Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Situlan (Macaranga dipterocarpifolia Merrill) Chapter III V

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Alat-alat

1.

Alat Destilasi

2.

Batang Pengaduk

3.

Beaker Glass

4.

Botol Vial

5.

Chamber

6.

Corong Kaca

7.

Corong Pisah

500 mL

Pyrex

8.

Ekstraktor

5000 mL

Schoot/ Duran

9.

Gelas Ukur

Pyrex

10. Gelas Erlenmeyer

Pyrex

11. Kolom Kromatografi

Pyrex

Pyrex

12. Labu Rotarievaporator

1000 mL

Schoot/ Duran

13. Labu Takar

250 mL

Pyrex

14. Lampu UV

254 nm/356 nm

UVGL 58

15. Neraca Analitis

Mettler AE 200

16. Penangas air
17. Pipa Kapiler
18. Pipet Tetes
19. Rotarievaporator

Buchi R-114

20. Spatula
21. Spektrofotometer FT-IR

2Shimadzu

22. Spektofotometer 1H-NMR

Jeol/Delta2NMR

23. Spektrofotometer UV-VIS

24. Statif dan Klem
25. Tabung Reaksi

Pyrex

Universitas Sumatera Utara

3.2 Bahan-bahan

1.

Daun Situlan

2.

Metanol

Destilasi

3.

Etil asetat

Teknis

4.

Aquadest

5.

N-heksana

6.

Silika gel 40

7.

FeCl3 5%

8.

NaOH 10%

9.

Serbuk Mg

Teknis
(70-230 mesh) ASTM

E.Merck. KgA

10. HCl(p)
11. H2SO4(p)
12. Kapas
13. Kloroform

p.a. E. Merck

14. Plat KLT silika gel 60 F254
15. Kloroform

p.a. E. Merck

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Situlan yang diperoleh dari daerah
Tarutung, kabupaten Tapanuli Utara , kecamatan Tarutung, Sumatera Utara. Daun
tumbuhan Situlan dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh
serbuk daun tumbuhan Situlan sebanyak 2000 g.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Situlan

Serbuk daun tumbuhan Situlan diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining
Fitokimia.

Universitas Sumatera Utara

Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun
tumbuhan Situlan maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi
warna sebagai berikut:

1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun tumbuhan Situlan yang telah
dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer
2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer I dan 100 mL
etil asetat ke dalam gelas Erlenmeyer II
3. Didiamkan selama 1 malam
4. Disaring
5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 4 tabung reaksi
6. Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I

:dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam

b. Tabung II

:dengan serbuk Mg, dan HCl(p) menghasilkan larutan merah

muda
c. Tabung III

:dengan

NaOH

10%

menghasilkan

larutan

hijau

kekuningan
d. Tabung IV

:dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan

3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Situlan

Serbuk daun tumbuhan Situlan ditimbang sebanyak 2000 g, kemudian dimaserasi
dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan
selama 24 jam. Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat
rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan
hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan lemak dengan
cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan menggunakan aquadest, hingga
negatif FeCl3, dan disaring. Lalu filtrat aquadest dipartisi berulang-ulang dengan
menggunakan etil asetat untuk memisahkan tanin, hingga lapisan aquadest negatif
FeCl3 . lapisan etil asetat dipisahkan dari lapisan aquadest. Fraksi etil asetat
kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat
menguap.

Universitas Sumatera Utara

Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi
berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening.
Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali
dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat
lapisan metanol.

3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan
menggunakan fase diam silika gel 60F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk
mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Fasa gerak yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform: metanol dengan
perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v).

Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak kloroform: metanol 90:10
(v/v) ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak
pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam
bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan
di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan.

Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi
dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga
Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut
kloroform: metanol dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v).

3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak
pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel
40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu kloroform 100%, campuran pelarut
kloroform: metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v).
Dirangkai alat kromatografi kolom.

Universitas Sumatera Utara

Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan
menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke
dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform
100% hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 4,0 g ekstrak pekat
metanol dengan silika gel dengan pelarut metanol, kemudian dimasukkan ke
dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan
fasa gerak kloroform: metanol 90:10 (v/v) secara perlahan-lahan dan diatur
sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan
fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak
kloroform: metanol dengan perbandingan 80:20 (v/v), 70:30 (v/v), dan 60:40
(v/v). Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di
KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5%.
Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta.

3.3.6 Pemurnian

Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali
dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang
diperoleh sudah murni atau belum. Kemudian dilakukan kembali kromatografi
kolom dengan fase gerak

Kloroform : etil asetat

50:50 (v/v). Hasil isolasi

direkristalisasi dengan menggunakan etil asetat dan n-heksana hingga diperoleh
senyawa murni yang dibuktikan dengan noda yang tunggal pada uji KLT.

3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan
menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak kloroform: etil asetat
50:50 (v/v), dan kloroform:metanol 70:30 (v/v).

Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis
tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan

Universitas Sumatera Utara

metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana
kromatografi lapis tipis yang telah jenuh.
Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan
dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan
menggunakan pereaksi FeCl3 5% dalam metanol menghasilkan bercak berwarna
hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.

3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan uji dengan tiga jenis
spektrofotometer
Inframerah

yaitu

spektrofotometer

UV-Visible,

spektrofotometer

(FT-IR), spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1H-

NMR).

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Pusat Peneltian
LPPT UGM, Yogyakarta dengan menggunakan pelarut metanol dan diperoleh
data yang dapat dilihat pada Gambar 4.1.

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Pusat Peneltian
LPPT UGM, Yogyakarta dengan menggunakan KBr dan diperoleh data yang
dapat dilihat pada Gambar 4.2.

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
(1H-NMR)

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Pusat Peneltian
LPPT UGM, Yogyakarta dengan menggunakan pelarut aseton dan diperoleh data
yang dapat dilihat pada Gambar 4.3.

Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Uji Flavonoida

3.4.1 Ekstraksi dengan pelarut metanol

Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Ekstraksi dengan pelarut etil asetat

Universitas Sumatera Utara

3.5 Bagan Penelitian

Universitas Sumatera Utara

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Peneltian

Berdasarkan hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari
daun tumbuhan situlan ( Macaranga dipterocarpifolia Merril) dengan adanya
penambahan pereaksi-pereaksi warna, menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan
ekstrak etil asetat sampel positif flavonoida.

Hasil elusi dari perbandingan pelarut kloroform: metanol 90:10 (v/v) pada
fraksi 51-58, dipisahkan kembali pada alat kolom dengan eluen kloroform: etil
asetat 50:50 (v/v) dan direkristalisasi dengan etil asetat dan n-heksan umtuk
mendapatkan senyawa murni. Sehingga diperoleh senyawa murni berupa pasta
berwarna kuning orange, seberat 21 mg, dan nilai Rf = 0,33

Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut
metanol ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini :

Universitas Sumatera Utara

Gambar 4.1 Spektrum UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi
Tabel 4.1 Serapan panjang gelombang Ultraviolet-Visible (UV-Vis) senyawa
hasil isolasi

No

Panjang Gelombang (nm)

Absorbansi

1.

260,000

1,216

2.

358,000

2,869

Hasil analisis spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi dengan
menggunakan pellet KBr dapat dilihat pada gambar 4.2. sebagai berikut:

Gambar 4.2. Spektrum Inframerah (FT-IR) senyawa hasil isolasi

Dari analisis Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) memberikan pita-pita serapan
pada daerah bilangan gelombang (cm-1) seperti pada tabel 4.2.

Universitas Sumatera Utara

Tabel 4.2 Interpretasi Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi
Bilangan Gelombang

Intensitas

Gugus Fungsi

3425,58

Sedang

Vibrasi ulur –OH

2931,80

Rendah

Vibrasi ulur C-H Aromatis

1705,07

Sedang

Vibrasi ulur C=O

1512,19-1442,75

Sedang

Vibrasi ulur C=C Aromatis

1203,58

Sedang

Vibrasi ulur C-O-C

(cm-1)

Berikut adalah hasil analisis Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton
(1H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut aseton-d6 dan
TMS sebagai standar pada senyawa hasil isolasi:

Gambar 4.3. Spektrum 1H-NMR senyawa hasil isolasi

Universitas Sumatera Utara

Hasil analisis Spektrofotmeter Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut Aseton-d6 dan TMS sebagai
standar yang memberikan signal-signal pergeseran kimia dengan penjelasan pada
tabel 4.3. berikut:
Tabel 4.3. Pergeseran Kimia 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
Atom H

δ H Senyawa Hasil Isolasi

H-2’ & H-6’

7,707-7,691 (d)

H-3’ & H-5’

7,113-7,097 (d)

H dari OCH3

3,836-3,809 (t)

Universitas Sumatera Utara

4.2 Pembahasan

Dari hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan situlan (Macaranga
dipterocarpifolia Merrill) mulai dari proses ekstraksi maserasi diperoleh ekstrak
pekat sebanyak 376,17 g, kemudian dilarutkan dengan menggunakan aquadest
untuk pemisahan lemak, lalu diekstraksi partisi menggunakan etil asetat untuk
memisahkan senyawa yang diduga merupakan tanin dan diperoleh ekstrak pekat
etil asetat sebanyak 28,34 g . Ekstrak pekat yang diperoleh dilarutkan dengan
metanol kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan
hingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 4 g.. Dianalisis kromatografi
lapis tipis sebelum kromatografi kolom dan didpat perbandingan pelarut yang
sesuai untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan situlan adalah
kloroform: metanol 90:10 v/v yang menunjukkan pemisahan yang lebih baik dari
noda yang dihasilkan (Lampiran 3). Hasil analisis kromatografi lapis tipis
terhadap eluat hasil kolom kromatografi dengan eluen kloroform: etil asetat 50:50
v/v yang menunjukkan masih terdapat beberapa noda pada fraksi yang
digabungkan (Lampiran 4). Ditunjukkan bahwa noda yang dihasilkan pada plat
kromatografi lapis tipis pada fraksi

