Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah.
Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan
Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah
(Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk)
Oleh:
Wendry Setiyadi Putranto,SPt.,MSi.
Disampaikan pada:
Seminar Nasional Bioteknologi “ Capturing Opportunities through
Biotechnology” Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI 15-16 November 2006
Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan
Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah
(Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk)
Wendry Setiyadi Putranto
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung
ABSTRAK
Enzim protease dengan aktivitas proteolitik yang rendah telah dimurnikan dengan
kromatografi yang konvensional dari Lactobacillus acidophilus. Enzim tersebut
memiliki aktivitas optimum pada pH 5,5 pada suhu 370C. Pemurnian enzim
dengan pengendapan amonium sulfat 45% dan kromatographi kolom dengan
Sephadex G-100. Aktivitas protease dihambat oleh pengkelat logam dengan
konsentrasi 1 mM dan 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Berat
molekul diukur dengan sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
adalah 72 kD.
Kata kunci
:
aktivitas proteolitik, pemurnian,
ABSTRACT
A proteolytic with low activation was purified by conventional chromatographic
techniques from Lactobacillus acidophilus. The pH optimum of the enzymes was
5,5 at 370C. The enzymes was purified using 45% ammonium sulfate
precipitation and column chromatography using Sephadex G-100. The protease
activity was inhibited by chelating agent at the concentrations as follows: 1 mM
and 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). The molecular weight value
as determined by sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis was
72 kD.
Key words : proteolytic activation, purification
Pendahuluan
Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan
maupun non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya
adalah untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada
industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease
dapat diperoleh dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan
kemampuan hewan dan tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah
mendorong berkembangnya protease mikroba.
Mikroba memiliki peran penting sebagai penghasil protease karena
memiliki beberapa keunggulan antara lain, mikroba memiliki siklus hidup yang
singkat, efisiensi waktu dan tempat, produktivitas tinggi dan memudahkan kita
untuk melakukan manipulasi genetik (melalui rekayasa genetika mikroba)
maupun manipulasi dalam proses fermentasi (rekayasa bioproses). Mikroba yang
telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara lain
Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Aspergillus
oryzae, dan Aspergillus niger.
Lactobacilus acidopillus merupakan kelompok bakteri asam laktat (BAL)
“friendly bacteria” yang merupakan kelompok bakteri yang banyak dimanfaatkan
dalam industri fermentasi susu, baik dalam pembuatan yoghurt maupun keju.
Bakteri tersebut mempunyai kemampuan menghidrolisis kasein yang ada pada
susu dengan mengekskresikan enzim proteolitik.
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui karakter biokimia
protease intra seluler dari beberapa bakteri asam laktat seperti Lactobacillus
bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, sedangkan karakter biokimia protease
intra seluler maupun ekstraseluler dari Lactobacilus acidopillus belum banyak
dilakukan terutama untuk isolat yang berasal dari Indonesia.
Berdasarkan uraian diatas, peneliti merasa tertarik untuk mengkaji lebih
jauh tentang karakter biokimia dari protease ekstraseluler dari
acidopillus
PAGE.
secara kuantitatif maupun kualitatif
Lactobacilus
menggunakan metoda SDS
Metode Penelitian
Strain Bakteri Asam Laktat yang digunakan adalah Lactobacilus acidopillus,
media propagasi menggunakan MRS broth, sedangkan media produksi
menggunakan susu sapi perah.
Lactobacilus acidopillus
diinokulasikan pada media propagasi
dari media padat
MRS broth (10 ml) inkubasi 37 0C,
dilakukan pengamatan pertumbuhannya pada dengan spektrofotometer (600 nm)
Selanjutnya sebanyak 2% (v/v) diinokulasikan pada media susu sapi perah (UHT).
Pengambilan sampel dilakukan tiap jam terhadap kedua media produksi tersebut,
dilakukan pengamatan pertumbuhan mikrobanya, dan pengukuran aktivitas
protease (Walter,1984) serta kadar protein (Bradford,1978).
Pengukuran densitas bakteri pada media produksi susu sapi perah.
Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan 9 ml EDTA (2g/l,pH 12) selanjutnya dilihat
absorbansinya pada 600 nm ( Metoda Kanasaki )
Isolasi protease intra seluler Lactobacilus acidopillus
Sampel disentrifugasi 12000 g, pada suhu 40C, selama 15 menit. Supernatan yang
didapat merupakan enzim protease kasar selanjutnya dianalisis kadar protein dan
aktivitas proteplitiknya.
