Sintesis turunan arilamida-2 dan uji aktivitas in vitro terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI
KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Benedictus Wisnu Putra Jati
NIM: 158114102
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI
KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Benedictus Wisnu Putra Jati
NIM: 158114102
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Barangsiapa Ingin Mutiara Harus Berani Terjun
di Lautan yang Dalam” (Ir. Soekarno)
“Sesungguhnya aku ini adalah Hamba Tuhan,
terjadilah padaku menurut perkataanMu itu” (St.
Perawan Maria) (Lukas 1:38)
Karya ini saya persembahkan kepada
Tuhan Yesus Kristus
Bapak, Ibu, dan Keluarga tercinta
Teman-teman dan sahabat
Teman-teman Farmasi Angkatan 2015
Dan Almamaterku Universitas Sanata Dharma
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
berkat dan rahmat-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-2 dan Uji
Aktivitas In Vitro Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai
Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun
sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt.
yang didanai oleh Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) 2017-2018 dengan
judul “Synthesis, enzymatic assay, and molecular modelling of purine derivatives
targeting hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 (PEX-9) in the
discovery of novel anti-breast cancer”.
Penulis juga ingin memberikan apresiasi yang besar kepada berbagai pihak
yang telah memberikan dukungan, bimbingan, dan bantuan dalam penyelesaian
naskah skripsi ini, tanpa mereka penulis tidak akan bisasampai pada tahap ini. Oleh
karena itu, peneliti ingin mengucapkan terimakasih yang besar kepada:
1.
Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2.
Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3.
Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang
telah membimbing tim penelitian dengan sabar, selalu memberikan perhatian,
semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir
penyusunan skripsi ini.
4.
Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. dan Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si.,
Apt. selaku dosen penguji yang selalu memberikan semangat, kritik, dan saran
yang membangun untuk penulis menyelesaikan skripsi ini.
5.
Bapak Christianus Heru Setiawan, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing
akademik yang selalu memberikan motivasi, semangat, dan perhatian untuk
kemajuan penulis.
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6.
Bapak Matius Abdullah Chaidir dan Ibu Gertruda Tri Teguh Rahayu, S.Pd.
yang selalu memberikan dukungan, motivasi, semangat, dan doa untuk
mendampingi penulis menyelesaikan skripsi ini.
7.
Teman-teman seperjuangan penelitian “Skripsi Kok Analog” Kevin, Krisna,
Ervan, Aldo, dan Sangga yang telah berjuang dan bekerja sama dengan penulis
melewati suka dan duka dalam menyelesaikan penelitian ini.
8.
Sahabat tercinta “Dolan Squad” dan “Quebec” Aldo, Krisna, Retha, Bulin,
Inge, dan Masrud yang telah menjalani bersama masa suka dan duka dalam
dunia perkuliahan dalam tiga setengah tahun ini.
9.
Teman dan keluarga Drug Discovery Research Group terutama para senior
Tito, Diana, dan Eko serta divisi penelitian dan pengembangan BEMF Farmasi
2017-2018 yang telah membantu penulis dalam penelitian ini.
10. Sahabat tercinta Almarhum Andreas Ardi Marwanto yang juga menjadi salah
satu motivasi penulis untuk masuk dalam dunia penemuan obat khususnya
kanker ini.
11. Aurel, Wanda, Laras, Rio, Echa, Dodo, Gilang, Ega, dan Vidan selaku sahabat
terbaik sejak kecil yang juga selalu hadir dalam jalinan persahabatan bersama
penulis.
12. Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo selaku laboran yang
selalu membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.
13. Teman-teman kelas FSM C 2015 dan Angkatan 2015 yang memberikan
dinamika dan kenangan yang indah selama masa perkuliahan di farmasi.
14. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu telah mendukung
penyelesaian naskah skrripsi ini.
Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam skripsi ini.
Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan masukan yang
membangun untuk perbaikan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat
bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan penelitian khususnya
dalam bidang farmasi penemuan obat. Terimakasih.
Yogyakarta, 30 januari 2019
Penulis
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL.......................................................................................
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................
HALAMAN PENGESAHAN .........................................................................
HALAMAN PERSEMBAHAN .....................................................................
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...........................................
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .........................................................
PRAKATA ......................................................................................................
DAFTAR ISI ...................................................................................................
DAFTAR TABEL ...........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................
ABSTRAK ......................................................................................................
ABSTRACT ....................................................................................................
PENDAHULUAN ..........................................................................................
METODE PENELITIAN ................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................
KESIMPULAN ...............................................................................................
SARAN ...........................................................................................................
UCAPAN TERIMAKASIH ............................................................................
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................
LAMPIRAN ....................................................................................................
BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................
ix
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
ix
x
xi
xii
xiii
xiv
1
4
7
18
18
19
20
23
32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I.
Tabel II.
Tabel III.
Tabel IV.
Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2 .......................
Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 .........................
Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 ........................
Hasil uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-2............
x
10
11
14
18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour
et al. 2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa
arilamida-2 ...................................................................................
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai
katalis nukleofil. ..........................................................................
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa turunan arilamida-2 ..............
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa turunan arilamida-2 .............
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b)
benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004) ........................
Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 ..
xi
3
8
10
13
15
16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan
arilamida-2 ................................................................................
Lampiran 2. Uji DAB-HCl ............................................................................
Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa
arilamida-2 ................................................................................
Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR ............................
Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak
senyawa arilamida-2 pada spektrometri massa ........................
Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro ............................
xii
23
25
26
27
30
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRAK
Enzim MMP-9 diekspresikan secara tinggi pada kanker payudara dengan
permasalahan, inhibitor yang telah dirancang untuk enzim tersebut bersifat tidak
selektif sehingga menyebabkan efek samping yang merugikan. Pada penelitian ini
telah disintesis senyawa arilamida-2 sebagai penghambat MMP-9 yang dirancang
lebih selektif dengan menghambat hemopexin domain MMP-9 (PEX-9). Senyawa
arilamida-2 berhasil disintesis dengan mereaksikan benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi
substitusi nukleofilik asil. Senyawa hasil sintesis dilakukan uji organoleptis,
kelarutan, titik lebur, dan warna dengan DAB-HCl. Produk yang terbentuk berupa
serbuk berwarna putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO. Titik lebur
senyawa hasil sintesis adalah 116-124oC yang bereaksi negatif terhadap DAB-HCl
mengindikasikan gugus amina primer dari benzokain sudah tersubstitusi. Senyawa
hasil sintesis dipastikan strukturnya dengan menggunakan 1H-NMR, 13C-NMR,
FTIR, dan GC-MS. Spektrum 1H-NMR menunjukan proton etilen pada geseran
kimia 2-4 ppm dan karbon etilen pada 20-40 ppm untuk 13C-NMR. Gugus karbonil
amida dideteksi dengan FTIR muncul pada 1535 cm-1 sementara bobot molekul
senyawa hasil sintesis dideteksi dengan MS sebesar m/z 299. Hasil uji aktivitas in
vitro terhadap enzim MMP-9 menunjukan persentase penghambatan enzim MMP9 sebesar 36% yang berasosiasi dengan aktivitas rendah-sedang senyawa arilamida2 sebagai inhibitor MMP-9.
Kata kunci : Arilamida-2, kanker payudara, MMP-9, PEX-9, uji aktivitas in vitro
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
MMP-9 is highly expressed in breast cancer with the major issue, the
inhibitor which has been designed for the corresponding enzyme having nonselective properties, therefore this causes some adverse drug reactions. In this study,
it has been synthesized arylamide-2 as MMP-9 inhibitor which is designed to be
more selective by inhibiting hemopexin domain of MMP-9 (PEX-9). Arylamide-2
was successfully synthesized by reacting benzocaine and 3-bromopropionyl
chloride using pyridine as the catalyst through the mechanism of acyl nucleophilic
substitution reactions. Synthesized compound was carried out by an organoleptic,
solubility, melting point, and color with DAB-HCl test. The product was formed as
a white powder which is soluble in ethyl acetate, chloroform, and DMSO. The
melting point of the synthetic product was measured at 116-124oC, while negatively
reacting with DAB-HCl indicating that primary amine has been substituted. The
synthesized compound structure was confirmed using 1H-NMR by showing
ethylene proton at 2-4 ppm whereas the ethylene-carbon appears at 20-40 ppm as
confirmed by 13C-NMR. The amide carbonyl group was indicated at 1535 cm-1 as
confirmed by FTIR while the molecular weight was detected using GC-MS by
showing m/z 299. The result showed that arylamide-2 was able to inhibit MMP-9
with percentage inhibition of 36% at 200 µg/ml concentration associating with its
potency as weak to moderate inhibitor of MMP-9 in searching of anti-breast cancer
candidate.
Keyword: Arylamide-2, breast cancer, MMP-9, PEX-9, in vitro activity bioassay
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit kedua penyebab utama kematian di dunia. Pada
tahun 2018, terdapat 18,1 juta kasus kanker baru di dunia. Kanker payudara
merupakan kasus yang paling sering terjadi pada wanita (World Health
Organization, 2018). Pada tahun 2013, kanker payudara merupakan salah satu
kanker dengan prevalensi tertinggi di Indonesia yaitu sebesar 0,5%. Daerah
Istimewa Yogyakarta merupakan provinsi dengan prevalensi kanker payudara
tertinggi yaitu sebesar 2,4% (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Menurut World
Health Organization (2014), kematian akibat kanker payudara pada wanita di
Indonesia cukup tinggi yaitu sebesar 21,4%.
Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak
normal dan tidak teratur yang disebabkan oleh mutasi genetik serta dapat
mengalami invasi dan penyebaran sel dari satu bagian tubuh ke bagian tubuh yang
lain. Metastasis menjadi penyebab utama kematian pada penderita kanker
(Pecorino, 2012). Menurut American Cancer Society (2018) metastasis sel kanker
ke organ-organ viseral seperti pankreas, kolon, dan paru-paru merupakan hal yang
paling membahayakan nyawa dengan memperpendek harapan hidup kurang dari 5
tahun pada 20% penderita kanker secara umum. Lebih daripada itu, metastasis
menyebabkan kematian pada 90% penderita kanker (Alford, 2017).
Pada tahun 2014, menurut penelitian yang dilakukan Yousef et al. (2014)
enzim Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) diekspresikan tinggi pada sel kanker
payudara dibandingkan dengan sel payudara normal. Selain itu, ditemukan
overexpression MMP-9 pada kanker payudara jenis triple-negative dan Human
Epidermal Receptor Growth Factor Receptor 2 positive (HER 2-positive). Merdad
et al., (2014) juga mengemukakan bahwa MMP-9 diekspresikan tinggi pada 97,5
% penderita kanker payudara Infiltrating Ductal Carcinoma (IDC), serta pada 5262% penderita kanker payudara Human Epidermal Receptor (HER).
Enzim MMP-9 merupakan salah satu peptidase yang termasuk dalam
subfamilia dari enzim matrix metalloproteinase (MMP). MMP merupakan enzim
jenis zinc-dependent endopeptidase yang bekerja dengan mendegradasi protein
extracellular matrix (ECM). Di dalam tubuh manusia terdapat 23 jenis enzim MMP
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
yang diklasifikasikan kedalam 6 jenis subfamilia MMP berdasarkan spesifitasnya
terhadap substrat (collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, enamelysin,
membrane type MMPs) (Benson et al., 2013). MMP-9 tergolong ke dalam
subfamilia MMP gelatinase B karena substratnya adalah gelatin. Degradasi ECM
oleh MMP-9 sangat penting pada proses kanker untuk memicu proses angiogenesis
dan metastasis sel kanker yang dapat bermigrasi ke daerah tubuh yang lain
(Stankovic et al., 2010).
Melihat pentingnya peran enzim MMP pada kanker, beberapa industri
farmasi telah merancang beberapa obat yang memiliki sifat penghambatan pada
MMP (MMP inhibitors) yang diharapkan mampu menjadi salah satu terapi kanker.
Namun, sebagian besar obat tersebut gagal melewati uji klinis karena kurang
selektif sehingga menimbulkan efek samping yang besar. Sebagai contoh,
marimastat menimbulkan efek samping berupa nyeri muskoskeletal dan inflamasi
(Cathcart et al., 2015). Sebagian besar MMP memiliki struktur genomik yang sama
yaitu propeptide region, catalytic domain, linker peptide (hinge region), dan
hemopexin domain (Nagase et al., 2006). Kegagalan MMP inhibitors tersebut
karena sebagian besar obat yang telah dirancang sebagai MMP inhibitor memiliki
spesifisitas yang rendah (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Hal ini disebabkan
obat-obat tersebut mentargetkan catalytic domain yang memiliki persamaan
sekuens asam-asam amino (homologi) yang tinggi pada sebagian besar MMP (4365%) (Dufour et al., 2011).
Hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) memiliki perbedaan sekuens asam
amino dengan MMP yang lain dengan homologi sebesar 25-35% (Dufour et al.,
2011) yang menyebabkan masing-masing MMP spesifik terhadap substrat,
sehingga dapat dijadikan target untuk merancang MMP inhibitor yang selektif
(Piccard et al., 2007). Studi hemopexin domain pada MMP-9 (PEX-9) diperlukan
untuk pengembangan senyawa-senyawa yang lebih selektif. Alford et al. (2017)
telah melakukan penelitian terhadap PEX-9 dengan penemuan dan sintesis 14
senyawa aktif secara in silico dan in vitro. Senyawa yang paling aktif adalah
senyawa 3c dengan Kd = 320 nM. Penelitian Alford et al. (2017) tersebut
dilatarbelakangi oleh penelitian Dufour et al. (2011) yang sebelumnya telah
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
melakukan penelitian tentang PEX-9 dan menemukan 5 senyawa aktif berdasarkan
penapisan virtual dengan metode in silico, uji in vitro, dan uji in vivo pada tikus
yang telah diinduksi dengan sel kanker MDA-MDB 435 sehingga mengalami
karsinogenesis.
Senyawa
yang
paling
aktif
adalah
CID135415473
www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov yang dinamakan senyawa 2 dengan Kd = 2,2 μM.
Senyawa tersebut memiliki struktur relatif sederhana untuk disintesis sehingga
berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut. Gugus yang berperan dalam aktivitas
penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang memiliki interaksi dengan pocket
blade PEX-9 dan juga memiliki arilamida yang terhubung oleh rantai alkil untuk
berinteraksi di daerah permukaan pocket. Gambar 1(a) dan 1(b) menunjukkan
struktur senyawa 2 yang ditemukan oleh Dufour et al. (2011) dan Alford et al.
(2011).
Gugus arilamida
Cincin planar
Rantai alkil
(a)
Gugus difluorometoksi
Gugus arilamida
Rantai alkil
Gugus Fluoro
Cincin planar
(b)
Gugus ester etil benzoat
Rantai alkil
Gugus arilamida
(c)
Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour et al.
2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa arilamida-2.
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pada penelitian kali ini telah disintesis senyawa fragmen dari senyawa 2
dengan mengambil sebagian farmakofor yang penting, yang akan diberi nama
turunan arilamida-2. Farmakofor yang diadaptasi untuk disintesis ialah gugus
arilamida dan rantai alkil. Selain itu juga dilakukan modifikasi pada posisi para dari
cincin arilamida yaitu berupa ester etil benzoat. Struktur senyawa turunan
arilamida-2 dapat dilihat pada gambar 1(c). Senyawa akan disintesis dengan
mereaksikan benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin
melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Kemudian senyawa
turunan arilamda-2 tersebut akan diuji aktivitasnya terhadap enzim MMP-9 secara
in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat menambah jumlah senyawa penghambat
PEX-9 yang diharapkan aktif dan selektif sebagai kandidat anti-kanker payudara.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian kecuali dinyatakan lain
bermutu analisis yang disuplai dari Sigma Aldrich dan Merck. Bahan-bahan untuk
sintesis meliputi: benzokain mutu farmasetis (ethyl 4-aminobenzoate), 3bromopropionil klorida mutu pro analisis, piridin mutu pro analisis, natrium
karbonat mutu teknis (Na2CO3), plat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel GF254,
pelarut organik sebagai fase gerak (n-heksana dan etil asetat) mutu pro analisis, dan
4-dimetilano benzaldehid HCl (DAB-HCl) mutu pro analisis. Bahan-bahan untuk
elusidasi struktur meliputi: pellet kalium bromide mutu pro analisis untuk FTIR dan
pelarut kloroform-D (CDCl3) pro analisis untuk NMR. Bahan-bahan untuk uji
aktivitas in vitro bermutu pro analisis meliputi: Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim
MMP-9 terliofilisasi, substrat peptide, dapar, peptida NNGH sebagai kontrol
positif, gliserol untuk rekonstitusi enzim, dan dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai
pelarut sampel.
Alat
Pada tahap sintesis alat-alat yang digunakan meliputi: timbangan analitik
(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
GmbH + Co.KG), labu alas bulat (pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas,
drupple plate, seperangkat alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), lampu UV254, dan
alat gelas pada umumnya. Ala-alat yang digunakan pada elusidasi struktur meliputi:
kromatografi gas-spektrofotometer inframerah (GC-MS-QP2010S SHIMADZU),
spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 700 MHz dan 176 MHz), dan
spektrometer massa. Alat-alat untuk uji in vitro meliputi: pipet mikro (Eppendorf),
micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, ELISA Tecan Infinite 200 PRO
microplate reader fluorescence.
Prosedur Penelitian
Sintesis Senyawa Arilamida-2 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)
Dalam labu alas bulat dimasukkan benzokain sebanyak 3,59 mmol (0,59 g)
kemudian ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 3,59 mmol (0,28 g ;
0,29 mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar. 3-bromopropionil
klorida ditambahkan tetes demi tetes sebanyak sebanyak 4,00 mmol (0,41 mL).
Campuran diaduk kembali selama 30 menit hingga tebentuk padatan. Padatan
disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% dan dicuci dengan akuades
untuk menghilangkan sisa piridin, NaCl, dan CO2 sebagai produk samping. Serbuk
hasil sintesis kemudian dihitung rendemennya.
Uji Organoleptis
Senyawa hasil sintesis dideterminasi bentuk dan warnanya.
Uji Kelarutan
Senyawa hasil sintesis diletakkan pada tabung reaksi kemudian ditetesi
perlahan-lahan dengan kloroform, etil asetat, DMSO, etanol, air, n-heksana, dan
aseton hingga larut dan ditentukan kategori kelarutannya berdasarkan Farmakope
Indonesia V.
