Optimasi Amplifikasi Bagian Gen gyrA Dengan Metode PCR Pada Isolat Salmonella typhi Dari Rumah Sakit Immanuel Bandung.
ABSTRAK
OPTIMASI AMPLIFIKASI BAGIAN GEN gyrA DENGAN METODE PCR
PADA ISOLAT Salmonella typhi DARI RUMAH SAKIT IMMANUEL
BANDUNG
Daniel Chandra, 2007 Pembimbing I : Ernawati Arifin Giri Rachman,Ph.D
Pembimbing II : Johan Lucianus, dr., M.Si
Salmonella typhi, bakteri penyebab demam tifoid, sekarang ini telah dapat
diobati dengan berbagai antibiotik-antibiotik, salah satunya adalah floroquinolone.
Akan tetapi, karena penggunaan antibiotik tersebut yang terus menerus dan tidak
sesuai dengan aturan maka timbul strain-strain yang resisten terhadap antibiotik
ini. Resistensi Salmonella typhi terhadap antibiotik ini terjadi karena adanya
mutasi-mutasi pada DNA Salmonella typhi yaitu DNA topoisomerase. Mutasi
yang terjadi pada DNA topoisomerase terjadi pada DNA topisomeraseII dan DNA
toposiomerase IV. DNA topoisomerase II (disebut juga dengan DNA gyrase)
terdiri dari 2 macam protein (gyrA dan gyrB). Dari penelitian sebelumnya
diketahui bahwa mutasi pada gen gyrA bisa single mutation ataupun double
mutation, yaitu pada posisi kodon 83 atau posisi kodon 87. Strain-strain ini
mungkin saja dapat ditemukan di Indonesia. Tujuan utama dari penelitian ini
adalah untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk mengamplifikasi gen gyrA
dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV agar dapat diketahui
pada posisi mana mutasi terjadi, sehingga dapat digunakan untuk penelitian yang
lebih lanjut. Sampel DNA yang digunakan adalah DNA hasil isolasi kromosom
dengan konsentrasi primer masing-masing 0.6mM. PCR dilakukan dalam 30
siklus, dengan denaturasi 940C selama 60 detik, annealing 400C selama 60 detik,
dan elongasi 720C selama 60 detik. Analisis dengan elektroforesis gel agarosa 1%
menunjukkan adanya pita antara 600 sampai 700 kb.
Kata Kunci : Salmonella typhi, gen gyrA, PCR
ABSTRACT
OPTIMATION OF PART gyrA GENE AMPLIFICATION OF Salmonella
typhi FROM IMMANUEL HOSPITAL BANDUNG BY PCR METHOD
Daniel Chandra, 2007
First Tutor : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D.
Second tutor : Johan Lucianus, dr., M.Si
Salmonella typhi is an etiologic agent of typhoid fever. This disease now can
be cured by antibiotics, one of them is floroquinolone. However, because of the
used of these antibiotics are not follow by the rules, now there are strain of
Salmonella typhi which is resistance to these antibiotics. Salmonella typhi
resistancy to antibiotics is possible because there are mutations in Salmonella
typhi DNA, which is DNA toposiomerase. Mutation in DNA toposiomerase occur
in DNA topoisomerase II and DNA topoisomerase IV. DNA toposiomerase II (
a.k.a DNA gyrase ) divided in two protein (gyrA and gyrB). From the previous
study, mutation in gyA gene can be single mutation or double mutation. This
mutation occur in codon 83 and or codon 87. These strains maybe can be found in
Indonesian. The main objective from this study is to find an optimal PCR
condition for amplification gyA gene with gyrA-FWD primer and gyrA-REV
primer so we can tell in which position the mutation occur, and can be use d for
further study. DNA sample that used in this study are collected from extracted
chromosom DNA, DNA amplification is extracted DNA with concentration is
0.5µL of each of the primer. PCR was performed for 30 cycles, denaturation for
60 second at 940C, annealing for 60 second at 400C, and elongation for 60
second at 720C. Analysis with 1% electrophoresis gel agarose showed at 600 to
700 bp fragment.
Keywords : Salmonella typhi, gyrA gene, PCR
ii
PRAKATA
Puji syukur kepada Than Yang Maha Esa atas berkat, rahmat dan
penyertaanNya sehingga Penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah ini yang
merupakan salah satu prasyarat kelulusan program studi S1 Sarjana Kedokteran (
S. Ked) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha, sesuai dengan waktu
yang ditentukan.
Dalam melakukan penelitian dan penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini, Penulis
banyak memperoleh dukungan dari berbagai pihak. Penulis mengucapkan terima
kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D. sebagai dosen pembimbing yang
telah memberikan kesempatan kepada Penulis untuk ikut ambil bagian
dalam penelitian ini. Ilmu dan pengalaman yang didapat oleh penulis
selama pengerjaan Kaya Tulis Ilmiah ini sanagt berharga dan kiranya akan
sangat bermanfaat unuk kehidupan penulis di masa yang akan datang.
Selain itu untuk segala waktu dan tenaga yang diberikan dalam membantu,
membimbing,
memberikan
nasehat
dan
dukungan
moril
selama
dilakukannya penelitian dan penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini.
2. Johan Lucianus, dr., M.Si., sebagai dosen pembimbing yang telah banyak
memberikan bantuan, bimbingan dan dukungan sehingga akhirnya Karya
Tulis Ilmiah ini dapat terselesaikan dengan baik.
