PENDAHULUAN Isolasi Dan Elusidasi Struktur Senyawa Penanda Dari Ekstrak Meniran (Phyllanthus Niruri L.).
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Ekstrak meniran (Phyllanthus niruri L.) yang berasal dari famili
Euphorbiaceae berkhasiat sebagai hepatoprotektif (Asha, 2011), antitumor (Jia et al.,
2013), antidiabetes (Coman et al., 2012), sitotoksik (Harish dan Shivanandappa,
2006) serta memiliki aktivitas antioksidan (Chirdchupunseree dan Pramyothin, 2010).
Di Indonesia, P. niruri telah diproduksi dan dipasarkan sebagai fitofarmaka dalam
bentuk kapsul dan pada penelitian selanjutnya akan dilakukan formulasi dalam
bentuk nanoemulsi sebagai obat herbal terstandar. Dalam upaya pengembangan jamu
menjadi obat herbal terstandar, menurut Kepala BPOM Indonesia dalam
HK.00.05.41.1384 tahun 2005 harus melalui berbagai tahap uji dan salah satunya
adalah standarisasi bahan baku.
Penggunaan obat tradisional dalam beberapa tahun ini meningkat drastis.
Tercatat pada tahun 2014, hanya 832 produk obat tradisional yang terdaftar di BPOM
(BPOM, 2014). Pada November 2013, terdapat 57 produk obat tardisional ditarik dari
pasaran karena terbukti mengandung bahan kimia obat (BKO) (Widarti, 2013). Untuk
menjamin keamanan dan mutu dari sediaan tersebut maka perlu dilakukan
standarisasi.
Dalam standarisasi suatu sediaan farmasi dengan bahan dasar ekstrak
tanaman diperlukan senyawa penanda atau chemical marker yang umumnya
merupakan senyawa mayor (senyawa utama) ataupun senyawa aktif dari tanaman
yang bersangkutan (Wahyuno, 2005). P. niruri dalam beberapa penelitian
menggunakan korilagin (Colombo et al., 2009), fillantin, dan hipofillantin
(Bhattacharyya et al., 2013) sebagai active marker. Beberapa senyawa penanda P.
niruri kebanyakan dalam penelitian dilakukan isolasi sendiri seperti fillantin,
hipofillantin (Tripathi et al., 2006; Murugaiyah & Chan, 2007), filtetralin, nirantin
(Murugaiyah & Chan, 2006), nirurisida (Qian-Cutrone et al., 1996), dan korilagin
(Colombo et al., 2009).
1
2
Pada penelitian Qian-Cutrone et al. (1996), menggunakan kromatografi
kolom dengan fase diam Sephadex LH-20 mendapatkan nirurisida sebanyak 12 mg.
Rendemen dari senyawa penanda tersebut terbilang sedikit. Teknik isolasi
menggunakan kromatografi sistem radial (kromatotron) belum pernah dilakukan
untuk mengisolasi P. niruri. Kromatotron dapat mengisolasi lebih cepat, dapat
mengisolasi senyawa yang tidak memiliki gugus kromofor, fase gerak yang
digunakan dapat berupa sistem gradien, dan harga yang relatif rendah dibanding
teknik isolasi lainnya (Kulkarni et al., 2011).
Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi
senyawa penanda yang terkandung di dalam ekstrak metanol herba P. niruri
menggunakan kromatotron dan mengelusidasi struktur isolat tersebut. Diharapkan
isolat yang didapat mampu memberikan kemurnian lebih dari 95% sehingga dapat
digunakan sebagai senyawa penanda dalam penelitian selanjutnya.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah penelitian ini
adalah senyawa penanda apa yang didapat dari ekstrak metanol herba P. niruri serta
berapa kemurnian dan bagaimana struktur kimianya dengan metode ESI-LC-MS, 1HNMR, dan 13C-NMR tanpa menggunakan standar?
C. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan rumusan masalah di atas, penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui senyawa penanda yang didapat dari ekstrak metanol
herba P. niruri serta mengetahui kemurnian dan struktur kimianya dengan metode
ESI-LC-MS, 1H-NMR, dan 13C-NMR tanpa menggunakan standar.
3
D. Tinjauan Pustaka
1. Meniran (Phillanthus niruri L.)
a. Klasifikasi meniran
Menurut Shankar (2012), meniran termasuk kingdom Plantae, divisi
Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Euphorbiales, famili Euphorbiaceae,
genus Phyllanthus, dan spesies niruri.
