LAPORAN PRAKTIKUM FUNDAMENTAL OF MOLECUL
LAPORAN PRAKTIKUM
FUNDAMENTAL OF MOLECULAR BIOLOGY
Cutting DNA dan Electroforesis
Disusun oleh:
Tiara Krisnani Muguri
472016017
PROGRAM STUDI GIZI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA
SALATIGA
2017
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Dalam ilmu biologi melekular, aktivitas memotong DNA adalah salah satu kegiatan
yang sering dilakukan. Pemotongan DNA dapat menggunakan enzim endonuklease yang
sering dilakukan dalam teknik biologi molekuler dengan menggunakan DNA sebagai
bahan kajian.
Enzim endonuklease yang memutus ikatan fosfodiester pada DNA dikelompokakan
kedalam nuklease. Enzim nuklease dibagi menjadi dua yakni eksonuklease yang
memutus ikatan fosfodiester mulai dari ujung rantai DNA dan endonuklease yang
memutus ikatan fosfodiester pada bagian dalam rantai DNA.Enzim endonuklease restriksi
mengkatalisis pemotongan DNA pada bagian dalam rantai DNA yang ditandai dengan
adanya urutan nukleotida (4-6 bp) yang khas.Urutan nukleotida yang dikenali oleh enzim
tersebut sering disebut sebagai urutan palindromic, yakni urutan yang apabila dibaca dari
kiri ke kanan sama dengan urutan kalau dibaca dari kanan ke kiri, misalnya 5’AATT 3’
dan 3’TTAA 5’.
Ada berbagai jenis endonuklease restriksi yang berhasil diisolasi dan dapat dibeli
secara komersial, antara lain: EcoR I, Hind III, BamH 1, Sal 1 dan lain-lain. Enzim
tersebut umumnya bekerja optimal pada suhu 37°C dan dalam buffer dengan pH
optimum.
Gambar 1. Sekuens Palindromik.
DNA yang akan diputus ikatan fosfodiesternya oleh enzim tersebut harus memiliki
urutan yang khas yang dikenali oleh enzim yang digunakan. Untuk mengetahui enzim
tersebut bekerja secara baik, maka diperlukan sampel kontrol positif (DNA yang jelas
mengandung daerah restriksi untuk enzim yang digunakan) dan kontrol negatif (DNA
yang tidak diberi enzim yang akan diuji dengan sampel kita).
Apabila yang digunakan sebagai sampel DNA adalah DNA genom maka pemberian
endonuklease restriksi akan menyebabkan fragmen DNA yang ukurannya bervariasi. Jika
yang digunakan DNA plasmid (ukurannya jauh lebih kecil) yang memiliki daerah yang
mampu dikenali endonuklease restriksi maka akan didapatkan sejumlah fragmen DNA
tergantung dari banyaknya daerah restriksi pada DNA plasmid tersebut.
Sebagai contoh DNA yang dipotong adalah DNA plasmid (pGAS102) dan tumbuhan.
Enzim yang mampu memotong untaian DNA pGAS102 dan DNA tumbuhan adalah
enzim nuklease. Atau disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Salah satu enzim yang
dipakai untuk memotong DNA tersebut adalah enzim restriksi nuklease. Enzim ini
mampu memotong DNA pada urutan yang spesifik. Dalam kegiatan praktikum ini
digunakan enzim restriksi endonuklease berupa BamHI yang merupakan enzim restriksi
tipe II. Enzim restriksi tipe II hanya memiliki aktivitas restriksi dengan kofaktor berupa
Mg2+, sementara aktivitas metilasi dilakukan oleh enzim metilase.
Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur
praktikum restriksi plasmid diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut
berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan
aktivitas enzim restriksi. Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan
fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′
Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G),
sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI
berupa formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau
sticky ends. Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens non-spesifik
di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut
menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa
konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara
nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah.
Pada tahap pemotongan plasmid pGAS102 dan genom tumbuhan, selain diberi enzim
restriksi BamHI juga diberi buffer yang terdiri dari 500mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM
MgCl2, 10mM Dithiothreitol (DTT), dan 100mM NaCl. Buffer Tris-HCl digunakan
untuk mempertahankan keoptimalan pH enzim. Hal ini dikarenakan Tris-HCl merupakan
buffer dengan rentang pH 7-9 yang secara tipikal mampu mempertahankan keadaan
fisiologis seperti dalam sel .
Kombinasi Tris-HCl dan NaCl akan mengaktifkan kinerja enzim
endonuklease.
Selain itu, adanya MgCl2 seperti yang dijelaskan sebelumnya mampu memberikan
konstribusi ion bivalen berupa Mg2+ yang bertindak sebagai kofaktor enzim BamHI yang
bertujuan agar meningkatkan kinerja enzim tersebut .
Adapun fungsi ¬Dithiothreitol (DTT) selain sebagai buffer, DTT juga memiliki fungsi
sebagai penstabil terhadap oksidasi oleh udara atau antioksidan yang bertujuan agar DNA
tidak mengalami kerusakan oksidatif selam proses restriksi (Tamam, 2016).
1.2 Tujuan Praktikum
Praktikum kali ini bertujuan agar mahasiswa mampu menjalankan tahapan-tahapan
cutting DNA dengan benar dan mampu memotong DNA genom dan/atau DNA lamda
menggunakan enzim restriksi. Selain itu praktikan juga mampu menjalankan tahapantahapan elektroforesis dengan baik, dan mampu membaca dan mengidentifikasi
keberadaan DNA berdasarkan pita-pita pada gel agarose.
