Modul 7 Isolasi dan Uji Aktivitas Enzim
1. TUJUAN
1.1. Mempelajari cari mengisolasi enzim.
1.2. Mengetahui aktivitas enzim.
2. DASAR TEORI
Enzim merupakan protein yang mempunyai aktivitas biologis. Bila
dilakukan analisis, maka komposisi kamia suatu enzim, baik yang masih aktif
maupun tidak aktif ternyata sama. Karena itu kita tidak dapat menentukan
keaktfifan enzim hanya dengan analisis atau penentuan komposisi kimia saja.
Keaktifan enzim dapat ditentukan secara kualitatif dengan reaksi kimia yaitu
dengan substrat yang dapat dikatalisis olah enzim tersebut, dan secara
kuantitatif ditentukan dengan mengukur laju reaksi karena itu jumlah enzim
lebih banyak dinyatakan dalam bentuk keaktifan enzim dan dinyakatan dalam
satuan unit enzim.
Amilase merupakan enzim yang berfungsi memecah pati atau glikogen.
Senyawa ini banyak terdapat pada tanaman dan hewan. Aktivitas enzim amilase
dapat ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari
penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dektrinnya dengan
menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan
pengurangan derajat pewarnaan Iodine terhadap substrat. Permasalahan yang
didapatkan saat mengisolasi produk biokimia yaitu terdapatnya pengotor yang
tercampur pada produk. Pemisahan pengotor dapat dilakukan dengan berbagai
cara, salah satunya dengan pengendapan. Pengendapan dapat dilakukan dengan
menambahkan garam dengan konsentrasi tertentu agar protein lain yang
menjadi pengotor ekstrak dapat mengendap. Proses dialysis atau sentrifuge
dapat dilakukan untuk mengendapkan pengotor sehingga didapatkan produk
biokimia (protein misalnya) yang murni dan dapat digunakan untuk analisis
(Holme and Peck,1998).
Katalis merupakan molekul yang mampu mempercepat laju reaksi,
namun tidak mengubah kesetimbangan kimia dari suatu reaksi (Vasudevan et
al.,2013). Cara kerja katalis yaitu dengan menurunkan energy aktivasi (Chang,
2010). Dengan menurunkan energy aktivasi maka suatu reaksi kimia dapat
berjalan dengan lebih cepat. Kelebihan enzim dibandingkan katalis lain adalah:
dapat meningkatkan produk, bekerja pada pH netral dan pada suhu rendah,
bersifat selektif pada substrat tertentu (Dincbas dan Demirkan,2010). Enzim
dapat mempercepat reaksi namun enzim tidak dapat mengubah keadaan normal
dari kesetimbangan kimia, atau dengan kata lain enzim hanya mempercepat
reaksi pembentukan produk tetapi tidak dapat mengubah yield dari produk
(Indah,2009). Aktivitas enzim dapat dilihat dari kemampuannya untuk
mengubah substrat menjadi produk dalam satu satuan waktu tertentu. Ada
beberapa hal yang dapat memengaruhi aktivitas enzim, diantaranya:
1
Pengaruh suhu: kecepatan katalis oleh enzim akan naik bila suhu
dinaikkan, namun jika enzim sudah mencapai keadaan optimlanya suhu
sudah tidak berpengaruh lagi. Penambahan suhu yang lebih tinggi pada
keadaan enzim yang sudah optimal akan menyebabkan penurunan
aktifitas enzim, bahkan dapat menyebabkan kerusakan enzyme
(Triyono,2008).
Pengaruh pH: enzim memiliki aktifitas yang maksimum pada kisaran
pH optimalnya. Enzim merupakan protein, adanya keadaan yang terlalu
asam dapat menyebabkan denaturasi protein/kerusakan protein.
Umumnya kisaran pH optimal dari enzim adalah 4,5-8
(Rahmayanti,2010).
Pengaruh konsentrasi enzim: kecepatan reaksi enzimatik berbanding
lurus dengan konsentrasi enzim. Semakin tinggi konsentrasi enzim,
semakin meningkat juga kecepatan reaksinya, namun saat kecepatan
reaksi sudah mencapai keadaan konstan, penambahan konsentrasi enzim
tidak mempengaruhi kecepatan reaksi (Nguyen et al.,2008)
Pengaruh konsentrasi substrat: Kecepatan reaksi akan meningkat seiring
bertambahnya konsentrasi substrat. Peningkatan kecepatan reaksi akan
semakin kecil sampai mencapai titik dimana penambahan substrat sudah
tidak mempengaruhi kecepatan reaksi enzim lagi. Hal ini disebabkan
semua molekul enzim sudah membentuk ikatan kompleks dengan
substrat (Omemu et al.,2005).
Pengaruh activator dan inhibitor: Aktivator adalah senyawa atau ion
yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatik dari enzim.
Komponen kimia tersebut dapat disebut kofaktor. Beberapa ion yang
termasuk kofaktor antara lain Zn, Fe, Ca,Mn, Cu, dan Mg. Kofaktor
dapat pula berupa molekul organik kompleks yang disebut koenzim.
Ikatan yang dibentuk dengan koenzim biasanya lemah, jika ada ikatan
kuat disebut gugus prostetis. Kerja enzim dipengaruhi juga dengan
adanya inhibitor atau penghambat (Dincbas dan Demirkan,2010).
