OPTIMASI METODE KULTUR PLASTIC- ADHERENT CELLS DARI SEL MONONUKLEAR DARAH TEPI MANUSIA.
OPTIMASI METODE KULTUR PLASTICADHERENT CELLS DARI SEL
MONONUKLEAR DARAH TEPI MANUSIA
SKRIPSI SARJANA FARMASI
Oleh
NOVIALDI
No. BP : 0811011009
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2012
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR
i
ABSTRAK
iii
ABSTRACT
iv
DAFTAR ISI
v
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR TABEL
x
I. PENDAHULUAN
1
II. TINJAUAN PUSTAKA
4
2.1. Darah
4
2.1.1. Pengertian Darah
4
2.1.2. Komponen Selular Darah
4
2.1.3. Hematopoiesis
5
2.2. Sel Punca
7
2.2.1. Pengertian Sel Punca
7
2.2.2. Karakteristik Sel Punca
7
2.2.3. Jenis-jenis Sel Punca
9
2.3. Sel Punca Mesenkim
2.3.1. Pengertian Sel Punca Mesenkim
12
12
2.3.2. Karakteristik Sel Punca
Mesenkim
13
15
2.4. Serum
15
III. PELAKSANAAN PENELITIAN
19
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
19
3.2. Metode Penelitian
19
3.3. Bahan dan Alat
19
3.3.1. Bahan
19
3.3.2. Alat
20
3.4. Cara Kerja
20
3.4.1. Sterilisasi Alat
20
3.4.2. Pengambilan Sampel
20
3.4.3. Isolasi Sel Mononuklear Darah Tepi Manusia
21
3.4.4. Optimasi Kultur Plastic-Adherent Cells
22
3.4.4.1.Variasi Waktu Penggantian Medium Kultur Awal
22
3.4.4.2.Variasi Konsentrasi FBS
23
3.4.5. Penggantian Medium
23
3.4.6. Pasasi Sel
24
3.4.7. Teknik Penghitungan Sel
25
3.4.7.1.Penghitungan Sel menggunakan Hemositometer
25
3.4.7.2.Penghitungan Sel dengan Teknik Foto Sel
25
3.5. Analisis Data
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
26
27
27
4.1.1. Variasi Waktu Penggantian Medium Kultur Awal
27
4.1.2. Variasi Konsentrasi FBS
27
4.2. Pembahasan
V. KESIMPULAN DAN SARAN
28
37
5.1. Kesimpulan
37
5.2. Saran
37
RUJUKAN
38
LAMPIRAN
42
ABSTRAK
Terapi berbasis sel menggunakan sel punca sangat dikembangkan saat ini. Plasticadherent cells yang diduga sebagai sel punca mesenkim dapat digunakan pada berbagai terapi
berbasis sel. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui waktu penggantian medium
kultur awal serta konsentrasi FBS yang paling optimal untuk pertumbuhan plastic-adherent
cells. Sel mononuklear yang terisolasi dari darah tepi manusia ini dilakukan optimasi metode
kultur dengan variasi waktu kultur awal yaitu H4, H6 dan H8 serta variasi konsentrasi FBS
dalam medium yaitu pada konsentrasi 10%,15% dan 20%. Pada hari terakhir kultur dilakukan
penghitungan jumlah total sel menggunakan hemositometer dan jumlah plastic-adherent cells
dengan teknik foto sel. Dari penelitian yang telah dilakukan, ternyata pertumbuhan plasticadherent cells optimal pada H6 penggantian medium kultur awal dengan konsentrasi 20% FBS.
ABSTRACT
Cell-based therapies using stem cells is highly developed at this time. Plastic-adherent cells
are thought to be mesenchymal stem cells can be used in a variety of cell-based therapies.
The purpose of this study was to know the time of initial replacement of culture medium and
FBS concentration at an optimum for the growth of plastic-adherent cells. Mononuclear cells
isolated from human peripheral blood culture method optimization was carried out with the
early culture of the time variation of the H4, H6 and H8 as well as variations in the
concentration of FBS in the medium at a concentration of 10%, 15% and 20%. On the last
day of culture were counted using a hemocytometer total cell number and the number of
plastic-adherent cells with the technique of cell images. Of research has been done, was the
growth of plastic-adherent cells on the optimal replacement DIV6 initial culture medium with
a concentration of 20% FBS.
