PEMBENTUKAN SENYAWA DIMER ANETOL DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH SKRIPSI

PEMBENTUKAN SENYAWA DIMER ANETOL DENGAN BIOKATALIS ENZIM

LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia pada

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.

Oleh :

SITI ZAINATUR RAHMAH

080810514

Tanggal Lulus : 10 Agustus 2012

Disetujui Oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA Dr. Sri Sumarsih, M. Si

NIP. 196711151991022001 NIP. 196001019881002001

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : PEMBENTUKAN SENYAWA DIMER ANETOL DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH

Penyusun : Siti Zainatur Rahmah NIM : 080810514 Pembimbing I : Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA Pembimbing II : Dr. Sri Sumarsih, M. Si

Disetujui oleh :

Pembimbing I Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

NIP. 196711151991022001 Pembimbing II

Dr. Sri Sumarsih, M. Si NIP. 196001019881002001

Mengetahui: Ketua Program Studi Kimia

Fakulatas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

NIP. 196711151991022001

KATA PENGANTAR

iii

Alhamdulillahirabbil ‘alamin,

puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat, taufiq dan hidayah-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul “Pembentukan Senyawa Dimer Anetol dengan Biokatalis Enzim Lakase dari Jamur Tiram Putih”.

Pada kesempatan ini penyusun menyampaikan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada :

1. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku dosen pembimbing I atas bimbingan, bantuan dan masukan yang sangat bermanfaat bagi penyusun selama penyusunan skripsi ini.

2. Ibu Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku pembimbing II atas bantuan dan kesabaran dalam memberikan bimbingan kepada penyusun.

3. Ibu Dra. Aning Purwaningsih, M.Si selaku dosen wali yang telah memberikan pendampingan selama studi penyusun.

4. Para dosen program studi Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga. Semoga Allah selalu merahmati beliau semua.

5. Ayah, bunda, dan kakak tercinta atas hangatnya kasih sayang, dukungan moral, material, dan spiritual.

6. Teman-teman angkatan 2008 Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga atas kebersamaan, kekompakan, kerjasama dan dukungannya. iv

7. Adik-adik mentoring 2009 (sinta dan lia), adik-adik mentoring 2010 (fisika, matematika, dan teknobiomedik), dan adik-adik mentoring kimia 2011 (group RnB (Rombongan Ngaji Bareng)).

8. Teman seperjuangan Pipit Dwi N, Muhimmatus Sa’diyah, dan Dwi Setya (lanjutkan perjuangan).

Penyusun menyadari bahwa naskah skripsi ini masih sangat banyak kekurangan, oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat penyusun harapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Surabaya, 30 Agustus 2012 Penyusun, Siti Zainatur Rahmah

Siti Zainatur Rahmah, 2012, Pembentukan Senyawa Dimer Anetol dengan Biokatalis Enzim Lakase dari Jamur Tiram Putih . Skripsi ini di bawah bimbingan Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si.

Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.

ABSTRAK

Penggunaan enzim sebagai biokatalis telah banyak digunakan untuk melakukan sintesis senyawa organik. Hal ini dikarenakan enzim bersifat spesifik dan ramah terhadap lingkungan. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah lakase yang merupakan golongan oksireduktase. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mensintesis dimer anetol dengan mengunakan biokatalis enzim lakase. Pada penelitian ini digunakan minyak anis yang mengandung 90% anetol, enzim lakase sebagai biokatalis, dan hidrokuinon sebagai mediator. Enzim lakase yang digunakan merupakan hasil isolasi dari jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) yang memiliki aktivitas sebesar 712,758 U/L. Reaksi pembentukan dimer anetol dilakukan dalam medium bifasa (etil asetat : buffer fosfat = 4:1) yang dilakukan selama 24 jam dan 48 jam. Hasil reaksi kemudian diekstraksi dengan etil asetat dan menghasilkan cairan kental berwarna kecoklatan dengan intensitas warna yang lebih pekat pada reaksi 48 jam. Perbandingan hasil uji GC terhadap minyak anis, reaksi 24 jam, dan reaksi 48 jam menunjukan adanya penambahan peak dan perubahan tinggi puncak pada reaksi 48 jam. Senyawa anetol dan p-anisaldehid memiliki %area yang lebih kecil dibanding pada reaksi 24 jam. Diduga pada reaksi 48 jam dihasilkan senyawa baru yang berasal dari hasil reaksi oksidasi yaitu kariofilena oksida, namun belum teridentifikasi senyawa yang merupakan dimer anetol.

Kata kunci: jamur tiram putih, biokatalis, enzim lakase, anetol v

Siti Zainatur Rahmah, 2012, Formation of Dimer Anethol Compounds by Biocatalys Laccase Enzyme from White Oyster Mushroom.This scription under guidance Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA and Dr. Sri Sumarsih, M.Si.Chemical Departemen, Faculty of Science and Technology, Airlangga University. ABSTRACT

Enzymes as biocatalyst has been much used to perform synthesis of organic compounds. This is because the enzyme is specific and friendly to the environment. The purpose this research is synthesis dimer anethol using laccase enzyme biocatalyst. Laccase enzyme that is widely used is that a group oxireductase. In this study use anise oil containing 90% anethole, the laccase enzyme as a biocatalyst, and hydroquinone as a mediator. Laccase enzyme used is the isolation of the white oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) which has the activity of 712,758 U/L. Anetol dimerization performed in medium bifase (ethyl acetate : phosphate buffer = 4:1) is carried out for 24 hours and 48 hours. The reaction was extracted with ethyl acetate and produce a brownish viscous liquid with a more color intensity in the reaction 48 hours. Comparison of GC assay results of anise oil, reaction 24 hours, and 48 hours showed the reaction to the addition of high-peak and peak changes in the reaction 48 hours. Anethole compound and p-anisaldehyde %area smaller than in the reaction 24 hours. Identification of 48 hours reaction estimed there are new compounds from of the oxidation reaction is caryophyllene oxide, but has not identifed a dimer anethole compound.

