3. HASIL PENELITIAN 3.1. Fermentasi Kakao - ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIBAKTERI PADA BIJI KAKAO (Theobroma cacao L.) YANG DIFERMENTASI SECARA SPONTAN - Unika Repository

3. HASIL PENELITIAN 3.1. Fermentasi Kakao

Bahan baku yang digunakan untuk pembuatan bubuk coklat adalah biji kakao (Theobroma cacao L.) yang berasal dari Kulon Progo, Jogjakarta. Jenis kakao yang digunakan adalah kakao lindak (Forastero). Fermentasi pada biji kakao terjadi dalam dua tahap yaitu fermentasi anaerob fakultatif dan fermentasi aerob. Proses fermentasi biji kakao berlangsung selama 5 hari dan nilai pH harus dijaga agar tetap >5, dan pada hari ke-2 fermentasi dilakukan aerasi dengan cara mengaduk biji kakao tersebut. Kemudian difermentasi lagi hingga hari ke-5. Pada akhir fermentasi, kakao akan mengalami perubahan warna menjadi lebih coklat (gelap), memiliki aroma asam, dan tekstur kulit biji menjadi lebih keras.

FERMENTASI FERMENTASI SPONTAN SPONTAN

(a) (b) (c)

FERMENTASI SPONTAN

(d) (e) Gambar 4. Fermentasi spontan biji kakao; biji kakao sebelum fermentasi (a), proses fermentasi anaerob fakultatif (b), proses aerasi (c), fermentasi dilanjutkan hingga hari ke-5 (d), dan setelah difermentasi 5 hari (e)

3.2. Total Asam Laktat pada Biji Kakao Fermentasi

Pengukuran kandungan total asam laktat yang terdapat pada biji kakao selama proses fermentasi dimulai dari hari ke-0 sampai hari ke-5. Pengujian total asam lakat dilakukan dengan 3 kali ulangan, dan rata-rata kandungan total asam laktat setiap harinya dapat dilihat pada Gambar 5 dan Lampiran 1.

0.016 0.014 )

0.0135 0.0135 0.0135 0.012 % (

0.01 Laktat 0.008 0.009 0.009 sam

0.006 tal A To 0.004

0.0045 0.002

H0 H1 H2 H3 H4 H5

Waktu Fermentasi (Hari)

Gambar 5. Total asam laktat selama fermentasi Berdasarkan hasil pengujian total asam laktat pada biji kakao selama proses fermentasi spontan, dapat dilihat bahwa total asam laktat selama proses fermentasi mengalami peningkatan. Total asam laktat pada hari ke-0 adalah 0,0045% dan terus mengalami peningkatan hingga hari ke-3 menjadi 0,0135% yang kemudian stabil hingga hari ke-5 (akhir fermentasi).

3.3. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

Bakteri yang terdapat pada biji kakao selama proses fermentasi diisolasi dengan cara ditumbuhkan pada media MRS agar yang mengandung CaCO

3 1%. Koloni yang

membentuk zona bening diidentifikasi sebagai bakteri penghasil asam dan kemudian dimurnikan pada media yang sama hingga membentuk koloni tunggal (Gambar 6).

Koloni tunggal Zona bening

Gambar 6. Isolat bakteri penghasil asam yang membentuk koloni tunggal dan membentuk zona bening Berdasarkan hasil pemurnian yang dilakukan, diperoleh 36 isolat bakteri penghasil asam. Setiap koloni bakteri penghasil asam diidentifikasi lebih lanjut hingga tahap genus berdasarkan morfologi (pewarnaan Gram, pewarnaan spora, dan motilitas bakteri), biokimia (aktivitas katalase dan produksi gas), serta kemampuan tumbuh isolat pada berbagai suhu (10 C, 45 C, 50 C), pH (4,4 dan 9,6), dan NaCl (6,5% dan 18%) untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut termasuk ke dalam kelompok bakteri asam laktat.

36 50 + b + - - - - B

26 40 + b + - - - - B

19 33 + b + - - - - B

20 34 + b + - - - - B

21 35 + b + - - - - B

22 36 + b + - - - - B

23 37 + b + - - - - B

24 38 + b + - - - - B

25 39 + b + - - - - B

27 41 + b + - - - - B

17 31 + b + - - - - B

28 42 + b + - - - - B

29 43 + b + - - - - B

30 44 + b + - - - - B

31 45 + b + - - - - B

32 46 + b + - - - - B

33 47 + b + - - - - B

34 48 + b + - - - - B

35 49 + b + - - - - B

18 32 + b + - - - - B

16 26 + b + - - - - B

Tabel 2. Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Morfologi dan Biokimia