I. PENDAHULUAN
Pengobatan penyakit degeneratif pada saat ini belum memberikan hasil yang
memuaskan. Penyakit seperti stroke, diabetes melitus, aterosklerosis, infark miokard
dan banyak penyakit degeratif lainnya disebabkan oleh kerusakan jaringan yang belum
ada terapinya (Halim, et al., 2010). Terapi menggunakan senyawa alami maupun
senyawa sintetis kurang maksimal karena belum bisa memperbaiki jaringan atau target
sasaran sepenuhnya, bahkan senyawa sintetis menimbulkan efek samping. Oleh karena
itu, diperlukan jenis terapi yang berpotensi untuk memperbaiki kerusakan jaringan dan
tidak menimbulkan efek samping yang merugikan.
Sel punca memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai salah satu alternatif
terapi berbasis sel (Aini, Setiawan & Sandra, 2008). Sel punca adalah sel yang menjadi
awal mula dari pertumbuhan sel lain yang menyusun keseluruhan tubuh makhluk hidup (Halim,
et al., 2010). Sel punca merupakan sel yang belum berdiferensiasi, mampu memperbanyak diri
dan mampu berdiferensiasi menjadi lebih dari satu jenis sel (Baksh, Song & Tuan, 2004).
Sel punca secara umum dapat dibedakan menjadi sel punca embrionik dan sel punca
dewasa. Sel punca dewasa digolongkan berdasarkan organ atau golongan sel yang akan
menjadi jalur diferensiasinya, seperti sel punca hematopoietik, sel punca jantung, sel punca
jaringan saraf, sel punca mesenkim, sel punca kulit, dan sebagainya (Halim, et al., 2010). Sel
punca juga digolongkan berdasarkan potensinya yaitu totipoten, pluripoten, multipoten dan
unipoten (Saputra, 2006). Sel punca mesenkim termasuk multipoten karena mampu
berdiferensiasi menjadi beberapa jenis sel, yaitu osteosit, kondrosit, osteoblas, osteoklas,
adiposit, otot, saraf dan tendon (Baksh, et al., 2004; Catherine, Cho & Tuan, 2007; Tuan,
Boland & Tuli, 2002).
Penelitian mengenai sel punca mesenkim sangat berkembang saat ini (Radiana, 2010).
Sel ini cukup mudah diisolasi dari jaringan (Catherine, et al., 2007) seperti sumsum tulang,
darah tali pusat, darah tepi, cairan sinovial dan jaringan adiposa (Hassan & El-Sheemy, 2004;
Tuan, et al., 2002; Pountos & Giannoudis, 2005). Isolasi sel punca mesenkim yang telah
dikembangkan umumnya berasal dari sumsum tulang (Hassan & El-Sheemy, 2004), tetapi
memiliki beberapa kekurangan karena bersifat invasif dalam pengambilannya (Winoto, 2010).
Oleh karena itu, perlu dicari alternatif sumber sel punca yang mudah diisolasi dan dikerjakan,
salah satunya dari darah tepi. Penggunaan darah tepi cukup menguntungkan karena mudah
dalam pengambilan, tidak invasif dan tidak bertentangan secara etis.
Penggunaan Fetal Bovine Serum (FBS) diperlukan untuk meningkatkan proliferasi dan
pelekatan sel (Gstraunthaler, 2003). FBS ditambahkan dalam medium kultur yang cocok untuk
pertumbuhan sel punca mesenkim (Potdar & Subedi, 2011). Selain penggunaan FBS, waktu
penggantian medium kultur awal untuk membuang sel yang tidak melekat pada cawan
diketahui juga berpengaruh terhadap keberhasilan kultur (Bossolasco, et.al., 2012) . Untuk
mengoptimalkan pertumbuhan kultur plastic-adherent cells dari darah tepi ini, maka perlu
dilakukan optimasi dengan variasi waktu penggantian medium kultur awal dan konsentrasi
FBS.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu penggantian medium kultur awal serta
konsentrasi FBS yang paling optimal untuk pertumbuhan plastic-adherent cells.