Key word : white oyster mushroom, biocatalyst, laccase enzymes, anethole vi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i

LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... ii

KATA PENGANTAR ................................................................................... iii

ABSTRAK ...................................................................................................... v

ABSTRACT .................................................................................................... vi

DAFTAR ISI .................................................................................................. vii

DAFTAR TABEL .......................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... x

BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1

1.1 Latar belakang ..................................................................................... 1

1.2 Rumusan masalah................................................................................. 3

1.3 Tujuan penelitian.................................................................................. 4

1.4 Manfaat penelitian................................................................................ 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 5

2.1 Jamur tiram putih ................................................................................. 5

2.2 Enzim ................................................................................................... 5

2.2.1 Penggolongan enzim ................................................................... 6

2.2.2 Kespesifikan enzim .................................................................... 6

2.2.3 Mekanisme kerja enzim .............................................................. 7

2.3 Metalloenzyme...................................................................................... 8

2.4 Enzim lakase ........................................................................................ 8

2.5 Minyak atsiri ........................................................................................ 10

2.6 Senyawa fenolik ................................................................................... 11

2.7 Anetol................................................................................................... 13

2.8 Dimerisasi dengan kopling oksidatif fenolik ....................................... 15

2.9 Kromatografi ....................................................................................... 17

2.9.1 Kromatografi lapis tipis (KLT) ................................................... 17

2.10 Spektroskopi....................................................................................... 19

2.10.1 Spektroskopi ultraviolet visibel................................................. 19

2.10.2 GC-MS Spektrometri ................................................................ 19

BAB III METODE PENELITIAN .............................................................. 20

3.1 Tempat penelitian ............................................................................. 20

3.2 Bahan dan alat penelitian ................................................................. 20

3.2.1 Bahan penelitian ...................................................................... 20

3.2.2 Bahan kimia ............................................................................ 20

3.2.4 Alat penelitian ......................................................................... 20

3.3 Prosedur kerja ................................................................................... 21

3.3.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih ............................ 21

3.3.2 Penentuan aktivitas enzim lakase............................................. 21

3.3.3 Reaksi dimerisasi anetol dengan katalis enzim lakase............. 22

3.3.4 Isolasi produk reaksi ................................................................ 23

3.3.5 Analisis produk reaksi.............................................................. 23

3.4 Skema kerja ......................................................................................25 vii

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 26

4.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih ..................................... 26

4.2 Pengendapan ekstrak kasar enzim lakase ......................................... 27

4.3 Penentuan aktivitas enzim lakase...................................................... 29

4.4 Reaksi dimerisasi anetol dengan katalis enzim lakase...................... 31

4.5 Analisis produk reaksi....................................................................... 35

4.5.1 Analisis GC-MS ...................................................................... 36

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 43

5.1 Kesimpulan ...................................................................................... 43

4.2 Saran ................................................................................................. 43

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 44

viii

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Tabel Halaman

4.1 Penggolongan enzim.......................................................................... 6

4.2 Kadar minyak atsiri, anetol, fencon dan estragol dalam adas dan anis ................................................................................................... 14

4.3 Data kandungan senyawa pada reaksi 24 jam................................... 39

4.4 Data kandungan senyawa pada reaksi 48 jam................................... 41 ix

2.12 Denaturasi protein akibat pelarut organik......................................... 29

2.21 Kromatogram minyak atsiri anis....................................................... 38

2.20 Hasil KLT (a) minyak anis (b) produk reaksi 24 jam (c) produk reaksi 48 jam..................................................................................... 37

2.19 Proses ekstraksi dan produk hasil reaksi dengan enzim lakase ........ 36

2.18 Hasil pengamatan reaksi dimerisasi anetol dan kontrol.................... 35

2.17 Mekanisme kerja Cu pada enzim lakase ........................................... 34

2.16 Skema sistem mediator lakase .......................................................... 33

2.15 Grafik hubungan absorbansi radikal kation ABTS terhadap waktu................................................................................................. 31

6-sulfonate) (ABTS) ......................................................................... 31

2.14 Reaksi oksidasi asam 2,2’-Azinobis-di-(3-ethylbenzthiazoline-

2.13 Proses pengendapan protein dengan aseton ...................................... 30

2.11 Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari protein satu dengan protein lain ........................................................ 28

DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Gambar Halaman

2.10 Instrumentasi GC-MS ....................................................................... 20

2.8 Pembentukan senyawa dimer fenolik ............................................... 16 2.9 . Pembentukan kopling dehidrodieugenol (orto-orto). ....................... 17