Presipitasi protein merupakan pengendapan yang terjadi karena
penggumpalan yang disebabkan berkurangnya kelarutan protein karena adanya
perubahan kimia. Metode isolasi enzim yang digunakan merupakan metode
salting in yang dilakukan dengan menambahkan garam tidak jenuh (konsentrasi
rendah) pada sampel sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam
larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan
peningkatan konsentrasi garam, maka apabila konsentrasi garam ditingkatkan
terus dapat menyebabkan kelarutan protein turun sehingga pada kadar garam
yang lebih tinggi, protein akan mengendap.
Aktivitas enzim dapat dianalisa dengan melihat selisih konsentrasi amilum
yang terhidrolisis oleh enzim pada waktu tertentu. Analisa ini dapat
2
menggunakan metode kolorimetri dari ikatan kompleks amilum-iodine yang
membentuk warna biru keunguan. Kepekaan warna yang terbentuk dapat
diketahui dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 580 nm.
Proses hidrolisis amilum oleh enzim harus dihentikan agar didapatkan
hubungan linear antara aktivitas enzim dengan penurunan intensitas warna pada
kompleks amilum-iodine, salah satu caranya dengan mendenaturasi enzim
dengan asam (pada pH rendah).
3. ALAT dan BAHAN
3.1. Alat
Gelas ukur 50 ml
Gelas beker 100 ml
Gelas beker 250 ml
Labu ukur 10 ml
Labu ukur 50 ml
Pipet ukur 1 ml
Pipet ukur 5 ml
Pipet ukur 10 ml
Micropipet 1 ml
Tip
Filler
Pengaduk kaca
3.2. Bahan
Akuades
Amilum
HCl 1 M
Sendok sungu
Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Blender
Kain saring
Kuvet
Sentrifuge
Spektrofotometer
Waterbath
Vortex
Botol akuades
Iodine
Sodium Chloride 1%
Kecambah
4. SKEMA KERJA
4.1. Isolasi Enzim Amilase dari Kecambah
100 gr Kecambah
30 mL NaCl 2%
Dihancurkan dan diaduk setiap 15 menit
selama 1 jam, kemudian disaring
Filtrat kotor
Disentrifugasi, diambil supernatannya, endapannya dibuang
Isolate enzyme amilase
Gambar 4.1 Skema isolasi enzim amilase dari kecambah.
3
4.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi
1 gram amilum
50 ml akuades
Dipanaskan hingga larut, kemudian diencerkan 2 kali, 4 kali, 8 kali, 16 kali, dan 32
kali dalam 5 labu ukur yang berbeda
1 ml hasil
pengenceran
2 kali
1 ml hasil
pengenceran
4 kali
1 ml hasil
pengenceran
16 kali
1 ml hasil
pengenceran
8 kali
1 ml hasil
pengenceran
32 kali
1 ml Iodine
Divortex hingga bercampur. Diencerkan hingga 50 ml
Diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm
Gambar 4.2 Skema kerja pembuatan kurva standar amilum.
4.3. Uji Aktifitas Enzim Amilase
Isolate enzyme amilase
Diencerkan hingga 2 kali, 5 kali, 10 kali, dan 20 kalinya
Enzim
pengenceran
2 kali
Enzim
pengenceran
5 kali
Enzim
pengenceran
10 kali
Enzim
pengenceran
20 kali
3 mL Enzim hasil
pengenceran
3 mL substrat (hasil
pengenceran 2 kali)
Inkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC
1 mL campuran Enzim-Substrat
1 mL Iodine
1 mL HCl 1M
Diencerkan hingga 50 ml. Dibaca serapannya
pada panjang gelombang 580nm
Gambar 4.3 Skema kerja pengujian aktivitas enzim amilase hasil isolasi dari
kecambah.
4
Catatan:
Kontrol uji enzim dibuat dengan mencampurkan 1 ml enzim hasil
pengenceran dengan 1 ml HCl dan 1 ml Iodine didalam tabung reaksi
kemudian baru ditambahkan 1 ml substrat (substrat dimasukkan terakhir).
Blanko enzim dibuat dengan mengganti substrat dengan akuades mengikuti
skema kerja pengujian aktivitas enzim amilase.
5. DATA HASIL PENGAMATAN dan PERHITUNGAN
5.1. Kurva Standar Amilum-I2
Pengenceran
2x
4x
8x
16 x
32 x
Konsentrasi
(mg/mL)
10
5
2,5
1,25
0,625
Absorbansi
A = 0,1149583333
0,721
0,424
0,260
0,188
0,158
B = 0,06070752688
R2 = 0,9994834804
y = A + Bx
5.2. Uji Aktivitas Enzim Amilase
Inkubasi selama 10 menit.
Absorbansi
(A580)
Pengenceran
Kontrol
Uji
1 kali
0,389
0,026
2 kali
0,509
0,031
5 kali
0,448
0,025
10 kali
0,415
0,036
20 kali
0,378
0,063
Contoh perhitungan:
Konsentrasi Amilum
(mg/mL)
Kontrol
Uji
4,514129973 -1,465359205
6,490820611 -1,382997095
5,486002870 -1,481831627
4,942412945 -1,300634985
4,332933332 -0,855879591
Aktivitas
Enzim
0,597948918
0,787381771
0,69678345
0,624304793
0,518881292
Konsentrasi Amilum:
−
=
Aktivitas Enzim:
�
=
[
= ,
�
=
�
,
]−[
�/
.
,
− ,
= ,
]
=
[ ,
/
/
] − [− .
�/
]
Catatan: untuk perhitungan lengkap berada di lampiran.