Rekristalisasi
Senyawa hasil sintesis ditetesi perlahan-lahan hingga tepat larut
menggunakan pelarut kloroform dan diuapkan perlahan-lahan hingga terbentuk
kristal.
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji Warna dengan DAB-HCl
Senyawa hasil sintesis diletakan di drupple plate kemudian ditetesi DABHCl. Perubahan warna dilihat dan dibandingkan dengan benzokain.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Serbuk hasil sintesis diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan tiga
sistem fase gerak hasil orientasi yaitu n-heksana: etil asetat 1:3; 2:2; 3:1 (diadaptasi
dari metode Adhipandito, 2017) dan didapat fase gerak dengan pemisahan terbaik
yaitu n-heksana: etil asetat 3:1. Serbuk hasil sintesis dilarutkan dalam etil asetat dan
ditotolkan pada fase diam plat silika gel GF254 kemudian dieluasi dengan fase gerak
terpilih. Bercak dideteksi dibawah lampu UV254.
Uji Titik Lebur
Senyawa hasil sintesis dimasukan kedalam pipa kapiler kemudian
dimasukan ke dalam alat pengukur titik lebur. Suhu diatur 85-150oC kemudian
senyawa diamati suhu saat pertama kali melebur hingga semua habis. Jarak lebur
didokumentasikan.
Elusidasi Struktur
Senyawa hasil sintesis dielusidasi strukturnya menggunakan NMR, FTIR,
dan GC-MS yang dilakukan di Fakultas MIPA UGM, Sleman, DIY dan Institut
Farmasetikal dan Nutrasetikal, Malaysia dengan metode standar yang sudah
dilakukan di masing-masing tempat tersebut.
Uji aktivitas in vitro
Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat
fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based MMP-9, dapar uji MMP-9,
dan NNGH inhibitor sebagai kontrol positif yang didapatkan dari Biovision. Enzim
yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µ L gliserol 30% dalam deionised
water. Enzim yang sudah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap
digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan
dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µ g/mL di dalam 96-microwell plate.
Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Setiap well berisi 44
µL dapar untuk uji senyawa hasil sintesis dan 45 µL dapar untuk kontrol negatif, 1
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
µL senyawa hasil sintesis, 5 µL enzim, dan 50 µL substrat, desain well plate untuk
uji in vitro dapat dilihat pada lampiran 6. Sampel dicampurkan dengan buffer dan
enzim dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Substrat (40 µM) sebanyak
50 µL ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diinkubasi kembali pada suhu
37ºC selama 60 menit. Fluorosensi dibaca menggunakan ELISA Tecan Infinite 200
PRO microplate reader fluorescence dengan panjang gelombang eksitasi 325 nm
dan emisi 393 nm dan dihitung persentase penghambatan enzim MMP-9 dengan
rumus:
1−
𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑠𝑖𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
𝑥 100%
𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa arilamida-2 disintesis dengan farmakofor cincin arilamida yang
dihubungkan oleh rantai alkil. Penelitian ini akan mengeksplorasi gugus para cincin
arilamida yaitu OCF2 pada senyawa 2 yang memiliki karakteristik electron
donating group (EDG) pada gugus OC-R dan electron withdrawing group (EWG)
pada gugus difluoro dengan penambahan gugus ester etil benzoat. Gugus ester etil
bezoat mewakili karakter gugus electron withdrawing group (EWG).
Sintesis Senyawa Arilamida-2
Metode sintesis senyawa arilamida-2 pada penelitian ini mengadaptasi dari
metode Arifiyanto (2001). Bamane et al. (2011). White et al. (2012). Reaksi yang
terjadi pada proses sintesis turunan arilamida-2 adalah substitusi nukleofilik asil
antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin
(Montalbetti et al., 2005). Reaksi ini berlangsung antara gugus nukleofil NH2 pada
benzokain menggantikan gugus pergi -Cl yang berikatan dengan gugus karbon asil
pada 3-bromopropionil klorida (McMurry, 2016). Produk utama yaitu senyawa
arilamida-2 dan produk samping reaksi berupa asam klorida (HCl). Mekanisme
reaksi disajikan pada gambar 2.
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil.
Reaksi berlangsung selama 30 menit hingga terbentuk produk yang diduga
arilamida-2. Hal ini dibuktikan dengan nilai Rf pada profil KLT untuk benzokain
sebesar 0,62 dan senyawa yang diduga arilamida-2 sebesar 0,36 dengan fase gerak
n-heksana: etil asetat (3:1) yang disajikan pada Lampiran 1a menunjukkan hasil
sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan awal sintesis (benzokain).
Produk awal hasil sintesis yang dihasilkan berupa padatan berwarna putih disajikan
pada Lampiran 1b. Produk awal sintesis dinetralkan dan dilakukan pencucian
dengan Na2CO3 dan akuades untuk menghilangkan NaCl, CO2 dan sisa piridin, pH
yang diukur setelah pencucian adalah 7. Senyawa hasil sintesis setelah pencucian
dan pengeringan berbentuk serbuk dan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1c.
Hasil rendemen dari senyawa arilamida-2 sebanyak 81,48%, yang
perhitungan rendemennya disajikan pada lampiran 3. Rendemen yang dihasilkan
cukup tinggi karena sebagian besar 3-bromopropionil klorida hampir habis bereaksi
dengan benzokain. Hal ini dikarenakan gugus klorida pada 3-bromopropionil
klorida merupakan gugus pergi yang baik (Zhang et al., 2009) dan piridin mampu
mengkatalisis reaksi dengan baik (Montalbetti et al., 2005), sehingga memudahkan
serangan nukleofilik yang dilakukan oleh benzokain. Rekristalisasi serbuk hasil
sintesis menggunakan pelarut kloroform, namun dilakukan setelah pengujian titik
lebur. Rekristalisasi pada senyawa hasil sintesis berhasil dilakukan karena
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kloroform memiliki titik didih yang rendah yaitu sebesar 62oC (Pubchem, 2019)
sehingga mudah menguap sempurna (volatile).
Uji warna dengan reagen DAB-HCl pada hasil sintesis ditujukan untuk
memastikan senyawa arilamida-2 telah terbentuk. Senyawa dengan gugus amina
primer akan bereaksi dengan DAB-HCl membentuk basa Schiff yang berwarna
jingga, sedangkan yang tidak memiliki gugus amina primer tidak akan bereaksi
(Adegoke, 2011). Senyawa arilamida-2 tidak bereaksi dengan DAB-HCl
membentuk warna jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi
menjadi amida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan benzokain disajikan pada
Lampiran 2a, sedangkan hasil uji warna berupa produk warna jingga disajikan pada
Lampiran 2b.
Senyawa arilamida-2 dilakukan uji titik lebur yang bertujuan untuk melihat
kemurnian dengan membandingkan titik lebur dari senyawa hasil sintesis (produk)
dan bahan awal (benzokain). Hasil yang diperoleh pada penelitian 3 kali replikasi
yaitu pada rentang titik lebur di antara 119-127ºC, 114-124 ºC, dan 116-122 ºC
dengan rata-rata 116-124oC. Senyawa dikatakan murni secara titik lebur jika
memiliki rentang lebur sebesar 0,5-1,5oC (Mohrig et al., 2014). Hasil tersebut
berbeda dengan benzokain yang memiliki titik lebur 88-90ºC (Sigma Aldrich,
2019). Hasil uji titik lebur menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis belum murni
secara titik lebur. Hal ini dapat diatasi dengan pemurnian menggunakkan
kromatografi kolom, KLT preparatif, dan rekristalisasi. Rekristalisasi sudah
dilakukan namun karena keterbatasan alat uji titik lebur belum dapat dilakukan.
Selain uji organoleptis, warna, dan titik lebur, uji kelarutan juga dilakukan terutama
untuk menentukan pelarut yang akan digunakan dalam spektroskopi. Hasil uji
kelarutan senyawa arilamida-2 ditunjukkan pada Tabel I. Berdasarkan hasil uji
kelarutan, senyawa hasil sintesis larut dalam kloroform, etil asetat, dan DMSO
sehingga memiliki sifat kelarutan semi polar.
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2
Pelarut
Senyawa Arilamida-2
Perbandingan Kategori
Kelarutan FI V
n-heksana
Kloroform
Etil asetat
Aseton
Etanol
Air
DMSO
sangat sukar larut
larut
larut
agak sukar larut
agak sukar larut
sangat sukar larut
larut
1: 1000
1:30
1:20
1:60
1:100
1:1000
1:30
Elusidasi Struktur
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti
Elusidasi struktur dilakukan dengan pelarut kloroform berdasarkan hasil uji
kelarutan yang dilakukan terhadap senyawa hasil sintesis. Selain itu, kloroform juga
tidak akan mengganggu pada pembacaan sinyal karena sinyal senyawa diprediksi
berbeda dengan sinyal kloroform. Spektrum 1H-NMR disajikan pada Gambar 3.
