Kata kunci: Stroke iskemik, tikus model stroke iskemik, metode induksi stroke iskemik, UCAO, MMP-9
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
RESEARCH ARTICLE
METODE UCAO (UNILATERAL CEREBRAL ARTERY OCCLUSSION) MENINGKATKAN KADAR MMP9 JARINGAN OTAK PADA MODEL TIKUS STROKE ISKEMIK
UCAO (UNILATERAL CEREBRAL ARTERY OCCLUSSION) METHOD INCREASES THE LEVEL OF MMP9 BRAIN TISSUE IN RATS MODEL OF ISCHEMIC STROKE
Muhamad Rasjad Indra*, Cakra Parindra Gasmara**
*Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
**Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
pISSN : 2407-6724 ● eISSN : 2442-5001 ● http://dx.doi.org/10.21776/ub.mnj.2016.002.02.1 ● MNJ.2016;2(2):47-51
● Received 25 October 2015 ● Reviewed 25 December 2015 ● Accepted 25 January 2016
ABSTRAK
Latar belakang. UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion) adalah metode penginduksian stroke dengan
mengikat arteri carotid selama 45 menit yang akan membuat kondisi hipoksia di jaringan otak sama
seperti stroke pada manusia. Prosedur ini tidak rumit dan lebih ekonomis dibandingkan dengan metode
yang ada lainnya. MMP-9 adalah marker stroke yang dapat dideteksi menggunakan ELISA melalui serum
darah hewan coba.
Tujuan. Membuktikan bahwa metode UCAO yang dilakukan selama 45 menit dapat meningkatkan kadar
MMP-9 tikus model stroke iskemik.
Metode. Eksperimen murni di laboratorium secara in vivo dengan metode randomized post test
controlled group design. 8 tikus wistar jantan umur 8-10 minggu dibagi menjadi 2 kelompok. Sehari
setelah induksi stroke dilakukan, kadar MMP-9 diukur dengan mengambil darah ekor melalui ELISA.
Hasil. Dalam penelitian ini, metode UCAO mampu meningkatkan kadar MMP-9 darah tikus kelompok
perlakuan dibandingankan dengan kelompok kontrol. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji statistik MannWhitney dan Kruskal-Wallis yang signifikan (p < 0.05).
Simpulan. Metode induksi stroke UCAO dapat dilakukan sebagai metode untuk membuat tikus model
stroke iskemik.
Kata kunci: Stroke iskemik, tikus model stroke iskemik, metode induksi stroke iskemik, UCAO, MMP-9
ABSTRACT
Background. UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion) is a stroke induction method by ligating mice’s
carotid artery for 45 minutes. Thus giving a hypoxic condition similar to stroke attacks to human. This
method is less complicated and far more efficient. MMP-9 is a stroke marker which is assayed by ELISA
from the blood of test animal.
Objective. To prove UCAO method is capable to raise MMP-9 concentration in mice’s blood.
Methods. This research was an experimental laboratory research with post-test only controlled group
design. 8 male rats (8-10 weeks) were divided into 2 groups. A day after the treatment group had been
induced to stroke, both group were tested to measure the MMP-9 blood concentration through ELISA.
Results. In this research, UCAO method had increased MMP-9 blood concentration in treatment group,
compared to the control group. It is proved by the statistic tests, Mann-Whitney and Kruskal-Wallis, which
showed a significant increase in treatment group (p < 0.05).
Conclusion. UCAO method is accepted as a method to create an ischemic stroke mice model.
Keywords: Ischemic stroke, ischemic stroke mice model, ischemic stroke induction method, UCAO, MMP-9
Korespondensi: [email protected]
47
48 Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
PENDAHULUAN
Stroke merupakan penyakit yang ditandai dengan
hilangnya sirkulasi darah ke area otak secara tibatiba dan mengakibatkan penurunan fungsi
neurologis.1
Stroke
merupakan
penyebab
kecacatan permanen nomer 1 di seluruh dunia.
Ada 15 juta penderita stroke di dunia setiap
tahunnya, 5 juta diantaranya meninggal dan 5 juta
lainnya hidup dengan disabilitas jangka panjang.
Jumlah penderita stroke di Indonesia terbanyak
dan menduduki urutan pertama di Asia.2 Selama
lima tahun terakhir, penderita stroke yang
meninggal dunia sejumlah 15,4 % dari total
populasi, dimana 42,9% merupakan akibat dari
stroke iskemik.3
Stroke iskemik terjadi bila pembuluh darah yang
memasok darah ke otak tersumbat oleh gumpalan
darah,4 sehingga sel-sel di daerah injury tidak
menerima oksigen dan glukosa yang dibutuhkan.
Neuron (sel-sel saraf otak) berhenti berfungsi dan
mati kecuali jika aliran darah dipulihkan dengan
cepat.5 Kematian neuron mengakibatkan defisit
fungsi neurologis primer, yang manifestasinya
adalah
berkurangnya
kemampuan
untuk
melakukan aktivitas fungsional seperti berpakaian
dan berjalan.6 Gejala yang terjadi pada penderita
stroke iskemik tergantung pada area otak mana
yang berhenti menerima darah. Penderita dapat
mengalami kehilangan salah satu penglihatan,
kesulitan berbicara, membaca, atau menulis,
kelemahan, dan kelumpuhan ekstremitas, serta
kesulitan dalam memori. Gejala-gejala ini dapat
menetap dan menyebabkan disabilitas jangka
panjang serta penurunan fungsi ADL (activity daily
living).5
Pengobatan stroke yang masih digunakan sekarang
adalah
anti-platelet,
anti-koagulan,
dan
trombolitik. Ketiga obat ini meringankan gejala
stroke dengan melisiskan thrombus yang biasanya
menjadi penyebab tersumbatnya arteri di otak.