BAB II
MATERI DAN METODOLOGI
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum dilaksanakan pada hari Kamis, 20 Juli 2017 dan Kamis, 27 Juli 2017,
pukul 10.00 – 13.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekular, Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan, Universitas Kristen Satya Wacana.
2.2 Alat dan Bahan
2.2.1 Cutting DNA
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Microtube (tabung ependorf
0,5 μl), rak tabung ependorf, micropipet, tip, water bath, box ice, vortex, dan spidol.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel DNA (genom &
lamda), Enzim restriksi (EcoRV, XhoI, SMAI, NoteI), buffer, aquades, dan ice.
2.2.2 Electroforesis
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah alat elektroforesis (tray/cetakan
gel, sisir, tangki, power suplly), beaker glass, gelas ukur, neraca analitik, hotplate, gel
doc (UV transiluminator), mikropipet dan tip, dan kertas parafilm. Bahan-bahan yang
digunakan dalam praktikum ini adalah Sampel DNA, DNA marker, agarose, larutan
buffer TAE (tris-base, EDTA, aseta glacial), aquades, loading dye, dan larutan ETBR.
2.3 Metode
2.3.1 Cutting DNA
Disiapkan microtube steril kemudian diberi label sesuai sampel yang akan
dipotong dan enzim pemotongannya. Selanjutnya dimasukkan 4 μl sampel DNA ke
dalam microtube. Lalu ditambahkan 2 μl buffer 1x yang disesuaikan dengan enzim
yang digunakan. Ditambahkan 1 μl enzim restriksi. Kemudian ditambahkan aquades
sampai volume total mencapai 20 μl. Larutan diinkubasi di waterbath dengan suhu
36oC selama 2 jam. Setelah selesai microtube disimpan di dalam kulkas dengan suhu
4oC.
2.3.2 Electroforesis
i. Larutan Buffer TAE 1x
Dibuat 500 ml larutan TAE 1x menggunakan stok larutan TAE 50x. Lalu
diambil Buffer TAE 50x sebanyak 10 ml dan diencerkan dengan aquades sampai
volume 500 ml. Buffer TAE dipakai sebagai perendam agarose gel dan juga sebagai
penghantar arus listrik saat running electroforesis.
ii. Buat Agarose gel
Dibuat agarose gel dengan konsentrasi 0,8% dengan pelarut menggunakan
Buffer TAE 1x di atas dengan volume total 80 ml. Kemudian timbang agarose
sebanyak 0,64 gr dalam eaker glass 100 ml. Lalu ditambahkan larutan TAE 1x
sampai volume 80 ml. Dipanaskan larutan agarose menggunakan hotplate dengan
magnetic stirrer sampai larutan berubah menjadi bening (jernih). Setelah itu,
disiapkan wadah pencetak gel agarose, pastikan bagian tutup samping dan sistem
pencetak sumur telah terpasang dengan benar. Terakhir, larutan agarose dituang ke
wadah penectak gel, lalu ditunggu sampai gel mengeras. Tutup samping dan sisiran
dilepaskan secara perlahan dan hati-hati jangan sampai merusak gel dan sumurnya.
iii. Setting alat dan persiapan sampel
Wadah dan agarose gel diletakkan secara perlahan dan hati-hati ke dalam
chamber alat elektroforesis. Lalu dituang larutan TAE 1x ke dalam chamber
secara perlahan sampai menutupi permukaan gel agarose, lebih kurang 2-3 ml di
atas permukaan agarose gel atau sesuai garis petunjuk pada chamber. Kemudian,
siapkan sampel DNA hasil isolasi dan loading dye dalam box ice, termasuk DNA
marker yang akan digunakan. Informasi DNA marker yang digunakan dicatat
untuk kebutuhan identifikasi. Disiapkan 10 μl sampel yang merupakan campuran
sampel DNA dan loading dye dengan perbandingan 4 DNA berbanding 1 loading
dye. Selanjutnya, diambil loading dye 2 μl lalu ditempatkan pada kertas parafilm,
kemudian diambil 8 μl sampel DNA dan di campurkan dengan loading dye
sampai tercampur merata. Setelah itu masukkan sampel ke dalam sumuran pada
agarose gel dengan hati-hati jangan sampai ujung tip merusak sumur atau sampel
tidak masuk ke dalam sumur. Lakukan untuk semua sampel DNA dan DNA
marker, untuk DNA marker cukup gunakan 5 μl.
iv. Running
Semua sampel DNA dan DNA marker harus dipastikan telah siap dalam
sumuran dan kode sampel dan nomor sumuran telah tercatat. Kemudian, dipasang
penutup alat elektroforesis dan kabel power dari power suplly pada electroda
masing-masing. Terakhir, dihidupkan power suply dan diatur tegangan lebih
kurang 40 – 50 volt dan arus listrik lebih kurang 180 mA. Setelah semua siap, di
running selama lebih kurang 1 jam.
v.
Deteksi dan Identifikasi
Selesai running, diambil agarose gel dan dipindahakn ke dalam wadah
perendaman did alam lemari asam. Lalu dituang larutan ETBR ke dalam wadah
perendaman sampai seluruh gel terendam. Didiamkan selama lebih kurang 20
menit. Setelah itu, diambil agarose del dan dimasukkan ke dalam gel doc untuk
proses visualisasi dengan bantuan sinar UV. Dokumentasikan hasil visualisasi.