Y
X
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
Proton
Geseran
kimia (ppm)
Integrasi
Splitting
HA
HB
1,39
2,85 dan 2,98
3
2
HC
3,71 dan 3,89
2
HD
HE
HF
Pelarut (X)
H2O (Y)
4,30
7,61
8,02
7,26
1,60
2
2
2
-
triplet
triplet of
triplet
triplet of
triplet
quartet
doublet
doublet
singlet
singlet
J Coupling
Constant
(Hz)
7,7
6,3 dan 6,3
6,3 dan 6,3
7,7
7,7
7
-
Sinyal pada geseran kimia 1,39 ppm (integrasi 3) (J = 7,7 Hz) merupakan
sinyal dari proton HA. Integrasi menunjukkan jumlah proton pada atom yang
dikenai gelombang radio. Integrasi yang muncul sudah sesuai dengan teori karena
jumlah proton pada HA berjumlah 3. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan
teori hukum pencacahan proton yaitu n+1 dengan n adalah jumlah proton tetangga
yang tidak ekivalen secara kimia, sehingga sinyal yang muncul berupa triplet
karena memiliki dua proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda.
Perbesaran sinyal HA disajikan pada Lampiran 4a.
Sinyal pada geseran kimia 2,85 ppm (intergrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,98 (J=
6,3 Hz) ppm merupakan sinyal dari proton HB, sedangkan geseran kimia 3,71 ppm
(integrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,89 ppm (J= 6,3 Hz) merupakan sinyal dari proton
HC. Kedua sinyal tersebut menunjukkan proton pada rantai etilen yang fleksibel dan
seharusnya muncul sebagai triplet. Namun, hasil percobaan berupa triplet of triplet.
Hal ini dapat disebabkan oleh proton pada etilen bersifat free rotatable sehingga
pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama memiliki
lingkungan kimia yang berbeda, hal ini menyebabkan setiap proton mengenali
tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua triplet. Kejadian ini dipastikan
dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan 2 proton. Proton HC
memiliki geseran kimia yang lebih jauh dari proton HB karena berdekatan dengan
gugus halogen (Br) yang lebih bersifat elektronegatif (menarik elektron kulit
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
terluarnya) daripada gugus karbonil amida yang berdekatan dengan HB sehingga
membuat HC kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) (Anderson,
2004). Perbesaran sinyal HB dan HC disajikan pada Lampiran 4b dan 4c.
Sinyal pada geseran kimia sekitar 4,30 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz)
merupakan sinyal dari proton HD. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan
teori yaitu muncul berupa quartet karena memiliki tiga proton tetangga pada
lingkungan kimia yang berbeda. Geseran kimia proton HD bergeser pada ppm yang
lebih jauh daripada proton HA yang merupakan proton tetangganya karena proton
HD berikatan langsung dengan atom O yang elektronegatif sehingga cenderung
menarik elektron atom C pada HD dan membuat HD kurang terlindungi dari medan
magnet luar (de-shielded) serta mengubah orientasi spin-nya untuk bergeser pada
ppm yang lebih jauh. Perbesaran sinyal HD disajikan pada Lampiran 4d.
Sinyal pada geseran kimia 7,00 – 9,00 ppm merupakan daerah proton
aromatik (Silverstein et al., 2005). Sinyal yang muncul pada geseran kimia tersebut
adalah dua sinyal berbeda, yaitu pada geseran kimia sekitar 7,61 ppm dan 8,02 ppm.
Perbesaran pada geseran kimia tersebut ditunjukkan pada Lampiran 4e dan 4f.
Sinyal pada geseran kimia 7,61 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan proton
HE, sedangkan sinyal 8,02 ppm, (integrasi 2) (J= 7 Hz) merupakan proton HF.
Proton HE lebih terlindungi (shielded) daripada proton HF karena berada di
lingkungan kimia dekat dengan gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih
rendah daripada gugus C=O karbonil yang dekat dengan proton HF (Anderson,
2004). Sinyal yang muncul pada kedua proton tersebut sudah sesuai dengan teori
yaitu berupa sinyal doublet karena hanya memiliki satu proton tetangga pada
lingkungan kimia berbeda. Pada geseran 7,26 pm merupakan sinyal X yaitu sinyal
dari pelarut kloroform sedangkan sinyal Y geseran kimia 1,60 ppm yang merupakan
sinyal H2O (Fulmer et al., 2010).
Kemudian dilakukan juga uji 13C-NMR dan hasilnya disajikan pada Gambar
4. Hasil 13C-NMR memuat hanya informasi geseran kimia atom C dengan isotop
13 karena kelimpahan isotop
13
C yang rendah di alam (1,1%) (Anderson, 2004).
Berdasarkan hasil percobaan, geseran kimia pada 20,0-40,0 ppm (Vollhardt dan
Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C alkil bromida, hal ini sudah sesuai
12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan hasil penelitian yaitu pada daerah tersebut terdapat 1 sinyal pada geseran
kimia 39,6 ppm menunjukkan atom CC pada rantai alkil (gugus etilen). Sementara
atom CB pada geseran kimia 26,7 ppm merupakan C etilen (alkil sekunder) yang
sesuai dengan hasil empiris terletak pada daerah geseran kimia 20,0-30,0 ppm
(Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CB lebih terlindungi daripada CC karena atom
CC berikatan dengan atom Br yang merupakan penarik elektron yang lebih kuat
daripada gugus karbonil (C=O) amida yang berikatan dengan atom CB. Geseran
kimia pada 5,0-20,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari
atom C metil (alkil primer), hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian bahwa pada
geseran kima tersebut muncul 1 sinyal yang menunjukan atom CA dari rantai etil
ester pada 14,4 ppm. Sementara CD pada sinyal 60,9 ppm merupakan atom C yang
berikatan langsung dengan atom O ester yang sesuai berdasarkan hasil empiris
muncul pada geseran kimia 50,0-90,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CA
lebih terlindungi daripada atom CD karena atom CD berikatan langsung dengan atom
O ester yang merupakan gugus penarik elektron.
X
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Geseran kimia 110,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) adalah
rentang atom-atom C pada cincin benzena. Hal ini sudah sesuai dengan hasil
penelitian yang menunjukan geseran kimia pada rentang tersebut dengan
munculnya 4 sinyal yaitu 118,9 ppm, 126,4 ppm, 130,9 ppm, dan 141,5 ppm yang
berkorespondensi dengan atom CE, CF, CG, dan CH pada cincin arilamida. Atom CE
13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
lebih terlindungi daripada atom CG karena posisi CE lebih dekat pada gugus NH
yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada C=O ester yang dekat
dengan atom CE (Anderson, 2004). Atom CH lebih tidak terlindung daripada CF
diduga akibat CH berikatan langsung dengan NH dan C=O amida yang merupakan
gugus elektronegatif, sedangkan CF tidak berikatan langsung dengan atom O
karbonil yang elektronegatif sehingga masih terlindungi oleh ikatan dengan atom C
karbonil (Anderson, 2004). Geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al.,
2005) ppm merupakan rentang dari atom C karbonil amida dan ester. Hasil
penelitian menunjukan hasil yang sesuai yaitu terdapat dua sinyal atom CI ester dan
CJ amida pada geseran kimia 166,1 ppm dan 167,9 ppm. Sinyal X pada geseran
kimia 77,0 ppm merupakan sinyal dari pelarut kloroforom (Fulmer et al., 2010).
Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Karbon
Geseran kimia (ppm)
CA
CB
CC
CD
CE
CF
CG
CH
CI
CJ
Pelarut (X)
14,4
26,7
39,6
60,9
118,9
126,4
130,9
141,5
166,1
167,9
77
Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi
struktur
dilanjutkan
dengan
menggunakan
instrumen
spektrofotometer inframerah. Tujuan elusidasi struktur dengan spektrofotometer
inframerah adalah untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional pada senyawa
hasil sintesis. Gugus fungsional yang memiliki momen dipol yang tinggi sangat
efektif menyerap radiasi inframerah sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi
baik secara mengulur (stretching) dan menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil
elusidasi struktur senyawa hasil sintesis serta perbandingannya dengan bahan awal
(benzokain) dan keberadaan gugus fungsionalnya pada spektroskopi IR disajikan
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pada gambar 5. Berdasarkan spektrum inframerah yang dihasilkan, terdapat pita
pada bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukan gugus C karbonil (C=O).
C=O tersebut merupakan C=O amida pada 1535 cm-1, sedangkan pada 1689 cm-1
menunjukan C=O ester. Keberadaan gugus C=O amida tersebut diperkuat dengan
adanya pita kembar yang satu ujungnya melebar pada daerah 3371 cm-1 dan 3464
cm-1 yang diduga merupakan gugus NH amida. Senyawa hasil sintesis diprediksi
sudah terbentuk dengan dukungan daerah sidik jari pada 500-1500 cm-1 yang sudah
berbeda dengan benzokain sebagai bahan awal sintesis.
daerah
sidik jari
HN-C=O
R-O-C=O
C=O
(a)
daerah
sidik jari
(b)
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain
(diadaptasi dari Anderson et al., 2004)
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
Senyawa dielusidasi struktur dengan menggunakan kromatografi gasspektrometer massa yang bertujuan untuk menentukan bobot molekul dari senyawa
baru hasil sintesis (Anderson, 2004). Kromatografi gas bertujuan untuk memastikan
kemurnian senyawa hasil sintesis, ditandai dengan hasil kromatogram satu puncak.
Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis karena berdasarkan sifat
fisika kimia senyawa dari hasil uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil
sintesis
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI
KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Benedictus Wisnu Putra Jati
NIM: 158114102
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO
TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI
KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Benedictus Wisnu Putra Jati
NIM: 158114102
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Barangsiapa Ingin Mutiara Harus Berani Terjun
di Lautan yang Dalam” (Ir. Soekarno)
“Sesungguhnya aku ini adalah Hamba Tuhan,
terjadilah padaku menurut perkataanMu itu” (St.
Perawan Maria) (Lukas 1:38)
Karya ini saya persembahkan kepada
Tuhan Yesus Kristus
Bapak, Ibu, dan Keluarga tercinta
Teman-teman dan sahabat
Teman-teman Farmasi Angkatan 2015
Dan Almamaterku Universitas Sanata Dharma
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
berkat dan rahmat-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-2 dan Uji
Aktivitas In Vitro Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai
Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun
sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt.
yang didanai oleh Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) 2017-2018 dengan
judul “Synthesis, enzymatic assay, and molecular modelling of purine derivatives
targeting hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 (PEX-9) in the
discovery of novel anti-breast cancer”.
Penulis juga ingin memberikan apresiasi yang besar kepada berbagai pihak
yang telah memberikan dukungan, bimbingan, dan bantuan dalam penyelesaian
naskah skripsi ini, tanpa mereka penulis tidak akan bisasampai pada tahap ini. Oleh
karena itu, peneliti ingin mengucapkan terimakasih yang besar kepada:
1.
Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2.
Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3.
Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang
telah membimbing tim penelitian dengan sabar, selalu memberikan perhatian,
semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir
penyusunan skripsi ini.
4.
Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. dan Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si.,
Apt. selaku dosen penguji yang selalu memberikan semangat, kritik, dan saran
yang membangun untuk penulis menyelesaikan skripsi ini.
5.
Bapak Christianus Heru Setiawan, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing
akademik yang selalu memberikan motivasi, semangat, dan perhatian untuk
kemajuan penulis.
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6.
Bapak Matius Abdullah Chaidir dan Ibu Gertruda Tri Teguh Rahayu, S.Pd.
yang selalu memberikan dukungan, motivasi, semangat, dan doa untuk
mendampingi penulis menyelesaikan skripsi ini.
7.
Teman-teman seperjuangan penelitian “Skripsi Kok Analog” Kevin, Krisna,
Ervan, Aldo, dan Sangga yang telah berjuang dan bekerja sama dengan penulis
melewati suka dan duka dalam menyelesaikan penelitian ini.
8.
Sahabat tercinta “Dolan Squad” dan “Quebec” Aldo, Krisna, Retha, Bulin,
Inge, dan Masrud yang telah menjalani bersama masa suka dan duka dalam
dunia perkuliahan dalam tiga setengah tahun ini.
9.
Teman dan keluarga Drug Discovery Research Group terutama para senior
Tito, Diana, dan Eko serta divisi penelitian dan pengembangan BEMF Farmasi
2017-2018 yang telah membantu penulis dalam penelitian ini.
10. Sahabat tercinta Almarhum Andreas Ardi Marwanto yang juga menjadi salah
satu motivasi penulis untuk masuk dalam dunia penemuan obat khususnya
kanker ini.
11. Aurel, Wanda, Laras, Rio, Echa, Dodo, Gilang, Ega, dan Vidan selaku sahabat
terbaik sejak kecil yang juga selalu hadir dalam jalinan persahabatan bersama
penulis.
12. Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo selaku laboran yang
selalu membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian.
13. Teman-teman kelas FSM C 2015 dan Angkatan 2015 yang memberikan
dinamika dan kenangan yang indah selama masa perkuliahan di farmasi.
14. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu telah mendukung
penyelesaian naskah skrripsi ini.
Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam skripsi ini.
Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan masukan yang
membangun untuk perbaikan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat
bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan penelitian khususnya
dalam bidang farmasi penemuan obat. Terimakasih.
Yogyakarta, 30 januari 2019
Penulis
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL.......................................................................................
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................
HALAMAN PENGESAHAN .........................................................................
HALAMAN PERSEMBAHAN .....................................................................
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...........................................
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .........................................................
PRAKATA ......................................................................................................
DAFTAR ISI ...................................................................................................
DAFTAR TABEL ...........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................
ABSTRAK ......................................................................................................
ABSTRACT ....................................................................................................
PENDAHULUAN ..........................................................................................
METODE PENELITIAN ................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................
KESIMPULAN ...............................................................................................
SARAN ...........................................................................................................
UCAPAN TERIMAKASIH ............................................................................
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................
LAMPIRAN ....................................................................................................
BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................
ix
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
ix
x
xi
xii
xiii
xiv
1
4
7
18
18
19
20
23
32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I.
Tabel II.
Tabel III.
Tabel IV.
Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2 .......................
Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 .........................
Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 ........................
Hasil uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-2............
x
10
11
14
18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour
et al. 2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa
arilamida-2 ...................................................................................
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai
katalis nukleofil. ..........................................................................
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa turunan arilamida-2 ..............
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa turunan arilamida-2 .............
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b)
benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004) ........................
Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 ..
xi
3
8
10
13
15
16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan
arilamida-2 ................................................................................
Lampiran 2. Uji DAB-HCl ............................................................................
Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa
arilamida-2 ................................................................................
Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR ............................
Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak
senyawa arilamida-2 pada spektrometri massa ........................
Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro ............................
xii
23
25
26
27
30
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRAK
Enzim MMP-9 diekspresikan secara tinggi pada kanker payudara dengan
permasalahan, inhibitor yang telah dirancang untuk enzim tersebut bersifat tidak
selektif sehingga menyebabkan efek samping yang merugikan. Pada penelitian ini
telah disintesis senyawa arilamida-2 sebagai penghambat MMP-9 yang dirancang
lebih selektif dengan menghambat hemopexin domain MMP-9 (PEX-9). Senyawa
arilamida-2 berhasil disintesis dengan mereaksikan benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi
substitusi nukleofilik asil. Senyawa hasil sintesis dilakukan uji organoleptis,
kelarutan, titik lebur, dan warna dengan DAB-HCl. Produk yang terbentuk berupa
serbuk berwarna putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO. Titik lebur
senyawa hasil sintesis adalah 116-124oC yang bereaksi negatif terhadap DAB-HCl
mengindikasikan gugus amina primer dari benzokain sudah tersubstitusi. Senyawa
hasil sintesis dipastikan strukturnya dengan menggunakan 1H-NMR, 13C-NMR,
FTIR, dan GC-MS. Spektrum 1H-NMR menunjukan proton etilen pada geseran
kimia 2-4 ppm dan karbon etilen pada 20-40 ppm untuk 13C-NMR. Gugus karbonil
amida dideteksi dengan FTIR muncul pada 1535 cm-1 sementara bobot molekul
senyawa hasil sintesis dideteksi dengan MS sebesar m/z 299. Hasil uji aktivitas in
vitro terhadap enzim MMP-9 menunjukan persentase penghambatan enzim MMP9 sebesar 36% yang berasosiasi dengan aktivitas rendah-sedang senyawa arilamida2 sebagai inhibitor MMP-9.
Kata kunci : Arilamida-2, kanker payudara, MMP-9, PEX-9, uji aktivitas in vitro
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
MMP-9 is highly expressed in breast cancer with the major issue, the
inhibitor which has been designed for the corresponding enzyme having nonselective properties, therefore this causes some adverse drug reactions. In this study,
it has been synthesized arylamide-2 as MMP-9 inhibitor which is designed to be
more selective by inhibiting hemopexin domain of MMP-9 (PEX-9). Arylamide-2
was successfully synthesized by reacting benzocaine and 3-bromopropionyl
chloride using pyridine as the catalyst through the mechanism of acyl nucleophilic
substitution reactions. Synthesized compound was carried out by an organoleptic,
solubility, melting point, and color with DAB-HCl test. The product was formed as
a white powder which is soluble in ethyl acetate, chloroform, and DMSO. The
melting point of the synthetic product was measured at 116-124oC, while negatively
reacting with DAB-HCl indicating that primary amine has been substituted. The
synthesized compound structure was confirmed using 1H-NMR by showing
ethylene proton at 2-4 ppm whereas the ethylene-carbon appears at 20-40 ppm as
confirmed by 13C-NMR. The amide carbonyl group was indicated at 1535 cm-1 as
confirmed by FTIR while the molecular weight was detected using GC-MS by
showing m/z 299. The result showed that arylamide-2 was able to inhibit MMP-9
with percentage inhibition of 36% at 200 µg/ml concentration associating with its
potency as weak to moderate inhibitor of MMP-9 in searching of anti-breast cancer
candidate.
Keyword: Arylamide-2, breast cancer, MMP-9, PEX-9, in vitro activity bioassay
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit kedua penyebab utama kematian di dunia. Pada
tahun 2018, terdapat 18,1 juta kasus kanker baru di dunia. Kanker payudara
merupakan kasus yang paling sering terjadi pada wanita (World Health
Organization, 2018). Pada tahun 2013, kanker payudara merupakan salah satu
kanker dengan prevalensi tertinggi di Indonesia yaitu sebesar 0,5%. Daerah
Istimewa Yogyakarta merupakan provinsi dengan prevalensi kanker payudara
tertinggi yaitu sebesar 2,4% (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Menurut World
Health Organization (2014), kematian akibat kanker payudara pada wanita di
Indonesia cukup tinggi yaitu sebesar 21,4%.
Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak
normal dan tidak teratur yang disebabkan oleh mutasi genetik serta dapat
mengalami invasi dan penyebaran sel dari satu bagian tubuh ke bagian tubuh yang
lain. Metastasis menjadi penyebab utama kematian pada penderita kanker
(Pecorino, 2012). Menurut American Cancer Society (2018) metastasis sel kanker
ke organ-organ viseral seperti pankreas, kolon, dan paru-paru merupakan hal yang
paling membahayakan nyawa dengan memperpendek harapan hidup kurang dari 5
tahun pada 20% penderita kanker secara umum. Lebih daripada itu, metastasis
menyebabkan kematian pada 90% penderita kanker (Alford, 2017).
Pada tahun 2014, menurut penelitian yang dilakukan Yousef et al. (2014)
enzim Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) diekspresikan tinggi pada sel kanker
payudara dibandingkan dengan sel payudara normal. Selain itu, ditemukan
overexpression MMP-9 pada kanker payudara jenis triple-negative dan Human
Epidermal Receptor Growth Factor Receptor 2 positive (HER 2-positive). Merdad
et al., (2014) juga mengemukakan bahwa MMP-9 diekspresikan tinggi pada 97,5
% penderita kanker payudara Infiltrating Ductal Carcinoma (IDC), serta pada 5262% penderita kanker payudara Human Epidermal Receptor (HER).
Enzim MMP-9 merupakan salah satu peptidase yang termasuk dalam
subfamilia dari enzim matrix metalloproteinase (MMP). MMP merupakan enzim
jenis zinc-dependent endopeptidase yang bekerja dengan mendegradasi protein
extracellular matrix (ECM). Di dalam tubuh manusia terdapat 23 jenis enzim MMP
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
yang diklasifikasikan kedalam 6 jenis subfamilia MMP berdasarkan spesifitasnya
terhadap substrat (collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, enamelysin,
membrane type MMPs) (Benson et al., 2013). MMP-9 tergolong ke dalam
subfamilia MMP gelatinase B karena substratnya adalah gelatin. Degradasi ECM
oleh MMP-9 sangat penting pada proses kanker untuk memicu proses angiogenesis
dan metastasis sel kanker yang dapat bermigrasi ke daerah tubuh yang lain
(Stankovic et al., 2010).
Melihat pentingnya peran enzim MMP pada kanker, beberapa industri
farmasi telah merancang beberapa obat yang memiliki sifat penghambatan pada
MMP (MMP inhibitors) yang diharapkan mampu menjadi salah satu terapi kanker.
Namun, sebagian besar obat tersebut gagal melewati uji klinis karena kurang
selektif sehingga menimbulkan efek samping yang besar. Sebagai contoh,
marimastat menimbulkan efek samping berupa nyeri muskoskeletal dan inflamasi
(Cathcart et al., 2015). Sebagian besar MMP memiliki struktur genomik yang sama
yaitu propeptide region, catalytic domain, linker peptide (hinge region), dan
hemopexin domain (Nagase et al., 2006). Kegagalan MMP inhibitors tersebut
karena sebagian besar obat yang telah dirancang sebagai MMP inhibitor memiliki
spesifisitas yang rendah (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Hal ini disebabkan
obat-obat tersebut mentargetkan catalytic domain yang memiliki persamaan
sekuens asam-asam amino (homologi) yang tinggi pada sebagian besar MMP (4365%) (Dufour et al., 2011).
Hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) memiliki perbedaan sekuens asam
amino dengan MMP yang lain dengan homologi sebesar 25-35% (Dufour et al.,
2011) yang menyebabkan masing-masing MMP spesifik terhadap substrat,
sehingga dapat dijadikan target untuk merancang MMP inhibitor yang selektif
(Piccard et al., 2007). Studi hemopexin domain pada MMP-9 (PEX-9) diperlukan
untuk pengembangan senyawa-senyawa yang lebih selektif. Alford et al. (2017)
telah melakukan penelitian terhadap PEX-9 dengan penemuan dan sintesis 14
senyawa aktif secara in silico dan in vitro. Senyawa yang paling aktif adalah
senyawa 3c dengan Kd = 320 nM. Penelitian Alford et al. (2017) tersebut
dilatarbelakangi oleh penelitian Dufour et al. (2011) yang sebelumnya telah
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
melakukan penelitian tentang PEX-9 dan menemukan 5 senyawa aktif berdasarkan
penapisan virtual dengan metode in silico, uji in vitro, dan uji in vivo pada tikus
yang telah diinduksi dengan sel kanker MDA-MDB 435 sehingga mengalami
karsinogenesis.
Senyawa
yang
paling
aktif
adalah
CID135415473
www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov yang dinamakan senyawa 2 dengan Kd = 2,2 μM.
Senyawa tersebut memiliki struktur relatif sederhana untuk disintesis sehingga
berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut. Gugus yang berperan dalam aktivitas
penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang memiliki interaksi dengan pocket
blade PEX-9 dan juga memiliki arilamida yang terhubung oleh rantai alkil untuk
berinteraksi di daerah permukaan pocket. Gambar 1(a) dan 1(b) menunjukkan
struktur senyawa 2 yang ditemukan oleh Dufour et al. (2011) dan Alford et al.
(2011).
Gugus arilamida
Cincin planar
Rantai alkil
(a)
Gugus difluorometoksi
Gugus arilamida
Rantai alkil
Gugus Fluoro
Cincin planar
(b)
Gugus ester etil benzoat
Rantai alkil
Gugus arilamida
(c)
Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour et al.
2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa arilamida-2.
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pada penelitian kali ini telah disintesis senyawa fragmen dari senyawa 2
dengan mengambil sebagian farmakofor yang penting, yang akan diberi nama
turunan arilamida-2. Farmakofor yang diadaptasi untuk disintesis ialah gugus
arilamida dan rantai alkil. Selain itu juga dilakukan modifikasi pada posisi para dari
cincin arilamida yaitu berupa ester etil benzoat. Struktur senyawa turunan
arilamida-2 dapat dilihat pada gambar 1(c). Senyawa akan disintesis dengan
mereaksikan benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin
melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Kemudian senyawa
turunan arilamda-2 tersebut akan diuji aktivitasnya terhadap enzim MMP-9 secara
in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat menambah jumlah senyawa penghambat
PEX-9 yang diharapkan aktif dan selektif sebagai kandidat anti-kanker payudara.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian kecuali dinyatakan lain
bermutu analisis yang disuplai dari Sigma Aldrich dan Merck. Bahan-bahan untuk
sintesis meliputi: benzokain mutu farmasetis (ethyl 4-aminobenzoate), 3bromopropionil klorida mutu pro analisis, piridin mutu pro analisis, natrium
karbonat mutu teknis (Na2CO3), plat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel GF254,
pelarut organik sebagai fase gerak (n-heksana dan etil asetat) mutu pro analisis, dan
4-dimetilano benzaldehid HCl (DAB-HCl) mutu pro analisis. Bahan-bahan untuk
elusidasi struktur meliputi: pellet kalium bromide mutu pro analisis untuk FTIR dan
pelarut kloroform-D (CDCl3) pro analisis untuk NMR. Bahan-bahan untuk uji
aktivitas in vitro bermutu pro analisis meliputi: Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim
MMP-9 terliofilisasi, substrat peptide, dapar, peptida NNGH sebagai kontrol
positif, gliserol untuk rekonstitusi enzim, dan dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai
pelarut sampel.
Alat
Pada tahap sintesis alat-alat yang digunakan meliputi: timbangan analitik
(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
GmbH + Co.KG), labu alas bulat (pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas,
drupple plate, seperangkat alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), lampu UV254, dan
alat gelas pada umumnya. Ala-alat yang digunakan pada elusidasi struktur meliputi:
kromatografi gas-spektrofotometer inframerah (GC-MS-QP2010S SHIMADZU),
spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 700 MHz dan 176 MHz), dan
spektrometer massa. Alat-alat untuk uji in vitro meliputi: pipet mikro (Eppendorf),
micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, ELISA Tecan Infinite 200 PRO
microplate reader fluorescence.
Prosedur Penelitian
Sintesis Senyawa Arilamida-2 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001)
Dalam labu alas bulat dimasukkan benzokain sebanyak 3,59 mmol (0,59 g)
kemudian ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 3,59 mmol (0,28 g ;
0,29 mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar. 3-bromopropionil
klorida ditambahkan tetes demi tetes sebanyak sebanyak 4,00 mmol (0,41 mL).
Campuran diaduk kembali selama 30 menit hingga tebentuk padatan. Padatan
disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% dan dicuci dengan akuades
untuk menghilangkan sisa piridin, NaCl, dan CO2 sebagai produk samping. Serbuk
hasil sintesis kemudian dihitung rendemennya.
Uji Organoleptis
Senyawa hasil sintesis dideterminasi bentuk dan warnanya.
Uji Kelarutan
Senyawa hasil sintesis diletakkan pada tabung reaksi kemudian ditetesi
perlahan-lahan dengan kloroform, etil asetat, DMSO, etanol, air, n-heksana, dan
aseton hingga larut dan ditentukan kategori kelarutannya berdasarkan Farmakope
Indonesia V.