5 9 + b + - - - - B

Keterangan : + : isolat tumbuh / positif

Berdasarkan hasil pengujian karakterisasi bakteri asam laktat berdasarkan morfologi dan biokimia, dapat dilihat bahwa dari 36 isolat yang diisolasi merupakan bakteri asam

No Isolat Zona Bening Katalase Produksi Gas Bakteri Asam Laktat Bentuk Gram Spora Motilitas

1 1 + b + - - - - B

2 2 + b + - - - - B

3 5 + b + - - - - B

4 6 + b + - - - - B

6 10 + b + - - - - B

15 25 + b + - - - - B

7 11 + b + - - - - B

8 12 + b + - - - - B

9 17 + b + - - - - B

10 18 + b + - - - - B

11 19 + b + - - - - B

12 20 + b + - - - - B

13 22 + b + - - - - B

14 23 + b + - - - - B

: isolat tidak tumbuh / negatif b : berbentuk bacil / batang B : Bakteri Asam Laktat

laktat karena memiliki katalase negatif, non-motil, memiliki bentuk bacil, Gram positif, dan tidak membentuk spora. Bakteri asam laktat ini memiliki sifat homofermentatif karena tidak memproduksi gas selama fermentasi.

3.4. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Pewarnaan Gram

Pengecatan Gram dilakukan untuk mengetahui sifat Gram bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif artinya sel bakteri memiliki warna ungu.

37 Gambar 7. Isolat bakteri asam laktat (37) termasuk kelompok bakteri Gram postif yang

diamati pada perbesaran 10x100 3.5.

Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Pewarnaan Spora Bakteri asam laktat termasuk dalam kelompok bakteri yang tidak membentuk spora.

Bakteri yang membentuk spora ditandai dengan sel bakteri berwarna hijau.

48 Gambar 8. Isolat bakteri asam laktat (48) termasuk kelompok bakteri yang tidak

membentuk spora yang diamati pada perbesaran 10x100

3.6. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Uji Motilitas

Motilitas merupakan kemampuan untuk bergerak. Motilitas dibagi menjadi 2 yaitu motil dan non-motil. Motil artinya bergerak atau dapat tumbuh menyebar sedangkan non- motil artinya tidak bergerak. Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang termasuk dalam kelompok non-motil (tidak bergerak). Hal ini ditandai dengan tumbuhnya bakteri asam laktat disekitar tusukan inokulasi dan tidak menyebar. Berdasarkan Tabel 2, dapat dilihat bahwa 36 isolat bakteri asam laktat bersifat non-motil (tidak bergerak).

Bakteri tumbuh di

6 9 daerah tusukan

Gambar 9. Isolat bakteri asam laktat memiliki sifat non-motil (tidak bergerak) 3.7.

Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Aktivitas Katalase

Katalase merupakan enzim yang mengkatalisis proses dekomposisi H

2 O 2 menjadi H

2 O

dan O sehingga akan terbentuk gelembung udara pada koloni disekitarnya. Bakteri

asam laktat merupakan bakteri yang tidak menghasilkan enzim katalase (katalase negatif) sehingga aktivitas katalase bakteri asam laktat ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gelembung udara pada isolat yang diberi tetesan larutan hidrogen peroksida (H O ). Berdasarkan Tabel 2, dapat dilihat bahwa 36 isolat bakteri asam

2 laktat memiliki katalase negatif (tidak membentuk gelembung).

Tidak terbentuk gelembung udara

3.8. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Uji Produksi Gas

Produksi gas merupakan kemampuan untuk menghasilkan gas. Bakteri asam laktat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri homofermetatif ditandai dengan tidak terbentuknya gelembung gas pada tabung durham sedangkan bakteri heterofermentatif ditandai dengan terbentuknya gelembung gas pada tabung durham. Berdasarkan Tabel 2, dapat dilihat bahwa 36 isolat bakteri asam laktat bersifat homofermentatif artinya tidak membentuk gelembung gas.

kontrol

Gambar 11. Isolat bakteri asam laktat bersifat homofermentatif 3.9.

Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Fisiologi

Penentuan genus bakteri asam laktat ditentukan berdasarkan sifat fisiologinya yaitu kemampuan bakteri untuk tumbuh pada NaCl (6,5% dan 18%), pH (4,4 dan 9,6), dan suhu (10 , 45 , dan 50 C). Kemampuan pertumbuhan pada berbagai NaCl, pH, dan suhu ditunjukkan dari kemampuan isolat membentuk kekeruhan pada media MRS broth (Tabel 3) dan (Gambar 12) serta peningkatan nilai absorbansi yang diamati pada jam ke-24 dan ke-48 (Lampiran 2).