Selanjutnya, agarose gel yang sudah selesai digunakan dipindahkan ke dalam
beaker glass lalu dipanaskan di hotplate sampai larut kembali. Larutan dibuang ke
dalam botol limbah yang sudah diberi label. Terakhir, gambar hasil dokumentasi
diberi label dan keterangan.
BAB III
HASIL
3.1 Gambar hasil Cutting DNA
Ke
Keterangan :
Sumur
Tipe DNA
Enzim restriksi
Hasil Elektroforesis
4
Lamda
Sal I
-
5
Genom
Sal I
-
6
Lamda
Sal I
-
7
Genom
Sal I
-
8
Lamda
Sal I
-
9
Lamda
Sal I
-
10
Genom
Xho I
Terpotong
11
Lamda
Xho I
-
12
DNA Marker
Terpotong
BAB IV
PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan dua tahap percobaan yaitu cutting DNA dan
elektroforesis. Cutting DNA atau pemotongan DNA adalah proses pemotongan DNA baik itu
DNA genom ataupun lamda dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi / enzim
endonuklease sendiri adalah salah satu enzim yang banyak digunakan dalam bidan rekayasa
genetika, karena mampu memotong ADN atau ARN pada posisi tertentu. Karena
kemampuannya ini endonuklease dijuluki ‘gunting Biologi’.
Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba
yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan enzim
restriksi endonuklease atau sering disebut endonuklease. Enzim tersebut mengenal dan
memotong DNA pada sekuen spesifik yang panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa nitrogen.
Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk memotong dan menghancurkan
menghancurkan DNA virus yang menginfeksinya. Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim
restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim
restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim
tersebut. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens tertentu dan mampu memotong bagian
yang khas pada DNA. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi
ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal sebenarnya adalah sejumlah urutan
basa nitrogen tertentu yang oleh enzim restriksi dikenali sebagai tempat atau bagian yang
akan dipotongnya (Isahi, 2011).
Salah satu contoh enzim retriksi adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali
oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcorI memotong
DNA pada bagian yang urutan basanya GAATTC karena bagian inilah sekuen pengenal bagi
EcoRI. Pada sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya bagian atau situs antara
G (guanin) dan A (adenin). Pada DNA utas ganda, sekuen GAATTC ini akan berpasangan
dengan pasangan sekuen yang sama tetapi berlawanan arah. Jadi pasangan GAATTC adalah
CTTAAG. Pada pasangan sekuen ini enzim EcoRI ini memotong bagian antara A dan G.
Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang
dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan
istilah sticky ends atau cohesive ends (Isahi, 2011).
Kemampuan memotong DNA pada sisi spesifik menjadi tonggak penting dalam
pengembangan manipulasi DNA saat ini. Penamaan enzim restriksi didasarkan pada sistem
sederhana yang diusulkan oleh Smith and Nathans. Nama enzim (seperti BamHI, EcoRI)
menunjukkan asal enzim, tetapi tidak menunjukkan informasi sekuen pengenal. Sisi
pengenalan enzim restriksi pada umumnya adalah urutan basa nitrogen dengan panjang 4, 5,
atau 6 pasang basa nitrogen seperti AGCT (untuk AluI), GAATTC (untuk EcoRI), dan lain
sebagainya. Masing-masing enzim restriksi memotong urutan basa nitrogen pada sisi spesifik.
Dua enzim berbeda dapat mempunya urutan pengenalan yang sama, tetapi memotong DNA
pada titik berbeda di dalam urutan basa tersebut (Isahi, 2011).
Dalam praktikum ini juga digunakan dua tipe DNA yaitu DNA genom dan DNA
lamda. DNA genom yaitu seluruh DNA yang ada pada suatu organisme (makhluk hidup),
baik yang berfungsi atau yang tidak, baik yang ada di inti sel, mitokondria, atau kloroplas.
Atau dengan kata lain DNA genom adalah DNA mentah yang masih memiliki komponen
lengkap seperti promoter gen, bagian exon, dan bagian intron (Biotektanaman, 2009). DNA
lamda adalah kebalikan dari DNA genom yaitu DNA yang tidak utuh lagi.
Selain cutting DNA terdapat tahap kedua yaitu elektroforesis. Elektroforesis gel
agarose adalah teknik pemisahan DNA dengan memanfaatkan perbedaan laju pergerakannya
di dalam medan listrik dengan menggunakan gel agarose sebagai medium penyangga.
Agarose merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit
mengandung sulfat. Agarose dikenal sebagai fraksi pembentuk gel dari agar-agar, dimana
sifat-sifat gel yang dihasilkanya mendekati sifat-sifat gel yang ideal untuk keperluan bidang
bioteknologi. Agarose diekstrak dari rumput laut yang merupakan polimer yang komponen
monomer
utamnya
adalah
D-galaktosa
dan
3,6-anhidro-L-galaktosa.
Keuntungan
menggunakan gel agarose adalah mempunyai kapasitas yang besar, mampu memisahkan
fragmen DNA dengan panjang antara 50 pb sampai 50.000 pb, mudah, cepat dalam
pembuatatannya, dan fragmen DNA yang diperoleh dari hasil pemisahannya dapat diperoleh
kembali untuk tujuan tertentu dalam keadaan tidak rusak (Setiadi, 2014) .