MONONUKLEAR DARAH TEPI MANUSIA
SKRIPSI SARJANA FARMASI
Oleh
NOVIALDI
No. BP : 0811011009
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2012
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR
i
ABSTRAK
iii
ABSTRACT
iv
DAFTAR ISI
v
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR TABEL
x
I. PENDAHULUAN
1
II. TINJAUAN PUSTAKA
4
2.1. Darah
4
2.1.1. Pengertian Darah
4
2.1.2. Komponen Selular Darah
4
2.1.3. Hematopoiesis
5
2.2. Sel Punca
7
2.2.1. Pengertian Sel Punca
7
2.2.2. Karakteristik Sel Punca
7
2.2.3. Jenis-jenis Sel Punca
9
2.3. Sel Punca Mesenkim
2.3.1. Pengertian Sel Punca Mesenkim
12
12
2.3.2. Karakteristik Sel Punca
Mesenkim
13
15
2.4. Serum
15
III. PELAKSANAAN PENELITIAN
19
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
19
3.2. Metode Penelitian
19
3.3. Bahan dan Alat
19
3.3.1. Bahan
19
3.3.2. Alat
20
3.4. Cara Kerja
20
3.4.1. Sterilisasi Alat
20
3.4.2. Pengambilan Sampel
20
3.4.3. Isolasi Sel Mononuklear Darah Tepi Manusia
21
3.4.4. Optimasi Kultur Plastic-Adherent Cells
22
3.4.4.1.Variasi Waktu Penggantian Medium Kultur Awal
22
3.4.4.2.Variasi Konsentrasi FBS
23
3.4.5. Penggantian Medium
23
3.4.6. Pasasi Sel
24
3.4.7. Teknik Penghitungan Sel
25
3.4.7.1.Penghitungan Sel menggunakan Hemositometer
25
3.4.7.2.Penghitungan Sel dengan Teknik Foto Sel
25
3.5. Analisis Data
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
26
27
27
4.1.1. Variasi Waktu Penggantian Medium Kultur Awal
27
4.1.2. Variasi Konsentrasi FBS
27
4.2. Pembahasan
V. KESIMPULAN DAN SARAN
28
37
5.1. Kesimpulan
37
5.2. Saran
37
RUJUKAN
38
LAMPIRAN
42
ABSTRAK
Terapi berbasis sel menggunakan sel punca sangat dikembangkan saat ini. Plasticadherent cells yang diduga sebagai sel punca mesenkim dapat digunakan pada berbagai terapi
berbasis sel. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui waktu penggantian medium
kultur awal serta konsentrasi FBS yang paling optimal untuk pertumbuhan plastic-adherent
cells. Sel mononuklear yang terisolasi dari darah tepi manusia ini dilakukan optimasi metode
kultur dengan variasi waktu kultur awal yaitu H4, H6 dan H8 serta variasi konsentrasi FBS
dalam medium yaitu pada konsentrasi 10%,15% dan 20%. Pada hari terakhir kultur dilakukan
penghitungan jumlah total sel menggunakan hemositometer dan jumlah plastic-adherent cells
dengan teknik foto sel. Dari penelitian yang telah dilakukan, ternyata pertumbuhan plasticadherent cells optimal pada H6 penggantian medium kultur awal dengan konsentrasi 20% FBS.
ABSTRACT
Cell-based therapies using stem cells is highly developed at this time. Plastic-adherent cells
are thought to be mesenchymal stem cells can be used in a variety of cell-based therapies.
The purpose of this study was to know the time of initial replacement of culture medium and
FBS concentration at an optimum for the growth of plastic-adherent cells. Mononuclear cells
isolated from human peripheral blood culture method optimization was carried out with the
early culture of the time variation of the H4, H6 and H8 as well as variations in the
concentration of FBS in the medium at a concentration of 10%, 15% and 20%. On the last
day of culture were counted using a hemocytometer total cell number and the number of
plastic-adherent cells with the technique of cell images. Of research has been done, was the
growth of plastic-adherent cells on the optimal replacement DIV6 initial culture medium with
a concentration of 20% FBS.