Sehingga aliran darah di otak menjadi normal
kembali. Tetapi, ketiga obat ini tidak memiliki
fungsi untuk memperbaiki jaringan otak yang
sudah rusak karena tidak adekuatnya suplai
oksigen ke otak.7 Hal ini menyiratkan peluang yang
besar dalam pengembangan terapi stroke di masa
depan.
Perkembangan dan penelitian untuk stroke
penting dilakukan karena prevalensinya yang kian
meningkat
bersamaan
dengan
penyakit
degenerative lainnya seperti hipertensi, diabetes
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
mellitus, dan penyakit jantung koroner. Riset
epidemilogi yang dilakukan Global Burden of
Disease Project tahun 2008, mengungkapkan 10
hingga 15 tahun ke depan prevalensi penyakit
degenerative akan lebih tinggi dari penyakit infeksi
yang disebabkan bakteri maupun parasite. Tahun
2030
diperkirakan
prevalensi
penyakit
degenerative adalah 87% dari semua masalah
kesehatan, dan stroke merupakan salah satu
masalah yang utama.
Metode-metode yang telah dikembangkan untuk
membuat tikus model stroke sangat beragam.
Menginduksi keadaan hipoksia secara sistemik
dapat mempengaruhi jaringan otak sama seperti
stroke. Menginduksi stroke di lobus otak yang
spesifik
juga
dapat
dilakukan
dengan
photothrombosis. Metode photothrombosis baik
dilakukan apabila ingin menginduksi stroke di salah
satu hemisfer otak. Tetapi, fasilitas yang
dibutuhkan belum tersedia secara bebas. Dengan
keterbatasan fasilitas penelitian stroke di
Indonesia, diperlukan metode penginduksian
stroke yang lebih mudah dilakukan, namun sama
efektifnya dengan metode lain.
UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion)
adalah metode penginduksian stroke dengan cara
mengikat arteri carotid, arteri yang langsung
mengalirkan darah menuju otak, selama 45 menit.8
Ini dilakukan untuk menghasilkan kondisi hipoksia
di jaringan otak sehingga hewan coba siap untuk
diteliti
lebih
lanjut.
Prosedur
untuk
mengimplementasikan metode ini tidak rumit dan
semahal metode-metode penginduksian stroke
lainnya. Sehingga metode UCAO ini dapat
diterapkan dengan mudah, ekonomis, dan bisa
dilakukan oleh siapapun untuk membantu
perkembangan terapi stroke di Indonesia.
MMP-9 adalah marker awal stroke yang dapat
dideteksi menggunakan ELISA melalui serum darah
hewan coba. MMP-9 muncul bersamaan dengan
infiltrasi neutrofil dalam neuron otak yang
mengalami iskemik. Ekspresi MMP-9 juga
meningkat seiring dengan proses iskemik yang
semakin meningkat pada sel neuron.9 Mekanisme
transkripsi MMP-9 dalam sel neuron dimulai dari
diekspresikannya faktor inflamatori seperti IL-1β,
TNF-α, FGF dan EGF dalam kondisi iskemik 10.
Faktor-faktor inflamatori tersebut menstimulasi
ekspresi MMP-9 dengan mengaktifkan sinyal
pathway protein kinase MEK1-Erk, P38, PI3K-Akt.
Kemudian, protein kinase tersebut meregulasi
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
transkripsi dari MMP-9 dengan mengaktivasi AP-1
dan NF-κB yang akan berikatan dengan elemen cis.
Hal ini akan membentuk chromatin remodeling
complexes, co-activator, dan memicu transkripsi
dari MMP-9.11
Metode UCAO ini diharapkan dapat meningkatkan
kadar MMP-9 sampel darah hewan coba sehingga
dapat memastikan bahwa metode ini efektif dalam
membuat tikus model stroke untuk penelitian.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan desain eksperimen
murni (true experimental design) di laboratorium
secara in vivo menggunakan rancangan
randomized post test controlled group design.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar
MMP-9 dari tikus yang diinduksi stroke dengan
menggunakan metode UCAO (Unilateral Cerebral
Artery Occlusion). Variable bebas dari penelitian
ini merupakan metode penginduksian stroke
UCAO, dan variabel tergantungnya adalah kadar
MMP-9 setelah induksi stroke UCAO.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Farmakologi dan Fisiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya pada bulan Maret 2013.
Hewan Coba
Populasi penelitian ini menggunakan tikus wistar
(Rattus norvegicus) jantan yang berumur 8-10
minggu. Sampel penelitian menggunakan 12 tikus
yang diambil secara random sampling dengan
kriteria inklusi dan eksklusi, serta kriteria drop out.
Kriteria inklusi tikus percobaan antara lain tikus
jenis Rattus norvegicus Wistar, tikus berjenis
kelamin jantan, berumur 8-10 minggu, dengan
berat badan rata-rata 150 gram dan tikus
berwarna putih sehat, aktif, bertingkah laku
normal dan tidak ada kelainan anatomic.
Sedangkan kriteria eksklusi yaitu tikus yang selama
penelitian tidak mau makan dan tikus yang
kondisinya menurun atau mati selama penelitian
berlangsung.
Tikus dinyatakan drop out apabila sesuai kriteria
eksklusi dan diganti tikus lain yang sesuai dengan
kriteria inklusi, sehingga didapat jumlah tikus
sesuai ketentuan sampel. Kemudian, sampel tikus
dibagi menjadi 2 kelompok, kontrol (K) dan
perlakuan (P), masing-masing kelompok 6 tikus.
Aklimatisasi tikus dilakukan selama 12 hari hingga
berat tikus berkisar antara 150-200 gram.