Rekristalisasi
Senyawa hasil sintesis ditetesi perlahan-lahan hingga tepat larut
menggunakan pelarut kloroform dan diuapkan perlahan-lahan hingga terbentuk
kristal.
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji Warna dengan DAB-HCl
Senyawa hasil sintesis diletakan di drupple plate kemudian ditetesi DABHCl. Perubahan warna dilihat dan dibandingkan dengan benzokain.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Serbuk hasil sintesis diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan tiga
sistem fase gerak hasil orientasi yaitu n-heksana: etil asetat 1:3; 2:2; 3:1 (diadaptasi
dari metode Adhipandito, 2017) dan didapat fase gerak dengan pemisahan terbaik
yaitu n-heksana: etil asetat 3:1. Serbuk hasil sintesis dilarutkan dalam etil asetat dan
ditotolkan pada fase diam plat silika gel GF254 kemudian dieluasi dengan fase gerak
terpilih. Bercak dideteksi dibawah lampu UV254.
Uji Titik Lebur
Senyawa hasil sintesis dimasukan kedalam pipa kapiler kemudian
dimasukan ke dalam alat pengukur titik lebur. Suhu diatur 85-150oC kemudian
senyawa diamati suhu saat pertama kali melebur hingga semua habis. Jarak lebur
didokumentasikan.
Elusidasi Struktur
Senyawa hasil sintesis dielusidasi strukturnya menggunakan NMR, FTIR,
dan GC-MS yang dilakukan di Fakultas MIPA UGM, Sleman, DIY dan Institut
Farmasetikal dan Nutrasetikal, Malaysia dengan metode standar yang sudah
dilakukan di masing-masing tempat tersebut.
Uji aktivitas in vitro
Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat
fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based MMP-9, dapar uji MMP-9,
dan NNGH inhibitor sebagai kontrol positif yang didapatkan dari Biovision. Enzim
yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µ L gliserol 30% dalam deionised
water. Enzim yang sudah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap
digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan
dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µ g/mL di dalam 96-microwell plate.
Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Setiap well berisi 44
µL dapar untuk uji senyawa hasil sintesis dan 45 µL dapar untuk kontrol negatif, 1
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
µL senyawa hasil sintesis, 5 µL enzim, dan 50 µL substrat, desain well plate untuk
uji in vitro dapat dilihat pada lampiran 6. Sampel dicampurkan dengan buffer dan
enzim dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Substrat (40 µM) sebanyak
50 µL ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diinkubasi kembali pada suhu
37ºC selama 60 menit. Fluorosensi dibaca menggunakan ELISA Tecan Infinite 200
PRO microplate reader fluorescence dengan panjang gelombang eksitasi 325 nm
dan emisi 393 nm dan dihitung persentase penghambatan enzim MMP-9 dengan
rumus:
1−
𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑠𝑖𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
𝑥 100%
𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa arilamida-2 disintesis dengan farmakofor cincin arilamida yang
dihubungkan oleh rantai alkil. Penelitian ini akan mengeksplorasi gugus para cincin
arilamida yaitu OCF2 pada senyawa 2 yang memiliki karakteristik electron
donating group (EDG) pada gugus OC-R dan electron withdrawing group (EWG)
pada gugus difluoro dengan penambahan gugus ester etil benzoat. Gugus ester etil
bezoat mewakili karakter gugus electron withdrawing group (EWG).
Sintesis Senyawa Arilamida-2
Metode sintesis senyawa arilamida-2 pada penelitian ini mengadaptasi dari
metode Arifiyanto (2001). Bamane et al. (2011). White et al. (2012). Reaksi yang
terjadi pada proses sintesis turunan arilamida-2 adalah substitusi nukleofilik asil
antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin
(Montalbetti et al., 2005). Reaksi ini berlangsung antara gugus nukleofil NH2 pada
benzokain menggantikan gugus pergi -Cl yang berikatan dengan gugus karbon asil
pada 3-bromopropionil klorida (McMurry, 2016). Produk utama yaitu senyawa
arilamida-2 dan produk samping reaksi berupa asam klorida (HCl). Mekanisme
reaksi disajikan pada gambar 2.
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil.
Reaksi berlangsung selama 30 menit hingga terbentuk produk yang diduga
arilamida-2. Hal ini dibuktikan dengan nilai Rf pada profil KLT untuk benzokain
sebesar 0,62 dan senyawa yang diduga arilamida-2 sebesar 0,36 dengan fase gerak
n-heksana: etil asetat (3:1) yang disajikan pada Lampiran 1a menunjukkan hasil
sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan awal sintesis (benzokain).
Produk awal hasil sintesis yang dihasilkan berupa padatan berwarna putih disajikan
pada Lampiran 1b. Produk awal sintesis dinetralkan dan dilakukan pencucian
dengan Na2CO3 dan akuades untuk menghilangkan NaCl, CO2 dan sisa piridin, pH
yang diukur setelah pencucian adalah 7. Senyawa hasil sintesis setelah pencucian
dan pengeringan berbentuk serbuk dan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1c.
Hasil rendemen dari senyawa arilamida-2 sebanyak 81,48%, yang
perhitungan rendemennya disajikan pada lampiran 3. Rendemen yang dihasilkan
cukup tinggi karena sebagian besar 3-bromopropionil klorida hampir habis bereaksi
dengan benzokain. Hal ini dikarenakan gugus klorida pada 3-bromopropionil
klorida merupakan gugus pergi yang baik (Zhang et al., 2009) dan piridin mampu
mengkatalisis reaksi dengan baik (Montalbetti et al., 2005), sehingga memudahkan
serangan nukleofilik yang dilakukan oleh benzokain. Rekristalisasi serbuk hasil
sintesis menggunakan pelarut kloroform, namun dilakukan setelah pengujian titik
lebur. Rekristalisasi pada senyawa hasil sintesis berhasil dilakukan karena
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kloroform memiliki titik didih yang rendah yaitu sebesar 62oC (Pubchem, 2019)
sehingga mudah menguap sempurna (volatile).
Uji warna dengan reagen DAB-HCl pada hasil sintesis ditujukan untuk
memastikan senyawa arilamida-2 telah terbentuk. Senyawa dengan gugus amina
primer akan bereaksi dengan DAB-HCl membentuk basa Schiff yang berwarna
jingga, sedangkan yang tidak memiliki gugus amina primer tidak akan bereaksi
(Adegoke, 2011). Senyawa arilamida-2 tidak bereaksi dengan DAB-HCl
membentuk warna jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi
menjadi amida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan benzokain disajikan pada
Lampiran 2a, sedangkan hasil uji warna berupa produk warna jingga disajikan pada
Lampiran 2b.
Senyawa arilamida-2 dilakukan uji titik lebur yang bertujuan untuk melihat
kemurnian dengan membandingkan titik lebur dari senyawa hasil sintesis (produk)
dan bahan awal (benzokain). Hasil yang diperoleh pada penelitian 3 kali replikasi
yaitu pada rentang titik lebur di antara 119-127ºC, 114-124 ºC, dan 116-122 ºC
dengan rata-rata 116-124oC. Senyawa dikatakan murni secara titik lebur jika
memiliki rentang lebur sebesar 0,5-1,5oC (Mohrig et al., 2014). Hasil tersebut
berbeda dengan benzokain yang memiliki titik lebur 88-90ºC (Sigma Aldrich,
2019). Hasil uji titik lebur menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis belum murni
secara titik lebur. Hal ini dapat diatasi dengan pemurnian menggunakkan
kromatografi kolom, KLT preparatif, dan rekristalisasi. Rekristalisasi sudah
dilakukan namun karena keterbatasan alat uji titik lebur belum dapat dilakukan.
Selain uji organoleptis, warna, dan titik lebur, uji kelarutan juga dilakukan terutama
untuk menentukan pelarut yang akan digunakan dalam spektroskopi. Hasil uji
kelarutan senyawa arilamida-2 ditunjukkan pada Tabel I. Berdasarkan hasil uji
kelarutan, senyawa hasil sintesis larut dalam kloroform, etil asetat, dan DMSO
sehingga memiliki sifat kelarutan semi polar.
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2
Pelarut
Senyawa Arilamida-2
Perbandingan Kategori
Kelarutan FI V
n-heksana
Kloroform
Etil asetat
Aseton
Etanol
Air
DMSO
sangat sukar larut
larut
larut
agak sukar larut
agak sukar larut
sangat sukar larut
larut
1: 1000
1:30
1:20
1:60
1:100
1:1000
1:30
Elusidasi Struktur
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti
Elusidasi struktur dilakukan dengan pelarut kloroform berdasarkan hasil uji
kelarutan yang dilakukan terhadap senyawa hasil sintesis. Selain itu, kloroform juga
tidak akan mengganggu pada pembacaan sinyal karena sinyal senyawa diprediksi
berbeda dengan sinyal kloroform. Spektrum 1H-NMR disajikan pada Gambar 3.