Agarose murni terbentuk bubuk dan tidak larut dalam air (maupun Buffer) pada suhu
kamar namun larut pada air mendidih oleh karena itu untuk memurnikan gel agarose
digunakan microwave untuk melarutkan agarose dalam Buffer seperti yang dilakukan dalam
praktikum elektroforesis kali ini. Agarose mengalami polimerase. Polimer gula berikatan
silang satu sama lain dan menyebabkan perubahan dari larutan gel menjadi larutan dalam air
mendidih semakin padat gel yang akan terbentuk. Larutan tersebut harus ditunggu sampai
cukup hangat sebelum dimasukkan kedalam casting try. Elektroforesis merupakan proses
penyaringan, semakin besar fragmen DNA semakin mudah terjerat dalam matriks dan
migrasinya menjadi lambat sedangkan fragmen yang kecil akan semakin sulit terjerat dan
akan bergerak lebih cepat pada laju proporsional sesuai dengan ukurannya. Dari hasil
praktikum adanya DNA yang menunjukkan adanya pergerakan DNA karena pada saat arus
listrik diaplikasikan pada gel molekul yang bermuatan negatif akan menuju elektroda positif
dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda yang bermuatan negatif, jadi ia
bergerak menuju ke muatan positif. Yang perlu diperhatikan adalah pemberian arus listrik
pada gel agarose tidak bisa sembarangan karena jika terlalu besar, dapat mengakibatkan
panas yang akan mengubah bentuk pita DNA (Setiadi, 2014).
Dari gambar hasil elektroforesis diperoleh hasil yaitu pada sumur 10 (Genom+XhoI)
dan sumur 12 (DNA marker) yang terpotong. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan
telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil
apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda
posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya
(Martin, 1996). Hasil yang tidak terbaca ini diakibatkan karena kurangnya ketelitian saat
memasukkan sampel kedalam sumur, dan hasilnya juga tergantung dengan keberadaan DNA
sendiri semakin besar molekul DNA maka akan semakin lambat pergerakannya sehingga
pada saat pembacaan hasil elektroforesis DNA yang muatannya kecil lebih jelas
dibandingkan dengan DNA yang bermuatan besar, hasil elektroforesi juga tergantung pada
tegangan listrik yang digunakan semakin besar kuat arus maka kecepatan running pada DNA
akan semakin cepat, selain itu proses elektroforesis juga tergantung pada keberadaan buffer
yang digunakan, semakin tinggi konsenterasi buffer maka akan menghambat proses motilitas
DNA dan konsentrasi gel agarose juga berpengaruh terhadap hasil elektroforesis karena
semakin tinggi konsentrasi gel agarose maka pori-pori gel yang terbentuk akan semakin kecil
sehingga sulit untuk ditembus DNA hal ini dapat berpengaruh pada motilitas DNA.
Pada beberapa sumur juga terjadi pemotongan hanya saja hasilnya sangat kecil
sehingga tidak telalu kelihatan. Berdasarkan hasil yang di dapat terlihat ada dua pita yang
terbentuk, satu pita berada diatas dan satu pita berada di bawah. Pita yang berada diatas
disebut vector karena ukurannya lebih besar dan yang di bawah disebut insert, hal itu terjadi
karena adanya perbedaan berat diantara vektor dan insert. Namun dalam foto terlihat ada
beberapa sumur yang hanya memiliki satu pita DNA, hal itu dapat disebabkan oleh kesalahan
teknis yang dilakukan praktikan. Hal ini juga dapat disebabkan kemungkinan terjadi pada
saat proses pengambilan plasmid, ketika proses pelisisan membran oleh EDTA.
Kemungkinan karena kurang sempurnanya proses tersebut tidah hanya plasmid yang terambil
atau terbawa, tetapi juga ikutnya DNA genom yang ukurannya lebih besar dibandingkan
plasmid (Pariama, 2017).
BAB V
KESIMPULAN
Cutting DNA atau pemotongan DNA adalah proses pemotongan DNA baik itu DNA
genom ataupun lamda dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi / enzim
endonuklease sendiri adalah salah satu enzim yang banyak digunakan dalam bidang rekayasa
genetika, karena mampu memotong ADN atau ARN pada posisi tertentu. Karena
kemampuannya ini endonuklease dijuluki ‘gunting Biologi’. Dari gambar hasil elektroforesis
diperoleh hasil yaitu pada sumur 10 (Genom+XhoI) dan sumur 12 (DNA marker) yang
terpotong. Ada beberapa faktor yang menyebabkan terjadinya kegagalan pada praktikum kali
ini selain dari kelalaian praktikan, diantaranya adalah faktor tegangan listrik pada saat proses
elektroforesis, selain itu bergantung juga pada konsentrasi buffer.
DAFTAR PUSTAKA
Biotektanaman. 2009. DNA Genomik. Diperoleh pada Senin 31 Juli 2017, dari
https://biotektanaman.wordpress.com/2009/06/22/dna-genomik-apakah-itu/
Isahi. 2011. Mengenal Enzim Endonuklease. Diperoleh pada Senin 31 Juli 2017, dari
http://biologimediacentre.com/mengenal-enzim-endonuklease/
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford.
Pariama, Sesha. 2017. Laporan Praktikum 4 Cutting DNA. Diperoleh pada Senin 31 Juli
2017, dari https://www.academia.edu/30170783/laporan_4_cutting_dna.docx
Setiadi, Eko, dkk. 2014. Elektroforesis pada Gel Agarose. Diperoleh pada Senin 31 Juli
2017, dari https://www.academia.edu/12162613/Proses_Elekroforesis_DNA
Tamam, Badrut. 2016. Bagaimana Cara Memotong DNA. Diperoleh pada Senin 31 Juli
2017, dari http://www.generasibiologi.com/2016/03/bagaima-cara-memotong-dna.html
FUNDAMENTAL OF MOLECULAR BIOLOGY
Cutting DNA dan Electroforesis
Disusun oleh:
Tiara Krisnani Muguri
472016017
PROGRAM STUDI GIZI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA
SALATIGA
2017
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Dalam ilmu biologi melekular, aktivitas memotong DNA adalah salah satu kegiatan
yang sering dilakukan. Pemotongan DNA dapat menggunakan enzim endonuklease yang
sering dilakukan dalam teknik biologi molekuler dengan menggunakan DNA sebagai
bahan kajian.