36 50 + - + + - + + Lactobacillus*

Lactobacillus*

19 33 + - + + + + + Lactobacillus*

20 34 - - + + + + + Lactobacillus*

21 35 - - + + + + + Lactobacillus*

22 36 + - + - + + + Lactobacillus

23 37 + - + + + - + Lactobacillus*

24 38 + - + + - + + Lactobacillus*

25 39 + - + + - - + Lactobacillus*

26 40 + - + + - - +

27 41 + - + + - - - Lactobacillus*

17 31 + - + + - + + Lactobacillus*

28 42 + - + - - + - Lactobacillus

29 43 - - + + - + + Lactobacillus*

30 44 + - + + - + - Lactobacillus*

31 45 + - + + + + +

Lactobacillus*

32 46 + - + + - + - Lactobacillus*

33 47 - - + + - + - Lactobacillus*

34 48 + - + + - + - Lactobacillus*

35 49 + - + - - + + Lactobacillus

18 32 + - + + - + + Lactobacillus*

16 26 + - + - - + + Lactobacillus

Tabel 3. Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Fisiologi

4 6 - - + + - + - Lactobacillus*

Keterangan: + : tumbuh

Berdasarkan hasil pengujian karakterisasi bakteri asam laktat berdasarkan fisiologi, dapat dilihat bahwa dari 36 isolat yang diisolasi hanya ada 7 isolat yang teridentifikasi sebagai bakteri asam laktat genus Lactobacillus karena dapat tumbuh pada media yang

No Isolat NaCl (%) pH Suhu ( C) Genus 6,5 18 4,4 9,6

1 1 - - + + + + + Lactobacillus*

2 2 - - + + - + + Lactobacillus*

3 5 + - + + - + - Lactobacillus*

5 9 + - + + - + - Lactobacillus*

15 25 + - + - - + - Lactobacillus

6 10 + - + + - + + Lactobacillus*

7 11 + - + + - - - Lactobacillus*

8 12 + - + + - + - Lactobacillus*

9 17 + - + + - - + Lactobacillus*

10 18 + - + + - + - Lactobacillus*

11 19 + - + - + + + Lactobacillus

12 20 + - + - - + + Lactobacillus

13 22 + - + + - - + Lactobacillus*

14 23 + - + + - + + Lactobacillus*

: tidak tumbuh NI : tidak teridentifikasi

mengandung 6,5% NaCl tetapi tidak tumbuh pada 18% NaCl, tumbuh pada media dengan pH 4,4 tetapi tidak tumbuh pada pH 9,6 serta dapat tumbuh pada media yang diinkubasi pada suhu antara 10-50 C.

(a-1) (a-2) (b-1) (b-2)

(c-1) (c-2) (c-3) Gambar 12. Isolat bakteri asam laktat dapat tumbuh pada NaCl 6,5% (a-1) dan tidak tumbuh pada NaCl 18% (a-2); tumbuh pada pH 4,4 (b-1) dan tidak tumbuh pada pH 9,6 (b-2); tumbuh pada suhu 10 C (c-1), 45 C (c-2), dan 50 C (c3)

3.10. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Aktivitas Antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri yang dilakukan dan menghasilkan zona hambat ditampilkan pada Gambar 13.

2.5 ) m

2 (c at b

1.5 am

Escherichia coli Escherichia coli h a n

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus o

1 Z

0.5 1 2 5 6 9 10 11 12 17 18 19 20 22 23 25 26 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Isolat

Gambar 13. Zona hambat dari aktivitas antibakteri isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari biji kakao fermentasi

26 Berdasarkan hasil pengujian kemampuan aktivitas antibakteri bakteri asam laktat yang dihasilkan dari proses fermentasi kakao, dapat dilihat bahwa dari 36 isolat bakteri asam laktat, isolat dengan nomor 35 memiliki zona hambat yang paling besar terhadap bakteri

Escherichia coli dan isolat dengan nomor 47 memiliki zona hambat yang paling besar

terhadap bakteri Staphylococcus aureus.

Kemampuan penghambatan isolat bakteri asam laktat diukur dari diameter zona bening yang terbentuk di sekeliling sumuran (Gambar 14) dan (Lampiran 3).

Zona bening

kontrol (a)

(b) Gambar 14. Zona hambat isolat bakteri asam laktat terhadap Escherichia coli (a) dan

Staphylococcus aureus (b)

3. HASIL PENELITIAN 3.1. Fermentasi Kakao - ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIBAKTERI PADA BIJI KAKAO (Theobroma cacao L.) YANG DIFERMENTASI SECARA SPONTAN - Unika Repository