dengan pereaksi FeCl 3 5% yang paling baik

maka dilakukan pemurnian hasil isolasi dengan kolom kromatografi kembali
dengan eluen kloroform:etil asetat 50:50 v/v. Hasil analisa kromatografi lapis tipis
terhadap eluat hasil kromatografi kolom yang kedua kali dengan eluen yang
seragam kloroform:etil asetat 50:50 v/v yang menunjukkan masih terdapat
beberapa noda yang dihasilkan pada plat kromatografi lapis tipis pada fraksi 1633 dengan pereaksi FeCl3 5% dan merupakan sangat baik untuk dilanjutkan
(Lampiran 5), maka dilakukan kembali pemurnian hasil isolasi dengan
rekristalisasi menggunakan pelarut etil asetat dan n heksan, kemudian
dikromatografi lapis tipis kembali untuk menentukan harga Rf hasil isolasi
dengan dua eluen yang berbeda, yaitu kloroform: etil asetat 50:50 v/v diperoleh
harga Rf= 0,33 dan kloroform metanol 70:30 v/v diperoleh harga Rf = 0,71 .

Universitas Sumatera Utara

Dari hasil interpretasi spektrum UV-Vis memberikan serapan pada pita II
dengan panjang gelombang 358 nm dan pita I 260 nm yang menunjukkan panjang
gelombang senyawa hasil isolasi berada pada rentang panjang gelombang
senyawa flavonoida golongan flavonol dengan 3 OH bebas ( pita I sekitar 350-385
nm dan pita II sekitar 250-280 nm) (Lampiran 7).

Hasil interpretasi Spekturm Inframerah (FT-IR) dan Spektrum Resonansi
Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dalam standar TMS diperoleh:
Pergeseran kimia pada daerah δ = 7,707-7,691 ppm puncak doblet menunjukkan
dua proton dari H- 2’ dan H-6’ sedangkan pada daerah δ = 7,113-7,097 ppm
puncak doblet yang lebih rendah menunjukkan adanya dua proton dari H-3’ dan
H-5’ pada cincin B senyawa flavonoida yang sesuai dengan peak spektrum
pembanding pada lampiran 11. Hal ini juga didukung oleh spektrum Inframerah
pada daerah bilangan gelombang 1442,75-1612,49 cm-1 dengan puncak sedang
menandakan adanya vibrasi ulur ikatan rangkap C=C pada sistem aromatis dan
pada bilangan gelombang 2931,80 cm-1 dengan puncak rendah menunjukkan
adanya vibrasi ulur C-H pada sistem aromatis.
Pergeseran kimia pada daerah δ =

3,836-3,809 ppm dengan puncak triplet

menunjukkan adanya proton dari gugus metoksi H-6, H-7 dan H-8 pada cincin A
senyawa flavonoida. Hal ini didukung oleh peak spektrum standar pembanding
pada lampiran 12, dimana gugus metoksi terdapat pada daerah δ = 3,5-4,0 ppm
dengan puncak triplet.

Berdasarkan analisis data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UVVisible, spektrum inframerah (FT-IR), spektrum 1H-NMR disimpulkan bahwa
besar kemungkinan senyawa yang diisolasi dari daun tumbuhan situlan
(Macaranga dipterocarpifolia Merrill) adalah senyawa flavonoida golongan
flavonol.

Universitas Sumatera Utara

Meskipun demikian, penulis mengakui bahwa data hasil 1H-NMR masih kurang
murni karena adanya campuran dari senyawa hasil isolasi. Gambar 4.4 berikut ini
merupakan struktur flavonol yang diperoleh dari senyawa hasil isolasi:

Gambar 4.4 Senyawa Hasil Isolasi (Flavonol)

Universitas Sumatera Utara

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 2000 g daun tumbuhan situlan
(Macaranga

dipterocarpifolia

Merrill)

merupakan

pasta

orange

kekuningan sebanyak 21 mg dengan harga Rf = 0,33
2. Hasil analisis dengan Spektrofotometri UV-Visible, Spektrofotometri
Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometri Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi dari daun tumbuhan situlan
(Macaranga dipterocarpifolia Merrill) diduga adalah senyawa flavonoida
golongan flavonol.

5.2 Saran

Untuk lebih mendukung struktur senyawa flavonoida hasil isolasi, maka
sebaiknya

perlu

dilakukan

analisis

Spektrometer

Karbon

( 13C-NMR),

Spektrometer Massa (MS), dan analisis HPLC.

Universitas Sumatera Utara