49
Induksi Stroke
Metode induksi stroke dilakukan dengan metode
Unilateral Carotid Artery Occlusion, yaitu dengan
melakukan ligasi pada arteri karotis interna dan
eksterna tikus pada sisi kiri. Prosedurnya antara
lain tikus dianestesi menggunakan ketamin dengan
dosis 40 mg/kgBB. Kemudian tikus difiksasi dalam
posisi supinasi di atas tempat pembedahan.
Selanjutnya bulu pada bagian leher dicukur lalu
kulit bagian leher dibersihkan menggunakan
alkohol 70% dengan kapas dan diberi antiseptik
untuk mencegah infeksi saat melakukan insisi.
Setelah itu dilakukan insisi dengan menggunakan
skalpel pada garis tengah leher secara vertikal
sepanjang 2–3 cm. Mencari arteri karotis yang
terletak di sebelah lateral trakea. Meligasi arteri
karotis selama 45 menit dengan menggunakan
benang prolene ukuran 6.0. Setelah 45 menit,
ikatan benang prolene dilepas. Lalu luka insisi
tersebut ditutup dan dijahit dengan menggunakan
benang catgut. Setelah itu luka jahitan diolesi
dengan antiseptik, kemudian luka ditutup dengan
kasa steril. Tikus lalu disonde dengan dextrose
10%.
Pengukuran Kadar MMP-9
Pengukuran kadar marker MMP-9, melalui darah
yang diambil lewat ekor tikus. Serum kemudian
dianalisa menggunakan Total MMP-9 Quantikine
ELISA kit (R&D systems, United States of America).
Pengambilan darah tikus dilakukan sehari setelah
penginduksian stroke.
HASIL PENELITIAN
Setelah aklimatisasi dilakukan, darah tikus diambil
untuk melihat kadar MMP-9 pada tikus kelompok
kontrol dan kelompok perlakuan. Peningkatan
kadar marker MMP-9 di dalam darah tikus,
mengindikasikan adanya kerusakan jaringan otak
yang disebabkan oleh stroke. Jaringan otak yang
terkena dampak dari stroke akan mengalami
hipoksia dan tidak mendapat suplai oksigen yang
dibutuhkan dalam homeostasis.
Jumlah total tikus yang diambil darahnya adalah 8
ekor. Tikus kelompok kontrol berjumlah 4 ekor,
dan kelompok perlakuan yang diinduksi stroke
berjumlah 4 ekor. Hal ini dikarenakan ada 2 ekor
tikus dari kelompok perlakuan yang mati saat
induksi stroke, sehingga 2 tikus dari kelompok
kontrol ikut dieksklusikan. Hasil rata-rata dan
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
50
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
standard deviasi dari hasil pengukuran MMP-9
darah tikus, dijelaskan di tabel 1.
Tabel 1. Rerata Kadar MMP-9 Darah Tikus Masingmasing Kelompok Perlakuan (dalam ng/ml).
Rata-rata kadar MMP-9 darah tikus dari tiap
kelompok perlakuan dinyatakan sebagai mean ±
standard deviasi. Dari data yang telah didapatkan,
diketahui bahwa pada kelompok K (kelompok
kontrol) rata-rata dari kadar MMP-9 darah tikus
adalah 0.582 ± 0.124. Untuk kelompok P
(kelompok perlakuan) memiliki rata-rata 0.747 ±
0.028. Perbandingan rata-rata kadar MMP-9 darah
tikus dari tiap kelompok perlakuan dapat dilihat
dari gambar 1.
Gambar 1. Perbandingan Rata-rata Kadar MMP-9 Darah
Tikus dari Tiap Kelompok Perlakuan.
Pada gambar 1 dapat dilihat rata-rata kadar MMP9 darah tikus dari kelompok K (kelompok kontrol)
adalah 0.582 ± 0.124. Untuk kelompok P
(kelompok perlakuan) memiliki rata-rata 0.747 ±
0.028. Gambar 5.1 juga menunjukkan peningkatan
kadar marker MMP-9 dalam darah tikus kelompok
perlakuan. Hasil penghitungan kadar MMP-9 darah
tikus yang telah didapat dianalisis dengan tes nonparametrik, Mann-Whitney dan Kruskall-Wallis,
menggunakan software SPSS 21.
DISKUSI
Stroke iskemik adalah suatu keadaan patologi, di
mana otak mengalami kekurangan pasukan
oksigen dan nutrisi.12 Penelitian ini menggunakan
subjek penelitian tikus model stroke, yaitu galur
Wistar (Rattus norvegicus). Tikus ini diinduksi
stroke dengan menggunakan metode Unilateral
Carotid Artery Occlusion. Dengan metode ini,
pasokan darah ke otak akan terhambat dan
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
terjadilah stroke akibat penyumbatan atau disebut
juga stroke iskemik. Setelah melakukan
penginduksian stroke, dilakukan pengecekan kadar
marker MMP-9 dari serum darah yang diambil dari
ekor tikus. Marker MMP-9 merupakan biomarker
petunjuk stroke, dan kadarnya akan meningkat
setelah periode stroke iskemik.13
Penelitian ini hendak menilai efektivitas metode
UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion)
sebagai metode untuk membuat tikus model
stroke iskemik. Marker MMP-9 darah tikus diukur
untuk melihat apakah tikus yang diinduksi stroke
dengan metode tersebut mengalami hipoksia
jaringan otak. Hipoksia pada jaringan otak
menyebabkan
kerusakan
jaringan
dan
meningkatkan kadar marker MMP-9.9 Mekanisme
transkripsi MMP-9 dalam sel neuron dimulai dari
diekspresikannya faktor inflamatori seperti IL-1β,
TNF-α, FGF dan EGF dalam kondisi iskemik 10.