2.7 Biosintesis propenilfenol dari jalur shikimat. ................................... 15

2.6 Struktur kimia cis-anetol (a), trans-anetol (b)................................... 14

2.5 Struktur anetol................................................................................... 13

2.4 Mekanisme kopling oksidatif eugenol dengan mediator hidroquinon....................................................................................... 10

ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid )(ABTS) .............................. 9

2.3 3-Hydroxyanthranilic acid (HAA) dan 2,2′-azino-bis-(3-

2.2 Struktur enzim lakase yang diisolasi dari M. albomyces .................. 8

2.1 Jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) ........................................... 5

2.22 Spektrum massa senyawa anetol....................................................... 38

2.23 Kromatogram hasil reaksi minyak anis selama 24 jam .................... 39

2.24 Kromatogram hasil reaksi minyak anis selama 48 jam .................... 40

2.25 Mekanisme reaksi oksidasi kariofilena dengan oksigen menjadi kariofilena oksida.............................................................................. 42

2.26 Spektrum massa senyawa kariofilena oksida.................................... 42

2.27 Spektrum massa senyawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2- dion ................................................................................................... 43

2.28 Struktur senyaawa 1-(4-Metoksi-fenil)-2-fenil-eten-1,2-dion .......... 43

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Indonesia adalah suatu negara kepulauan yang memiliki hutan tropika terbesar kedua di dunia, kaya dengan keanekaragaman hayati dan dikenal sebagai salah satu dari 7 (tujuh) negara megabiodiversity setelah Brazilia. Distribusi tumbuhan tingkat tinggi yang terdapat di hutan tropika Indonesia lebih dari 12 % (30.000) dari yang terdapat di muka bumi (250.000) (Ersam, 2004). Dengan fakta ini, menjadikan Indonesia sebagai negara yang berperan dalam memenuhi kebutuhan dunia akan minyak kelapa sawit, rempah-rempah, dan minyak atsiri.

Dewasa ini minyak atsiri merupakan komoditas ekspor Indonesia yang meningkat signifikan sejak 2005 (Anonim, 2006). Minyak atsiri ini biasanya digunakan dalam industri farmasi, kosmetik, parfum, maupun makanan dan minuman. Minyak atsiri merupakan metabolit sekunder tumbuhan yang berfungsi sebagai pertahanan diri dan sarana yang merupakan daya tarik bagi lawan jenisnya (Guenther dan Ketaren, 2006).

Di antara sekian banyak produk minyak atsiri yang dihasilkan, Indonesia dikenal sebagai penghasil minyak adas dan minyak anis yang sebagaian besar terdapat di Yogyakarta, Boyolali, dan Sumatera (Handayani, 2001). Minyak atsiri anis diketahui mengandung senyawa golongan propenil fenol, yaitu anetol sebesar 80-90% (Rostiana, 2007). Anetol biasanya digunakan sebagai salah satu bahan dasar dari minyak telon dan obat-obatan. Selain itu anetol juga memiliki aktivitas sebagai antioksidan, anti-inflamasi, dan gastroprotektor (Freire, et al., 2005)

Senyawa metabolit sekunder dalam minyak atsiri diantanya merupakan golongan terpenoid, fenolik, dan aril propanoid (Verpoorte, et al., 2000). Di alam, senyawa aril propanoid ditemukan dalam beberapa kelompok berdasarkan strukturnya yaitu lignan, alil fenol, propenil fenol, dan sinamat. Lignan sebagai senyawa yang lebih kompleks dapat disintesis dari kelompok senyawa aril propanoid yang lebih sederhana seperti kelompok propenil fenol (Lenny, 2006).

Dewasa ini banyak penelitian dilakukan untuk mentransformasi senyawa aril propanoid menjadi senyawa lain yang memiliki aktivitas biologis yang lebih tinggi. Salah satu cara yang dilakukan yaitu dengan mensintesis senyawa dimer propenil fenol. Hal ini telah dilakukan oleh Arifin (2008) yang mensintesis senyawa dimer dari eugenol. Senyawa dimer eugenol ini kemudian diuji aktivitasnya sebagai antioksidan. Hasil uji aktivitas menunjukkan senyawa eugenol memiliki nilai IC 50 yang lebih rendah dibandingkan senyawa dimernya. Dengan demikian pembentukan senyawa dimer eugenol dapat meningkatkan aktivitas antioksidan.

Reaksi penggabungan (kopling) senyawa propenil fenol untuk membentuk senyawa dimer dapat dilakukan dengan menggunakan katalis asam seperti HCl (Ngadiwiyana, dkk., 2002), maupun melalui pembentukan radikal dengan UV. Namun cara yang terakhir ini memiliki kekurangan yaitu produk yang dihasilkan merupakan produk campuran lebih dari 5 senyawa (Castro, et al., 2010).

Penggunaan katalis dalam reaksi kopling cukup mahal dan kurang ramah terhadap lingkungan sehingga banyak penelitian yang dilakukan untuk menemukan katalis yang lebih ramah terhadap lingkungan.