Enzim endonuklease yang memutus ikatan fosfodiester pada DNA dikelompokakan
kedalam nuklease. Enzim nuklease dibagi menjadi dua yakni eksonuklease yang
memutus ikatan fosfodiester mulai dari ujung rantai DNA dan endonuklease yang
memutus ikatan fosfodiester pada bagian dalam rantai DNA.Enzim endonuklease restriksi
mengkatalisis pemotongan DNA pada bagian dalam rantai DNA yang ditandai dengan
adanya urutan nukleotida (4-6 bp) yang khas.Urutan nukleotida yang dikenali oleh enzim
tersebut sering disebut sebagai urutan palindromic, yakni urutan yang apabila dibaca dari
kiri ke kanan sama dengan urutan kalau dibaca dari kanan ke kiri, misalnya 5’AATT 3’
dan 3’TTAA 5’.
Ada berbagai jenis endonuklease restriksi yang berhasil diisolasi dan dapat dibeli
secara komersial, antara lain: EcoR I, Hind III, BamH 1, Sal 1 dan lain-lain. Enzim
tersebut umumnya bekerja optimal pada suhu 37°C dan dalam buffer dengan pH
optimum.
Gambar 1. Sekuens Palindromik.
DNA yang akan diputus ikatan fosfodiesternya oleh enzim tersebut harus memiliki
urutan yang khas yang dikenali oleh enzim yang digunakan. Untuk mengetahui enzim
tersebut bekerja secara baik, maka diperlukan sampel kontrol positif (DNA yang jelas
mengandung daerah restriksi untuk enzim yang digunakan) dan kontrol negatif (DNA
yang tidak diberi enzim yang akan diuji dengan sampel kita).
Apabila yang digunakan sebagai sampel DNA adalah DNA genom maka pemberian
endonuklease restriksi akan menyebabkan fragmen DNA yang ukurannya bervariasi. Jika
yang digunakan DNA plasmid (ukurannya jauh lebih kecil) yang memiliki daerah yang
mampu dikenali endonuklease restriksi maka akan didapatkan sejumlah fragmen DNA
tergantung dari banyaknya daerah restriksi pada DNA plasmid tersebut.
Sebagai contoh DNA yang dipotong adalah DNA plasmid (pGAS102) dan tumbuhan.
Enzim yang mampu memotong untaian DNA pGAS102 dan DNA tumbuhan adalah
enzim nuklease. Atau disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Salah satu enzim yang
dipakai untuk memotong DNA tersebut adalah enzim restriksi nuklease. Enzim ini
mampu memotong DNA pada urutan yang spesifik. Dalam kegiatan praktikum ini
digunakan enzim restriksi endonuklease berupa BamHI yang merupakan enzim restriksi
tipe II. Enzim restriksi tipe II hanya memiliki aktivitas restriksi dengan kofaktor berupa
Mg2+, sementara aktivitas metilasi dilakukan oleh enzim metilase.
Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur
praktikum restriksi plasmid diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut
berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan
aktivitas enzim restriksi. Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan
fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′
Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G),
sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI
berupa formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau
sticky ends. Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens non-spesifik
di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut
menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa
konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara
nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah.
Pada tahap pemotongan plasmid pGAS102 dan genom tumbuhan, selain diberi enzim
restriksi BamHI juga diberi buffer yang terdiri dari 500mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM
MgCl2, 10mM Dithiothreitol (DTT), dan 100mM NaCl. Buffer Tris-HCl digunakan
untuk mempertahankan keoptimalan pH enzim. Hal ini dikarenakan Tris-HCl merupakan
buffer dengan rentang pH 7-9 yang secara tipikal mampu mempertahankan keadaan
fisiologis seperti dalam sel .
Kombinasi Tris-HCl dan NaCl akan mengaktifkan kinerja enzim
endonuklease.
Selain itu, adanya MgCl2 seperti yang dijelaskan sebelumnya mampu memberikan
konstribusi ion bivalen berupa Mg2+ yang bertindak sebagai kofaktor enzim BamHI yang
bertujuan agar meningkatkan kinerja enzim tersebut .
Adapun fungsi ¬Dithiothreitol (DTT) selain sebagai buffer, DTT juga memiliki fungsi
sebagai penstabil terhadap oksidasi oleh udara atau antioksidan yang bertujuan agar DNA
tidak mengalami kerusakan oksidatif selam proses restriksi (Tamam, 2016).
1.2 Tujuan Praktikum
Praktikum kali ini bertujuan agar mahasiswa mampu menjalankan tahapan-tahapan
cutting DNA dengan benar dan mampu memotong DNA genom dan/atau DNA lamda
menggunakan enzim restriksi. Selain itu praktikan juga mampu menjalankan tahapantahapan elektroforesis dengan baik, dan mampu membaca dan mengidentifikasi
keberadaan DNA berdasarkan pita-pita pada gel agarose.
