Optimasi Amplifikasi Bagian Gen parC Dengan Metode PCR Pada Isolat Salmonella Typhi Dari Rumah Sakit Immanuel Bandung Periode 2006.

iv ABSTRAK

OPTIMASI AMPLIFIKASI BAGIAN GEN _parC DENGAN METODE PCR PADA ISOLAT Salmonella typhi DARI RUMAH SAKIT IMMANUEL

BANDUNG PERIODE 2006

Hadi Sumitro Jioe, 2008. Pembimbing I : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph. D Pembimbing II : Sylvia Soeng, dr., M. Kes

Strain dari Salmonella typhi yang resisten terhadap antibiotik telah menjadi masalah kesehatan di dunia. Dari penelitian terdahulu, telah di temukan bahwa pada negara lain, beberapa strain dari Salmonella typhi, yang resisten terhadap antibiotik seperti kuinolon, memiliki mutasi pada bagian dari gen parC, yaitu gen yang penting dalam proses replikasi DNA. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi bagian dari gen parC dari Salmonella typhi yang diduga telah mengalami resistensi terhadap kuinolon. Kondisi PCR ini diperlakukan pada beberapa sampel Salmonella typhi yang didapat dari Rumah Sakit Immanuel Bandung. Kromosom DNA di ekstrak dari sampel-sampel tersebut dan digunakan sebagai templat. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan ekstrak DNA tersebut dan menggunakan 0.6 µM dari masing-masing primer. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus selama 60 detik pada suhu 94ºC, 60 detik pada suhu 40ºC, dan 60 detik pada suhu 72ºC. Analisis dengan menggunakan gel agarosa elektroforesis 1% menunjukkan pita yang diharapkan, yaitu antara 400 – 500 pb.

v ABSTRACT

OPTIMATION PART OF parC GENE AMPLIFICATION BY PCR METHOD IN ISOLATE OFSalmonella typhiFROM IMMANUEL HOSPITAL BANDUNG IN

PERIOD OF 2006

Hadi Sumitro Jioe, 2008. First tutor : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph. D Second Tutor : Sylvia Soeng, dr., M. Kes

Strains of Salmonella typhi that are resistant to antimicrobial agents have become a worldwide health problem. From previous investigation, it was found that in other countries, some strains of Salmonella typhi, that are resistant to some antibiotics such as quinolons, have mutations in the part of parC gene, the gene that important in DNA replication process. The purpose of this research is to determine the PCR condition that can be used to amplify part of parC of Salmonella typhi that is suspected to be responsible for quinolon resistance. This PCR condition was applied into few Salmonella typhi samples obtained from Immanuel Hospital Bandung. Chromosomal DNA were extracted from those samples and used as a template. DNA amplification was performed with extracted DNA using 0.6 µM of each of the primer. PCR was performed for 30 cycles of 60 seconds at 94oC, 60 second at 40oC and 60 second at 72oC. Analysis with 1% electrophoresis gel agarose showed the expected band, between 400 and 500 bp.

ix DAFTAR ISI

Halaman

LEMBAR PERSETUJUAN ii

SURAT PERNYATAAN iii

ABSTRAK iv

ABSTRACT v

KATA PENGANTAR vi

DAFTAR ISI ix

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR TABEL xii

BAB I PENDAHULUAN 1

1.1Latar Belakang 1

1.2Identifikasi Masalah 3

1.3Maksud dan Tujuan 3

1.4Manfaat Penelitian 4

1.5Metode Penelitian 4

1.6Waktu dan Lokasi Penelitian 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 5