5
6. PEMBAHASAN
Isolasi enzim amilase dari kecambah dilakukan dengan proses salting
in. Proses ini dilakukan menggunakan NaCl 2% sebagai agen presipitat
sehingga protein lain selain enzim amilase akan mengendap. Setelah kecambah
yang telah hancur di tambahkan larutan NaCl 2% sebagai agen presipitat yang
mengendapkan pengotor/protein selain enzim amilase dan diaduk 15 menit
sekali selama 1 jam, ekstrak diguncangkan dengan sentrigufator dan
supernatant yang merupakan isolate enzim dianalisis. Penambahan NaCl
menyebabkan adanya interaksi eletrolit yang menyebabkan kelarutan senyawa
nonelektrolit menurun akibat kadar garam tinggi. Selain itu, NaCl juga
berfungsi sebagai buffer dan merupakan activator enzim amilase. Karena
protein yang menyusun amilase memiliki berat molekul lebih ringan
dibandingkan dengan protein penyusun organel sel sehingga amilase akan
berada dibagian atas (supernatant) sedangkan organel sel akan berada dibagian
bawah dan mengendap pada hasil sentrifugasi.
Aktivitas enzim dianalisis dengan menggunakan hasil dari banyaknya
amilum yang dihidrolisis selama kurun waktu tertentu. Pengukuran kadar
amilum dilakukan dengan membuat kurva kalibrasi amilum. Hasil pengukuran
kurva didapatkan bahwa nilai absorbansi akan meningkat seiring dengan
meningkatnya kadar amilum (amilum semakin pekat). Dari hasil pembacaan
absorbansi, didapati data R2 sebesar 0,9994834804 yang hamper mendekati
angka
1
sehingga
cukup
presisi
dengan
persamaan
linear
y=0,06070752688x+0,1149583333. Factor yang mungkin dapat menyebabkan
ketidakakuratan kurva adalah ikatan kompleks amilum-iodin yang tidak stabil
sehingga ada kemungkinan ikatan akan terdisosiasi dalam air (Woodard,1934).
Blanko yang digunakan dalam pembuatan kurva merupakan akuades yang
ditambahkan dengan iodin kemudian diencerkan hingga 50 mL. Blanko
digunakan sebagai larutan pembanding dan untuk mengetahui besarnya serapan
oleh zat selain sampel (beberapa senyawa yang digunakan misalnya reagen
maupun pelarut dapat memberikan serapan pada saat pembacaan absorbansi,
sehingga penggunaan blanko bertujuan untuk menghindari error akibat adanya
serapan oleh zat pereaksi, pelarut, kondisi, maupun zat lain selain sampel,
misalnya pengotor).
Pengujian aktivitas enzim didapatkan hasil kadar amilum yang sangat
rendah pada sampel uji. Hal ini dapat disebabkan oleh nilai absorbansi yang
tidak masuk dalam range kurva standar kompleks amilum-iodine sehingga
perhitungan kadarnya tidak akurat, selain itu juga dapat disebabkan karena
waktu inkubasi yang terlalu lama sehingga amilum telah habis terhidrolisis oleh
enzim. Blanko yang digunakan dalam pengujian aktivitas enzim merukapan
akuades yang diperlakukan sama seperti sampel uji, sedangkan control yang
6
digunakan merupakan enzim yang telah di inaktivasi terlebih dahulu dengan
menambahkan HCl 1 M pada enzim sebelum menambahkan substrat (amilum).
Hasil dari perhitungan aktivitas enzim pada berbagai pengenceran,
didapatkan hasil percobaan yang tidak sesuai dengan teori. Secara teori,
semakin tinggi konsentrasi enzim, maka akan semakin cepat proses hidrolisis
amilum. Sedangkan dari hasil percobaan didapatkan bahwa aktivitas enzim
dalam mengkatalis proses hidrolisis amilum terjadi secara acak. Namun jika
dilihat dari nilai absorbansi sampel uji, dapat dikatakan bahwa semakin pekat
konsentrasi enzyme amilase, didapatkan semakin kecil kadar amilum yang
dapat dilihat dari nilai absorbansinya.
7. KESIMPULAN
Isolasi enzim amilase dari kecambah dilakukan dengan cara
menghancurkan sel kecambah dan mengeluarkan endoenzim dan pemurnian
dengan cara salting in dan sentrifugasi yang menghasilkan supernatant yang
dianalisis. Isolat enzim diukur aktivitasnya dengan melihat kemampuan
hidrolisis amilum dengan metode kolorimetri berdasarkan intensitas warna dari
kompleks amilum-iodin dan didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi
enzim maka semakin tinggi pula aktivitas enzim tersebut.
8. DAFTAR PUSTAKA
Budiarti, G.I., Sumardiono, S., Kusmiyati. 2016. “Studi Konversi Pati Ubi
Kayu (Cassava Starch) menjadi Glukosa secara Enzimatik”. Chemica ,
3(1), pp 7-16.
Chang, R. 2010. Chemistry, 10th Edition. New York: McGraw-Hill.
Derera, N.F. 1989. Preharvest Field Sprouting in Cereals. Florida: CRC Press.
Dincbas, S. and Demirkan, E. 2010. “Comparison of Hydrolysis Abilities onto
Soluble and Commercial Raw Starches of Immobilized and Free
B.amyloliquefaciens α-Amylase”. Journal Biol.Environ.Sci, 4(11), pp.87–
95.
Fuwa, H. “A New Method for Microdetermination of Amylase Activity by the
Use of Amylose as the Substrate”. The Journal of Biochemistry, 41(5), pp
583-603.