BAB II
MATERI DAN METODOLOGI
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum dilaksanakan pada hari Kamis, 20 Juli 2017 dan Kamis, 27 Juli 2017,
pukul 10.00 – 13.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekular, Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan, Universitas Kristen Satya Wacana.
2.2 Alat dan Bahan
2.2.1 Cutting DNA
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Microtube (tabung ependorf
0,5 μl), rak tabung ependorf, micropipet, tip, water bath, box ice, vortex, dan spidol.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sampel DNA (genom &
lamda), Enzim restriksi (EcoRV, XhoI, SMAI, NoteI), buffer, aquades, dan ice.
2.2.2 Electroforesis
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah alat elektroforesis (tray/cetakan
gel, sisir, tangki, power suplly), beaker glass, gelas ukur, neraca analitik, hotplate, gel
doc (UV transiluminator), mikropipet dan tip, dan kertas parafilm. Bahan-bahan yang
digunakan dalam praktikum ini adalah Sampel DNA, DNA marker, agarose, larutan
buffer TAE (tris-base, EDTA, aseta glacial), aquades, loading dye, dan larutan ETBR.
2.3 Metode
2.3.1 Cutting DNA
Disiapkan microtube steril kemudian diberi label sesuai sampel yang akan
dipotong dan enzim pemotongannya. Selanjutnya dimasukkan 4 μl sampel DNA ke
dalam microtube. Lalu ditambahkan 2 μl buffer 1x yang disesuaikan dengan enzim
yang digunakan. Ditambahkan 1 μl enzim restriksi. Kemudian ditambahkan aquades
sampai volume total mencapai 20 μl. Larutan diinkubasi di waterbath dengan suhu
36oC selama 2 jam. Setelah selesai microtube disimpan di dalam kulkas dengan suhu
4oC.
2.3.2 Electroforesis
i. Larutan Buffer TAE 1x
Dibuat 500 ml larutan TAE 1x menggunakan stok larutan TAE 50x. Lalu
diambil Buffer TAE 50x sebanyak 10 ml dan diencerkan dengan aquades sampai
volume 500 ml. Buffer TAE dipakai sebagai perendam agarose gel dan juga sebagai
penghantar arus listrik saat running electroforesis.
ii. Buat Agarose gel
Dibuat agarose gel dengan konsentrasi 0,8% dengan pelarut menggunakan
Buffer TAE 1x di atas dengan volume total 80 ml. Kemudian timbang agarose
sebanyak 0,64 gr dalam eaker glass 100 ml. Lalu ditambahkan larutan TAE 1x
sampai volume 80 ml. Dipanaskan larutan agarose menggunakan hotplate dengan
magnetic stirrer sampai larutan berubah menjadi bening (jernih). Setelah itu,
disiapkan wadah pencetak gel agarose, pastikan bagian tutup samping dan sistem
pencetak sumur telah terpasang dengan benar. Terakhir, larutan agarose dituang ke
wadah penectak gel, lalu ditunggu sampai gel mengeras. Tutup samping dan sisiran
dilepaskan secara perlahan dan hati-hati jangan sampai merusak gel dan sumurnya.
iii. Setting alat dan persiapan sampel
Wadah dan agarose gel diletakkan secara perlahan dan hati-hati ke dalam
chamber alat elektroforesis. Lalu dituang larutan TAE 1x ke dalam chamber
secara perlahan sampai menutupi permukaan gel agarose, lebih kurang 2-3 ml di
atas permukaan agarose gel atau sesuai garis petunjuk pada chamber. Kemudian,
siapkan sampel DNA hasil isolasi dan loading dye dalam box ice, termasuk DNA
marker yang akan digunakan. Informasi DNA marker yang digunakan dicatat
untuk kebutuhan identifikasi. Disiapkan 10 μl sampel yang merupakan campuran
sampel DNA dan loading dye dengan perbandingan 4 DNA berbanding 1 loading
dye. Selanjutnya, diambil loading dye 2 μl lalu ditempatkan pada kertas parafilm,
kemudian diambil 8 μl sampel DNA dan di campurkan dengan loading dye
sampai tercampur merata. Setelah itu masukkan sampel ke dalam sumuran pada
agarose gel dengan hati-hati jangan sampai ujung tip merusak sumur atau sampel
tidak masuk ke dalam sumur. Lakukan untuk semua sampel DNA dan DNA
marker, untuk DNA marker cukup gunakan 5 μl.
iv. Running
Semua sampel DNA dan DNA marker harus dipastikan telah siap dalam
sumuran dan kode sampel dan nomor sumuran telah tercatat. Kemudian, dipasang
penutup alat elektroforesis dan kabel power dari power suplly pada electroda
masing-masing. Terakhir, dihidupkan power suply dan diatur tegangan lebih
kurang 40 – 50 volt dan arus listrik lebih kurang 180 mA. Setelah semua siap, di
running selama lebih kurang 1 jam.
v.
Deteksi dan Identifikasi
Selesai running, diambil agarose gel dan dipindahakn ke dalam wadah
perendaman did alam lemari asam. Lalu dituang larutan ETBR ke dalam wadah
perendaman sampai seluruh gel terendam. Didiamkan selama lebih kurang 20
menit. Setelah itu, diambil agarose del dan dimasukkan ke dalam gel doc untuk
proses visualisasi dengan bantuan sinar UV. Dokumentasikan hasil visualisasi.
Selanjutnya, agarose gel yang sudah selesai digunakan dipindahkan ke dalam
beaker glass lalu dipanaskan di hotplate sampai larut kembali. Larutan dibuang ke
dalam botol limbah yang sudah diberi label. Terakhir, gambar hasil dokumentasi
diberi label dan keterangan.