2.1 Salmonella typhi 5

2.1.1 Sejarah 5

2.1.2 Epidemiologi 5

2.1.3 Karakteristik 6

2.1.4 Gejala Infeksi 8

2.1.5 Faktor Virulensi dan Toksin 9

x

2.1.7 Pengobatan 13

2.1.8 Resistensi Antibiotik 14

2.2 Gen parC 16

2.3 Amplifikasi dengan Teknik PCR 21

BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE 26

3.1 Subjek Penelitian 26

3.2 Metode Penelitian 26

3.3 Alat dan Bahan 26

3.3.1 Alat 26

3.3.2 Bahan 27

3.4 Cara Kerja 27

3.4.1 Tahap 1 : Pembuatan Templat 27

3.4.2 Tahap 2 : PCR 28

3.4.2.1 PCR menggunakan Primer Ca8 dan Ca9 28 3.4.2.2 PCR menggunakan Primer parC1 dan parC2 28

3.4.3 Elektroforesis 29

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 30

4.1 Penanaman Sampel pada Medium Salmonella Shigella 30

4.2 PCR menggunakan Primer Ca8 dan Ca9 31

4.3 PCR menggunakan Primer parC1 dan parC2 32

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 35

5.1 Kesimpulan 35

5.2 Saran 36

DAFTAR PUSTAKA 37

xi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Salmonella typhi 7

Gambar 2.2 Salmonella typhi dengan pewarnaan gram 7

Gambar 2.3 Proses masuknya Salmonella typhi kedalam tubuh manusia 8 Gambar 2.4 Faktor-faktor virulensi yang penting dalam Patogenesis Salmonella 9 Gambar 2.5 Salmonella typhi menginfeksi tubuh melalui plaque Peyeri yang ada di

usus halus 12

Gambar 2.6 Multi-drug Resistant oleh Salmonella typhi 15

Gambar 2.7 DNA Supercoiled and DNA Open Circular 17

Gambar 2.8 Tahap-tahap utama pada proses PCR 23

Gambar 2.9 Penggandaan gen secara eksponensial pada proses PCR 24 Gambar 4.1 Sampel setelah di tanam pada medium Salmonella Shigella 30 Gambar 4.2 hasil PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9 31 Gambar 4.31 Hasil PCR menggunakan primer parC1 dan parC2 33 Gambar 4.32 Hasil PCR menggunakan primer parC1 dan parC2 dgn variasi Mg2+ 34

xii

DAFTAR TABEL

Halaman

39

RIWAYAT HIDUP PENULIS

Nama : Hadi Sumitro Jioe

Tempat dan Tanggal Lahir : Tasikmalaya, 06 Agustus 1986 Alamat : Jl. Rumah Sakit No. 21 Tasikmalaya Riwayat Pendidikan :

- 1992 Lulus TKK BPK Penabur Tasikmalaya - 1998 Lulus SDK BPK Penabur Tasikmalaya - 2001 Lulus SLTPK BPK Penabur Tasikmalaya - 2004 Lulus SMU Negeri 1 Tasikmalaya

- 2004 Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha Bandung

1 Universitas Kristen Maranatha BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Demam tifoid atau demam enterik adalah penyakit akut atau sub-akut yang disebabkan oleh bakteri Salmonella, secara lebih spesifik lebih banyak disebabkan oleh Salmonella typhi. Gejala awal penyakit ini dapat berupa malaise, demam, nyeri pada perut, dan konstipasi. Apabila tidak diobati, maka dapat menyebabkan diare, rash, pembesaran limpa dan komplikasi lainnya. (Darmowandowo, 2006)

Demam enterik adalah penyakit endemik di sebagian besar negara-negara berkembang di dunia, khususnya di daerah Amerika Selatan dan Tengah, juga Asia, terutama Asia Selatan dan Asia Tenggara. Dilaporkan ada sekitar 16 – 33 juta kasus, dengan angka kematian 500.000 – 600.000 per tahunnya. Angka kejadian rata – rata penyakit ini 225 – 810 per 100.000 penduduk di Chili, Nepal, Indonesia dan Afrika Selatan (Giraud, et al., 2005)

Sejak tahun 1948 kloramfenikol merupakan drug of choice untuk infeksi Salmonella. Keampuhan kloramfenikol pada pengobatan demam tifoid telah diakui berdasarkan efektifitasnya terhadap Salmonella typhi disamping harga obat yang relatif murah. Setelah kloramfenikol bertahan sekitar 25 tahun, dilaporkan oleh beberapa peneliti di berbagai negara adanya strain Salmonella typhi yang resisten terhadap kloramfenikol. Peneliti di India melaporkan adanya kasus demam tifoid yang resisten terhadap kloramfenikol pada tahun 1970, sedangkan di Mexico pertama kali dilaporkan pada tahun 1972. Resistensi tersebut ternyata diikuti oleh adanya resistensi Salmonella typhi terhadap obat-obat lain yang biasa dipergunakan untuk mengobati demam tifoid. (Hadinegoro, 1999)

2

Universitas Kristen Maranatha Pada tahun 1960, kuinolon yang pertama diperkenalkan, yaitu asam nalidiksat akan tetapi memiliki keterbatasan oleh karena aktivitas intrinsik yang rendah dan cepatnya terjadi resistensi. Penambahan fluor pada molekul kuinolon menghasilkan fluorokuinolon (pertama kali diperkenalkan sebagai siprofloksasin pada 1987) yang memiliki spektrum lebih luas terhadap bakteri gram negatif, namun aktivitas terhadap gram positif lemah (Sastroasmoro, 2005)