P. niruri L. memiliki nama yang berbeda di tiap negara seperti chanca
piedra di Spanyol, quebra pedra di Portugal, stone-breaker di Belanda, punarnava di
India, bhoomi amalika di Thailand, bhui-amla di Vietnam, cane peas senna di Kuba,
derriere-dos di Filifina, erva-pombinha di Kolombia, elrageig di Afrika Selatan,
quinine weed di Amerika, dan meniran di Indonesia Shankar (2012).
b. Morfologi meniran
Gambar 1. Tanaman Meniran (Phyllanthus niruri L.)
Merupakan tumbuhan ramuan yang tegak dan kecil, tumbuh tinggi 30-40
cm. Banyak tumbuh di daerah hutan hujan di Amazon dan daerah tropis lain seperti
Asia Tenggara, Selatan India, serta Cina (Girach et al., 1994). Daunnya memiliki
panjang 7-12 cm, memiliki bunga berwarna putih kehijauan yang berukuran kecil
(Lee et al., 2006).
c. Kandungan meniran
P. niruri, menurut Bagalkotkar et al., (2006), mengandung golongan
flavanoid (rutin, kuersetin, kuersitrin, astragalin, katekin, flavanon glikosida, nirurin,
flavanon 5-o-rutinosid, kuersetol), terpen (limonene, p-cimen, lupeol, kumarin, metil
brevifolinkarboksilat), lignan (fillantin, hipofillantin, nirantin, isolintetralin, 2,3desmetoksi seko-isilintetralin, 2,3-desmetoksi seko-isilintetralin diasetat, linnantin,
demetilenedioksinirantin, nirfillin, fillnirurin), tannin (asam repandusinat, geraniin,
korilagin), saponin, alkaloid (norsekuirin, sekurinin, fillantina, nirurin, fillokrisina),
4
dan senyawa lain seperti 1-o-galloil-6-luteoil-α-D-glukosa, β-glukogallin, dan
nirurisida.
2. Kromatotron
Dalam pengisolasian senyawa kimia yang terkandung di dalam sediaan
alam, khususnya ekstrak, banyak dilakukan menggunakan teknik pemisahan senyawa
dengan kromatografi kolom (Moreira et al., 2013; Prasad et al., 2009) menggunakan
prinsip partisi antara senyawa yang diharapkan dengan fase gerak yang digunakan
berdasarkan teknik like dissolve like (Gandjar dan Rohman, 2012). Selain
kromatografi kolom, kromatografi sistem radial (kromatotron) juga dapat digunakan.
Kromatotron merupakan teknik kromatografi preparatif berbentuk lingkaran dibantu
dengan adanya rotor dengan kecepatan tertentu. Prinsip dari kromatotron sama
dengan kromatografi planar seperti kromatografi lapis tipis, namun hasil
pengembangan setelah terpisah dapat ditampung pada tabung penampungan
(Kulkarni et al., 2011).
Volume alir fase gerak akan mengalir sesuai dengan katup yang digunakan
menuju ke bagian tengah lempeng kromatotron, mengelusi analit seperti halnya KLT,
namun elusi berkembang searah gravitasi dan analit membentuk rotasi pita. Dalam
pengisolasian, tambungan dari kromatotron yang didapat berdasarkan pendaran yang
terbentuk dengan pengamatan menggunakan sinar UV 366 nm karena fraksi polar
dari sampel memiliki bercak yang dapat berfluoresensi (Kulkarni et al., 2011).
3. LC-MS (Liquid Chromatoghraphy Mass Spectrum)
Liquid Chromatoghraphy-Mass Spectrum (LC-MS) merupakan perpaduan
dua instrumen analisis senyawa kimia yang dapat mengidentifikasi senyawa dengan
mekanisme pemisahan dengan prinsip kromatografi dan dapat mengidentifikasi berat
molekul dari senyawa yang dianalisis (Hoffmann & Stoobant, 2007). Prinsip dasar
LC-MS adalah menghasilkan molekul yang bermuatan untuk dapat terdeteksi dari
senyawa yang semula netral (Saifudin, 2014).