Reaksi dimerisasi senyawa turunan propenil fenol juga dapat dilakukan dengan menggunakan biokatalis enzim oksireduktase, seperti enzim lakase (Zille, 2005). Berdasarkan penelitian sebelumnya, enzim lakase dapat diisolasi dari jamur pelapuk kayu (Risdianto, dkk., 2008), kapang dari tandan kosong kelapa sawit (Dewi, 2011), dan jamur tiram putih (Arifin, 2008). Enzim lakase yang disolasi dari jamur tiram putih memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,56 unit/mg protein (Arifin, 2008). Dalam proses katalitiknya, enzim lakase menggunakan oksigen dan hanya menghasilkan air sebagai produk samping, sehingga enzim ini merupakan katalis yang ramah lingkungan (Riva, 2006).

Mengacu dari keberhasilan pada penelitian sebelumnya, telah dihasilkan produk senyawa dimer golongan propenil fenol yang bersifat bioaktif, antara lain senyawa dimer dari guaiakol (Andrian, 2007), etil ferulat (Junaedi, 2007), dan asam ferulat (Permatasari, 2007). Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dilakukan reaksi dimerisasi terhadap golongan propenil fenol, yaitu anetol dengan katalis enzim lakase dari jamur tiram putih. Proses ini diharapkan dapat menjadi alternatif dalam penyediaan senyawa dimer propenil fenol dengan rendemen yang besar, bioaktivitas yang tinggi serta prosesnya bersifat ramah lingkungan. Produk yang terbentuk dari hasil sintesis akan diidentifikasi menggunakan metode spektroskopi GC-MS.

1.2 Rumusan Masalah

1. Berapa besar aktivitas unit enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih?

2. Apakah enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih dapat digunakan untuk mensintesis senyawa dimer anetol dari minyak anis?

1.3 Tujuan 1. Mengetahui aktivitas unit enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram pitih.

2. Mengetahui apakah enzim lakase yang diisolasi dari jamur tiram putih dapat digunakan dalam mensintesis senyawa aktif dimer anetol dari minyak anis.

1.3 Manfaat

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan pengetahuan baru tentang pembentukan senyawa dimer anetol dengan menggunakan biokatalis enzim lakase yang disolasi dari jamur tiram putih.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jamur Tiram Putih

Jamur adalah organisme yang tidak berklorofil sehingga jamur tidak dapat menyediakan makanan sendiri dengan cara fotosintesis seperti pada tanaman yang berklorofil. Salah satu contoh golongan jamur yang banyak dikonsumsi masyarakat adalah jamur tiram (Pleurotus ostreatus). Secara alamiah golongan

jamur ini menempel pada pohon di daerah bersuhu antara 10-32 C dengan

pertumbuhan optimum pada suhu 25-26

C. Suhu pertumbuhan jamur tiram pada saat inkubasi lebih tinggi dibandingkan suhu pada saat pertumbuhan (pembentukan tubuh buah jamur). Suhu inkubasi jamur tiram berkisar antara 22-

28 C dengan kelembaban 60-80 %, sedangkan suhu pada pembentukan tubuh

o buah berkisar antara 16-22 C (Dewi, 2009).

Taksonomi jamur tiram putih Kingdom Fungi Divisi Basidiomycota Kelas Homobasidiomycetes Ordo Agaricales Family Tricholomataceae Genus Pleurotus

Gambar 2.1 Jamur tiram putih

Spesies Pleurotus ostreatus (Pleurotus ostreatus)

2.2 Enzim

Enzim merupakan suatu protein yang dapat mengkatalisis suatu reaksi kimia dalam makhluk hidup. Sama seperti protein, enzim tersusun dari rantai lurus asam amino yang kemudian mengalami proses pelipatan membentuk suatu struktur tiga dimensi.

2.2.1 Penggolongan enzim

Enzim mempunyai nama yang kompleks berdasarkan sistem penggolongan yang didasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisisnya. Golongan enzim utama diringkas dalam tabel 1.1 dibawah ini.

Tabel 4.1 Penggolongan Enzim (Stryer, et al., 2007)

No Golongan Enzim Jenis reaksi yang dikatalisis

1 Oksireduktase Oksidasi-reduksi. Donor hidrogen atau donor elektron

2 Transferase Transfer gugus kimia dengan bentuk umum

3 Hidrolase Pemutusan secara hidrolitik pada ikatan C-C, C- N, C-O, dan ikatan lainnya.

4 Liase Pemutusan (bukan hidrolitik) pada ikatan C-C, C-O, dan ikatan lainnya, menyisakan ikatan rangkap; atau, penambahan gugus pada ikatan rangkap dua.

5 Isomerase Perubahan susunan geometris pada suatu molekul

6 Ligase Pengikatan (penggabungan) dua molekul

2.2.2 Kespesifikan enzim

Sifat khusus enzim yang paling utama adalah spesifisitas dan aktivitas katalitik. Spesifisitas enzim sangat tinggi baik terhadap reaksi yang dikatalisisnya ataupun terhadap substrat yang dilibatkan dalam reaksi (Horton, et al., 2002). Secara umum terdapat empat jenis enzim yang berbeda spesifisitasnya, yaitu :

Absolute specificity : enzim mengenali satu jenis substrat

 Group specificity : enzim yang bertindak pada molekul yang spesifik

 gugus fungsionalnya

Linkage specifity : Enzim bertindak pada jenis ikatan kimia tertentu

 Stereochemical specifity : enzim bertindak pada isomer sterik atau optik

 tertentu

2.2.3 Mekanisme kerja enzim

Dalam proses kerjanya, enzim tidaklah merubah konstanta kesetimbangan, tetapi dengan enzim dibutuhkan energi yang lebih rendah untuk mengkonversi substrat menjadi produk. Proses katalisis dimulai dengan diikatnya substrat pada daerah sisi aktif enzim sehingga membentuk kompleks enzim substrat dan terjadi reaksi kimia diakhiri dengan pelepasan enzim dan produk (Stryer, et al, 2007).