Holme, D.J., dan Peek, H. 1998. Analytical Biochemstry, 3rd Edition. London:
Pearson Education Limited.
Triyono, A. 2008. “Karakteristik Gula Glukosa dari Hasil Hidrolisa Pati Ubi
Jalar ( Ipomoea Batatas , L .) dalam Upaya Pemanfaatan Pati Umbi –
7
Umbian”. In Seminar Nasional Teknoin Bidang Teknik Kimia dan Tekstil,
pp. 7–10.
Omemu, A.M., Akpan, I., Bankole, M.O., Tenida, O.D. 2005. “Hydrolisis of
Raw Tuber Starches by Amylase of Aspergillus niger AMO7 Isolated from
The Soil”. African Journal of Biotechnology, 4 (1), pp. 19-25.
Rahmayanti, D., 2010. Pemodelan dan Optimasi Hidrolisa Pati Menjadi
Glukosa dengan Metode Artificial Neural Network-Genetic Algorithm
(ANN-GA). Semarang: Universitas Diponegoro.
Indah, S. 2009. Pra Rancangan Pabrik Pembuatan Glukosa Dari Pati Jagung
dengan Proses Hidrolisa Dengan Kapasitas 12000 Ton/Tahun . Medan:
Universitas Sumatera Utara.
Nguyen, H.M., Ha, S.H., Koo, Y.M. 2008. “Optimization of Lipase-Catalyzed
Fructose Palmitate Synthesis in Ionic Liquid”. Jurnal of Biotechnology,
136s, pp. s356-s401.
Vaseudevan, D.M., Sreekumari, S., dan Vaidyanathan, K. 2013. Textbook of
Biochemistry for Medical Student, 7th Ed. New Delhi: Jaypee Brothers
Medical Publisher.
Woodard, H.Q. 1934. “Colorimetric Determination of Iodine by The StarchIodine Reaction”. Industrial and Engineering Chemistry Analytical
Edition, 6(5), pp 331-333.
8
Lampiran
A. Perhitungan lengkap konsentrasi amilum hasil hidrolisis enzim
Persamaan garis: A=0,06070752688 [amilum] + 0,1149583333
[amilum]=(A-0,1149583333)/0,06070752688
Pengenceran Enzim
[Amilum] mg/ml
−
,
,
− ,
1 kali
=
=
2 kali
=
5 kali
=
10 kali
=
20 kali
=
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
= − ,
=
= − ,
=
= − ,
=
= − ,
=
= − ,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
−
,
−
,
−
,
−
,
Tabel 1. Perhitungan konsentrasi amilum hasil hidrolisis oleh enzim.
B. Perhitungan lengkap konsentrasi amilum pada control enzim
Persamaan garis: A=0,06070752688 [amilum] + 0,1149583333
[amilum]=(A-0,1149583333)/0,06070752688
Pengenceran Enzim
[Amilum] mg/ml
−
,
,
− ,
1 kali
=
=
2 kali
=
5 kali
=
10 kali
=
20 kali
=
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
=
,
=
,
=
,
=
,
=
,
=
=
=
=
,
,
,
,
,
,
,
,
,
−
,
−
,
−
,
−
,
Tabel 2. Perhitungan konsentrasi amilum pada control.
C. Perhitungan lengkap aktivitas enzim pada setiap pengenceran
Aktivitas Enzim =
[�
� ]−[�
��
]
9
Pengenceran Enzim
1 kali
Aktivitas Enzim (mg/ml.menit)
=
2 kali
=
5 kali
[
[
=
10 kali
=
20 kali
=
[
[
[
,
,
,
,
] − [−
,
] − [−
] − [−
] − [−
] − [−
,
,
,
]
,
,
]
=
,
= ,
]
= ,
]
= ,
]
= ,
Tabel 3. Perhitungan aktivitas enzim amilase.
Kurva Standar Konsentrasi Amilum terhadap Absorbansi
0,8
0,7
Absorbansi
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Konsentrasi Amilum (mg/mL)
8
9
10
Gambar 1. Kurva standar konsentrasi amilum terhadap Absorbansi (Amilum-I2).
Aktivitas Enzim (mg/mL.menit)
Banyak Pengenceran Enzim terhadap Kecepatan Reaksi
0,8
0,75
0,7
0,65
0,6
0,55
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Banyak Pengenceran Enzim
Gambar 2. Kurva banyak pengenceran enzim terhadap kecepatan reaksi enzim.
10
Gambar 3. Hasil pembacaan absorbansi kompleks amilum-iodine pada
konsentrasi 10 mg/ml (gambar kiri, cell 1), konsentrasi 5 mg/ml (gambar kanan,
cell 2), dan konsentrasi 2.5 mg/ml (gambar kanan, cell 3).
Gambar 4. Hasil pembacaan absorbansi kompleks amilum-iodin pada konsentrasi
1.25 mg/ml (cell 1) dan konsentrasi 0,625 mg/ml (cell 2).
Gambar 5. Hasil pembacaan absorbansi control (cell 1) dan sampel uji (cell 2)
pada pengenceran 20 kali (gambar kiri) dan pengenceran 10 kali (gambar kanan)
enzim amilase hasil isolasi dari kecambah.
11
Gambar 6. Hasil pembacaan absorbansi control (cell 1) dan sampel uji (cell 2)
pada pengenceran 5 kali (gambar kiri) dan pengenceran 2 kali (gambar kanan)
enzim amilase hasil isolasi dari kecambah.
Gambar 7. Hasil pembacaan absorbansi control (cell 1) dan sampel uji (cell 2)
pada enzim amilase pekat (tanpa pengenceran).
