B1J010115 11.
III. METODE PENELITIAN
A.
Alat dan Bahan
Materi penelitian berupa larva dari nilem umur 1 hari setelah menetas, yang
diperoleh dari pemijahan induksi di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Bahan penelitian disajikan pada
Lampiran 1. Peralatan yang digunakan selama penelitian disajikan pada Lampiran 1.
B.
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan
Hewan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian ini telah
dilakukan selama 6 bulan dimulai dari bulan Mei-Oktober 2014.
C.
Rancangan Percobaan
Penelitian dilaksanakan secara eksperimental dengan dengan Rancangan Acak
Lengkap (RAL) pola Split-plot, sebagai petak utama (Main plot) adalah temperatur
terdiri dari temperatur ruang (T1), 27±1oC (T2), dan 30±1oC (T3). Anak Petak (Sub
plot) berupa konsentrasi metiltestosteron dalam medium terdiri dari kontrol (M1),
1,6 nM (M2), 16 nM (M3), dan 32 nM (M4), dengan demikian terdapat 12
kombinasi perlakuan yaitu T1M1, T1M2, T1M3, T1M4, T2M1, T2M2, T2M3,
T2M4, T3M1, T3M2, T3M3, T3M4. Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 3
kali. Setiap unit ulangan berisi 20 ekor larva ikan nilem umur 1 hari setelah menetas,
dengan demikian diperlukan 720 ekor larva ikan nilem.
1.
Variabel penelitian
Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas dan variabel tergantung.
Variabel bebas adalah temperatur media dan kadar metiltestosteron dalam media.
bio.unsoed.ac.id
Variabel tergantung adalah perkembangan sirip larva dan post larva ikan nilem
dengan parameter panjang dan luas sirip serta diferensiasi sirip (yang dievaluasi
dengan pewarnaan alizarin red), sebagai data pendukung diukur panjang tubuh post
larva.
9
D.
Cara Kerja
1.
Persiapan Bak Pemeliharaan
Pada Bak pemeliharaan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah
Bak dengan ukuran 10 x 5 x 15 cm3, diisi dengan air hingga volume 1 liter dan
diaerasi. Jumlah bak pemeliharaan yang digunakan adalah 36 buah. Setiap bak
pemeliharaan akan diisi larva 20 ekor ikan nilem. Sebelum digunakan bak
pemeliharaan dicuci, kemudian diisi dengan methyllene blue untuk pencegahan
adanya parasit dan jamur agar selama penelitian diharapkan ikan tetap hidup
dan sehat.
2. Pembuatan Bahan Penelitian
a. Pembuatan Medium Larutan Hormon Metiltestosteron
Pembuatan medium larutan hormon Metiltestoteron dilakukan
dengan membuat larutan stok metiltestosteron dengan cara melarutkan
0,3 mg ke dalam 100 ml etanol 70%. Untuk
pembuatan medium
dengan kadar 1,6nM diambil 0,16 ml larutan stok dilarutkan dalam 1L
air yang sebelumnya sudah diambil 0,16 ml. Selanjutnya untuk kadar
16 nM dan 32 nM, sama seperti kadar metiltestosteron 1,6 nM, namun
bedanya hanya jumlah stok yang dilarutkan yakni untuk 16 nM diambil
1,6 mL, sedangkan 3,2 ml untuk kadar 32 nM.
b. Pembuatan Larutan Alizarin Red
Pembuatan untuk 75 ml larutan stok alizarin red dilakukan dengan
cara melarutkan 0,06 g bubuk alizarin red ke dalam 6 ml asam asetat
glasial sampai jenuh, dari larutan tersebut diambil 5 ml untuk
dicampurkan dengan gliserin PA sebanyak 10 ml, kemudian
ditambahkan alkohol hidrat aquosa 60 ml, sehingga jadilah larutan stok
bio.unsoed.ac.id
alizarin red 75 ml. Larutan alizarin red yang dapat digunakan adalah
dengan mengambil 75 ml larutan stok dilarutkan ke dalam 75 ml KOH
2%.
10
c. Pembuatan Larutan Penjernih
1) Larutan Penjernih A (komposisi 100 ml)
Gliserin......................................................................... 20 ml
KOH 4%.......................................................................
3 ml
Aquades........................................................................ 77 ml
2) Larutan Penjernih B (komposisi 100 ml)
Gliserin.........................................................................
50 ml
KOH 4%.......................................................................
3 ml
Aquades........................................................................
47 ml
3) Larutan Penjernih C (komposisi 100 ml)
Gliserin......................................................................... 75 ml
Aquades.......................................................................
3.