Dewasa ini fluorokuinolon biasa digunakan sebagai obat golongan utama dalam mengobati infeksi Salmonella typhi. Akan tetapi, beberapa kuman Salmonella typhi yang resisten terhadap obat ini pun telah diketemukan. Lebih lagi, telah dilaporkan kegagalan pengobatan dengan fluorokuinolon terhadap pasien dengan infeksi Salmonella typhi. Kasus-kasus tersebut banyak dilaporkan dan terjadi di negara-negara berkembang. Pada kebanyakan strain Salmonella typhi, resistensi terhadap fluorokuinolon tersebut diakibatkan oleh adanya mutasi dari gen yang mengkode

DNA gyrase (gyrA dan gyrB) dan DNA topoisomerase IV (parC dan parE) (Hirose,

et al., 2002). Dahulu para peneliti mengira bahwa hanya gen gyrA yang menyebabkan resistensi terhadap fluorokuinolon, akan tetapi penelitian terbaru menemukan bahwa gen parC pun terlibat dalam mekanisme resistensi tersebut (Gaind, et al., 2006)

Menjadi hal yang menarik bagi kita untuk meneliti lebih lanjut tentang hubungan antara mutasi pada gen parC dengan resistensi terhadap fluorokuinolon pada Salmonella typhi di Indonesia.

Untuk mengawali penelitian ini, dilakukan perbanyakan (amplifikasi) bagian gen parC dari Salmonella typhi di Indonesia, yang sampelnya diperoleh dari Rumah Sakit Immanuel Bandung. Bagian gen yang diamplifikasi adalah bagian gen parC, yang dari penelitian di negara Inggris dan Jepang telah diketahui merupakan bagian yang termutasi (Hirose, et al., 2002, Turner, et al., 2006). Pada penelitian ini, amplifikasi bagian gen parC dilakukan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).

Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan pada penelitian selanjutnya, untuk memperoleh informasi lebih lanjut tentang mutasi pada gen parC dengan resistensi Salmonella typhi di Indonesia terhadap fluorokuinolon.

3

Universitas Kristen Maranatha Informasi tersebut diharapkan dapat digunakan untuk pembuatan kit yang dapat mendeteksi adanya resistensi terhadap Salmonella typhi dalam waktu cepat menggunakan teknik PCR, sehingga dapat dilakukan metode pengobatan yang lebih tepat.

Penelitian ini mengerjakan tahap awal, yaitu mencari kondisi PCR yang paling optimal untuk mengamplifikasi gen parC, dengan cara optimalisasi kondisi PCR yang sudah ada sebelumnya.

1.2. Identifikasi Masalah

Bagaiman kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen parC menggunakan primer parC1 dan parC2?

1.3. Maksud dan Tujuan

Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan antara gen parC dengan resistensi terhadap fluorokuinolon pada Salmonella typhi di Indonesia.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR gen parC menggunakan primer parC1 dan parC2 pada Salmonella typhi di Indonesia, khususnya di Rumah Sakit Immanuel Bandung.

4

Universitas Kristen Maranatha 1.4 Manfaat Penelitian

Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para peneliti selanjutnya dalam melakukan penelitian lebih lanjut mengenai adakah hubungan antara gen parC dengan resistensi antibiotik yang ditimbulkannya serta pembuatan kit untuk deteksi infeksi kuman Salmonella typhi.

1.5 Metode Penelitian

Penelitian laboratory experimental ini merupakan suatu cara untuk mencari kondisi yang paling optimal untuk deteksi gen parC menggunakan teknik PCR.

1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian & Pengembangan Ilmu Kedokteran Dasar (LP2 – IKD) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha dan Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia, FMIPA ITB pada bulan Maret sampai September 2007.