Isolasi protease ekstraseluler Lactobacilus acidopillus
Crude extract ektraseluler protease diperoleh dengan memisahkan media (susu
sapi perah) dengan sel bakteri, dialkukan sentrifugasi 12000 g, supernatant yang
diperoleh dilakukan pengukuran aktivitas protease (Walter,1984) serta kadar
protein (Bradford,1978).
Pengendapan dengan Amonium sulfat
Untuk menggumpalkan protein, supernatan hasil sentrifugasi
ditambahkan
ammonium sulfat sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirrer
dengan konsentrasi (30%, 40%, 45%, 60%) dan dibiarkan selama satu malam
pada suhu 40C. Selanjutnya disentrifugasi 10000 rpm, suhu 4 0C, selama 15
menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dengan buffer Tris-HCl 10 mM pH
8, kemudian dilakukan pengujian aktivitas proteasenya dengan metode Walter
(1984) dan penentuan kadar proteinnya dengan metode Bradford (1976).
Dialisis
Dialisis dilakukan untuk menghilangkan kadar garam yang tersisa dari proses
pengendapan dengan ammonium sulfat menggunakan kantong dialisis. Kantong
diikat dengan benang jahit, lalu dimasukkan 10 ml larutan enzim, dan kemudian
ujung lain diikat dengan benang. Kantung dimasukkan dalam larutan Tris HCl 20
mM dengan volume 100 kali volume filtrat dan diagitasi secara perlahan pada
suhu 40C selama 1 jam. Setelah 30 menit bufer diganti dengan bufer segar. Enzim
hasil dialisis dipekatkan menjadi setengah volume dengan freeze dryer dan
disimpan pada suhu 40C untuk segera dilakukan kromatografi filtrasi gel.
Kromatografi Filtrasi Gel
Kolom kromatografi filtrasi gel
Sephadex G-100
diekuilibrasi dengan
mengalirkan bufer Tris HCL 10 M sebanyak 200 ml dan didiamkan selama
semalam pada suhu 4 0C. Larutan protease sebanyak 2 ml dimasukkan dengan
pipet secara perlahan kedalam kolom tepat di atas permukaan gel.
Enzim
dibiarkan mengalir perlahan sampai seluruh enzim berada dibawah permukaan
gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu bufer Tris HCl 10 mM pH 8. Fraksinasi
sebanyak 20 fraksi sebanyak 70 tetes pada masing-masing fraksi menggunakan
fraction collector. Setiap fraksi diukur aktivitas protease dan kadar proteinnya.
Pengukuran konsentrasi protein (Bradford, 1976)
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum
Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Sebanyak 100 l sampel
ditambah 5 ml pereaksi Bradford, selanjutnya dihomogenkan dan diinkubasi
selama 5 menit pada suhu 370C dan kemudian diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada 595 nm. Pengukuran Aktivitas Protease (Walter,1984)
pH optimum
Ditentukan dengan cara mengubah bufer universal yang digunakan sesuai dengan
pH yang diinginkan pada suhu 50 0C. Nilai pH yang diuji anatar 6- 10. Aktivitas
enzim diukur dengan metode Walter (1984).
Pengaruh inhibitor (Chaotropic agent)
Ditentukan dengan penambahan Phenyl Methil Sulfonil Flouride (PMSF) dan
Ethylena Diamina Tetra Acetat (EDTA) yang ditambahkan pada konsentrasi 1mM
dan 5 mM. Aktivitas enzim diukur dengan metode Walter (1984).
SDS-PAGE
Protein hasil pemurnian dianalisa dengan Sodium Dodecyl Sulphate
polyachrilamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE). Peralatan elektroforesis yang
digunakan adalah tipe vertikal. Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan sistem
gel diskontinue yang terdiri dari stacking gel dan separating gel. Marker yang
digunakan adalah High molecular Weight
Hasil dan Pembahasan
Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus aktivitas proteolitiknya
Pertumbuhan dan produksi protease Dilakukan pengamatan terhadap data
turbiditas suspensi sel (panjang gelombang 600 nm) yang diukur tiap selang
waktu tertentu, disamping itu pula dilakukan pengambilan suspensi sel untuk
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Absorbansi 600 nm
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
20
25
Aktivitas spesifik (U/mg)
pengukuran aktivitas protease dan kadar proteinnya.