Faktor-faktor inflamatori tersebut menstimulasi
ekspresi MMP-9 dengan mengaktifkan sinyal
pathway protein kinase MEK1-Erk, P38, PI3K-Akt.
Kemudian, protein kinase tersebut meregulasi
transkripsi dari MMP-9 dengan mengaktivasi AP-1
dan NF-κB yang akan berikatan dengan elemen cis.
Hal ini akan membentuk chromatin remodeling
complexes, co-activator, dan memicu transkripsi
dari MMP-9.11
Hasil dari pengukuran kadar marker MMP-9
menunjukkan kelompok kontrol (K) dengan ratarata 0.582 ng/ml ± 0.124. Untuk kelompok
perlakuan (P), menunjukkan nilai rata-rata 0.747
ng/ml
± 0.028. Dari hasil yang didapat
diperkirakan metode induksi stroke UCAO dapat
menyebabkan kerusakan jaringan otak tikus
seperti stroke iskemik. Hal ini didasari oleh kadar
marker MMP-9 yang tinggi pada pemeriksaan
darah tikus kelompok perlakuan (P) dengan ratarata 0.747 ng/ml ± 0.028 dibandingkan dengan
kadar MMP-9 pada pemeriksaan darah tikus
kelompok kontrol (K).
Pada uji normalitas data Shapiro-Wilk, sebaran
data kadar marker MMP-9 dari 2 kelompok
perlakuan dinyatakan normal (p > 0.05). Lalu data
diuji menggunakan metode Independent T-test
dan ditemukan data tidak homogen, sehingga
analisis dilanjutkan dengan metode Mann-Whitney
dan Kruskal-Wallis. Uji Mann-Whitney dilakukan
untuk melihat hubungan antar kelompok
perlakuan. Hasilnya didapatkan perbedaan yang
signifikan di antara kelompok kontrol (K) dan
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
kelompok perlakuan (P) dengan p = 0.021 (p <
0.05). Uji Kruskal-Wallis dilakukan untuk melihat
perbedaan antar kelompok. Dan dari hasil uji
dinyatakan signifikan dengan p = 0.021 (p < 0.05).
Saran untuk penelitian ini adalah dilakukannya
pengukuran kadar marker MMP-9 sebelum dan
sesudah induksi stroke (pre-post test design).
SIMPULAN
Metode UCAO (Unilateral Cerebral Artery
Occlusion) dapat meningkatkan kadar MMP-9
serum tikus.
DAFTAR PUSTAKA
1. Cruz-Flores, S., et al. Racial-ethnic disparities in
stroke care: the American experience: a
statement for healthcare professionals from
the American Heart Association. American
Stroke Association.Stroke. 2011 42(7) : 2091116
2. Yayasan Stroke Indonesia. 2011. Jakarta,
Republik Indonesia.
3. World Health Organization. 2011. The
International Agenda for Stroke Marc Fisher,
MD, University of Massachussets. Stroke AHA/
ASA. Norrving B. 1st Global Conferences on
Healthy Lifestyles and Noncommunicable
Diseases Control. Moscow.
4. Zieve, D. 2011. Stroke.Neurosurgery, CedarsSinai Medical Center.National Library of
Medicine. Los Angeles.
5. Caplan, A. 2007.Adult mesenchymal stem cells
for tissue engineering versus regenerative
medicine.J cell physiol. 213(2): 341-347.
6. Soyuer, F. 2005. Ischemic Stroke: Motor
Impairment And Disability With Relation To
Age And Lesion Location. The Internet Journal
of Neurology. 3(2): DOI: 10.5580/9b4.
51
7. Mayo Clinic. 2012. Stroke: Treatment and
Drug.
http://mayoclinic.com/health/stroke/DS00150
/DSECTION=treatments-and-drugs.
Diakses
pada tanggal 13 Oktober 2012.
8. Kuraoka, M., Furuta, T., Matsuwaki, T.,
Omatsu, T., Ishii, Y., Kyuwa, S., Yoshikawa, Y.
Direct Experimental Occlusion of the Distal
Middle Cerebral Artery Induces High
Reproducibility of Brain Ischemia in Mice. Exp.
Anim. 2009. 58(1):19-29.
9. Justicia, C., Panes, J., Sole, S., Cervera, A.,
Delofeu, R., Chamorro, A., Planas, A.M.
Neurotrophil Infiltration Increase Matrix
Metalloproteinase-9 in the Ischemic Brain
After Occlusion/Reperfusion of the Middle
Cerebral Artery in Rats. J Cereb Blood Flow
Metab.2003. 23(12):1430-1440.
10. Ruhul Amin AR, Senga T, Oo ML, Thant AA,
Hamaguchi
M.
Secretion
of
matrix
metalloproteinase-9 by the proinflammatory
cytokine, IL-1beta: a role for the dual signalling
pathways, Akt and Erk. Genes Cells. 2003 Jun;
8(6):515-23.
11. Ma Z, Shah RC, Chang MJ, Benveniste EN.
Coordination of cell signaling, chromatin
remodeling, histone modifications, and
regulator recruitment in human matrix
metalloproteinase 9 gene transcription. Mol
Cell Biol. 2004 Jun; 24(12):5496-509.
12. Sjahrir, H. 2003. Stroke Iskemik, Yandira
Agung, Medan, p. 1-3.
13. Reynolds, M.A., Kirchick, H.J., Dahlen, J.R.,
Anderberg, J.M., Mcpherson, P.H., Nakamura,
K.K., Laskowitz, D.T., Valkirs, G.E., Buechler,
K.F. Early Biomarkers of Stroke.Clinical
Chemistry.2003. 49(10):1733-1739.