3. Fanny Rahardja, dr., M.Si. dan Hartini, dr. sebagai dosen penguji yang
telah bersedia menyisihkan waktunya dan memberikan kritik dan saran
yang membangun untuk perbaikan Karya Tulis Ilmiah ini.
4. Pendanaan oleh Riset KK Biokimia FMIPA ITB 2007
5. Dra. Endang Srieatimah atas bantuannya dalam pembuatan templat dan
menyediakan bahan-bahan yang diperlukan selama pengerjaan penelitian
ini.
6. Karyawan Laboratorium Mikrobiologi FK UKM : Bpk. Riska, Ibu Yuli,
Bpk. Koma dan juga Bpk. Samuel atas bimbingan dan bantuan yang
diberikan kepada penulis selama mengerjakan penelitian.
iii
7. Bapak Denny selaku analisis laboratorim LP2IKD FK UKM yang telah
memberikan banyak bantuan dalam pelaksaaan penelitian ini.
8. Seluruh staf bagian Mikrobiologi FK UKM atas bimbingan, dukungan,
dan kehangatan yang diberikan selama ini.
9. Seluruh dosen pengajar FK UKM atas ilmu dan bimbingan yang diberikan
kepada Penulis selama mengikuti perkuliahan di FK UKM.
10. Teman seperjuangan, Hadi Sumitro Joe, yang selalu menjadi teman
berbagi dalam suka dan duka.
11. Dan semua yang ikut membantu, yang tidak dapat Penulis sebutkan satu
persatu.
Semoga Tuhan membalas setiap kebaikan yang telah diberikan kepada penulis
Ucapan terima kasih tak terhingga Penlis sampaikan kepada kedua orang tua,
Bapak Thian Soen Kiong dan Ibu Meiliana Chandra, yang telah berusaha sangat
keras, sehingga akhirnya penulis dapat kuliah di Fakultas Kedokteran. Oleh
karena dukungan doa, moril, kasih sayang, pengertian dan dorongan semangat
dari mereka semualah akhirnya Penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah
ini dengan baik.
Akhirnya, Penulis sangat berharap agar Karya Tulis Ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi para mahasiswa / mahasiswi Fakultas Kedokteran, masyarakat,
dan perkembangan ilmu kedokteran.
Bandung, Januari 2008
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN .............................................................................. ii
SURAT PERNYATAAN .................................................................................. iii
ABSTRAK ......................................................................................................... iv
ABSTRACT ......................................................................................................... v
PRAKATA......................................................................................................... vi
DAFTAR ISI.................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR.......................................................................................... x
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xi
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1
1.2 Identifikasi Masalah............................................................................. 3
1.3 Maksud dan Tujuan.............................................................................. 3
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 3
1.5 Metode Penelitian ................................................................................ 3
1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian ............................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Salmonella typhi
2.1.1 Sejarah.......................................................................................... 5
2.1.2 Epidemiologi................................................................................ 5
2.1.3 Gejala Klinik ................................................................................ 7
2.1.4 Karakteristik Mikrobiologi .......................................................... 7
2.1.5 Faktor Virulensi ........................................................................... 8
2.1.6 Patogenesis................................................................................... 9
2.1.7 Pengobatan dan Pencegahan ...................................................... 10
2.1.8 Resistensi Antibiotik.................................................................. 11
2.1.9 DNA Topoisomerase ................................................................. 12
2.1.9.1 DNA Gyrase....................................................................... 13
2.2 Polymerase Chain Reaction ............................................................... 17
2.3 Elektroforesis ..................................................................................... 20
BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE
3.1 Subjek Penelitian................................................................................ 23
3.2 Metode Penelititan ............................................................................. 23
3.3 Alat dan Bahan................................................................................... 23
3.4 Cara Kerja .......................................................................................... 24
v
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Penanaman sampel pada Medium SS ................................................ 26
4.2 Pembuatan templat DNA ................................................................... 27
4.3 PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9 ........................................... 27
4.4 PCR menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ...................... 29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 33
5.2 Saran .................................................................................................. 34
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................... 35
RIWAYAT HIDUP .......................................................................................... 37
vi
DAFTAR GAMBAR
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Salmonella typhi ................................................................................. ..5
2.2 Penyebaran Salmonella typhi di dunia................................................ ..6
2.3 Patogenesis Salmonella typhi ............................................................. 10
2.4 DNA Topoisomerase .......................................................................... 12
2.5 Proses PCR.......................................................................................... 19
2.6 Elektroforesis ...................................................................................... 21
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Salmonella typhi (ST01) pada medium SS ........................................ 26
4.2 Salmonella typhi (ST03) pada medium SS......................................... 27
4.3 Salmonella typhi (ST22) pada medium SS......................................... 27
4.4 Hasil PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9................................... 28
4.5 Hasil PCR (Mg2+ : 1.5mM dan 2mM) dengan menggunakan
primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ..................................................... 30
4.6 Hasil PCR (Mg2+ : 1.5mM) dengan menggunakan
primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ..................................................... 31
vii
DAFTAR TABEL
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Point of Mutation dari
gen gyrA di berbagai negara ............................................................... 16
viii
RIWAYAT HIDUP
Nama
: Daniel Chandra
NRP
: 0410132
Alamat
: Jl. Mandalagiri No 65, Garut, Jawa Barat
Tempat / Tanggal Lahir
: Bandung, 28 Oktober 1986
Riwayat Pendidikan :
1998, Lulus SD Daya Susila, Garut, Jawa Barat
2001, Lulus SLTP Daya Susila, Garut, Jawa Barat
2004, Lulus SLTA Aloysius, Bandung, Jawa Barat
2004, Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha,
Bandung, Jawa Barat.