12
1.1. Mempelajari cari mengisolasi enzim.
1.2. Mengetahui aktivitas enzim.
2. DASAR TEORI
Enzim merupakan protein yang mempunyai aktivitas biologis. Bila
dilakukan analisis, maka komposisi kamia suatu enzim, baik yang masih aktif
maupun tidak aktif ternyata sama. Karena itu kita tidak dapat menentukan
keaktfifan enzim hanya dengan analisis atau penentuan komposisi kimia saja.
Keaktifan enzim dapat ditentukan secara kualitatif dengan reaksi kimia yaitu
dengan substrat yang dapat dikatalisis olah enzim tersebut, dan secara
kuantitatif ditentukan dengan mengukur laju reaksi karena itu jumlah enzim
lebih banyak dinyatakan dalam bentuk keaktifan enzim dan dinyakatan dalam
satuan unit enzim.
Amilase merupakan enzim yang berfungsi memecah pati atau glikogen.
Senyawa ini banyak terdapat pada tanaman dan hewan. Aktivitas enzim amilase
dapat ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari
penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dektrinnya dengan
menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan
pengurangan derajat pewarnaan Iodine terhadap substrat. Permasalahan yang
didapatkan saat mengisolasi produk biokimia yaitu terdapatnya pengotor yang
tercampur pada produk. Pemisahan pengotor dapat dilakukan dengan berbagai
cara, salah satunya dengan pengendapan. Pengendapan dapat dilakukan dengan
menambahkan garam dengan konsentrasi tertentu agar protein lain yang
menjadi pengotor ekstrak dapat mengendap. Proses dialysis atau sentrifuge
dapat dilakukan untuk mengendapkan pengotor sehingga didapatkan produk
biokimia (protein misalnya) yang murni dan dapat digunakan untuk analisis
(Holme and Peck,1998).
Katalis merupakan molekul yang mampu mempercepat laju reaksi,
namun tidak mengubah kesetimbangan kimia dari suatu reaksi (Vasudevan et
al.,2013). Cara kerja katalis yaitu dengan menurunkan energy aktivasi (Chang,
2010). Dengan menurunkan energy aktivasi maka suatu reaksi kimia dapat
berjalan dengan lebih cepat. Kelebihan enzim dibandingkan katalis lain adalah:
dapat meningkatkan produk, bekerja pada pH netral dan pada suhu rendah,
bersifat selektif pada substrat tertentu (Dincbas dan Demirkan,2010). Enzim
dapat mempercepat reaksi namun enzim tidak dapat mengubah keadaan normal
dari kesetimbangan kimia, atau dengan kata lain enzim hanya mempercepat
reaksi pembentukan produk tetapi tidak dapat mengubah yield dari produk
(Indah,2009). Aktivitas enzim dapat dilihat dari kemampuannya untuk
mengubah substrat menjadi produk dalam satu satuan waktu tertentu. Ada
beberapa hal yang dapat memengaruhi aktivitas enzim, diantaranya:
1
Pengaruh suhu: kecepatan katalis oleh enzim akan naik bila suhu
dinaikkan, namun jika enzim sudah mencapai keadaan optimlanya suhu
sudah tidak berpengaruh lagi. Penambahan suhu yang lebih tinggi pada
keadaan enzim yang sudah optimal akan menyebabkan penurunan
aktifitas enzim, bahkan dapat menyebabkan kerusakan enzyme
(Triyono,2008).
Pengaruh pH: enzim memiliki aktifitas yang maksimum pada kisaran
pH optimalnya. Enzim merupakan protein, adanya keadaan yang terlalu
asam dapat menyebabkan denaturasi protein/kerusakan protein.
Umumnya kisaran pH optimal dari enzim adalah 4,5-8
(Rahmayanti,2010).
Pengaruh konsentrasi enzim: kecepatan reaksi enzimatik berbanding
lurus dengan konsentrasi enzim. Semakin tinggi konsentrasi enzim,
semakin meningkat juga kecepatan reaksinya, namun saat kecepatan
reaksi sudah mencapai keadaan konstan, penambahan konsentrasi enzim
tidak mempengaruhi kecepatan reaksi (Nguyen et al.,2008)
Pengaruh konsentrasi substrat: Kecepatan reaksi akan meningkat seiring
bertambahnya konsentrasi substrat. Peningkatan kecepatan reaksi akan
semakin kecil sampai mencapai titik dimana penambahan substrat sudah
tidak mempengaruhi kecepatan reaksi enzim lagi. Hal ini disebabkan
semua molekul enzim sudah membentuk ikatan kompleks dengan
substrat (Omemu et al.,2005).
Pengaruh activator dan inhibitor: Aktivator adalah senyawa atau ion
yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatik dari enzim.
Komponen kimia tersebut dapat disebut kofaktor. Beberapa ion yang
termasuk kofaktor antara lain Zn, Fe, Ca,Mn, Cu, dan Mg. Kofaktor
dapat pula berupa molekul organik kompleks yang disebut koenzim.
Ikatan yang dibentuk dengan koenzim biasanya lemah, jika ada ikatan
kuat disebut gugus prostetis. Kerja enzim dipengaruhi juga dengan
adanya inhibitor atau penghambat (Dincbas dan Demirkan,2010).