Y
X
Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2
Proton
Geseran
kimia (ppm)
Integrasi
Splitting
HA
HB
1,39
2,85 dan 2,98
3
2
HC
3,71 dan 3,89
2
HD
HE
HF
Pelarut (X)
H2O (Y)
4,30
7,61
8,02
7,26
1,60
2
2
2
-
triplet
triplet of
triplet
triplet of
triplet
quartet
doublet
doublet
singlet
singlet
J Coupling
Constant
(Hz)
7,7
6,3 dan 6,3
6,3 dan 6,3
7,7
7,7
7
-
Sinyal pada geseran kimia 1,39 ppm (integrasi 3) (J = 7,7 Hz) merupakan
sinyal dari proton HA. Integrasi menunjukkan jumlah proton pada atom yang
dikenai gelombang radio. Integrasi yang muncul sudah sesuai dengan teori karena
jumlah proton pada HA berjumlah 3. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan
teori hukum pencacahan proton yaitu n+1 dengan n adalah jumlah proton tetangga
yang tidak ekivalen secara kimia, sehingga sinyal yang muncul berupa triplet
karena memiliki dua proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda.
Perbesaran sinyal HA disajikan pada Lampiran 4a.
Sinyal pada geseran kimia 2,85 ppm (intergrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,98 (J=
6,3 Hz) ppm merupakan sinyal dari proton HB, sedangkan geseran kimia 3,71 ppm
(integrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,89 ppm (J= 6,3 Hz) merupakan sinyal dari proton
HC. Kedua sinyal tersebut menunjukkan proton pada rantai etilen yang fleksibel dan
seharusnya muncul sebagai triplet. Namun, hasil percobaan berupa triplet of triplet.
Hal ini dapat disebabkan oleh proton pada etilen bersifat free rotatable sehingga
pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama memiliki
lingkungan kimia yang berbeda, hal ini menyebabkan setiap proton mengenali
tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua triplet. Kejadian ini dipastikan
dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan 2 proton. Proton HC
memiliki geseran kimia yang lebih jauh dari proton HB karena berdekatan dengan
gugus halogen (Br) yang lebih bersifat elektronegatif (menarik elektron kulit
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
terluarnya) daripada gugus karbonil amida yang berdekatan dengan HB sehingga
membuat HC kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) (Anderson,
2004). Perbesaran sinyal HB dan HC disajikan pada Lampiran 4b dan 4c.
Sinyal pada geseran kimia sekitar 4,30 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz)
merupakan sinyal dari proton HD. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan
teori yaitu muncul berupa quartet karena memiliki tiga proton tetangga pada
lingkungan kimia yang berbeda. Geseran kimia proton HD bergeser pada ppm yang
lebih jauh daripada proton HA yang merupakan proton tetangganya karena proton
HD berikatan langsung dengan atom O yang elektronegatif sehingga cenderung
menarik elektron atom C pada HD dan membuat HD kurang terlindungi dari medan
magnet luar (de-shielded) serta mengubah orientasi spin-nya untuk bergeser pada
ppm yang lebih jauh. Perbesaran sinyal HD disajikan pada Lampiran 4d.
Sinyal pada geseran kimia 7,00 – 9,00 ppm merupakan daerah proton
aromatik (Silverstein et al., 2005). Sinyal yang muncul pada geseran kimia tersebut
adalah dua sinyal berbeda, yaitu pada geseran kimia sekitar 7,61 ppm dan 8,02 ppm.
Perbesaran pada geseran kimia tersebut ditunjukkan pada Lampiran 4e dan 4f.
Sinyal pada geseran kimia 7,61 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan proton
HE, sedangkan sinyal 8,02 ppm, (integrasi 2) (J= 7 Hz) merupakan proton HF.
Proton HE lebih terlindungi (shielded) daripada proton HF karena berada di
lingkungan kimia dekat dengan gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih
rendah daripada gugus C=O karbonil yang dekat dengan proton HF (Anderson,
2004). Sinyal yang muncul pada kedua proton tersebut sudah sesuai dengan teori
yaitu berupa sinyal doublet karena hanya memiliki satu proton tetangga pada
lingkungan kimia berbeda. Pada geseran 7,26 pm merupakan sinyal X yaitu sinyal
dari pelarut kloroform sedangkan sinyal Y geseran kimia 1,60 ppm yang merupakan
sinyal H2O (Fulmer et al., 2010).
Kemudian dilakukan juga uji 13C-NMR dan hasilnya disajikan pada Gambar
4. Hasil 13C-NMR memuat hanya informasi geseran kimia atom C dengan isotop
13 karena kelimpahan isotop
13
C yang rendah di alam (1,1%) (Anderson, 2004).
Berdasarkan hasil percobaan, geseran kimia pada 20,0-40,0 ppm (Vollhardt dan
Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C alkil bromida, hal ini sudah sesuai
12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan hasil penelitian yaitu pada daerah tersebut terdapat 1 sinyal pada geseran
kimia 39,6 ppm menunjukkan atom CC pada rantai alkil (gugus etilen). Sementara
atom CB pada geseran kimia 26,7 ppm merupakan C etilen (alkil sekunder) yang
sesuai dengan hasil empiris terletak pada daerah geseran kimia 20,0-30,0 ppm
(Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CB lebih terlindungi daripada CC karena atom
CC berikatan dengan atom Br yang merupakan penarik elektron yang lebih kuat
daripada gugus karbonil (C=O) amida yang berikatan dengan atom CB. Geseran
kimia pada 5,0-20,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari
atom C metil (alkil primer), hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian bahwa pada
geseran kima tersebut muncul 1 sinyal yang menunjukan atom CA dari rantai etil
ester pada 14,4 ppm. Sementara CD pada sinyal 60,9 ppm merupakan atom C yang
berikatan langsung dengan atom O ester yang sesuai berdasarkan hasil empiris
muncul pada geseran kimia 50,0-90,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CA
lebih terlindungi daripada atom CD karena atom CD berikatan langsung dengan atom
O ester yang merupakan gugus penarik elektron.
X
Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Geseran kimia 110,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) adalah
rentang atom-atom C pada cincin benzena. Hal ini sudah sesuai dengan hasil
penelitian yang menunjukan geseran kimia pada rentang tersebut dengan
munculnya 4 sinyal yaitu 118,9 ppm, 126,4 ppm, 130,9 ppm, dan 141,5 ppm yang
berkorespondensi dengan atom CE, CF, CG, dan CH pada cincin arilamida. Atom CE
13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
lebih terlindungi daripada atom CG karena posisi CE lebih dekat pada gugus NH
yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada C=O ester yang dekat
dengan atom CE (Anderson, 2004). Atom CH lebih tidak terlindung daripada CF
diduga akibat CH berikatan langsung dengan NH dan C=O amida yang merupakan
gugus elektronegatif, sedangkan CF tidak berikatan langsung dengan atom O
karbonil yang elektronegatif sehingga masih terlindungi oleh ikatan dengan atom C
karbonil (Anderson, 2004). Geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al.,
2005) ppm merupakan rentang dari atom C karbonil amida dan ester. Hasil
penelitian menunjukan hasil yang sesuai yaitu terdapat dua sinyal atom CI ester dan
CJ amida pada geseran kimia 166,1 ppm dan 167,9 ppm. Sinyal X pada geseran
kimia 77,0 ppm merupakan sinyal dari pelarut kloroforom (Fulmer et al., 2010).
Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2
Karbon
Geseran kimia (ppm)
CA
CB
CC
CD
CE
CF
CG
CH
CI
CJ
Pelarut (X)
14,4
26,7
39,6
60,9
118,9
126,4
130,9
141,5
166,1
167,9
77
Spektrofotometri Inframerah
Elusidasi
struktur
dilanjutkan
dengan
menggunakan
instrumen
spektrofotometer inframerah. Tujuan elusidasi struktur dengan spektrofotometer
inframerah adalah untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional pada senyawa
hasil sintesis. Gugus fungsional yang memiliki momen dipol yang tinggi sangat
efektif menyerap radiasi inframerah sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi
baik secara mengulur (stretching) dan menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil
elusidasi struktur senyawa hasil sintesis serta perbandingannya dengan bahan awal
(benzokain) dan keberadaan gugus fungsionalnya pada spektroskopi IR disajikan
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pada gambar 5. Berdasarkan spektrum inframerah yang dihasilkan, terdapat pita
pada bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukan gugus C karbonil (C=O).
C=O tersebut merupakan C=O amida pada 1535 cm-1, sedangkan pada 1689 cm-1
menunjukan C=O ester. Keberadaan gugus C=O amida tersebut diperkuat dengan
adanya pita kembar yang satu ujungnya melebar pada daerah 3371 cm-1 dan 3464
cm-1 yang diduga merupakan gugus NH amida. Senyawa hasil sintesis diprediksi
sudah terbentuk dengan dukungan daerah sidik jari pada 500-1500 cm-1 yang sudah
berbeda dengan benzokain sebagai bahan awal sintesis.
daerah
sidik jari
HN-C=O
R-O-C=O
C=O
(a)
daerah
sidik jari
(b)
Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain
(diadaptasi dari Anderson et al., 2004)
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
Senyawa dielusidasi struktur dengan menggunakan kromatografi gasspektrometer massa yang bertujuan untuk menentukan bobot molekul dari senyawa
baru hasil sintesis (Anderson, 2004). Kromatografi gas bertujuan untuk memastikan
kemurnian senyawa hasil sintesis, ditandai dengan hasil kromatogram satu puncak.
Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis karena berdasarkan sifat
fisika kimia senyawa dari hasil uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil
sintesis