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Salmonella typhi, merupakan bakteri Gram – (negatif) penyebab penyakit
demam tifoid atau typhus abdominalis atau disebut juga demam enterik.
Salmonella typhi merupakan patogen yang spesifik menyerang manusia. Pada
pasien dengan demam tifoid, bakteri ini berada di dalam aliran darah dan saluran
pencernaannya. Selain itu ada juga pasien yang disebut sebagai karier, yaitu
pasien tesebut telah sembuh dari penyakitnya tetapi di dalam tubuhnya masih
terdapat bakteri. Baik orang yang sakit ataupun yang menjadi karier dapat
menularkan Salmonella typhi ini. Penyakit ini menular melalui makanan dan
minuman yang telah tercemar oleh Salmonella typhi sehingga mudah
menimbulkan wabah.
Demam tifoid merupakan penyakit endemik yang dapat mengakibatkan
kematian, yang biasanya terdapat pada negara-negara berkembang, khususnya di
Asia dan Afrika, dimana sekitar 21.5 juta orang per tahunnya terkena penyakit ini.
Di Amerika Serikat sendiri, walaupun sudah termasuk negara maju, masih terjadi
sekitar 400 kasus demam tifoid per tahunnya, dan sekitar 75% dari kasus tersebut
didapatkan
saat
mereka
sedang
melakukan
perjalanan
internasional.
(www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/typhoidfever_g.htm)
Seiring dengan kemajuan jaman, telah ditemukan beberapa antibiotik generasi
pertama untuk mengobati demam tifoid, seperti chloramphenicol, co-trimoxazole,
dan amoxicilin, sehingga prevalensi demam tifoid dapat berkurang. Akan tetapi,
dengan seringnya digunakan antibiotik tersebut untuk mengobati penyakit demam
tifoid, mengakibatkan terjadinya mutasi pada bakteri penyebab demam tifoid,
yang mengakibatkan Salmonella typhi menjadi resisten terhadap antibiotik
1
Universitas Kristen Maranatha
2
tersebut, yang disebut dengan Multi Drug Resistance Salmonella typhi (MDR-ST).
Untuk mengatasi masalah tersebut maka telah dilakukan beberapa penelitian. Dan
dari penelitian tersebut diketahui bahwa fluoroquinolone sangat efektif untuk
mengatasi MDR-ST, dimana demam yang terjadi dapat turun dalam waktu kurang
dari 4 hari dengan tingkat keberhasilan mencapai 96%, sehingga fluoroqinolone
digunakan sebagai fist line drugs untuk pengobatan demam tifoid. ( Article from
BMC Infectious Diseases ).
Akan tetapi setelah beberapa dekade, dengan alasan yang sama, yaitu dengan
terjadinya mutasi, timbul strain Salmonella typhi yang resisten terhadap
fluoroqinolone. Dan hal ini dibuktikan dengan adanya laporan-laporan yang
menyatakan adanya kegagalan dalam pengobatan demam tifoid dengan
menggunakan
ciprofloxacin
di
India
dan
negara-negara
lain
(http://jmm.sgmjournals.org). Dari semua penelitian tentang hal ini, diketahui
bahwa timbulnya resistensi terhadap fluoroquinolone disebabkan karena adanya
mutasi yang terjadi pada DNA topoisomerase, yaitu DNA topoisomerase II (DNA
gyrase) dan DNA topoisomerase IV, selain itu diketahui juga bahwa posisi mutasi
DNA topoisomerase yang terjadi pada Salmonella typhi dari tiap-tiap negara
berbeda-beda
(http://www.pubmedcentral.nih.gov).
Dengan
kenyataan
ini,
mungkin saja pada Salmonella typhi galur Indonesia dapat ditemukan strain yang
resisten terhadap fluoroquinolone dan posisi mutasi yang terjadi berbeda dengan
negara-negara lain, sehingga perlu dilakukan penelitian pada Salmonella typhi
galur Indonesia untuk mengetahui hal tersebut.
Pada penelitian ini, hanya dilakukan penelitian awal untuk mengetahui tentang
mutasi DNA topoisomerase ini, yaitu mencari kondisi PCR yang paling optimal
untuk mengamplifikasi gen gyrA dengan cara modifikasi dan optimalisasi kondisi
PCR yang sudah ada sebelumnya.
Universitas Kristen Maranatha
3
1.2. Identifikasi Masalah
Bagaimana kondisi PCR yang optimal untuk mengamplifikasi bagian gen gyrA
menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV
1.3.Maksud dan Tujuan
Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adakah hubungan antara
gen gyrA dengan timbulnya resistensi Salmonella typhi terhadap fluoroquinolone.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR yang optimal
untuk bagian gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV.
1.4. Manfaat Penelitian
Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para
peneliti selanjutnya agar dapat mengembangkan ilmu kedokteran khususnya
dalam meningkatkan cara pengobatan terhadap infeksi kuman Salmonella typhi
sehingga lebih spesifik.