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
RESEARCH ARTICLE
METODE UCAO (UNILATERAL CEREBRAL ARTERY OCCLUSSION) MENINGKATKAN KADAR MMP9 JARINGAN OTAK PADA MODEL TIKUS STROKE ISKEMIK
UCAO (UNILATERAL CEREBRAL ARTERY OCCLUSSION) METHOD INCREASES THE LEVEL OF MMP9 BRAIN TISSUE IN RATS MODEL OF ISCHEMIC STROKE
Muhamad Rasjad Indra*, Cakra Parindra Gasmara**
*Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
**Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
pISSN : 2407-6724 ● eISSN : 2442-5001 ● http://dx.doi.org/10.21776/ub.mnj.2016.002.02.1 ● MNJ.2016;2(2):47-51
● Received 25 October 2015 ● Reviewed 25 December 2015 ● Accepted 25 January 2016
ABSTRAK
Latar belakang. UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion) adalah metode penginduksian stroke dengan
mengikat arteri carotid selama 45 menit yang akan membuat kondisi hipoksia di jaringan otak sama
seperti stroke pada manusia. Prosedur ini tidak rumit dan lebih ekonomis dibandingkan dengan metode
yang ada lainnya. MMP-9 adalah marker stroke yang dapat dideteksi menggunakan ELISA melalui serum
darah hewan coba.
Tujuan. Membuktikan bahwa metode UCAO yang dilakukan selama 45 menit dapat meningkatkan kadar
MMP-9 tikus model stroke iskemik.
Metode. Eksperimen murni di laboratorium secara in vivo dengan metode randomized post test
controlled group design. 8 tikus wistar jantan umur 8-10 minggu dibagi menjadi 2 kelompok. Sehari
setelah induksi stroke dilakukan, kadar MMP-9 diukur dengan mengambil darah ekor melalui ELISA.
Hasil. Dalam penelitian ini, metode UCAO mampu meningkatkan kadar MMP-9 darah tikus kelompok
perlakuan dibandingankan dengan kelompok kontrol. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji statistik MannWhitney dan Kruskal-Wallis yang signifikan (p < 0.05).
Simpulan. Metode induksi stroke UCAO dapat dilakukan sebagai metode untuk membuat tikus model
stroke iskemik.
Kata kunci: Stroke iskemik, tikus model stroke iskemik, metode induksi stroke iskemik, UCAO, MMP-9
ABSTRACT
Background. UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion) is a stroke induction method by ligating mice’s
carotid artery for 45 minutes. Thus giving a hypoxic condition similar to stroke attacks to human. This
method is less complicated and far more efficient. MMP-9 is a stroke marker which is assayed by ELISA
from the blood of test animal.
Objective. To prove UCAO method is capable to raise MMP-9 concentration in mice’s blood.
Methods. This research was an experimental laboratory research with post-test only controlled group
design. 8 male rats (8-10 weeks) were divided into 2 groups. A day after the treatment group had been
induced to stroke, both group were tested to measure the MMP-9 blood concentration through ELISA.
Results. In this research, UCAO method had increased MMP-9 blood concentration in treatment group,
compared to the control group. It is proved by the statistic tests, Mann-Whitney and Kruskal-Wallis, which
showed a significant increase in treatment group (p < 0.05).
Conclusion. UCAO method is accepted as a method to create an ischemic stroke mice model.
Keywords: Ischemic stroke, ischemic stroke mice model, ischemic stroke induction method, UCAO, MMP-9
Korespondensi: [email protected]
47
48 Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
PENDAHULUAN
Stroke merupakan penyakit yang ditandai dengan
hilangnya sirkulasi darah ke area otak secara tibatiba dan mengakibatkan penurunan fungsi
neurologis.1
Stroke
merupakan
penyebab
kecacatan permanen nomer 1 di seluruh dunia.
Ada 15 juta penderita stroke di dunia setiap
tahunnya, 5 juta diantaranya meninggal dan 5 juta
lainnya hidup dengan disabilitas jangka panjang.
Jumlah penderita stroke di Indonesia terbanyak
dan menduduki urutan pertama di Asia.2 Selama
lima tahun terakhir, penderita stroke yang
meninggal dunia sejumlah 15,4 % dari total
populasi, dimana 42,9% merupakan akibat dari
stroke iskemik.3
Stroke iskemik terjadi bila pembuluh darah yang
memasok darah ke otak tersumbat oleh gumpalan
darah,4 sehingga sel-sel di daerah injury tidak
menerima oksigen dan glukosa yang dibutuhkan.
Neuron (sel-sel saraf otak) berhenti berfungsi dan
mati kecuali jika aliran darah dipulihkan dengan
cepat.5 Kematian neuron mengakibatkan defisit
fungsi neurologis primer, yang manifestasinya
adalah
berkurangnya
kemampuan
untuk
melakukan aktivitas fungsional seperti berpakaian
dan berjalan.6 Gejala yang terjadi pada penderita
stroke iskemik tergantung pada area otak mana
yang berhenti menerima darah. Penderita dapat
mengalami kehilangan salah satu penglihatan,
kesulitan berbicara, membaca, atau menulis,
kelemahan, dan kelumpuhan ekstremitas, serta
kesulitan dalam memori. Gejala-gejala ini dapat
menetap dan menyebabkan disabilitas jangka
panjang serta penurunan fungsi ADL (activity daily
living).5
Pengobatan stroke yang masih digunakan sekarang
adalah
anti-platelet,
anti-koagulan,
dan
trombolitik. Ketiga obat ini meringankan gejala
stroke dengan melisiskan thrombus yang biasanya
menjadi penyebab tersumbatnya arteri di otak.