25 ml
Pengadaan Larva
Larva yang digunakan adalah larva umur 1 hari setelah menetas,
sehingga harus dilakukan pemijahan atau fertilisasi untuk mendapatkan larva.
Induk ikan jantan dan betina yang matang gonad disiapkan, keduanya diinduksi
menggunakan 0,5 ml/kg berat badan GnRH analog. Induk betina yang telah
diinduksi dipasangkan dengan induk jantan, setiap akuarium diisi dengan satu
induk betina dan satu induk jantan. Delapan sampai sepuluh jam setelah
diinduksi kemudian distriping untuk mendapatkan milt dari induk jantan dan
sel telur dari induk betina. Dilakukan pemijahan buatan atau fertilisasi buatan,
dengan cara mencampurkan sel telur dan milt di dalam baskom kemudian
diberi akuades untuk aktivasi spermatozoa, kemudian dicampurkan dengan
bio.unsoed.ac.id
cara digoyangkan baskomnya selama 2 menit. Setelah 2 menit pencampuran,
sel telur dipisahkan dengan saringan, kemudian ditetesi sedikit air dengan
tujuan agar sisa dari plasma spermatozoa terbuang, kemudian dimasukkan ke
dalam akuarium pemeliharaan.
11
4.
Pemeliharaan
Larva ikan Nilem yang pertama kali menetas dipelihara pada medium
metiltestosteron dengan konsentrasi 1,6 nM, 16 nM, 32 nM dan kontrol pada
temperatur yang berbeda-beda terdiri dari temperatur ruang, 27oC, dan 30oC.
Larva dipelihara selama 5 minggu, dengan setiap hari diberi pakan dan 2 hari
sekali ganti medium pemeliharaan. Pakan diberikan setiap hari pada pukul
08.00 dan 16.00 serta medium diganti setiap 2 hari sekali.
5.
Pengamatan
a. Pengukuran Temperatur
Pengukuran temperatur dilakukan setiap hari selama pemeliharaan,
pengukuran ini meliputi pengukuran temperatur udara dan temperatur medium
sebanyak 3 kali yakni pagi, siang dan sore.
b. Pengukuran Panjang dan Luas
Sirip ikan Nilem diukur panjang dan luasnya menggunakan eye piece/
graticle yang telah dikalibrasi. Pengukuran dilakukan setiap hari sejak hari
pertama penetasan hingga hari ketujuh dilanjutkan setiap minggu hingga
minggu kelima. Sirip yang diukur meliputi sirip pectoral (pinnae pectoralis),
abdominal (pinnae abdominalis), dorsal (pinna dorsalis), anal (pinna analis)
dan caudal (pinna caudalis). Sampel yang diukur adalah 11 pada setiap
kombinasi perlakuan, sehingga total sampel yang diukur adalah 11x36= 396
sampel. Hasil pengukuran kemudian ditabulasikan.
c. Pengukuran Panjang Tubuh
Larva dan post larva Ikan Nilem diukur panjang tubuhnya menggunakan
milimeter blok dengan ketelitian 1 mm.
d. Proses Diferensiasi Sirip dengan Metode Alizarin Red
bio.unsoed.ac.id
Proses diferensiasi sirip diamati dengan menggunakan metode Alizarin
Red, dengan tujuan untuk melihat proses kalsifikasi jari-jari siripnya. Langkah
dalam proses pewarnaannya adalah larva ikan difiksasi dalam alkohol 96%
selama 12 jam, kemudian direndam dalam akuades selama 10 menit, lalu
direndam dalam KOH 1% selama 25 menit, larva selanjutnya direndam dalam
larutan pewarna alizarin red selama 2-4 jam, dan dicuci dalam larutan
penjernih A, B, C masing-masing selama 25 menit. Pengamatan dilakukan di
12
bawah mikroskop cahaya. Pada minggu pertama dilakukan setiap hari
pewarnaan dengan alizarin red, pada minggu kedua sampai minggu kelima
dilakukan dengan interval 7 hari. Proses diferensiasi sirip dievaluasi dengan
melihat sirip apa saja yang telah terbentuk dan jari-jari sirip yang telah
terkalsifikasi. Sampel yang diwarnai adalah 11 pada setiap kombinasi
perlakuan, sehingga total sampel yang diwarnai adalah 11x36= 396 sampel.
E.
Analisis Data
Data penelitian terdiri atas 2 data yakni data diferensiasi dan data
pertumbuhan sirip. Data diferensiasi dianalisis secara deskriptif sedangkan data
pertumbuhan sirip dianalisis menggunakan ANOVA dua arah dengan tingkat
signifikansi 0,05. Apabila hasil Anova menunjukkan p
A.