1.5. Metode Penelitian
Penelitian laboratory experimental ini merupakan suatu cara untuk
mengidentifikasi gen gyrA dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction).
Universitas Kristen Maranatha
4
1.6. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian & Pengembangan Ilmu
Kedokteran Dasar (LP2-IKD) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha
yang dimulai pada bulan Maret sampai Desember 2007.
Universitas Kristen Maranatha
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk bagian
gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV. Primer gyrAFWD dan gyrA-REV dirancang dengan mengoptimalisasi primer yang sudah ada
sebelumnya. Rancangan primer baru ini dapat digunakan untuk amplifikasi
dengan kondisi sebagai berikut :
•
Formula PCR untuk satu kali reaksi (25µL) menggunakan primer gyrAFWD dan gyrA-REV adalah :
o Deion
o Buffer
1X
o dNTPs
200µM
o gyrA-FWD
0.6mM
o gyrA-REV
0.6mM
o
•
Mg2+
1.5mM
o Taq polymerase
1U
o Templat
0.5µL
Kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen gyrA adalah :
o Jumlah siklus
: 30
o Denaturasi
: 940C
o Annealing
o Elongasi
1 menit
0
1 menit
0
1 menit
: 40 C
: 72 C
33
Universitas Kristen Maranatha
34
5.2 Saran
•
Penelitian hendaknya menggunakan lebih banyak sampel kuman yang
sebelumnya telah dideteksi sifat resistensinya terhadap fluoroquinolone
dengan menggunakan kertas cakram sehingga hasil yang diperoleh dapat
lebih baik
•
Penelitian ini dapat digunakan untuk sequencing DNA Salmonella typhi
galur Indonesia sehingga kemudian dapat dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk mengetahui hubungan antara mutasi gen gyrA dengan timbulnya
resistensi terhadap fluoroquinolone.
Universitas Kristen Maranatha
DAFTAR PUSTAKA
Anonymous. Cell Biology Research: Salmonella typhi
http://www.wfu.edu/~urdaaj4/Cell/index.html, 10 September 2007.
Anonymous. Typhoid Fever.
www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/typhoidfever_g.htm,5Desember 2007
Anonymous. Typhoid Fever Not Always Typhoid, Not Always Fever
http://www.expator.id/medical/typhoid.html, 16 Oktober 2007
Barnard, Faye M., Maxwell, Anthony,Department of Biochemistry, University
of Leicester LE1 7RH, United Kingdom. Interaction between DNA Gyrase
and Quinolones: Effects of Alanine Mutations at GyrA Subunit Residues Ser83
and Asp87
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?&artid=90591, 26
November 2007
Brown, T. A. 1995. Gene Cloning, an introduction, 3rd ed. Chapman & Hall. p.
228-238.
Kariuki, S. et al.2004. Characterization of Multidrug-Resistant Typhoid Outbreak
in Kenya.
Lesser, C.F., Miller, S. I. 2005. Salmonellosis. In : Kasper, D.L., Fauci, A. S.,
Longo, D.L., Braunwald, E., Hauser, S.L., Jameson, J. L. eds. Harrison’s
Principles of Internal Medicine. 16th ed. Volume 1. New York: The
MacGrawHill Companies, Inc. p. 897-898.
Lengeler, J.W., Drews, G., Schelgel, H.G. 1999. Biology of The Prokaryotes.
Carlton: Black Well Science Pty Ltd. P. 343-356, 431-432.
London Research Institute, Clare Hall Laboratories. DNA topoisomerases
http://sci.cancerresearchuk.org/labs/wigley/projects/topoisomerase/topoisome
rase.html. 15 Oktober 2007.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Perker, J. 2003. Brock’s Biology of
Microorganism, 10th ed. New Jersey: Pearson Education, Inc. p. 741-742
35
Universitas Kristen Maranatha
36
Mathews, C.K., et al.1999.Biochemistry 3rd ed.San Fransisco: Adison Wesley
Longman
Parry, Christopher M. Epidemiological and clinical aspects of human typhoid
fever.
http://www.cambridge.org/catalogue/catalouge.asp, 16 Oktober 2007
Pollack, D.V., Salmonella enterica typhi
http://web.uconn.edu/mcbstaff/graf/Student%20presentations/Salmonellatyphi
/Salmonellatyphi.html, 21 Agustus 2007.
Renuka, K., Sood, S., Das, B.K., Kapil, A. High Level Ciprofloxacin Resistance
in Salmonella enterica serotyphe Typhi in India.
http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/6/1595, 8 Oktober 2007.
Salyers, A.A., Whitt, D.D.2002. Bacterial Pathogenesis A Molecular Approach
2nd ed.Washington D.C.: ASM Press p.383-385
Todar, K. 2005. Salmonella and Salmonellosis. Todar’s Online Textbook of
Bacteriology. University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology.
http://textbookofbacteriology.net/salmonella.html, 15 September 2007.
Turner, Arthur K., Nair, Satheesh., Wain, John. The Acquisition of Full
Fluroquinolone Resistance In Salmonella typhi by Accumulationof Point
Mutation In The Toposiomerase Target.
http://jac.oxfordjournals.org/cgi/content/full/58/4/733, 15November 2007
Weill, F., et.al. Multidrug Resistance in Salmonella enterica Serotype
Typhimurium from Humans in France (1993 to 2003)
http://jcm.asm.org/cgi/content/full/44/3/70, 10 September 2007.