Mode ESI (electrospray ionization) merupakan salah satu metode
spektroskopi massa untuk mendeteksi bobot molekul suatu senyawa yang dianalisis
dari peak yang terbentuk akibat adanya penambahan ion dari proses penyemprotan,
5
sehingga tidak didapatkan fragmentasi dari senyawa seperti jika dianalisis
menggunakan mode EI (electron impact). Analit bersama dengan eluen akan masuk
ke dalam kapiler membentuk butiran-butiran halus yang kemudian akan berikatan
dengan ion positif yang disemprotkan melalui taylor cone. Ion positif yang biasanya
ditambahkan berupa ion hidrogen (H+), ion natrium (Na+), ion amonium (NH4+), ion
litium (Li+), ion kalium (K+), dan beberapa kation lainnya (Jessica & Gilment, 2002).
Ion positif dipilih dengan tujuan agar tidak terjadi penyatuan tetesan-tetesan kecil
yang sudah terbentuk sebelumnya. Ada 5 (lima) kemungkinan yang terdeteksi oleh
detektor (1) analit akan berikatan dengan satu muatan positif, (2) analit akan
berikatan dengan beberapa muatan positif, (3) analit akan berikatan dengan satu
muatan positif dan satu molekul solven, (4) analit akan berikatan dengan satu muatan
positif dan beberapa molekul solven, atau (5) analit akan berikatan dengan beberapa
muatan positif dan beberapa molekul solven (Ardrey, 2003).
4. NMR
Prinsip dari NMR adalah berdasarkan pada penyerapan gelombang radio
oleh inti-inti tertentu dalam molekul organik yang berada dalam medan magnet yang
kuat. Nuklida yang penting dalam analisis data berdasarkan pada spin inti dari isotop
H, C, dan O dengan menyerap energi pada radiofrekuensi yang berbeda (Fessenden
dan Fessenden, 1986). Analisis NMR digunakan untuk mengetahui senyawa yang
dianalisa merupakan senyawa baru atau senyawa yang telah diketahui dengan
menganalisis lingkungan kimia dan pemecahan puncak dari 1H-NMR dan
13
C-NMR
yang kemudian dibandingkan dengan penelitian yang sudah ada. NMR merupakan
golden method dalam menentukan struktur suatu molekul organik (Saifudin, 2014).
E. KETERANGAN EMPIRIS
Penelitian ini diharapkan dapat menunjukkan bahwa metode kromatografi
sistem radial (kromatotron) mampu menghasilkan senyawa murni dari P. niriuri yang
dapat digunakan sebagai senyawa penanda dalam standarisasi ekstrak P. niruri.
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Ekstrak meniran (Phyllanthus niruri L.) yang berasal dari famili
Euphorbiaceae berkhasiat sebagai hepatoprotektif (Asha, 2011), antitumor (Jia et al.,
2013), antidiabetes (Coman et al., 2012), sitotoksik (Harish dan Shivanandappa,
2006) serta memiliki aktivitas antioksidan (Chirdchupunseree dan Pramyothin, 2010).
Di Indonesia, P. niruri telah diproduksi dan dipasarkan sebagai fitofarmaka dalam
bentuk kapsul dan pada penelitian selanjutnya akan dilakukan formulasi dalam
bentuk nanoemulsi sebagai obat herbal terstandar. Dalam upaya pengembangan jamu
menjadi obat herbal terstandar, menurut Kepala BPOM Indonesia dalam
HK.00.05.41.1384 tahun 2005 harus melalui berbagai tahap uji dan salah satunya
adalah standarisasi bahan baku.
Penggunaan obat tradisional dalam beberapa tahun ini meningkat drastis.
Tercatat pada tahun 2014, hanya 832 produk obat tradisional yang terdaftar di BPOM
(BPOM, 2014). Pada November 2013, terdapat 57 produk obat tardisional ditarik dari
pasaran karena terbukti mengandung bahan kimia obat (BKO) (Widarti, 2013). Untuk
menjamin keamanan dan mutu dari sediaan tersebut maka perlu dilakukan
standarisasi.
Dalam standarisasi suatu sediaan farmasi dengan bahan dasar ekstrak
tanaman diperlukan senyawa penanda atau chemical marker yang umumnya
merupakan senyawa mayor (senyawa utama) ataupun senyawa aktif dari tanaman
yang bersangkutan (Wahyuno, 2005). P. niruri dalam beberapa penelitian
menggunakan korilagin (Colombo et al., 2009), fillantin, dan hipofillantin
(Bhattacharyya et al., 2013) sebagai active marker. Beberapa senyawa penanda P.
niruri kebanyakan dalam penelitian dilakukan isolasi sendiri seperti fillantin,
hipofillantin (Tripathi et al., 2006; Murugaiyah & Chan, 2007), filtetralin, nirantin
(Murugaiyah & Chan, 2006), nirurisida (Qian-Cutrone et al., 1996), dan korilagin
(Colombo et al., 2009).