35 Universitas Kristen Maranatha

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR bagian gen parC

menggunakan primer parC1, dan parC2. Primer parC1 dan parC2 dirancang dengan mengoptimalisasi primer yang sudah ada sebelumnya. Rancangan primer baru ini ternyata bisa digunakan untuk amplifikasi dengan kondisi sebagai berikut:

1. Formula PCR untuk satu kali reaksi menggunakan primer parC1 dan parC2 adalah:

- Buffer 1x (tanpa Mg2+) - Mg2+ 1.5 – 3.5 mM - dNTP 200 µM - parC1 0.6 µM - parC2 0.6 µM - Taq polymerase 1 U - H2O steril

- Templat hasil isolasi keromosom 0.5 µl

2. Kondisi PCR untuk mengamplifiksai bagian gen parC adalah: - Jumlah siklus : 30

- Denaturasi : 94ºC 1 menit

- Annealing : 40ºC 1 menit

36

Universitas Kristen Maranatha

5.2 Saran

1. Pada penelitian selanjutnya, analisis sekuensing perlu dilakukan terhadap hasil amplifikasi PCR bagian gen parC Salmonella typhi. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya mutasi pada bagian gen parC

tersebut.

2. Analisis resistensi terhadap fluorokuinolon menggunakan kertas cakram dapat digunakan sebagai awal pemilihan sampel Salmonella typhi sebelum amplifikasi bagian gen parC dan sekuensing dilakukan.

37 Universitas Kristen Maranatha

DAFTAR PUSTAKA

Brown, T. A. (1995). Gene cloning, an introduction, 3rd ed. Chapman & Hall. p. 228 - 38

Darmowandowo, W., et al (2006) Demam Tifoid. Surabaya: FK Unair..

Eykyn, S. J. & Williams, H. (1987). Treatment of multiresistant Salmonella typhi with oral ciprofloxacin. Lancet ii, 1407 – 1408.

Gaind, R., et al (2006). Molecular characterization of ciprofloxacin-resistant Salmonella enterica serovar Typhi and Paratyphi A causing enteric fever in India. J Antimicrob Chemother 58: 1139 – 44.

Giraud., et al (2005). A review of vaccine research and development: human enteric infections. Science Direct. p. 2744

Hadinegoro, S. R. (1999). Masalag Multi Drug Resistance pada Demam Tifoid Anak.

Jakarta: FK UI.

Heisig P.(1996). Genetic Evidence for a Role of parC Mutations in Development of High-level Fluoroquinolone resistance in a Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 879 – 85.

Hirose, K., et al (2002). DNA Sequence Analysis of DNA Gyrase and DNA Topoisomerase IV Quinolone Resistance-Determining Regions of Salmonella enterica Serovar Typhi and Serovar Paratyphi A. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3249-52.

Kariuki S, Revathi G, Muyodi J, et al (2004). Characterisation of multi-resistant typhoid outbreaks in Kenya. J Clin Microbiol 42:_{1477 – 82.}

Lesser., et al. (2005). Salmonellosis. In: Kapses, D. L., Fauci, A. S., Longo, D. L., Braunwald., Hauser, S.L., Jameson, J. L. Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16th ed. Volume 1. New York: The MacGrawHill Companies. Inc. p. 897 – 98.

38

Universitas Kristen Maranatha

Madigan, M. T., et al (2003). Brock’s Biology of Microorganism, 10th ed. New Jersey: Pearson Education, Inc .p. 741-42

Pollack, D, V. (2003). Student presentation on Salmonella enterica typhi. Connecticut: University of Connecticut – Department of Molecular and Cell Biology.

Juwono, R. (1996). Demam Tifoid. In: Noer, H.M.S., Waspadji, S., Rachman, A.M., Lesmana, L. A., Widodo, D., Isbagio, H., et al. eds. Buku Ajar Ilmu PEnyakit Dalam, 3rd ed. Jilid 1. Jakarta: balai Penerbit FKUI. p. 435 - 62

Rudiretna, A. (1998) Gen mirip CarA pada Salmonella typhi. Desertasi Program Pasca Sarjana. Institut Teknologi Bandung.

Turner, A. K., Nair, S., Wain, J. (2006). The acquisition of full fluoroquinolone resistance in Salmonella Typhi by accumulation of point mutations in the topoisomerase targets. J Antimicrob Chemother 58: 733-40.

Sastroasmoro, S., et al (2005). Penggunaan Siprofloksasin di Indonesia. Jakarta: FKUI.

Informasi tersebut diharapkan dapat digunakan untuk pembuatan kit yang dapat mendeteksi adanya resistensi terhadap Salmonella typhi dalam waktu cepat menggunakan teknik PCR, sehingga dapat dilakukan metode pengobatan yang lebih tepat.

Penelitian ini mengerjakan tahap awal, yaitu mencari kondisi PCR yang paling optimal untuk mengamplifikasi gen parC, dengan cara optimalisasi kondisi PCR yang sudah ada sebelumnya.

1.2. Identifikasi Masalah

Bagaiman kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen parC menggunakan primer parC1 dan parC2?