Sehingga aliran darah di otak menjadi normal
kembali. Tetapi, ketiga obat ini tidak memiliki
fungsi untuk memperbaiki jaringan otak yang
sudah rusak karena tidak adekuatnya suplai
oksigen ke otak.7 Hal ini menyiratkan peluang yang
besar dalam pengembangan terapi stroke di masa
depan.
Perkembangan dan penelitian untuk stroke
penting dilakukan karena prevalensinya yang kian
meningkat
bersamaan
dengan
penyakit
degenerative lainnya seperti hipertensi, diabetes
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
mellitus, dan penyakit jantung koroner. Riset
epidemilogi yang dilakukan Global Burden of
Disease Project tahun 2008, mengungkapkan 10
hingga 15 tahun ke depan prevalensi penyakit
degenerative akan lebih tinggi dari penyakit infeksi
yang disebabkan bakteri maupun parasite. Tahun
2030
diperkirakan
prevalensi
penyakit
degenerative adalah 87% dari semua masalah
kesehatan, dan stroke merupakan salah satu
masalah yang utama.
Metode-metode yang telah dikembangkan untuk
membuat tikus model stroke sangat beragam.
Menginduksi keadaan hipoksia secara sistemik
dapat mempengaruhi jaringan otak sama seperti
stroke. Menginduksi stroke di lobus otak yang
spesifik
juga
dapat
dilakukan
dengan
photothrombosis. Metode photothrombosis baik
dilakukan apabila ingin menginduksi stroke di salah
satu hemisfer otak. Tetapi, fasilitas yang
dibutuhkan belum tersedia secara bebas. Dengan
keterbatasan fasilitas penelitian stroke di
Indonesia, diperlukan metode penginduksian
stroke yang lebih mudah dilakukan, namun sama
efektifnya dengan metode lain.
UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion)
adalah metode penginduksian stroke dengan cara
mengikat arteri carotid, arteri yang langsung
mengalirkan darah menuju otak, selama 45 menit.8
Ini dilakukan untuk menghasilkan kondisi hipoksia
di jaringan otak sehingga hewan coba siap untuk
diteliti
lebih
lanjut.
Prosedur
untuk
mengimplementasikan metode ini tidak rumit dan
semahal metode-metode penginduksian stroke
lainnya. Sehingga metode UCAO ini dapat
diterapkan dengan mudah, ekonomis, dan bisa
dilakukan oleh siapapun untuk membantu
perkembangan terapi stroke di Indonesia.
MMP-9 adalah marker awal stroke yang dapat
dideteksi menggunakan ELISA melalui serum darah
hewan coba. MMP-9 muncul bersamaan dengan
infiltrasi neutrofil dalam neuron otak yang
mengalami iskemik. Ekspresi MMP-9 juga
meningkat seiring dengan proses iskemik yang
semakin meningkat pada sel neuron.9 Mekanisme
transkripsi MMP-9 dalam sel neuron dimulai dari
diekspresikannya faktor inflamatori seperti IL-1β,
TNF-α, FGF dan EGF dalam kondisi iskemik 10.
Faktor-faktor inflamatori tersebut menstimulasi
ekspresi MMP-9 dengan mengaktifkan sinyal
pathway protein kinase MEK1-Erk, P38, PI3K-Akt.
Kemudian, protein kinase tersebut meregulasi
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
transkripsi dari MMP-9 dengan mengaktivasi AP-1
dan NF-κB yang akan berikatan dengan elemen cis.
Hal ini akan membentuk chromatin remodeling
complexes, co-activator, dan memicu transkripsi
dari MMP-9.11
Metode UCAO ini diharapkan dapat meningkatkan
kadar MMP-9 sampel darah hewan coba sehingga
dapat memastikan bahwa metode ini efektif dalam
membuat tikus model stroke untuk penelitian.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan desain eksperimen
murni (true experimental design) di laboratorium
secara in vivo menggunakan rancangan
randomized post test controlled group design.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar
MMP-9 dari tikus yang diinduksi stroke dengan
menggunakan metode UCAO (Unilateral Cerebral
Artery Occlusion). Variable bebas dari penelitian
ini merupakan metode penginduksian stroke
UCAO, dan variabel tergantungnya adalah kadar
MMP-9 setelah induksi stroke UCAO.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Farmakologi dan Fisiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya pada bulan Maret 2013.
Hewan Coba
Populasi penelitian ini menggunakan tikus wistar
(Rattus norvegicus) jantan yang berumur 8-10
minggu. Sampel penelitian menggunakan 12 tikus
yang diambil secara random sampling dengan
kriteria inklusi dan eksklusi, serta kriteria drop out.
Kriteria inklusi tikus percobaan antara lain tikus
jenis Rattus norvegicus Wistar, tikus berjenis
kelamin jantan, berumur 8-10 minggu, dengan
berat badan rata-rata 150 gram dan tikus
berwarna putih sehat, aktif, bertingkah laku
normal dan tidak ada kelainan anatomic.
Sedangkan kriteria eksklusi yaitu tikus yang selama
penelitian tidak mau makan dan tikus yang
kondisinya menurun atau mati selama penelitian
berlangsung.
Tikus dinyatakan drop out apabila sesuai kriteria
eksklusi dan diganti tikus lain yang sesuai dengan
kriteria inklusi, sehingga didapat jumlah tikus
sesuai ketentuan sampel. Kemudian, sampel tikus
dibagi menjadi 2 kelompok, kontrol (K) dan
perlakuan (P), masing-masing kelompok 6 tikus.
Aklimatisasi tikus dilakukan selama 12 hari hingga
berat tikus berkisar antara 150-200 gram.