Universitas Kristen Maranatha
OPTIMASI AMPLIFIKASI BAGIAN GEN gyrA DENGAN METODE PCR
PADA ISOLAT Salmonella typhi DARI RUMAH SAKIT IMMANUEL
BANDUNG
Daniel Chandra, 2007 Pembimbing I : Ernawati Arifin Giri Rachman,Ph.D
Pembimbing II : Johan Lucianus, dr., M.Si
Salmonella typhi, bakteri penyebab demam tifoid, sekarang ini telah dapat
diobati dengan berbagai antibiotik-antibiotik, salah satunya adalah floroquinolone.
Akan tetapi, karena penggunaan antibiotik tersebut yang terus menerus dan tidak
sesuai dengan aturan maka timbul strain-strain yang resisten terhadap antibiotik
ini. Resistensi Salmonella typhi terhadap antibiotik ini terjadi karena adanya
mutasi-mutasi pada DNA Salmonella typhi yaitu DNA topoisomerase. Mutasi
yang terjadi pada DNA topoisomerase terjadi pada DNA topisomeraseII dan DNA
toposiomerase IV. DNA topoisomerase II (disebut juga dengan DNA gyrase)
terdiri dari 2 macam protein (gyrA dan gyrB). Dari penelitian sebelumnya
diketahui bahwa mutasi pada gen gyrA bisa single mutation ataupun double
mutation, yaitu pada posisi kodon 83 atau posisi kodon 87. Strain-strain ini
mungkin saja dapat ditemukan di Indonesia. Tujuan utama dari penelitian ini
adalah untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk mengamplifikasi gen gyrA
dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV agar dapat diketahui
pada posisi mana mutasi terjadi, sehingga dapat digunakan untuk penelitian yang
lebih lanjut. Sampel DNA yang digunakan adalah DNA hasil isolasi kromosom
dengan konsentrasi primer masing-masing 0.6mM. PCR dilakukan dalam 30
siklus, dengan denaturasi 940C selama 60 detik, annealing 400C selama 60 detik,
dan elongasi 720C selama 60 detik. Analisis dengan elektroforesis gel agarosa 1%
menunjukkan adanya pita antara 600 sampai 700 kb.
Kata Kunci : Salmonella typhi, gen gyrA, PCR
ABSTRACT
OPTIMATION OF PART gyrA GENE AMPLIFICATION OF Salmonella
typhi FROM IMMANUEL HOSPITAL BANDUNG BY PCR METHOD
Daniel Chandra, 2007
First Tutor : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D.
Second tutor : Johan Lucianus, dr., M.Si
Salmonella typhi is an etiologic agent of typhoid fever. This disease now can
be cured by antibiotics, one of them is floroquinolone. However, because of the
used of these antibiotics are not follow by the rules, now there are strain of
Salmonella typhi which is resistance to these antibiotics. Salmonella typhi
resistancy to antibiotics is possible because there are mutations in Salmonella
typhi DNA, which is DNA toposiomerase. Mutation in DNA toposiomerase occur
in DNA topoisomerase II and DNA topoisomerase IV. DNA toposiomerase II (
a.k.a DNA gyrase ) divided in two protein (gyrA and gyrB). From the previous
study, mutation in gyA gene can be single mutation or double mutation. This
mutation occur in codon 83 and or codon 87. These strains maybe can be found in
Indonesian. The main objective from this study is to find an optimal PCR
condition for amplification gyA gene with gyrA-FWD primer and gyrA-REV
primer so we can tell in which position the mutation occur, and can be use d for
further study. DNA sample that used in this study are collected from extracted
chromosom DNA, DNA amplification is extracted DNA with concentration is
0.5µL of each of the primer. PCR was performed for 30 cycles, denaturation for
60 second at 940C, annealing for 60 second at 400C, and elongation for 60
second at 720C. Analysis with 1% electrophoresis gel agarose showed at 600 to
700 bp fragment.
Keywords : Salmonella typhi, gyrA gene, PCR
ii
PRAKATA
Puji syukur kepada Than Yang Maha Esa atas berkat, rahmat dan
penyertaanNya sehingga Penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah ini yang
merupakan salah satu prasyarat kelulusan program studi S1 Sarjana Kedokteran (
S. Ked) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha, sesuai dengan waktu
yang ditentukan.
Dalam melakukan penelitian dan penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini, Penulis
banyak memperoleh dukungan dari berbagai pihak. Penulis mengucapkan terima
kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D. sebagai dosen pembimbing yang
telah memberikan kesempatan kepada Penulis untuk ikut ambil bagian
dalam penelitian ini. Ilmu dan pengalaman yang didapat oleh penulis
selama pengerjaan Kaya Tulis Ilmiah ini sanagt berharga dan kiranya akan
sangat bermanfaat unuk kehidupan penulis di masa yang akan datang.
Selain itu untuk segala waktu dan tenaga yang diberikan dalam membantu,
membimbing,
memberikan
nasehat
dan
dukungan
moril
selama
dilakukannya penelitian dan penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini.
2. Johan Lucianus, dr., M.Si., sebagai dosen pembimbing yang telah banyak
memberikan bantuan, bimbingan dan dukungan sehingga akhirnya Karya
Tulis Ilmiah ini dapat terselesaikan dengan baik.