E + P EP Kompleks ES E + S

Mekanisme katalisis enzim melibatkan gugus fungsi yang terdapat pada sisi aktif enzim. Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang mengandung residu asam amino yang berperan dalam pembuatan dan pemutusan ikatan selama proses katalisis. Ikatan – ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat adalah ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun interaksi hidrofobik. Gugus yang terlibat dalam proses pengikatan substrat disebut gugus pengikat (binding group). Gugus yang terlibat dalam proses katalitik antara enzim dan substrat disebut gugus katalitik (catalytic group). Gugus katalitik terletak pada gugus samping enzim (Horton, et al. 2002).

2.3 Metalloenzyme Metalloenzyme adalah sebuah protein enzimatik yang memiliki hubungan

kuat antara bagian protein dan logam, dimana logam tertanam di dalam molekul enzim ini. Logam yang terdapat pada enzim ini biasanya dalam bentuk ion dan peran utamanya adalah berfungsi dalam reaksi enzimatik. Logam memainkan peran langsung dalam pengikatan atom yang bekerja untuk membantu menstabilkan protein setelah reaksi enzimatik.

Logam juga membantu dalam proses transfer elektron. Logam ini berada di sisi aktif dari enzim, dimana mereka bertindak sebagai elektrofil yang menarik elektron dari zat lain untuk membentuk sebuah ikatan (Cynthia, et al., 2004)

2.4 Enzim lakase

Lakase (EC 1.10.3.2; benzendiol: oksigen oksidoreduktase) sebagian besar merupakan glikoprotein ekstraseluler yang mengandung atom tembaga dengan bobot molekul 60-80 kDa. Lakase merupakan enzim multy-copper (mangandung banyak ion tembaga) sehingga dapat membantu katalisis reaksi oksidasi beberapa substrat seperti polifenol, substituen fenol, dan diamin. Enzim ini pertama kali ditemukan dalam getah pohon pernis Jepang (Rhus vernicifera), pada tahun 1988 (Kunamneni, et al., 2008).

Gambar 2.2 Struktur enzim lakase yang diisolasi dari M. albomyces

(Skalova, et al., 2007) Enzim lakase merupakan salah satu enzim yang banyak diteliti sejak abad ke 19. Enzim lakase banyak terdapat pada jamur dan tanaman tingkat tinggi. Pada kelompok jamur, enzim lakase telah diisolasi dari jamur golongan Ascomycetes, Deuteromycetes, Basidiomycetes. Enzim ini termasuk ke dalam kelompok oksidoreduktase, yang dapat mengkatalis reaksi oksidasi dan reduksi. Enzim lakase dapat mengkatalis proses oksidasi senyawa golongan fenolik menjadi radikal, yang selanjutnya dapat membentuk dimer, oligomer, maupun polimerasi.

Dalam mekanismenya, enzim lakase menggunakan oksigen, dan hanya menghasilkan air sebagai produk samping. Oleh karena itu, enzim ini merupakan enzim yang sangat ramah lingkungan.

Lakase telah banyak diteliti karena sifat spesivitasnya yang rendah terhadap substrat. Hidrokuinon, guaiakol, 2,6-dimetoksifenol, dan p-fenildiamin merupakan substrat-substrat yang sering digunakan. Substrat seperti 2,2-azinobis-

3-etilbenzethiazolin-6-sulfonat (ABTS) berperan sebagai mediator yang

memungkinkan oksidasi komponen non-fenolik pada lignin yang tidak dapat dioksidasi oleh lakase sendiri. Senyawa-senyawa yang telah digunakan sebagai mediator dalam industri antara lain, HAA dan ABTS.

Gambar 2.3 Struktur senyawa (a). 3-Hydroxyanthranilic acid (HAA)

(b). 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid)(ABTS) Mekanisme reaksi enzimatis oleh lakase adalah reaksi oksidasi satu elektron. Oksigen dibutuhkan sebagai penerima elektron dan kemudian membentuk air. Ketika reaksi oksidasi berlangsung, substrat kehilangan satu elektronnya dan membentuk radikal fenoksi bebas yang berperan sebagai senyawa perantara. Radikal bebas yang terbentuk tersebut dapat melangsungkan reaksi oksidatif enzimatik selanjutnya atau reaksi non-enzimatik seperti hidrasi dan polimerisasi (Rochefort, et al., 2004). Salah satu contohnya adalah dalam pembentukan dimer eugenol, berikut :

Gambar 2.4 Mekanisme kopling oksidatif eugenol dengan mediator hidroquinon

(Arifin, 2008)

2.5 Minyak atsiri

Secara biologis, minyak atsiri merupakan metabolit sekunder yang biasanya berperan sebagai alat pertahanan diri agar tidak dimakan oleh hewan (hama) ataupun sebagai agen untuk bersaing dengan tumbuhan lain dalam mempertahankan ruang hidup. Pada mulanya istilah “minyak atsiri” atau minyak eteris adalah istilah yang digunakan untuk minyak mudah menguap dan diperoleh dari tanaman dengan cara penyulingan uap. Definisi ini dimaksudkan untuk membedakan minyak/lemak dengan minyak atsiri yang berbeda tanaman penghasilnya (Agusta, 2002).