1
2
Pada penelitian Qian-Cutrone et al. (1996), menggunakan kromatografi
kolom dengan fase diam Sephadex LH-20 mendapatkan nirurisida sebanyak 12 mg.
Rendemen dari senyawa penanda tersebut terbilang sedikit. Teknik isolasi
menggunakan kromatografi sistem radial (kromatotron) belum pernah dilakukan
untuk mengisolasi P. niruri. Kromatotron dapat mengisolasi lebih cepat, dapat
mengisolasi senyawa yang tidak memiliki gugus kromofor, fase gerak yang
digunakan dapat berupa sistem gradien, dan harga yang relatif rendah dibanding
teknik isolasi lainnya (Kulkarni et al., 2011).
Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi
senyawa penanda yang terkandung di dalam ekstrak metanol herba P. niruri
menggunakan kromatotron dan mengelusidasi struktur isolat tersebut. Diharapkan
isolat yang didapat mampu memberikan kemurnian lebih dari 95% sehingga dapat
digunakan sebagai senyawa penanda dalam penelitian selanjutnya.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah penelitian ini
adalah senyawa penanda apa yang didapat dari ekstrak metanol herba P. niruri serta
berapa kemurnian dan bagaimana struktur kimianya dengan metode ESI-LC-MS, 1HNMR, dan 13C-NMR tanpa menggunakan standar?
C. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan rumusan masalah di atas, penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui senyawa penanda yang didapat dari ekstrak metanol
herba P. niruri serta mengetahui kemurnian dan struktur kimianya dengan metode
ESI-LC-MS, 1H-NMR, dan 13C-NMR tanpa menggunakan standar.
3
D. Tinjauan Pustaka
1. Meniran (Phillanthus niruri L.)
a. Klasifikasi meniran
Menurut Shankar (2012), meniran termasuk kingdom Plantae, divisi
Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Euphorbiales, famili Euphorbiaceae,
genus Phyllanthus, dan spesies niruri.
P. niruri L. memiliki nama yang berbeda di tiap negara seperti chanca
piedra di Spanyol, quebra pedra di Portugal, stone-breaker di Belanda, punarnava di
India, bhoomi amalika di Thailand, bhui-amla di Vietnam, cane peas senna di Kuba,
derriere-dos di Filifina, erva-pombinha di Kolombia, elrageig di Afrika Selatan,
quinine weed di Amerika, dan meniran di Indonesia Shankar (2012).
b. Morfologi meniran
Gambar 1. Tanaman Meniran (Phyllanthus niruri L.)
Merupakan tumbuhan ramuan yang tegak dan kecil, tumbuh tinggi 30-40
cm. Banyak tumbuh di daerah hutan hujan di Amazon dan daerah tropis lain seperti
Asia Tenggara, Selatan India, serta Cina (Girach et al., 1994). Daunnya memiliki
panjang 7-12 cm, memiliki bunga berwarna putih kehijauan yang berukuran kecil
(Lee et al., 2006).
c. Kandungan meniran
P. niruri, menurut Bagalkotkar et al., (2006), mengandung golongan
flavanoid (rutin, kuersetin, kuersitrin, astragalin, katekin, flavanon glikosida, nirurin,
flavanon 5-o-rutinosid, kuersetol), terpen (limonene, p-cimen, lupeol, kumarin, metil
brevifolinkarboksilat), lignan (fillantin, hipofillantin, nirantin, isolintetralin, 2,3desmetoksi seko-isilintetralin, 2,3-desmetoksi seko-isilintetralin diasetat, linnantin,
demetilenedioksinirantin, nirfillin, fillnirurin), tannin (asam repandusinat, geraniin,
korilagin), saponin, alkaloid (norsekuirin, sekurinin, fillantina, nirurin, fillokrisina),
4
dan senyawa lain seperti 1-o-galloil-6-luteoil-α-D-glukosa, β-glukogallin, dan
nirurisida.
2. Kromatotron
Dalam pengisolasian senyawa kimia yang terkandung di dalam sediaan
alam, khususnya ekstrak, banyak dilakukan menggunakan teknik pemisahan senyawa
dengan kromatografi kolom (Moreira et al., 2013; Prasad et al., 2009) menggunakan
prinsip partisi antara senyawa yang diharapkan dengan fase gerak yang digunakan
berdasarkan teknik like dissolve like (Gandjar dan Rohman, 2012). Selain
kromatografi kolom, kromatografi sistem radial (kromatotron) juga dapat digunakan.