49
Induksi Stroke
Metode induksi stroke dilakukan dengan metode
Unilateral Carotid Artery Occlusion, yaitu dengan
melakukan ligasi pada arteri karotis interna dan
eksterna tikus pada sisi kiri. Prosedurnya antara
lain tikus dianestesi menggunakan ketamin dengan
dosis 40 mg/kgBB. Kemudian tikus difiksasi dalam
posisi supinasi di atas tempat pembedahan.
Selanjutnya bulu pada bagian leher dicukur lalu
kulit bagian leher dibersihkan menggunakan
alkohol 70% dengan kapas dan diberi antiseptik
untuk mencegah infeksi saat melakukan insisi.
Setelah itu dilakukan insisi dengan menggunakan
skalpel pada garis tengah leher secara vertikal
sepanjang 2–3 cm. Mencari arteri karotis yang
terletak di sebelah lateral trakea. Meligasi arteri
karotis selama 45 menit dengan menggunakan
benang prolene ukuran 6.0. Setelah 45 menit,
ikatan benang prolene dilepas. Lalu luka insisi
tersebut ditutup dan dijahit dengan menggunakan
benang catgut. Setelah itu luka jahitan diolesi
dengan antiseptik, kemudian luka ditutup dengan
kasa steril. Tikus lalu disonde dengan dextrose
10%.
Pengukuran Kadar MMP-9
Pengukuran kadar marker MMP-9, melalui darah
yang diambil lewat ekor tikus. Serum kemudian
dianalisa menggunakan Total MMP-9 Quantikine
ELISA kit (R&D systems, United States of America).
Pengambilan darah tikus dilakukan sehari setelah
penginduksian stroke.
HASIL PENELITIAN
Setelah aklimatisasi dilakukan, darah tikus diambil
untuk melihat kadar MMP-9 pada tikus kelompok
kontrol dan kelompok perlakuan. Peningkatan
kadar marker MMP-9 di dalam darah tikus,
mengindikasikan adanya kerusakan jaringan otak
yang disebabkan oleh stroke. Jaringan otak yang
terkena dampak dari stroke akan mengalami
hipoksia dan tidak mendapat suplai oksigen yang
dibutuhkan dalam homeostasis.
Jumlah total tikus yang diambil darahnya adalah 8
ekor. Tikus kelompok kontrol berjumlah 4 ekor,
dan kelompok perlakuan yang diinduksi stroke
berjumlah 4 ekor. Hal ini dikarenakan ada 2 ekor
tikus dari kelompok perlakuan yang mati saat
induksi stroke, sehingga 2 tikus dari kelompok
kontrol ikut dieksklusikan. Hasil rata-rata dan
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
50
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
standard deviasi dari hasil pengukuran MMP-9
darah tikus, dijelaskan di tabel 1.
Tabel 1. Rerata Kadar MMP-9 Darah Tikus Masingmasing Kelompok Perlakuan (dalam ng/ml).
Rata-rata kadar MMP-9 darah tikus dari tiap
kelompok perlakuan dinyatakan sebagai mean ±
standard deviasi. Dari data yang telah didapatkan,
diketahui bahwa pada kelompok K (kelompok
kontrol) rata-rata dari kadar MMP-9 darah tikus
adalah 0.582 ± 0.124. Untuk kelompok P
(kelompok perlakuan) memiliki rata-rata 0.747 ±
0.028. Perbandingan rata-rata kadar MMP-9 darah
tikus dari tiap kelompok perlakuan dapat dilihat
dari gambar 1.
Gambar 1. Perbandingan Rata-rata Kadar MMP-9 Darah
Tikus dari Tiap Kelompok Perlakuan.
Pada gambar 1 dapat dilihat rata-rata kadar MMP9 darah tikus dari kelompok K (kelompok kontrol)
adalah 0.582 ± 0.124. Untuk kelompok P
(kelompok perlakuan) memiliki rata-rata 0.747 ±
0.028. Gambar 5.1 juga menunjukkan peningkatan
kadar marker MMP-9 dalam darah tikus kelompok
perlakuan. Hasil penghitungan kadar MMP-9 darah
tikus yang telah didapat dianalisis dengan tes nonparametrik, Mann-Whitney dan Kruskall-Wallis,
menggunakan software SPSS 21.
DISKUSI
Stroke iskemik adalah suatu keadaan patologi, di
mana otak mengalami kekurangan pasukan
oksigen dan nutrisi.12 Penelitian ini menggunakan
subjek penelitian tikus model stroke, yaitu galur
Wistar (Rattus norvegicus). Tikus ini diinduksi
stroke dengan menggunakan metode Unilateral
Carotid Artery Occlusion. Dengan metode ini,
pasokan darah ke otak akan terhambat dan
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016
terjadilah stroke akibat penyumbatan atau disebut
juga stroke iskemik. Setelah melakukan
penginduksian stroke, dilakukan pengecekan kadar
marker MMP-9 dari serum darah yang diambil dari
ekor tikus. Marker MMP-9 merupakan biomarker
petunjuk stroke, dan kadarnya akan meningkat
setelah periode stroke iskemik.13
Penelitian ini hendak menilai efektivitas metode
UCAO (Unilateral Cerebral Artery Occlusion)
sebagai metode untuk membuat tikus model
stroke iskemik. Marker MMP-9 darah tikus diukur
untuk melihat apakah tikus yang diinduksi stroke
dengan metode tersebut mengalami hipoksia
jaringan otak. Hipoksia pada jaringan otak
menyebabkan
kerusakan
jaringan
dan
meningkatkan kadar marker MMP-9.9 Mekanisme
transkripsi MMP-9 dalam sel neuron dimulai dari
diekspresikannya faktor inflamatori seperti IL-1β,
TNF-α, FGF dan EGF dalam kondisi iskemik 10.