Intensitas suatu bau (harum yang dihasilkan, dengan kekecualian pada kondisi tertentu) merupakan manifestasi dari sifat mudah menguap persenyawaan yang menghasilkan bau harum tersebut (Guenther, 2006). Minyak atsiri yang mudah menguap terdapat di dalam kelenjar minyak khusus di dalam kantung minyak atau di dalam ruang antar sel dalam jaringan tanaman. Minyak atsiri tersebut harus dibebaskan sebelum disuling yaitu dengan merajang/memotong jaringan tanaman dan membuka kelenjar minyak sebanyak mungkin, sehingga minyak dapat dengan mudah diuapkan (Guenther, 2006).

Minyak atsiri yang bagian utamanya terpenoid terdapat pada fraksi atsiri yang tersuling uap. Zat inilah penyebab harum, wangi dan bau yang khas pada banyak tumbuhan (Harborne, 2000). Ditinjau dari segi kimia fisika, minyak atsiri hanya mengandung dua golongan senyawa yaitu oleopyna dan strearopyena.

Oleopyna adalah bagian hidrokarbon di dalam minyak atsiri dan berwujud cairan. Sedangkan strearopyena adalah senyawa hidrokarbon teroksigenasi yang umumnya berwujud padat (Agusta, 2002).

2.6 Senyawa fenolik

Senyawa fenolik adalah senyawa yang terbentuk atas cincin aromatik yang sekurang-kurangnya tersubtitusi oleh satu gugus hidroksil. Contoh yang paling sederhana adalah fenol. Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder yang ada di alam dan biasanya berada dalam bentuk polimernya ataupun terikat pada beberapa gugus fungsi membentuk eter, ester, dan glikosida. Sebagian besar senyawa fenolik termasuk ke dalam golongan oligostilbenoid, flavonoid, fenil propanoid, dan turunan asam fenolat (Saroyobudiyono dan Aisyah, 2006).

Aktivitas fisiologis senyawa fenolik yang terdapat pada tumbuhan sangat beragam. Beberapa senyawa tertentu yang tergolong flavanoid, berperan dalam merangsang atau menarik serangga untuk penyerbukan bunga. Selain itu, senyawa fenolik tertentu juga dapat dimanfaatkan manusia sebagai antikanker, antioksidan, antimikroba, herbisida dan lain-lain (Andrian, 2007).

Menurut Lenny (2006) senyawa fenolik dapat dibedakan menjadi dua golongan berdasarkan biogenetiknya, yaitu senyawa yang berasal dari jalur shikimat dan asetat malonat. Namun ada juga senyawa-senyawa yang berasal dari kombinasi antara kedua jalur biosintesa ini yaitu senyawa-senyawa flavonoida.

Senyawa fenolik yang berasal dari jalur shikimat yang utama adalah fenilpropanoid. Senyawa fenol ini memiliki kerangka dasar karbon yang terdiri atas cincin benzen (C6) yang terikat pada ujung rantai karbon propan (C3). Kelompok senyawa fenol ini banyak ditemukan dalam tumbuhan tingkat tinggi. Beberapa jenis senyawa yang termasuk fenil propanoid adalah turunan asam sinamat, alilfenol, propenilfenol, dan kumarin (Robinson, 1995).

Senyawa fenol yang bersal dari jalur asetat malonat disebut senyawa poliketida. Senyawa poliketida dapat diklasifikasikan berdasarkan pola struktur tertentu yang berkaitan dengan jalur biogenetiknya diantaranya turunan kromon, antraquinon, dan turunan benzokuinon. Senyawa poliketida memiliki kerangka dasar aromatik yang disusun oleh beberapa unit dua atom karbon dan membentuk suatu rantai karbon yang linier yakni asam poli β-ketokarboksilat yang disebut rantai poliasetil (Manitto, 1999).

2.7 Anetol

Anetol memiliki nama lain sebagai para-anisaldehid, para-metoksi propenil benzen atau “anise champor”, mempunyai rumus kimia C

10 H

12 O, berat

molekul 148,20 g/mol dan memiliki struktur kimia seperti pada gambar 2.7 (Kusumaningsih, 2000). Kandungan anetol dalam minyak adas maupun minyak anis mengeluarkan aroma yang khas anetol (Sastrohamidjojo, 2004).

Gambar 2.5 Struktur anetol

Struktur kimia anetol terdiri dari cincin aromatis dengan dua rantai samping berupa alil dan metoksi. Hal ini memungkinkan anetol untuk dikonversi menjadi senyawa lain dengan tingkat kemanfaatan yang lebih tinggi. Gugus alil yang dimiliki anetol ini sama dengan gugus yang dimiliki oleh eugenol sehingga dapat mengalami polimerisasi kationik dengan menggunakan katalis Friedel Crafts dan asam mineral (Kartikawati, 2007). Anetol memiliki dua isomer yaitu o cis dan trans. cis-Anetol memiliki titik didih 70-70,5 C/2,3 mmHg. trans-Anetol o

memiliki titik didih 81-81,5 C/2,3 mmHg (Kusumaningsih, 2000). Struktur kimia cis dan trans anetol ditunjukkan pada gambar 2.6.