3. Fanny Rahardja, dr., M.Si. dan Hartini, dr. sebagai dosen penguji yang
telah bersedia menyisihkan waktunya dan memberikan kritik dan saran
yang membangun untuk perbaikan Karya Tulis Ilmiah ini.
4. Pendanaan oleh Riset KK Biokimia FMIPA ITB 2007
5. Dra. Endang Srieatimah atas bantuannya dalam pembuatan templat dan
menyediakan bahan-bahan yang diperlukan selama pengerjaan penelitian
ini.
6. Karyawan Laboratorium Mikrobiologi FK UKM : Bpk. Riska, Ibu Yuli,
Bpk. Koma dan juga Bpk. Samuel atas bimbingan dan bantuan yang
diberikan kepada penulis selama mengerjakan penelitian.
iii
7. Bapak Denny selaku analisis laboratorim LP2IKD FK UKM yang telah
memberikan banyak bantuan dalam pelaksaaan penelitian ini.
8. Seluruh staf bagian Mikrobiologi FK UKM atas bimbingan, dukungan,
dan kehangatan yang diberikan selama ini.
9. Seluruh dosen pengajar FK UKM atas ilmu dan bimbingan yang diberikan
kepada Penulis selama mengikuti perkuliahan di FK UKM.
10. Teman seperjuangan, Hadi Sumitro Joe, yang selalu menjadi teman
berbagi dalam suka dan duka.
11. Dan semua yang ikut membantu, yang tidak dapat Penulis sebutkan satu
persatu.
Semoga Tuhan membalas setiap kebaikan yang telah diberikan kepada penulis
Ucapan terima kasih tak terhingga Penlis sampaikan kepada kedua orang tua,
Bapak Thian Soen Kiong dan Ibu Meiliana Chandra, yang telah berusaha sangat
keras, sehingga akhirnya penulis dapat kuliah di Fakultas Kedokteran. Oleh
karena dukungan doa, moril, kasih sayang, pengertian dan dorongan semangat
dari mereka semualah akhirnya Penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah
ini dengan baik.
Akhirnya, Penulis sangat berharap agar Karya Tulis Ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi para mahasiswa / mahasiswi Fakultas Kedokteran, masyarakat,
dan perkembangan ilmu kedokteran.
Bandung, Januari 2008
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN .............................................................................. ii
SURAT PERNYATAAN .................................................................................. iii
ABSTRAK ......................................................................................................... iv
ABSTRACT ......................................................................................................... v
PRAKATA......................................................................................................... vi
DAFTAR ISI.................................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR.......................................................................................... x
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xi
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1
1.2 Identifikasi Masalah............................................................................. 3
1.3 Maksud dan Tujuan.............................................................................. 3
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 3
1.5 Metode Penelitian ................................................................................ 3
1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian ............................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Salmonella typhi
2.1.1 Sejarah.......................................................................................... 5
2.1.2 Epidemiologi................................................................................ 5
2.1.3 Gejala Klinik ................................................................................ 7
2.1.4 Karakteristik Mikrobiologi .......................................................... 7
2.1.5 Faktor Virulensi ........................................................................... 8
2.1.6 Patogenesis................................................................................... 9
2.1.7 Pengobatan dan Pencegahan ...................................................... 10
2.1.8 Resistensi Antibiotik.................................................................. 11
2.1.9 DNA Topoisomerase ................................................................. 12
2.1.9.1 DNA Gyrase....................................................................... 13
2.2 Polymerase Chain Reaction ............................................................... 17
2.3 Elektroforesis ..................................................................................... 20
BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE
3.1 Subjek Penelitian................................................................................ 23
3.2 Metode Penelititan ............................................................................. 23
3.3 Alat dan Bahan................................................................................... 23
3.4 Cara Kerja .......................................................................................... 24
v
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Penanaman sampel pada Medium SS ................................................ 26
4.2 Pembuatan templat DNA ................................................................... 27
4.3 PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9 ........................................... 27
4.4 PCR menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ...................... 29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 33
5.2 Saran .................................................................................................. 34
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................... 35
RIWAYAT HIDUP .......................................................................................... 37
vi
DAFTAR GAMBAR
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Salmonella typhi ................................................................................. ..5
2.2 Penyebaran Salmonella typhi di dunia................................................ ..6
2.3 Patogenesis Salmonella typhi ............................................................. 10
2.4 DNA Topoisomerase .......................................................................... 12
2.5 Proses PCR.......................................................................................... 19
2.6 Elektroforesis ...................................................................................... 21
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Salmonella typhi (ST01) pada medium SS ........................................ 26
4.2 Salmonella typhi (ST03) pada medium SS......................................... 27
4.3 Salmonella typhi (ST22) pada medium SS......................................... 27
4.4 Hasil PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9................................... 28
4.5 Hasil PCR (Mg2+ : 1.5mM dan 2mM) dengan menggunakan
primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ..................................................... 30
4.6 Hasil PCR (Mg2+ : 1.5mM) dengan menggunakan
primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ..................................................... 31
vii
DAFTAR TABEL
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Point of Mutation dari
gen gyrA di berbagai negara ............................................................... 16
viii
RIWAYAT HIDUP
Nama
: Daniel Chandra
NRP
: 0410132
Alamat
: Jl. Mandalagiri No 65, Garut, Jawa Barat
Tempat / Tanggal Lahir
: Bandung, 28 Oktober 1986
Riwayat Pendidikan :
1998, Lulus SD Daya Susila, Garut, Jawa Barat
2001, Lulus SLTP Daya Susila, Garut, Jawa Barat
2004, Lulus SLTA Aloysius, Bandung, Jawa Barat
2004, Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha,
Bandung, Jawa Barat.