BAB III
HASIL
3.1 Gambar hasil Cutting DNA
Ke
Keterangan :
Sumur
Tipe DNA
Enzim restriksi
Hasil Elektroforesis
4
Lamda
Sal I
-
5
Genom
Sal I
-
6
Lamda
Sal I
-
7
Genom
Sal I
-
8
Lamda
Sal I
-
9
Lamda
Sal I
-
10
Genom
Xho I
Terpotong
11
Lamda
Xho I
-
12
DNA Marker
Terpotong
BAB IV
PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan dua tahap percobaan yaitu cutting DNA dan
elektroforesis. Cutting DNA atau pemotongan DNA adalah proses pemotongan DNA baik itu
DNA genom ataupun lamda dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi / enzim
endonuklease sendiri adalah salah satu enzim yang banyak digunakan dalam bidan rekayasa
genetika, karena mampu memotong ADN atau ARN pada posisi tertentu. Karena
kemampuannya ini endonuklease dijuluki ‘gunting Biologi’.
Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba
yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan enzim
restriksi endonuklease atau sering disebut endonuklease. Enzim tersebut mengenal dan
memotong DNA pada sekuen spesifik yang panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa nitrogen.
Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk memotong dan menghancurkan
menghancurkan DNA virus yang menginfeksinya. Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim
restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim
restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim
tersebut. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens tertentu dan mampu memotong bagian
yang khas pada DNA. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi
ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal sebenarnya adalah sejumlah urutan
basa nitrogen tertentu yang oleh enzim restriksi dikenali sebagai tempat atau bagian yang
akan dipotongnya (Isahi, 2011).
Salah satu contoh enzim retriksi adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali
oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcorI memotong
DNA pada bagian yang urutan basanya GAATTC karena bagian inilah sekuen pengenal bagi
EcoRI. Pada sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya bagian atau situs antara
G (guanin) dan A (adenin). Pada DNA utas ganda, sekuen GAATTC ini akan berpasangan
dengan pasangan sekuen yang sama tetapi berlawanan arah. Jadi pasangan GAATTC adalah
CTTAAG. Pada pasangan sekuen ini enzim EcoRI ini memotong bagian antara A dan G.
Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang
dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan
istilah sticky ends atau cohesive ends (Isahi, 2011).
Kemampuan memotong DNA pada sisi spesifik menjadi tonggak penting dalam
pengembangan manipulasi DNA saat ini. Penamaan enzim restriksi didasarkan pada sistem
sederhana yang diusulkan oleh Smith and Nathans. Nama enzim (seperti BamHI, EcoRI)
menunjukkan asal enzim, tetapi tidak menunjukkan informasi sekuen pengenal. Sisi
pengenalan enzim restriksi pada umumnya adalah urutan basa nitrogen dengan panjang 4, 5,
atau 6 pasang basa nitrogen seperti AGCT (untuk AluI), GAATTC (untuk EcoRI), dan lain
sebagainya. Masing-masing enzim restriksi memotong urutan basa nitrogen pada sisi spesifik.
Dua enzim berbeda dapat mempunya urutan pengenalan yang sama, tetapi memotong DNA
pada titik berbeda di dalam urutan basa tersebut (Isahi, 2011).
Dalam praktikum ini juga digunakan dua tipe DNA yaitu DNA genom dan DNA
lamda. DNA genom yaitu seluruh DNA yang ada pada suatu organisme (makhluk hidup),
baik yang berfungsi atau yang tidak, baik yang ada di inti sel, mitokondria, atau kloroplas.
Atau dengan kata lain DNA genom adalah DNA mentah yang masih memiliki komponen
lengkap seperti promoter gen, bagian exon, dan bagian intron (Biotektanaman, 2009). DNA
lamda adalah kebalikan dari DNA genom yaitu DNA yang tidak utuh lagi.
Selain cutting DNA terdapat tahap kedua yaitu elektroforesis. Elektroforesis gel
agarose adalah teknik pemisahan DNA dengan memanfaatkan perbedaan laju pergerakannya
di dalam medan listrik dengan menggunakan gel agarose sebagai medium penyangga.
Agarose merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit
mengandung sulfat. Agarose dikenal sebagai fraksi pembentuk gel dari agar-agar, dimana
sifat-sifat gel yang dihasilkanya mendekati sifat-sifat gel yang ideal untuk keperluan bidang
bioteknologi. Agarose diekstrak dari rumput laut yang merupakan polimer yang komponen
monomer
utamnya
adalah
D-galaktosa
dan
3,6-anhidro-L-galaktosa.
Keuntungan
menggunakan gel agarose adalah mempunyai kapasitas yang besar, mampu memisahkan
fragmen DNA dengan panjang antara 50 pb sampai 50.000 pb, mudah, cepat dalam
pembuatatannya, dan fragmen DNA yang diperoleh dari hasil pemisahannya dapat diperoleh
kembali untuk tujuan tertentu dalam keadaan tidak rusak (Setiadi, 2014) .