Faktor-faktor inflamatori tersebut menstimulasi
ekspresi MMP-9 dengan mengaktifkan sinyal
pathway protein kinase MEK1-Erk, P38, PI3K-Akt.
Kemudian, protein kinase tersebut meregulasi
transkripsi dari MMP-9 dengan mengaktivasi AP-1
dan NF-κB yang akan berikatan dengan elemen cis.
Hal ini akan membentuk chromatin remodeling
complexes, co-activator, dan memicu transkripsi
dari MMP-9.11
Hasil dari pengukuran kadar marker MMP-9
menunjukkan kelompok kontrol (K) dengan ratarata 0.582 ng/ml ± 0.124. Untuk kelompok
perlakuan (P), menunjukkan nilai rata-rata 0.747
ng/ml
± 0.028. Dari hasil yang didapat
diperkirakan metode induksi stroke UCAO dapat
menyebabkan kerusakan jaringan otak tikus
seperti stroke iskemik. Hal ini didasari oleh kadar
marker MMP-9 yang tinggi pada pemeriksaan
darah tikus kelompok perlakuan (P) dengan ratarata 0.747 ng/ml ± 0.028 dibandingkan dengan
kadar MMP-9 pada pemeriksaan darah tikus
kelompok kontrol (K).
Pada uji normalitas data Shapiro-Wilk, sebaran
data kadar marker MMP-9 dari 2 kelompok
perlakuan dinyatakan normal (p > 0.05). Lalu data
diuji menggunakan metode Independent T-test
dan ditemukan data tidak homogen, sehingga
analisis dilanjutkan dengan metode Mann-Whitney
dan Kruskal-Wallis. Uji Mann-Whitney dilakukan
untuk melihat hubungan antar kelompok
perlakuan. Hasilnya didapatkan perbedaan yang
signifikan di antara kelompok kontrol (K) dan
Indra, et al.
UCAO Method Increases the Level of MMP-9 Brain Tissue
kelompok perlakuan (P) dengan p = 0.021 (p <
0.05). Uji Kruskal-Wallis dilakukan untuk melihat
perbedaan antar kelompok. Dan dari hasil uji
dinyatakan signifikan dengan p = 0.021 (p < 0.05).
Saran untuk penelitian ini adalah dilakukannya
pengukuran kadar marker MMP-9 sebelum dan
sesudah induksi stroke (pre-post test design).
SIMPULAN
Metode UCAO (Unilateral Cerebral Artery
Occlusion) dapat meningkatkan kadar MMP-9
serum tikus.
DAFTAR PUSTAKA
1. Cruz-Flores, S., et al. Racial-ethnic disparities in
stroke care: the American experience: a
statement for healthcare professionals from
the American Heart Association. American
Stroke Association.Stroke. 2011 42(7) : 2091116
2. Yayasan Stroke Indonesia. 2011. Jakarta,
Republik Indonesia.
3. World Health Organization. 2011. The
International Agenda for Stroke Marc Fisher,
MD, University of Massachussets. Stroke AHA/
ASA. Norrving B. 1st Global Conferences on
Healthy Lifestyles and Noncommunicable
Diseases Control. Moscow.
4. Zieve, D. 2011. Stroke.Neurosurgery, CedarsSinai Medical Center.National Library of
Medicine. Los Angeles.
5. Caplan, A. 2007.Adult mesenchymal stem cells
for tissue engineering versus regenerative
medicine.J cell physiol. 213(2): 341-347.
6. Soyuer, F. 2005. Ischemic Stroke: Motor
Impairment And Disability With Relation To
Age And Lesion Location. The Internet Journal
of Neurology. 3(2): DOI: 10.5580/9b4.
51
7. Mayo Clinic. 2012. Stroke: Treatment and
Drug.
http://mayoclinic.com/health/stroke/DS00150
/DSECTION=treatments-and-drugs.
Diakses
pada tanggal 13 Oktober 2012.
8. Kuraoka, M., Furuta, T., Matsuwaki, T.,
Omatsu, T., Ishii, Y., Kyuwa, S., Yoshikawa, Y.
Direct Experimental Occlusion of the Distal
Middle Cerebral Artery Induces High
Reproducibility of Brain Ischemia in Mice. Exp.
Anim. 2009. 58(1):19-29.
9. Justicia, C., Panes, J., Sole, S., Cervera, A.,
Delofeu, R., Chamorro, A., Planas, A.M.
Neurotrophil Infiltration Increase Matrix
Metalloproteinase-9 in the Ischemic Brain
After Occlusion/Reperfusion of the Middle
Cerebral Artery in Rats. J Cereb Blood Flow
Metab.2003. 23(12):1430-1440.
10. Ruhul Amin AR, Senga T, Oo ML, Thant AA,
Hamaguchi
M.
Secretion
of
matrix
metalloproteinase-9 by the proinflammatory
cytokine, IL-1beta: a role for the dual signalling
pathways, Akt and Erk. Genes Cells. 2003 Jun;
8(6):515-23.
11. Ma Z, Shah RC, Chang MJ, Benveniste EN.
Coordination of cell signaling, chromatin
remodeling, histone modifications, and
regulator recruitment in human matrix
metalloproteinase 9 gene transcription. Mol
Cell Biol. 2004 Jun; 24(12):5496-509.
12. Sjahrir, H. 2003. Stroke Iskemik, Yandira
Agung, Medan, p. 1-3.
13. Reynolds, M.A., Kirchick, H.J., Dahlen, J.R.,
Anderberg, J.M., Mcpherson, P.H., Nakamura,
K.K., Laskowitz, D.T., Valkirs, G.E., Buechler,
K.F. Early Biomarkers of Stroke.Clinical
Chemistry.2003. 49(10):1733-1739.
MNJ, Vol.02, No.02, Juli 2016