Alat dan Bahan
Materi penelitian berupa larva dari nilem umur 1 hari setelah menetas, yang
diperoleh dari pemijahan induksi di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Bahan penelitian disajikan pada
Lampiran 1. Peralatan yang digunakan selama penelitian disajikan pada Lampiran 1.
B.
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan
Hewan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian ini telah
dilakukan selama 6 bulan dimulai dari bulan Mei-Oktober 2014.
C.
Rancangan Percobaan
Penelitian dilaksanakan secara eksperimental dengan dengan Rancangan Acak
Lengkap (RAL) pola Split-plot, sebagai petak utama (Main plot) adalah temperatur
terdiri dari temperatur ruang (T1), 27±1oC (T2), dan 30±1oC (T3). Anak Petak (Sub
plot) berupa konsentrasi metiltestosteron dalam medium terdiri dari kontrol (M1),
1,6 nM (M2), 16 nM (M3), dan 32 nM (M4), dengan demikian terdapat 12
kombinasi perlakuan yaitu T1M1, T1M2, T1M3, T1M4, T2M1, T2M2, T2M3,
T2M4, T3M1, T3M2, T3M3, T3M4. Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 3
kali. Setiap unit ulangan berisi 20 ekor larva ikan nilem umur 1 hari setelah menetas,
dengan demikian diperlukan 720 ekor larva ikan nilem.
1.
Variabel penelitian
Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas dan variabel tergantung.
Variabel bebas adalah temperatur media dan kadar metiltestosteron dalam media.
bio.unsoed.ac.id
Variabel tergantung adalah perkembangan sirip larva dan post larva ikan nilem
dengan parameter panjang dan luas sirip serta diferensiasi sirip (yang dievaluasi
dengan pewarnaan alizarin red), sebagai data pendukung diukur panjang tubuh post
larva.
9
D.
Cara Kerja
1.
Persiapan Bak Pemeliharaan
Pada Bak pemeliharaan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah
Bak dengan ukuran 10 x 5 x 15 cm3, diisi dengan air hingga volume 1 liter dan
diaerasi. Jumlah bak pemeliharaan yang digunakan adalah 36 buah. Setiap bak
pemeliharaan akan diisi larva 20 ekor ikan nilem. Sebelum digunakan bak
pemeliharaan dicuci, kemudian diisi dengan methyllene blue untuk pencegahan
adanya parasit dan jamur agar selama penelitian diharapkan ikan tetap hidup
dan sehat.
2. Pembuatan Bahan Penelitian
a. Pembuatan Medium Larutan Hormon Metiltestosteron
Pembuatan medium larutan hormon Metiltestoteron dilakukan
dengan membuat larutan stok metiltestosteron dengan cara melarutkan
0,3 mg ke dalam 100 ml etanol 70%. Untuk
pembuatan medium
dengan kadar 1,6nM diambil 0,16 ml larutan stok dilarutkan dalam 1L
air yang sebelumnya sudah diambil 0,16 ml. Selanjutnya untuk kadar
16 nM dan 32 nM, sama seperti kadar metiltestosteron 1,6 nM, namun
bedanya hanya jumlah stok yang dilarutkan yakni untuk 16 nM diambil
1,6 mL, sedangkan 3,2 ml untuk kadar 32 nM.
b. Pembuatan Larutan Alizarin Red
Pembuatan untuk 75 ml larutan stok alizarin red dilakukan dengan
cara melarutkan 0,06 g bubuk alizarin red ke dalam 6 ml asam asetat
glasial sampai jenuh, dari larutan tersebut diambil 5 ml untuk
dicampurkan dengan gliserin PA sebanyak 10 ml, kemudian
ditambahkan alkohol hidrat aquosa 60 ml, sehingga jadilah larutan stok
bio.unsoed.ac.id
alizarin red 75 ml. Larutan alizarin red yang dapat digunakan adalah
dengan mengambil 75 ml larutan stok dilarutkan ke dalam 75 ml KOH
2%.
10
c. Pembuatan Larutan Penjernih
1) Larutan Penjernih A (komposisi 100 ml)
Gliserin......................................................................... 20 ml
KOH 4%.......................................................................
3 ml
Aquades........................................................................ 77 ml
2) Larutan Penjernih B (komposisi 100 ml)
Gliserin.........................................................................
50 ml
KOH 4%.......................................................................
3 ml
Aquades........................................................................
47 ml
3) Larutan Penjernih C (komposisi 100 ml)
Gliserin......................................................................... 75 ml
Aquades.......................................................................
3.
