. Setelah itu, sistem tersebut disimpan dalam format arsip pdb (urutan atom dan posisinya), arsip prmtop (topologi sistem), dan arsip prmcrd (parameter sistem) yang nantinya akan digunakan dalam proses minimisasi, penyeimbangan, dan simulasi.

3. Minimisasi Sistem

Agar proses solvasi sempurna (yaitu jarak model air dekat dengan sistem), maka dilakukan minimisasi. Minimisasi sistem dilakukan sebanyak 500 step di mana tiap 100 step besarnya penahanan harmonik pada makromolekul dan counterion diubah. Pada 100 step pertama, besarnya penahanan harmonik pada

makromolekul dan counterion adalah sama-sama sebesar 25 kcal/mol -1 A -2 . Pada

100 step 2, besarnya penahanan harmonik pada makromolekul tetap 25 kcal/mol -

1 A -2 dan pada counterion hanya sebesar 20 kcal/mol -1 A -2 . Pada 100 step ketiga, besarnya penahanan harmonik pada makromolekul adalah 20 kcal/mol -1 A -2 dan

pada counterion hanya 15 kcal/mol -1 A -2 . Pada step keempat, besarnya penahanan harmonik pada makromolekul adalah 15 kcal/mol -1 A -2 dan pada counterion hanya sebesar 10 kcal/mol -1 A -2 . Pada step kelima, besarnya penahanan harmonik pada makromolekul adalah 10 kcal/mol -1 A -2 dan pada counterion hanya sebesar 5 kcal/mol -1 A -2 . Minimisasi ini akhirnya dilakukan tanpa adanya restraints.

4. Equilibrasi Sistem

Penyeimbangan dilakukan dengan pemanasan bertahap 50-300 K (sesuai suhu sistem yang sebenarnya) selama 200 ps di mana makromolekul dan posisi- posisi ion dijaga konstan dengan penahanan harmonik (harmonic restraint) 25

kcal/mol -1 A -2 . Penahanan harmonik berkurang 5 kcal/mol -1 A -2 setiap 5 ps selama

commit to user

5. Simulasi Sistem

Simulasi dijalankan pada temperatur konstan 300 K, tekanan 1 atm, 2 fs time step, SHAKE constraints 0,00005 Ǻ (mengabaikan vibrasi yang melibatkan atom hidrogen), nonbonded cutoff 9 Ǻ, dan 0,00001 untuk prosedur particle-mesh Ewald (PME) (Kawata et al., 2001) yang digunakan untuk menangani interaksi elektrostatik yang jangkauannya jauh (long-range electrostatic interactions). Informasi struktural dikumpulkan setiap 500 step (1 ps).

D. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang berupa trajektori hasil simulasi DM diolah dengan perangkat analisis yang terdapat dalam program AMBER7 (ptraj) dan program MATLAB7. Pengamatan awal dilakukan terhadap perubahan nilai RMSDnya. Faktor fluktuasi penyebab perubahan nilai RMSD dapat dicari melalui profil B-factornya. Program CHIMERA dan VMD digunakan untuk menampilkan data secara visual. Khususnya dinamika konformasi yang terjadi.

commit to user

A. Parameterisasi PRIMA-1

Fungsi parameterisasi PRIMA-1 adalah mendapatkan parameter- parameter PRIMA-1 yang diperlukan dalam proses minimisasi, equilibrasi, dan simulasi. Struktur PRIMA-1 diambil dari hasil penelitian Warsino (2008) sedangkan koordinat atom wt-p53 diambil dari data pdb (kode pdb : wt-p53). Koordinat hidrogen ditambahkan dengan program XLEAP dalam AMBER7. Muatan digambarkan sebagai RESP (Restrained ElectroStatic Potensial) dihitung dengan GAUSSIAN98 pada level teori HF/6-31G*. Hasil parameterisasi PRIMA-1 disajikan pada gambar 11 dan tabel 2 berikut.

Gambar 11. Struktur PRIMA-1

Terparameterisasi

Tabel 2. Kode atom, tipe atom, dan muatan PRIMA-1 yang diperoleh dengan RESP.

Kode atom

Tipe atom

Muatan

O1=O2

OH -0.652

H12=H15

HO 0.441

C8=C9

CT 0.096 H10=H11=H13=H14

H1 0.079 C5 CT

0.073 C1 C 0.601

O3

O -0.581 C2 CT

0.029 H5 HC 0.011

C3=C7

CT -0.115

C4=C6

CT -0.007

H1=H2=H6=H7

H1 0.094

N1

NT -0.552

H3=H4=H8=H9

HC 0.050

B. Hasil Simulasi

1. Perbandingan perilaku wild type p53 (wt-p53) dan quadruple mutan

M133L/V203A/N239Y/N268D (QMT)

Setelah minimisasi dan equilibrasi dilakukan, wt-p53 disimulasikan selama 9 ns sedangkan QMT disimulasikan dua kali masing-masing selama 5 ns. Hasil simulasi diolah dengan program analisis ptraj. Analisis yang pertama

commit to user