Kromatotron merupakan teknik kromatografi preparatif berbentuk lingkaran dibantu
dengan adanya rotor dengan kecepatan tertentu. Prinsip dari kromatotron sama
dengan kromatografi planar seperti kromatografi lapis tipis, namun hasil
pengembangan setelah terpisah dapat ditampung pada tabung penampungan
(Kulkarni et al., 2011).
Volume alir fase gerak akan mengalir sesuai dengan katup yang digunakan
menuju ke bagian tengah lempeng kromatotron, mengelusi analit seperti halnya KLT,
namun elusi berkembang searah gravitasi dan analit membentuk rotasi pita. Dalam
pengisolasian, tambungan dari kromatotron yang didapat berdasarkan pendaran yang
terbentuk dengan pengamatan menggunakan sinar UV 366 nm karena fraksi polar
dari sampel memiliki bercak yang dapat berfluoresensi (Kulkarni et al., 2011).
3. LC-MS (Liquid Chromatoghraphy Mass Spectrum)
Liquid Chromatoghraphy-Mass Spectrum (LC-MS) merupakan perpaduan
dua instrumen analisis senyawa kimia yang dapat mengidentifikasi senyawa dengan
mekanisme pemisahan dengan prinsip kromatografi dan dapat mengidentifikasi berat
molekul dari senyawa yang dianalisis (Hoffmann & Stoobant, 2007). Prinsip dasar
LC-MS adalah menghasilkan molekul yang bermuatan untuk dapat terdeteksi dari
senyawa yang semula netral (Saifudin, 2014).
Mode ESI (electrospray ionization) merupakan salah satu metode
spektroskopi massa untuk mendeteksi bobot molekul suatu senyawa yang dianalisis
dari peak yang terbentuk akibat adanya penambahan ion dari proses penyemprotan,
5
sehingga tidak didapatkan fragmentasi dari senyawa seperti jika dianalisis
menggunakan mode EI (electron impact). Analit bersama dengan eluen akan masuk
ke dalam kapiler membentuk butiran-butiran halus yang kemudian akan berikatan
dengan ion positif yang disemprotkan melalui taylor cone. Ion positif yang biasanya
ditambahkan berupa ion hidrogen (H+), ion natrium (Na+), ion amonium (NH4+), ion
litium (Li+), ion kalium (K+), dan beberapa kation lainnya (Jessica & Gilment, 2002).
Ion positif dipilih dengan tujuan agar tidak terjadi penyatuan tetesan-tetesan kecil
yang sudah terbentuk sebelumnya. Ada 5 (lima) kemungkinan yang terdeteksi oleh
detektor (1) analit akan berikatan dengan satu muatan positif, (2) analit akan
berikatan dengan beberapa muatan positif, (3) analit akan berikatan dengan satu
muatan positif dan satu molekul solven, (4) analit akan berikatan dengan satu muatan
positif dan beberapa molekul solven, atau (5) analit akan berikatan dengan beberapa
muatan positif dan beberapa molekul solven (Ardrey, 2003).
4. NMR
Prinsip dari NMR adalah berdasarkan pada penyerapan gelombang radio
oleh inti-inti tertentu dalam molekul organik yang berada dalam medan magnet yang
kuat. Nuklida yang penting dalam analisis data berdasarkan pada spin inti dari isotop
H, C, dan O dengan menyerap energi pada radiofrekuensi yang berbeda (Fessenden
dan Fessenden, 1986). Analisis NMR digunakan untuk mengetahui senyawa yang
dianalisa merupakan senyawa baru atau senyawa yang telah diketahui dengan
menganalisis lingkungan kimia dan pemecahan puncak dari 1H-NMR dan
13
C-NMR
yang kemudian dibandingkan dengan penelitian yang sudah ada. NMR merupakan
golden method dalam menentukan struktur suatu molekul organik (Saifudin, 2014).
E. KETERANGAN EMPIRIS
Penelitian ini diharapkan dapat menunjukkan bahwa metode kromatografi
sistem radial (kromatotron) mampu menghasilkan senyawa murni dari P. niriuri yang
dapat digunakan sebagai senyawa penanda dalam standarisasi ekstrak P. niruri.