1.3. Maksud dan Tujuan

Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan antara gen parC dengan resistensi terhadap fluorokuinolon pada Salmonella typhi di Indonesia.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR gen parC menggunakan primer parC1 dan parC2 pada Salmonella typhi di Indonesia,

4

1.4 Manfaat Penelitian

Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para peneliti selanjutnya dalam melakukan penelitian lebih lanjut mengenai adakah hubungan antara gen parC dengan resistensi antibiotik yang ditimbulkannya serta pembuatan kit untuk deteksi infeksi kuman Salmonella typhi.

1.5 Metode Penelitian

Penelitian laboratory experimental ini merupakan suatu cara untuk mencari kondisi yang paling optimal untuk deteksi gen parC menggunakan teknik PCR.

1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian & Pengembangan Ilmu Kedokteran Dasar (LP2 – IKD) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha dan Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia, FMIPA ITB pada bulan Maret sampai September 2007.

5.1 Kesimpulan

Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR bagian gen parC

menggunakan primer parC1, dan parC2. Primer parC1 dan parC2 dirancang dengan mengoptimalisasi primer yang sudah ada sebelumnya. Rancangan primer baru ini ternyata bisa digunakan untuk amplifikasi dengan kondisi sebagai berikut:

1. Formula PCR untuk satu kali reaksi menggunakan primer parC1 dan parC2 adalah:

- Buffer 1x (tanpa Mg2+) - Mg2+ 1.5 – 3.5 mM - dNTP 200 µM - parC1 0.6 µM - parC2 0.6 µM - Taq polymerase 1 U - H2O steril

- Templat hasil isolasi keromosom 0.5 µl

36

5.2 Saran

1. Pada penelitian selanjutnya, analisis sekuensing perlu dilakukan terhadap hasil amplifikasi PCR bagian gen parC Salmonella typhi. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya mutasi pada bagian gen parC

tersebut.

2. Analisis resistensi terhadap fluorokuinolon menggunakan kertas cakram dapat digunakan sebagai awal pemilihan sampel Salmonella typhi sebelum amplifikasi bagian gen parC dan sekuensing dilakukan.

Darmowandowo, W., et al (2006) Demam Tifoid. Surabaya: FK Unair..

Eykyn, S. J. & Williams, H. (1987). Treatment of multiresistant Salmonella typhi with oral ciprofloxacin. Lancet ii, 1407 – 1408.

Gaind, R., et al (2006). Molecular characterization of ciprofloxacin-resistant Salmonella enterica serovar Typhi and Paratyphi A causing enteric fever in India. J Antimicrob Chemother 58: 1139 – 44.

Giraud., et al (2005). A review of vaccine research and development: human enteric infections. Science Direct. p. 2744

Hadinegoro, S. R. (1999). Masalag Multi Drug Resistance pada Demam Tifoid Anak.

Jakarta: FK UI.

Heisig P.(1996). Genetic Evidence for a Role of parC Mutations in Development of High-level Fluoroquinolone resistance in a Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 879 – 85.

Hirose, K., et al (2002). DNA Sequence Analysis of DNA Gyrase and DNA Topoisomerase IV Quinolone Resistance-Determining Regions of Salmonella

enterica Serovar Typhi and Serovar Paratyphi A. Antimicrob. Agents Chemother.

38

Madigan, M. T., et al (2003). Brock’s Biology of Microorganism, 10th ed. New Jersey: Pearson Education, Inc .p. 741-42

Pollack, D, V. (2003). Student presentation on Salmonella enterica typhi. Connecticut: University of Connecticut – Department of Molecular and Cell Biology.

Juwono, R. (1996). Demam Tifoid. In: Noer, H.M.S., Waspadji, S., Rachman, A.M., Lesmana, L. A., Widodo, D., Isbagio, H., et al. eds. Buku Ajar Ilmu PEnyakit Dalam, 3rd ed. Jilid 1. Jakarta: balai Penerbit FKUI. p. 435 - 62

Rudiretna, A. (1998) Gen mirip CarA pada Salmonella typhi. Desertasi Program Pasca Sarjana. Institut Teknologi Bandung.

Turner, A. K., Nair, S., Wain, J. (2006). The acquisition of full fluoroquinolone resistance in Salmonella Typhi by accumulation of point mutations in the topoisomerase targets. J Antimicrob Chemother 58: 733-40.

Sastroasmoro, S., et al (2005). Penggunaan Siprofloksasin di Indonesia. Jakarta: FKUI.