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Salmonella typhi, merupakan bakteri Gram – (negatif) penyebab penyakit
demam tifoid atau typhus abdominalis atau disebut juga demam enterik.
Salmonella typhi merupakan patogen yang spesifik menyerang manusia. Pada
pasien dengan demam tifoid, bakteri ini berada di dalam aliran darah dan saluran
pencernaannya. Selain itu ada juga pasien yang disebut sebagai karier, yaitu
pasien tesebut telah sembuh dari penyakitnya tetapi di dalam tubuhnya masih
terdapat bakteri. Baik orang yang sakit ataupun yang menjadi karier dapat
menularkan Salmonella typhi ini. Penyakit ini menular melalui makanan dan
minuman yang telah tercemar oleh Salmonella typhi sehingga mudah
menimbulkan wabah.
Demam tifoid merupakan penyakit endemik yang dapat mengakibatkan
kematian, yang biasanya terdapat pada negara-negara berkembang, khususnya di
Asia dan Afrika, dimana sekitar 21.5 juta orang per tahunnya terkena penyakit ini.
Di Amerika Serikat sendiri, walaupun sudah termasuk negara maju, masih terjadi
sekitar 400 kasus demam tifoid per tahunnya, dan sekitar 75% dari kasus tersebut
didapatkan
saat
mereka
sedang
melakukan
perjalanan
internasional.
(www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/typhoidfever_g.htm)
Seiring dengan kemajuan jaman, telah ditemukan beberapa antibiotik generasi
pertama untuk mengobati demam tifoid, seperti chloramphenicol, co-trimoxazole,
dan amoxicilin, sehingga prevalensi demam tifoid dapat berkurang. Akan tetapi,
dengan seringnya digunakan antibiotik tersebut untuk mengobati penyakit demam
tifoid, mengakibatkan terjadinya mutasi pada bakteri penyebab demam tifoid,
yang mengakibatkan Salmonella typhi menjadi resisten terhadap antibiotik
1
Universitas Kristen Maranatha
2
tersebut, yang disebut dengan Multi Drug Resistance Salmonella typhi (MDR-ST).
Untuk mengatasi masalah tersebut maka telah dilakukan beberapa penelitian. Dan
dari penelitian tersebut diketahui bahwa fluoroquinolone sangat efektif untuk
mengatasi MDR-ST, dimana demam yang terjadi dapat turun dalam waktu kurang
dari 4 hari dengan tingkat keberhasilan mencapai 96%, sehingga fluoroqinolone
digunakan sebagai fist line drugs untuk pengobatan demam tifoid. ( Article from
BMC Infectious Diseases ).
Akan tetapi setelah beberapa dekade, dengan alasan yang sama, yaitu dengan
terjadinya mutasi, timbul strain Salmonella typhi yang resisten terhadap
fluoroqinolone. Dan hal ini dibuktikan dengan adanya laporan-laporan yang
menyatakan adanya kegagalan dalam pengobatan demam tifoid dengan
menggunakan
ciprofloxacin
di
India
dan
negara-negara
lain
(http://jmm.sgmjournals.org). Dari semua penelitian tentang hal ini, diketahui
bahwa timbulnya resistensi terhadap fluoroquinolone disebabkan karena adanya
mutasi yang terjadi pada DNA topoisomerase, yaitu DNA topoisomerase II (DNA
gyrase) dan DNA topoisomerase IV, selain itu diketahui juga bahwa posisi mutasi
DNA topoisomerase yang terjadi pada Salmonella typhi dari tiap-tiap negara
berbeda-beda
(http://www.pubmedcentral.nih.gov).
Dengan
kenyataan
ini,
mungkin saja pada Salmonella typhi galur Indonesia dapat ditemukan strain yang
resisten terhadap fluoroquinolone dan posisi mutasi yang terjadi berbeda dengan
negara-negara lain, sehingga perlu dilakukan penelitian pada Salmonella typhi
galur Indonesia untuk mengetahui hal tersebut.
Pada penelitian ini, hanya dilakukan penelitian awal untuk mengetahui tentang
mutasi DNA topoisomerase ini, yaitu mencari kondisi PCR yang paling optimal
untuk mengamplifikasi gen gyrA dengan cara modifikasi dan optimalisasi kondisi
PCR yang sudah ada sebelumnya.
Universitas Kristen Maranatha
3
1.2. Identifikasi Masalah
Bagaimana kondisi PCR yang optimal untuk mengamplifikasi bagian gen gyrA
menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV
1.3.Maksud dan Tujuan
Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adakah hubungan antara
gen gyrA dengan timbulnya resistensi Salmonella typhi terhadap fluoroquinolone.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR yang optimal
untuk bagian gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV.
1.4. Manfaat Penelitian
Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para
peneliti selanjutnya agar dapat mengembangkan ilmu kedokteran khususnya
dalam meningkatkan cara pengobatan terhadap infeksi kuman Salmonella typhi
sehingga lebih spesifik.
1.5. Metode Penelitian
Penelitian laboratory experimental ini merupakan suatu cara untuk
mengidentifikasi gen gyrA dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction).