Presipitasi protein merupakan pengendapan yang terjadi karena
penggumpalan yang disebabkan berkurangnya kelarutan protein karena adanya
perubahan kimia. Metode isolasi enzim yang digunakan merupakan metode
salting in yang dilakukan dengan menambahkan garam tidak jenuh (konsentrasi
rendah) pada sampel sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam
larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan
peningkatan konsentrasi garam, maka apabila konsentrasi garam ditingkatkan
terus dapat menyebabkan kelarutan protein turun sehingga pada kadar garam
yang lebih tinggi, protein akan mengendap.
Aktivitas enzim dapat dianalisa dengan melihat selisih konsentrasi amilum
yang terhidrolisis oleh enzim pada waktu tertentu. Analisa ini dapat
2
menggunakan metode kolorimetri dari ikatan kompleks amilum-iodine yang
membentuk warna biru keunguan. Kepekaan warna yang terbentuk dapat
diketahui dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 580 nm.
Proses hidrolisis amilum oleh enzim harus dihentikan agar didapatkan
hubungan linear antara aktivitas enzim dengan penurunan intensitas warna pada
kompleks amilum-iodine, salah satu caranya dengan mendenaturasi enzim
dengan asam (pada pH rendah).
3. ALAT dan BAHAN
3.1. Alat
Gelas ukur 50 ml
Gelas beker 100 ml
Gelas beker 250 ml
Labu ukur 10 ml
Labu ukur 50 ml
Pipet ukur 1 ml
Pipet ukur 5 ml
Pipet ukur 10 ml
Micropipet 1 ml
Tip
Filler
Pengaduk kaca
3.2. Bahan
Akuades
Amilum
HCl 1 M
Sendok sungu
Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Blender
Kain saring
Kuvet
Sentrifuge
Spektrofotometer
Waterbath
Vortex
Botol akuades
Iodine
Sodium Chloride 1%
Kecambah
4. SKEMA KERJA
4.1. Isolasi Enzim Amilase dari Kecambah
100 gr Kecambah
30 mL NaCl 2%
Dihancurkan dan diaduk setiap 15 menit
selama 1 jam, kemudian disaring
Filtrat kotor
Disentrifugasi, diambil supernatannya, endapannya dibuang
Isolate enzyme amilase
Gambar 4.1 Skema isolasi enzim amilase dari kecambah.
3
4.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi
1 gram amilum
50 ml akuades
Dipanaskan hingga larut, kemudian diencerkan 2 kali, 4 kali, 8 kali, 16 kali, dan 32
kali dalam 5 labu ukur yang berbeda
1 ml hasil
pengenceran
2 kali
1 ml hasil
pengenceran
4 kali
1 ml hasil
pengenceran
16 kali
1 ml hasil
pengenceran
8 kali
1 ml hasil
pengenceran
32 kali
1 ml Iodine
Divortex hingga bercampur. Diencerkan hingga 50 ml
Diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm
Gambar 4.2 Skema kerja pembuatan kurva standar amilum.
4.3. Uji Aktifitas Enzim Amilase
Isolate enzyme amilase
Diencerkan hingga 2 kali, 5 kali, 10 kali, dan 20 kalinya
Enzim
pengenceran
2 kali
Enzim
pengenceran
5 kali
Enzim
pengenceran
10 kali
Enzim
pengenceran
20 kali
3 mL Enzim hasil
pengenceran
3 mL substrat (hasil
pengenceran 2 kali)
Inkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC
1 mL campuran Enzim-Substrat
1 mL Iodine
1 mL HCl 1M
Diencerkan hingga 50 ml. Dibaca serapannya
pada panjang gelombang 580nm
Gambar 4.3 Skema kerja pengujian aktivitas enzim amilase hasil isolasi dari
kecambah.
4
Catatan:
Kontrol uji enzim dibuat dengan mencampurkan 1 ml enzim hasil
pengenceran dengan 1 ml HCl dan 1 ml Iodine didalam tabung reaksi
kemudian baru ditambahkan 1 ml substrat (substrat dimasukkan terakhir).
Blanko enzim dibuat dengan mengganti substrat dengan akuades mengikuti
skema kerja pengujian aktivitas enzim amilase.
5. DATA HASIL PENGAMATAN dan PERHITUNGAN
5.1. Kurva Standar Amilum-I2
Pengenceran
2x
4x
8x
16 x
32 x
Konsentrasi
(mg/mL)
10
5
2,5
1,25
0,625
Absorbansi
A = 0,1149583333
0,721
0,424
0,260
0,188
0,158
B = 0,06070752688
R2 = 0,9994834804
y = A + Bx
5.2. Uji Aktivitas Enzim Amilase
Inkubasi selama 10 menit.
Absorbansi
(A580)
Pengenceran
Kontrol
Uji
1 kali
0,389
0,026
2 kali
0,509
0,031
5 kali
0,448
0,025
10 kali
0,415
0,036
20 kali
0,378
0,063
Contoh perhitungan:
Konsentrasi Amilum
(mg/mL)
Kontrol
Uji
4,514129973 -1,465359205
6,490820611 -1,382997095
5,486002870 -1,481831627
4,942412945 -1,300634985
4,332933332 -0,855879591
Aktivitas
Enzim
0,597948918
0,787381771
0,69678345
0,624304793
0,518881292
Konsentrasi Amilum:
−
=
Aktivitas Enzim:
�
=
[
= ,
�
=
�
,
]−[
�/
.
,
− ,
= ,
]
=
[ ,
/
/
] − [− .
�/
]
Catatan: untuk perhitungan lengkap berada di lampiran.