Gambar 2.6 Struktur kimia cis-anetol (a), trans-anetol (b)

Anetol berwujud cair tak berwarna pada suhu 22,5 C dan bersifat optis inaktif, berbau anis dan rasanya manis. Anetol tidak dapat mengkristal, berwarna kuning dan agak pahit dengan disertai kenaikan berat jenis di atas 1 jika terkena cahaya, udara, air atau kalor. Kelarutan anetol dalam air kurang baik karena anetol mempunyai sifat polaritas rendah. Dalam industri, anetol biasanya digunakan sebagai bahan dasar minyak telon dan obat batuk (Freire, et al., 2005).

Sebagian besar anetol dapat diperoleh dari hasil isolasi minyak atsiri anis dan sebagian adas. Anis (Pimpinella anisum L.) merupakan salah satu tanaman yang tergolong famili Apiaceae, berasal dari Asia, Yunani dan Mesir. Bagian tanaman yang digunakan adalah buahnya yang mengandung minyak atsiri yang terdiri dari anetol (80-90%), pinen, fencon, metil kavikol, anisaldehid, kamfen, dan felandren (Rostiana, 2007). Berikut perbandingan kadar anetol yang terdapat dalam beberapa tanaman adas dan anis.

Tabel 4.2 Kadar minyak atsiri, anetol, fencon dan estragol dalam adas dan anis

(Anonim, 2006) Jenis/tempat asal Kadar Anetol Fencon Estragol minyak(g/100 ml) (%) (%) (%)

Adas (F. vulgare) 3,83 43,3 33,3 15,3 Cipanas, Jawa

Barat Adas (F. vulgare) 3,23 28,3 28,9 16,9 Lembang , Jawa Barat Adas jamu (F. 4,39 44,5 16,9 22,7

vulgare ) Jawa

Tengah Adas (F. dulce) 2,23 73,0 2,0 0,96 komersial Anis (Pimpinella 13,97 82,8 - 0,96

) komersial

anisum

Anetol merupakan senyawa golongan fenilpropanoid yang merupakan senyawa turunan propenilfenol. Propenilfenol ini merupakan senyawa yang bertalian satu sama lain dengan alilfenol. Berikut proses biosintesisnya dari jalur shikamat :

Asam sinamat Asam shikamat CH ₂ X

X ₊ ₊

CH ₂

H
H propenilfenol alilfenol

Gambar 2.7 Biosintesis propenilfenol dari jalur shikimat

2.8 Dimerisasi melalui kopling oksidatif fenolik

Pembentukan senyawa dimer dapat dilakukan melalui reaksi kopling oksidatif. Reaksi kopling oksidatif sendiri merupakan suatu reaksi penggabungan antara dua molekul atau lebih, yang telah teroksidasi dalam bentuk radikalnya. Reaksi ini dapat terjadi dengan bantuan biokatalis enzim, misalnya enzim peroksidase dan lakase (Dewick, 1997) Radikal yang terbentuk akan mengalami resonansi dan menghasilkan intermediet radikal yang selanjutnya akan mengalami penggabungan. Berikut mekanisme penggabungan serta kemungkinan produk yang dihasilkan (Eickhoff, et al., 2000).

Gambar 2.8 Pembentukan senyawa dimer fenolik

Seperti yang terlihat pada gambar di atas bahwasanya hasil kopling radikal fenoksi dapat membentuk dimer fenolik, baik pada orto-orto, para-para, maupun

orto-para . Selain itu juga terdapat kemungkinan penggabungan O-para, O-orto, dan O-O, bergantung pada kestabilan peroduk kopling oksidatif.

Berdasarkan Merly (2005) yang melakukan reaksi kopling oksidatif untuk menghasilkan senyawa dimer eugenol dengan bantuan katalis peroksidase, dihasilkan produk dimer dari kopling posisi orto-orto yang dominan. Hal ini dikarenakan kestabilan radikalnya lebih tinggi dibandingkan pada posisi lainnya dan juga halangan steriknya yang lebih kecil. Berikut proses pembentukannya :

OCH ₃ OCH OCH ³ ³ OCH OCH ₃ ³ O O O O O _O _OCH ₃ _O OCH ₃ _{H CO} ₃ _O _{H CO} ₃ _O

Gambar 2.9 Pembentukan kopling dehidrodieugenol (orto-orto)

2.9 Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Rizvi, 2008).

2.9.1 Kromatografi lapis tipis (KLT)

Fenomena yang terjadi pada KLT adalah berdasarkan pada prinsip adsorpsi. Setelah sampel ditotolkan di atas fasa diam, senyawa-senyawa dalam sampel akan terelusi dengan kecepatan yang sangat bergantung pada sifat-sifat kemampuan terikat pada fasa diam dan kemampuan larut dalam fasa gerak, sifat kekuatan elektrolisis yang menarik senyawa di atas fasa diam kemampuan melarutkan senyawa. Pada KLT, secara umum senyawa yang memiliki kepolaran rendah akan terelusi lebih cepat daripada senyawa polar karena senyawa polar terikat lebih kuat pada bahan silika yang mengandung silanol (SiOH

2 ) yang pada

dasarnya memiliki avinitas yang kuat terhadap senyawa polar (Gritter, dkk., 1999).