Agarose murni terbentuk bubuk dan tidak larut dalam air (maupun Buffer) pada suhu
kamar namun larut pada air mendidih oleh karena itu untuk memurnikan gel agarose
digunakan microwave untuk melarutkan agarose dalam Buffer seperti yang dilakukan dalam
praktikum elektroforesis kali ini. Agarose mengalami polimerase. Polimer gula berikatan
silang satu sama lain dan menyebabkan perubahan dari larutan gel menjadi larutan dalam air
mendidih semakin padat gel yang akan terbentuk. Larutan tersebut harus ditunggu sampai
cukup hangat sebelum dimasukkan kedalam casting try. Elektroforesis merupakan proses
penyaringan, semakin besar fragmen DNA semakin mudah terjerat dalam matriks dan
migrasinya menjadi lambat sedangkan fragmen yang kecil akan semakin sulit terjerat dan
akan bergerak lebih cepat pada laju proporsional sesuai dengan ukurannya. Dari hasil
praktikum adanya DNA yang menunjukkan adanya pergerakan DNA karena pada saat arus
listrik diaplikasikan pada gel molekul yang bermuatan negatif akan menuju elektroda positif
dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda yang bermuatan negatif, jadi ia
bergerak menuju ke muatan positif. Yang perlu diperhatikan adalah pemberian arus listrik
pada gel agarose tidak bisa sembarangan karena jika terlalu besar, dapat mengakibatkan
panas yang akan mengubah bentuk pita DNA (Setiadi, 2014).
Dari gambar hasil elektroforesis diperoleh hasil yaitu pada sumur 10 (Genom+XhoI)
dan sumur 12 (DNA marker) yang terpotong. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan
telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil
apmlifikasi. Marker DNA yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda
posisi molekul DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya
(Martin, 1996). Hasil yang tidak terbaca ini diakibatkan karena kurangnya ketelitian saat
memasukkan sampel kedalam sumur, dan hasilnya juga tergantung dengan keberadaan DNA
sendiri semakin besar molekul DNA maka akan semakin lambat pergerakannya sehingga
pada saat pembacaan hasil elektroforesis DNA yang muatannya kecil lebih jelas
dibandingkan dengan DNA yang bermuatan besar, hasil elektroforesi juga tergantung pada
tegangan listrik yang digunakan semakin besar kuat arus maka kecepatan running pada DNA
akan semakin cepat, selain itu proses elektroforesis juga tergantung pada keberadaan buffer
yang digunakan, semakin tinggi konsenterasi buffer maka akan menghambat proses motilitas
DNA dan konsentrasi gel agarose juga berpengaruh terhadap hasil elektroforesis karena
semakin tinggi konsentrasi gel agarose maka pori-pori gel yang terbentuk akan semakin kecil
sehingga sulit untuk ditembus DNA hal ini dapat berpengaruh pada motilitas DNA.
Pada beberapa sumur juga terjadi pemotongan hanya saja hasilnya sangat kecil
sehingga tidak telalu kelihatan. Berdasarkan hasil yang di dapat terlihat ada dua pita yang
terbentuk, satu pita berada diatas dan satu pita berada di bawah. Pita yang berada diatas
disebut vector karena ukurannya lebih besar dan yang di bawah disebut insert, hal itu terjadi
karena adanya perbedaan berat diantara vektor dan insert. Namun dalam foto terlihat ada
beberapa sumur yang hanya memiliki satu pita DNA, hal itu dapat disebabkan oleh kesalahan
teknis yang dilakukan praktikan. Hal ini juga dapat disebabkan kemungkinan terjadi pada
saat proses pengambilan plasmid, ketika proses pelisisan membran oleh EDTA.
Kemungkinan karena kurang sempurnanya proses tersebut tidah hanya plasmid yang terambil
atau terbawa, tetapi juga ikutnya DNA genom yang ukurannya lebih besar dibandingkan
plasmid (Pariama, 2017).
BAB V
KESIMPULAN
Cutting DNA atau pemotongan DNA adalah proses pemotongan DNA baik itu DNA
genom ataupun lamda dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi / enzim
endonuklease sendiri adalah salah satu enzim yang banyak digunakan dalam bidang rekayasa
genetika, karena mampu memotong ADN atau ARN pada posisi tertentu. Karena
kemampuannya ini endonuklease dijuluki ‘gunting Biologi’. Dari gambar hasil elektroforesis
diperoleh hasil yaitu pada sumur 10 (Genom+XhoI) dan sumur 12 (DNA marker) yang
terpotong. Ada beberapa faktor yang menyebabkan terjadinya kegagalan pada praktikum kali
ini selain dari kelalaian praktikan, diantaranya adalah faktor tegangan listrik pada saat proses
elektroforesis, selain itu bergantung juga pada konsentrasi buffer.
DAFTAR PUSTAKA
Biotektanaman. 2009. DNA Genomik. Diperoleh pada Senin 31 Juli 2017, dari
https://biotektanaman.wordpress.com/2009/06/22/dna-genomik-apakah-itu/
Isahi. 2011. Mengenal Enzim Endonuklease. Diperoleh pada Senin 31 Juli 2017, dari
http://biologimediacentre.com/mengenal-enzim-endonuklease/
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford.
Pariama, Sesha. 2017. Laporan Praktikum 4 Cutting DNA. Diperoleh pada Senin 31 Juli
2017, dari https://www.academia.edu/30170783/laporan_4_cutting_dna.docx
Setiadi, Eko, dkk. 2014. Elektroforesis pada Gel Agarose. Diperoleh pada Senin 31 Juli
2017, dari https://www.academia.edu/12162613/Proses_Elekroforesis_DNA
Tamam, Badrut. 2016. Bagaimana Cara Memotong DNA. Diperoleh pada Senin 31 Juli
2017, dari http://www.generasibiologi.com/2016/03/bagaima-cara-memotong-dna.html