5
6. PEMBAHASAN
Isolasi enzim amilase dari kecambah dilakukan dengan proses salting
in. Proses ini dilakukan menggunakan NaCl 2% sebagai agen presipitat
sehingga protein lain selain enzim amilase akan mengendap. Setelah kecambah
yang telah hancur di tambahkan larutan NaCl 2% sebagai agen presipitat yang
mengendapkan pengotor/protein selain enzim amilase dan diaduk 15 menit
sekali selama 1 jam, ekstrak diguncangkan dengan sentrigufator dan
supernatant yang merupakan isolate enzim dianalisis. Penambahan NaCl
menyebabkan adanya interaksi eletrolit yang menyebabkan kelarutan senyawa
nonelektrolit menurun akibat kadar garam tinggi. Selain itu, NaCl juga
berfungsi sebagai buffer dan merupakan activator enzim amilase. Karena
protein yang menyusun amilase memiliki berat molekul lebih ringan
dibandingkan dengan protein penyusun organel sel sehingga amilase akan
berada dibagian atas (supernatant) sedangkan organel sel akan berada dibagian
bawah dan mengendap pada hasil sentrifugasi.
Aktivitas enzim dianalisis dengan menggunakan hasil dari banyaknya
amilum yang dihidrolisis selama kurun waktu tertentu. Pengukuran kadar
amilum dilakukan dengan membuat kurva kalibrasi amilum. Hasil pengukuran
kurva didapatkan bahwa nilai absorbansi akan meningkat seiring dengan
meningkatnya kadar amilum (amilum semakin pekat). Dari hasil pembacaan
absorbansi, didapati data R2 sebesar 0,9994834804 yang hamper mendekati
angka
1
sehingga
cukup
presisi
dengan
persamaan
linear
y=0,06070752688x+0,1149583333. Factor yang mungkin dapat menyebabkan
ketidakakuratan kurva adalah ikatan kompleks amilum-iodin yang tidak stabil
sehingga ada kemungkinan ikatan akan terdisosiasi dalam air (Woodard,1934).
Blanko yang digunakan dalam pembuatan kurva merupakan akuades yang
ditambahkan dengan iodin kemudian diencerkan hingga 50 mL. Blanko
digunakan sebagai larutan pembanding dan untuk mengetahui besarnya serapan
oleh zat selain sampel (beberapa senyawa yang digunakan misalnya reagen
maupun pelarut dapat memberikan serapan pada saat pembacaan absorbansi,
sehingga penggunaan blanko bertujuan untuk menghindari error akibat adanya
serapan oleh zat pereaksi, pelarut, kondisi, maupun zat lain selain sampel,
misalnya pengotor).
Pengujian aktivitas enzim didapatkan hasil kadar amilum yang sangat
rendah pada sampel uji. Hal ini dapat disebabkan oleh nilai absorbansi yang
tidak masuk dalam range kurva standar kompleks amilum-iodine sehingga
perhitungan kadarnya tidak akurat, selain itu juga dapat disebabkan karena
waktu inkubasi yang terlalu lama sehingga amilum telah habis terhidrolisis oleh
enzim. Blanko yang digunakan dalam pengujian aktivitas enzim merukapan
akuades yang diperlakukan sama seperti sampel uji, sedangkan control yang
6
digunakan merupakan enzim yang telah di inaktivasi terlebih dahulu dengan
menambahkan HCl 1 M pada enzim sebelum menambahkan substrat (amilum).
Hasil dari perhitungan aktivitas enzim pada berbagai pengenceran,
didapatkan hasil percobaan yang tidak sesuai dengan teori. Secara teori,
semakin tinggi konsentrasi enzim, maka akan semakin cepat proses hidrolisis
amilum. Sedangkan dari hasil percobaan didapatkan bahwa aktivitas enzim
dalam mengkatalis proses hidrolisis amilum terjadi secara acak. Namun jika
dilihat dari nilai absorbansi sampel uji, dapat dikatakan bahwa semakin pekat
konsentrasi enzyme amilase, didapatkan semakin kecil kadar amilum yang
dapat dilihat dari nilai absorbansinya.
7. KESIMPULAN
Isolasi enzim amilase dari kecambah dilakukan dengan cara
menghancurkan sel kecambah dan mengeluarkan endoenzim dan pemurnian
dengan cara salting in dan sentrifugasi yang menghasilkan supernatant yang
dianalisis. Isolat enzim diukur aktivitasnya dengan melihat kemampuan
hidrolisis amilum dengan metode kolorimetri berdasarkan intensitas warna dari
kompleks amilum-iodin dan didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi
enzim maka semakin tinggi pula aktivitas enzim tersebut.
8. DAFTAR PUSTAKA
Budiarti, G.I., Sumardiono, S., Kusmiyati. 2016. “Studi Konversi Pati Ubi
Kayu (Cassava Starch) menjadi Glukosa secara Enzimatik”. Chemica ,
3(1), pp 7-16.
Chang, R. 2010. Chemistry, 10th Edition. New York: McGraw-Hill.
Derera, N.F. 1989. Preharvest Field Sprouting in Cereals. Florida: CRC Press.
Dincbas, S. and Demirkan, E. 2010. “Comparison of Hydrolysis Abilities onto
Soluble and Commercial Raw Starches of Immobilized and Free
B.amyloliquefaciens α-Amylase”. Journal Biol.Environ.Sci, 4(11), pp.87–
95.
Fuwa, H. “A New Method for Microdetermination of Amylase Activity by the
Use of Amylose as the Substrate”. The Journal of Biochemistry, 41(5), pp
583-603.
Holme, D.J., dan Peek, H. 1998. Analytical Biochemstry, 3rd Edition. London:
Pearson Education Limited.