Karena prosesnya yang mudah dan cepat, KLT banyak digunakan untuk melihat kemurnian senyawa organik. Biasanya analisis dilakukan dengan mengubah pelarut beberapa kali (minimal 3 macam) dan hasil elusi tetap menampakkan satu noda maka akan dapat dikatakan bahwa sampel yang ditotolkan adalah murni. Selain itu, karena KLT juga dapat menampakkan jumlah senyawa dalam campuran sampel (menurut noda yang muncul), maka KLT dapat digunakan untuk mengikuti atau mengontrol jalannya reaksi organik maupun untuk mengontrol proses pemisahan campuran yang dilakukan menggunakan kromatografi kolom, kromatografi preparatif, dan kromatotron. KLT ini juga merupakan suatu cara yang umum dilakukan untuk memilih pelarut yang sesuai sebelum dilakukan pemisahan menggunakan berbagai jenis kromatografi .

Untuk dapat menghitung jarak yang ditempuh oleh noda maka harus diketahui lokasi noda pada plat dengan tepat. Untuk noda yang bewarna dapat dilihat secara visual, tetapi untuk noda yang tidak berwarna dapat diamati dengan cara menggunakan sinar lampu UV, uap iodium dan pereaksi penampak noda.

Noda yang telah didapat diberi tanda, dan dihitung harga Rf (Rizvi, 2008).

Jarak titik pusat bercak dari titik awal

Rf =

Jarak garis depan dengan titik awal

2.10 Spektroskopi

Metode spektoskopi berguna dalam penentuan struktur molekul. Terdapat banyak teknik spektroskopi yang sering digunakan dalam penentuan struktur molekul dan berat molekul. Salah satunya adalah spektroskopi ultraviolet visible.

2.10.1 Spektroskopi ultraviolet visibel

Spektroskopi ulatraviolet Visible (UV-Vis) adalah analisis yang didasarkan pada interaksi sinar dengan panjang gelombang tertentu dengan suatu materi. Materi atau zat tersebut menyerap (absorbsi) sinar, kemudian ditransfer ke atom atau molekul dalam sampel. Dalam hal ini, elektron terluar dipromosikan dari tingkat energi yang lebih rendah ke energi yang lebih tinggi (Underwood, 1998).

Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang sangat encer dengan blanko pelarut analit tersebut. Pelarut yang sering digunakan yaitu etanol 95%, hal ini dikarenakan sebagian besar senyawa larut dalam pelarut tersebut. Pelarut lain yang umum digunakan antara lain air, metanol, n-heksana, petroleum eter, dan eter. Senyawa yang tidak berwarna diukur pada panjang gelombang 200-400 nm. Sedangkan senyawa berwarna diukur pada panjang gelombang 400-700 nm (Harborne, 1987).

2.10.3 GC-MS Spektrometri

Kromatografi Gas–Spektrometri Massa merupakan suatu instrumen gabungan kromatografi dan spektroskopi. Instrumen ini terdiri dari kromatografi gas (GC) yang merupakan alat pemisah berbagai komponen dalam analit dan spektrometer massa (MS) untuk mendeteksi struktur tiap komponen yang telah dipisahkan. Banyak campuran senyawa kimia yang dapat dipisahkan, diidentifikasi, dan dihitung kadarnya dengan GC-MS.

Senyawa yang akan dianalisis dengan GC-MS harus bersifat volatil dan stabil terhadap suhu. Selain itu komponen campuran harus mempunyai kelarutan yang baik di dalam fasa gerak. Untuk senyawa yang kurang volatil atau bahkan tak volatil harus diubah dulu menjadi turunan yang volatil dan lebih stabil (Gritter, et al., 1999).

Komponen pada instrumen GC antara lain adalah: tangki gas pembawa dengan pengatur tekanan dan pengontrol aliran gas, kolom, fase diam, sistem injeksi, detektor, pengontrol temperatur oven, sistem ionisasi, dan perekam kromatogram (Skoog, et al., 1997). Berikut instrumen GC-MS :

Gambar 2.10 Instrumentasi GC-MS

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-Juni 2012, di Laboratorium Kimia Organik dan Biokimia Departemen Kimia Fakultas Sain dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya.

3.2 Bahan dan alat penelitian

3.2.1 Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa jamur tiram putih dan minyak anis

3.2.2 Bahan kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah buffer fosfat, aseton, aquadem, hidroquinon, n-heksan, etilasetat, etanol, dan ABTS.

3.2.3 Alat penelitian

Alat-alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini meliputi blender, labu erlenmeyer, corong pisah, rotary vacum evaporator, kertas saring, sentrifuga, GC-MS, UV-Vis, plat KLT, kromatotron, mikropipet, alumunium foil, pendingin, pH-meter, termometer, lemari pendingin, serta peralatan gelas yang biasa digunakan di laboratorium.

3.3 Prosedur kerja

3.3.1 Isolasi enzim lakase dari jamur tiram putih

Sebanyak 300 gram jamur tiram putih diblender dalam larutan buffer fosfat 0,2 M, pH 6,0, kemudian dihomogenkan dengan homogenizer pada suhu 0-

PEMBENTUKAN SENYAWA DIMER ANETOL DENGAN BIOKATALIS ENZIM LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH SKRIPSI