Universitas Kristen Maranatha
4
1.6. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian & Pengembangan Ilmu
Kedokteran Dasar (LP2-IKD) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha
yang dimulai pada bulan Maret sampai Desember 2007.
Universitas Kristen Maranatha
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk bagian
gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV. Primer gyrAFWD dan gyrA-REV dirancang dengan mengoptimalisasi primer yang sudah ada
sebelumnya. Rancangan primer baru ini dapat digunakan untuk amplifikasi
dengan kondisi sebagai berikut :
•
Formula PCR untuk satu kali reaksi (25µL) menggunakan primer gyrAFWD dan gyrA-REV adalah :
o Deion
o Buffer
1X
o dNTPs
200µM
o gyrA-FWD
0.6mM
o gyrA-REV
0.6mM
o
•
Mg2+
1.5mM
o Taq polymerase
1U
o Templat
0.5µL
Kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen gyrA adalah :
o Jumlah siklus
: 30
o Denaturasi
: 940C
o Annealing
o Elongasi
1 menit
0
1 menit
0
1 menit
: 40 C
: 72 C
33
Universitas Kristen Maranatha
34
5.2 Saran
•
Penelitian hendaknya menggunakan lebih banyak sampel kuman yang
sebelumnya telah dideteksi sifat resistensinya terhadap fluoroquinolone
dengan menggunakan kertas cakram sehingga hasil yang diperoleh dapat
lebih baik
•
Penelitian ini dapat digunakan untuk sequencing DNA Salmonella typhi
galur Indonesia sehingga kemudian dapat dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk mengetahui hubungan antara mutasi gen gyrA dengan timbulnya
resistensi terhadap fluoroquinolone.
Universitas Kristen Maranatha
DAFTAR PUSTAKA
Anonymous. Cell Biology Research: Salmonella typhi
http://www.wfu.edu/~urdaaj4/Cell/index.html, 10 September 2007.
Anonymous. Typhoid Fever.
www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/typhoidfever_g.htm,5Desember 2007
Anonymous. Typhoid Fever Not Always Typhoid, Not Always Fever
http://www.expator.id/medical/typhoid.html, 16 Oktober 2007
Barnard, Faye M., Maxwell, Anthony,Department of Biochemistry, University
of Leicester LE1 7RH, United Kingdom. Interaction between DNA Gyrase
and Quinolones: Effects of Alanine Mutations at GyrA Subunit Residues Ser83
and Asp87
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?&artid=90591, 26
November 2007
Brown, T. A. 1995. Gene Cloning, an introduction, 3rd ed. Chapman & Hall. p.
228-238.
Kariuki, S. et al.2004. Characterization of Multidrug-Resistant Typhoid Outbreak
in Kenya.
Lesser, C.F., Miller, S. I. 2005. Salmonellosis. In : Kasper, D.L., Fauci, A. S.,
Longo, D.L., Braunwald, E., Hauser, S.L., Jameson, J. L. eds. Harrison’s
Principles of Internal Medicine. 16th ed. Volume 1. New York: The
MacGrawHill Companies, Inc. p. 897-898.
Lengeler, J.W., Drews, G., Schelgel, H.G. 1999. Biology of The Prokaryotes.
Carlton: Black Well Science Pty Ltd. P. 343-356, 431-432.
London Research Institute, Clare Hall Laboratories. DNA topoisomerases
http://sci.cancerresearchuk.org/labs/wigley/projects/topoisomerase/topoisome
rase.html. 15 Oktober 2007.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Perker, J. 2003. Brock’s Biology of
Microorganism, 10th ed. New Jersey: Pearson Education, Inc. p. 741-742
35
Universitas Kristen Maranatha
36
Mathews, C.K., et al.1999.Biochemistry 3rd ed.San Fransisco: Adison Wesley
Longman
Parry, Christopher M. Epidemiological and clinical aspects of human typhoid
fever.
http://www.cambridge.org/catalogue/catalouge.asp, 16 Oktober 2007
Pollack, D.V., Salmonella enterica typhi
http://web.uconn.edu/mcbstaff/graf/Student%20presentations/Salmonellatyphi
/Salmonellatyphi.html, 21 Agustus 2007.
Renuka, K., Sood, S., Das, B.K., Kapil, A. High Level Ciprofloxacin Resistance
in Salmonella enterica serotyphe Typhi in India.
http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/6/1595, 8 Oktober 2007.
Salyers, A.A., Whitt, D.D.2002. Bacterial Pathogenesis A Molecular Approach
2nd ed.Washington D.C.: ASM Press p.383-385
Todar, K. 2005. Salmonella and Salmonellosis. Todar’s Online Textbook of
Bacteriology. University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology.
http://textbookofbacteriology.net/salmonella.html, 15 September 2007.
Turner, Arthur K., Nair, Satheesh., Wain, John. The Acquisition of Full
Fluroquinolone Resistance In Salmonella typhi by Accumulationof Point
Mutation In The Toposiomerase Target.
http://jac.oxfordjournals.org/cgi/content/full/58/4/733, 15November 2007
Weill, F., et.al. Multidrug Resistance in Salmonella enterica Serotype
Typhimurium from Humans in France (1993 to 2003)
http://jcm.asm.org/cgi/content/full/44/3/70, 10 September 2007.
Universitas Kristen Maranatha