25 ml
Pengadaan Larva
Larva yang digunakan adalah larva umur 1 hari setelah menetas,
sehingga harus dilakukan pemijahan atau fertilisasi untuk mendapatkan larva.
Induk ikan jantan dan betina yang matang gonad disiapkan, keduanya diinduksi
menggunakan 0,5 ml/kg berat badan GnRH analog. Induk betina yang telah
diinduksi dipasangkan dengan induk jantan, setiap akuarium diisi dengan satu
induk betina dan satu induk jantan. Delapan sampai sepuluh jam setelah
diinduksi kemudian distriping untuk mendapatkan milt dari induk jantan dan
sel telur dari induk betina. Dilakukan pemijahan buatan atau fertilisasi buatan,
dengan cara mencampurkan sel telur dan milt di dalam baskom kemudian
diberi akuades untuk aktivasi spermatozoa, kemudian dicampurkan dengan
bio.unsoed.ac.id
cara digoyangkan baskomnya selama 2 menit. Setelah 2 menit pencampuran,
sel telur dipisahkan dengan saringan, kemudian ditetesi sedikit air dengan
tujuan agar sisa dari plasma spermatozoa terbuang, kemudian dimasukkan ke
dalam akuarium pemeliharaan.
11
4.
Pemeliharaan
Larva ikan Nilem yang pertama kali menetas dipelihara pada medium
metiltestosteron dengan konsentrasi 1,6 nM, 16 nM, 32 nM dan kontrol pada
temperatur yang berbeda-beda terdiri dari temperatur ruang, 27oC, dan 30oC.
Larva dipelihara selama 5 minggu, dengan setiap hari diberi pakan dan 2 hari
sekali ganti medium pemeliharaan. Pakan diberikan setiap hari pada pukul
08.00 dan 16.00 serta medium diganti setiap 2 hari sekali.
5.
Pengamatan
a. Pengukuran Temperatur
Pengukuran temperatur dilakukan setiap hari selama pemeliharaan,
pengukuran ini meliputi pengukuran temperatur udara dan temperatur medium
sebanyak 3 kali yakni pagi, siang dan sore.
b. Pengukuran Panjang dan Luas
Sirip ikan Nilem diukur panjang dan luasnya menggunakan eye piece/
graticle yang telah dikalibrasi. Pengukuran dilakukan setiap hari sejak hari
pertama penetasan hingga hari ketujuh dilanjutkan setiap minggu hingga
minggu kelima. Sirip yang diukur meliputi sirip pectoral (pinnae pectoralis),
abdominal (pinnae abdominalis), dorsal (pinna dorsalis), anal (pinna analis)
dan caudal (pinna caudalis). Sampel yang diukur adalah 11 pada setiap
kombinasi perlakuan, sehingga total sampel yang diukur adalah 11x36= 396
sampel. Hasil pengukuran kemudian ditabulasikan.
c. Pengukuran Panjang Tubuh
Larva dan post larva Ikan Nilem diukur panjang tubuhnya menggunakan
milimeter blok dengan ketelitian 1 mm.
d. Proses Diferensiasi Sirip dengan Metode Alizarin Red
bio.unsoed.ac.id
Proses diferensiasi sirip diamati dengan menggunakan metode Alizarin
Red, dengan tujuan untuk melihat proses kalsifikasi jari-jari siripnya. Langkah
dalam proses pewarnaannya adalah larva ikan difiksasi dalam alkohol 96%
selama 12 jam, kemudian direndam dalam akuades selama 10 menit, lalu
direndam dalam KOH 1% selama 25 menit, larva selanjutnya direndam dalam
larutan pewarna alizarin red selama 2-4 jam, dan dicuci dalam larutan
penjernih A, B, C masing-masing selama 25 menit. Pengamatan dilakukan di
12
bawah mikroskop cahaya. Pada minggu pertama dilakukan setiap hari
pewarnaan dengan alizarin red, pada minggu kedua sampai minggu kelima
dilakukan dengan interval 7 hari. Proses diferensiasi sirip dievaluasi dengan
melihat sirip apa saja yang telah terbentuk dan jari-jari sirip yang telah
terkalsifikasi. Sampel yang diwarnai adalah 11 pada setiap kombinasi
perlakuan, sehingga total sampel yang diwarnai adalah 11x36= 396 sampel.
E.
Analisis Data
Data penelitian terdiri atas 2 data yakni data diferensiasi dan data
pertumbuhan sirip. Data diferensiasi dianalisis secara deskriptif sedangkan data
pertumbuhan sirip dianalisis menggunakan ANOVA dua arah dengan tingkat
signifikansi 0,05. Apabila hasil Anova menunjukkan p