I. PENDAHULUAN
Pengobatan penyakit degeneratif pada saat ini belum memberikan hasil yang
memuaskan. Penyakit seperti stroke, diabetes melitus, aterosklerosis, infark miokard
dan banyak penyakit degeratif lainnya disebabkan oleh kerusakan jaringan yang belum
ada terapinya (Halim, et al., 2010). Terapi menggunakan senyawa alami maupun
senyawa sintetis kurang maksimal karena belum bisa memperbaiki jaringan atau target
sasaran sepenuhnya, bahkan senyawa sintetis menimbulkan efek samping. Oleh karena
itu, diperlukan jenis terapi yang berpotensi untuk memperbaiki kerusakan jaringan dan
tidak menimbulkan efek samping yang merugikan.
Sel punca memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai salah satu alternatif
terapi berbasis sel (Aini, Setiawan & Sandra, 2008). Sel punca adalah sel yang menjadi
awal mula dari pertumbuhan sel lain yang menyusun keseluruhan tubuh makhluk hidup (Halim,
et al., 2010). Sel punca merupakan sel yang belum berdiferensiasi, mampu memperbanyak diri
dan mampu berdiferensiasi menjadi lebih dari satu jenis sel (Baksh, Song & Tuan, 2004).
Sel punca secara umum dapat dibedakan menjadi sel punca embrionik dan sel punca
dewasa. Sel punca dewasa digolongkan berdasarkan organ atau golongan sel yang akan
menjadi jalur diferensiasinya, seperti sel punca hematopoietik, sel punca jantung, sel punca
jaringan saraf, sel punca mesenkim, sel punca kulit, dan sebagainya (Halim, et al., 2010). Sel
punca juga digolongkan berdasarkan potensinya yaitu totipoten, pluripoten, multipoten dan
unipoten (Saputra, 2006). Sel punca mesenkim termasuk multipoten karena mampu
berdiferensiasi menjadi beberapa jenis sel, yaitu osteosit, kondrosit, osteoblas, osteoklas,
adiposit, otot, saraf dan tendon (Baksh, et al., 2004; Catherine, Cho & Tuan, 2007; Tuan,
Boland & Tuli, 2002).
Penelitian mengenai sel punca mesenkim sangat berkembang saat ini (Radiana, 2010).
Sel ini cukup mudah diisolasi dari jaringan (Catherine, et al., 2007) seperti sumsum tulang,
darah tali pusat, darah tepi, cairan sinovial dan jaringan adiposa (Hassan & El-Sheemy, 2004;
Tuan, et al., 2002; Pountos & Giannoudis, 2005). Isolasi sel punca mesenkim yang telah
dikembangkan umumnya berasal dari sumsum tulang (Hassan & El-Sheemy, 2004), tetapi
memiliki beberapa kekurangan karena bersifat invasif dalam pengambilannya (Winoto, 2010).
Oleh karena itu, perlu dicari alternatif sumber sel punca yang mudah diisolasi dan dikerjakan,
salah satunya dari darah tepi. Penggunaan darah tepi cukup menguntungkan karena mudah
dalam pengambilan, tidak invasif dan tidak bertentangan secara etis.
Penggunaan Fetal Bovine Serum (FBS) diperlukan untuk meningkatkan proliferasi dan
pelekatan sel (Gstraunthaler, 2003). FBS ditambahkan dalam medium kultur yang cocok untuk
pertumbuhan sel punca mesenkim (Potdar & Subedi, 2011). Selain penggunaan FBS, waktu
penggantian medium kultur awal untuk membuang sel yang tidak melekat pada cawan
diketahui juga berpengaruh terhadap keberhasilan kultur (Bossolasco, et.al., 2012) . Untuk
mengoptimalkan pertumbuhan kultur plastic-adherent cells dari darah tepi ini, maka perlu
dilakukan optimasi dengan variasi waktu penggantian medium kultur awal dan konsentrasi
FBS.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu penggantian medium kultur awal serta
konsentrasi FBS yang paling optimal untuk pertumbuhan plastic-adherent cells.