Triyono, A. 2008. “Karakteristik Gula Glukosa dari Hasil Hidrolisa Pati Ubi
Jalar ( Ipomoea Batatas , L .) dalam Upaya Pemanfaatan Pati Umbi –
7
Umbian”. In Seminar Nasional Teknoin Bidang Teknik Kimia dan Tekstil,
pp. 7–10.
Omemu, A.M., Akpan, I., Bankole, M.O., Tenida, O.D. 2005. “Hydrolisis of
Raw Tuber Starches by Amylase of Aspergillus niger AMO7 Isolated from
The Soil”. African Journal of Biotechnology, 4 (1), pp. 19-25.
Rahmayanti, D., 2010. Pemodelan dan Optimasi Hidrolisa Pati Menjadi
Glukosa dengan Metode Artificial Neural Network-Genetic Algorithm
(ANN-GA). Semarang: Universitas Diponegoro.
Indah, S. 2009. Pra Rancangan Pabrik Pembuatan Glukosa Dari Pati Jagung
dengan Proses Hidrolisa Dengan Kapasitas 12000 Ton/Tahun . Medan:
Universitas Sumatera Utara.
Nguyen, H.M., Ha, S.H., Koo, Y.M. 2008. “Optimization of Lipase-Catalyzed
Fructose Palmitate Synthesis in Ionic Liquid”. Jurnal of Biotechnology,
136s, pp. s356-s401.
Vaseudevan, D.M., Sreekumari, S., dan Vaidyanathan, K. 2013. Textbook of
Biochemistry for Medical Student, 7th Ed. New Delhi: Jaypee Brothers
Medical Publisher.
Woodard, H.Q. 1934. “Colorimetric Determination of Iodine by The StarchIodine Reaction”. Industrial and Engineering Chemistry Analytical
Edition, 6(5), pp 331-333.
8
Lampiran
A. Perhitungan lengkap konsentrasi amilum hasil hidrolisis enzim
Persamaan garis: A=0,06070752688 [amilum] + 0,1149583333
[amilum]=(A-0,1149583333)/0,06070752688
Pengenceran Enzim
[Amilum] mg/ml
−
,
,
− ,
1 kali
=
=
2 kali
=
5 kali
=
10 kali
=
20 kali
=
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
= − ,
=
= − ,
=
= − ,
=
= − ,
=
= − ,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
−
,
−
,
−
,
−
,
Tabel 1. Perhitungan konsentrasi amilum hasil hidrolisis oleh enzim.
B. Perhitungan lengkap konsentrasi amilum pada control enzim
Persamaan garis: A=0,06070752688 [amilum] + 0,1149583333
[amilum]=(A-0,1149583333)/0,06070752688
Pengenceran Enzim
[Amilum] mg/ml
−
,
,
− ,
1 kali
=
=
2 kali
=
5 kali
=
10 kali
=
20 kali
=
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
− ,
,
=
,
=
,
=
,
=
,
=
,
=
=
=
=
,
,
,
,
,
,
,
,
,
−
,
−
,
−
,
−
,
Tabel 2. Perhitungan konsentrasi amilum pada control.
C. Perhitungan lengkap aktivitas enzim pada setiap pengenceran
Aktivitas Enzim =
[�
� ]−[�
��
]
9
Pengenceran Enzim
1 kali
Aktivitas Enzim (mg/ml.menit)
=
2 kali
=
5 kali
[
[
=
10 kali
=
20 kali
=
[
[
[
,
,
,
,
] − [−
,
] − [−
] − [−
] − [−
] − [−
,
,
,
]
,
,
]
=
,
= ,
]
= ,
]
= ,
]
= ,
Tabel 3. Perhitungan aktivitas enzim amilase.
Kurva Standar Konsentrasi Amilum terhadap Absorbansi
0,8
0,7
Absorbansi
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Konsentrasi Amilum (mg/mL)
8
9
10
Gambar 1. Kurva standar konsentrasi amilum terhadap Absorbansi (Amilum-I2).
Aktivitas Enzim (mg/mL.menit)
Banyak Pengenceran Enzim terhadap Kecepatan Reaksi
0,8
0,75
0,7
0,65
0,6
0,55
0,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Banyak Pengenceran Enzim
Gambar 2. Kurva banyak pengenceran enzim terhadap kecepatan reaksi enzim.
10
Gambar 3. Hasil pembacaan absorbansi kompleks amilum-iodine pada
konsentrasi 10 mg/ml (gambar kiri, cell 1), konsentrasi 5 mg/ml (gambar kanan,
cell 2), dan konsentrasi 2.5 mg/ml (gambar kanan, cell 3).
Gambar 4. Hasil pembacaan absorbansi kompleks amilum-iodin pada konsentrasi
1.25 mg/ml (cell 1) dan konsentrasi 0,625 mg/ml (cell 2).
Gambar 5. Hasil pembacaan absorbansi control (cell 1) dan sampel uji (cell 2)
pada pengenceran 20 kali (gambar kiri) dan pengenceran 10 kali (gambar kanan)
enzim amilase hasil isolasi dari kecambah.
11
Gambar 6. Hasil pembacaan absorbansi control (cell 1) dan sampel uji (cell 2)
pada pengenceran 5 kali (gambar kiri) dan pengenceran 2 kali (gambar kanan)
enzim amilase hasil isolasi dari kecambah.
Gambar 7. Hasil pembacaan absorbansi control (cell 1) dan sampel uji (cell 2)
pada enzim amilase pekat (tanpa pengenceran).
12