30
Jam ke
Absorbansi 600 nm
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar.1. Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus dan aktivitas spesifik
protease yang dihasilkannya pada fermentasi susu sapi perah.
Berdasarkan data pada Gambar 1. terlihat bahwa kurva pertumbuhan
diawali dengan fase awal (lag) yang merupakan masa penyesuaian mikroba. Pada
fase tersebut terjadi sintesis enzim oleh sel yang dipergunakan untuk metabolisme
metabolit.
Setelah fase awal selesai, baru mulai terjadi reproduksi selular.
Konsentrasi selular meningkat, mula-mula perlahan kemudian makin lama makin
meningkat sampai pada suatu saat laju pertumbuhan atau reproduksi seluler
mencapi titik maksimal dan terjadi pertumbuhan secara logaritmik atau
eksponesial.
Selanjutnya setelah subtrat atau persenyawaan tertentu yang
diperlukan untuk pertumbuhan bakteri dalam media biakan mendekati habis dan
terjadi penumpukan produk-produk penghambat , maka terjadi penurunan laju
pertumbuhan bakteri tersebut. Fase penurunan ditandai oleh berkurangnya jumlah
sel hidup (viable) dalam media akibat terjadinya kematian (mortalitas).
(Mangunwidjaja,et al.1994).
Lactobacillus acidophilus
mengekskresikan protease
dengan aktivitas tertinggi adalah pada saat jam ke- 18
ektraseluler
( 0,752 U/mg) masa
pertumbuhan bakteri tersebut (fase logaritma pertumbuhan).
Data waktu
produksi tersebut dapat kita gunakan untuk melakukan produksi enzim dalam
skala yang lebih besar. Selanjutnya dilakukan pengendapan amonium sulfat 45%
dan pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel
SDS-PAGE
Tingkat kemurnian enzim dapat diketahui dengan menggunakan teknik
elektroforesis gel poliakrilmida, SDS-PAGE. Gel disusun oleh akrilamida dan
N,N’-metilen – bis – akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme radikal
bebas dengan bantuan katalisator N,N,N’,N’,- tetrametilen diamina (TEMED) dan
inisiator amoniumpersulfat (APS) (Dunn,1989). Prinsip analisis SDS-PAGE yaitu
pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul.
75 kD
Gambar 2. SDS-PAGE protease Lactobacillus acidophilus
Pada sumur no. 4 dan 5 adalah hasil pemurnian dengan kolom Sephadex G-100
yang menunjukan satu pita dengan berat molekul 75 kD. Sedangkan sumur 6 dan
7 merupakan ekstrak kasar protease, dan sumur 8 adalah marker.
Aktivitas spesifik
protease (U/mg)
Penentuan pH Optimum
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
pH
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar.3. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease Lactobacillus
acidophillus pada suhu 370C.
Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya
aktivitas enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya.
Gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk
mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi
besar, perubahan pH akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena
adanya gangguan terhadap berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga
kestabilan struktur tiga dimensi enzim (Hames,et al.2000)
Pengaruh EDTA terhadap aktivitas protease
Tabel.3. Pengaruh EDTA terhadap aktivitas protease Lactobacillus acidophillus
Konsentrasi EDTA (mM)
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
1
8,6
5
1,5
Penggunaan EDTA menunjukkan penuruan aktivitas yang signifikan. Hal ini
menunjukan bahwa EDTA merupakan inhibitor bagi aktivitas enzim tersebut.
Kesimpulan dan Saran
Protease Lactobacillus acidophilus memiliki aktivitas yang sangat rendah
(0,752 U/mg). Karakterisasi biokimia dari protease tersebut meunujukkan pH
optimum 5,5, serta dihambat oleh pengkelat logam EDTA. Hasil pemurnian
dengan kolom Sephadex G -100 menunjukkan satu pita pada SDS-PAGE dengan
ukuran berat molekul sekitar 75 kD
Berdasarkan hasil karakterisasi dapat memberikan informasi untuk
penelitian lebih jauh dalam bidang bioteknologi pangan dan disarankan untuk
mengkaji lebih jauh tentang karakter gen yang menyandikan protease tersebut.
Ucapan Terimakasih
Penulis ucapkan terimaksih sebesarnya kepada semua pihak yang berperan demi
terselesainya penelitian ini, khususnya bagi Lembaga Penelitian Universitas
Padjadjaran yang memberikan pendanaan.
DAFTAR
PUSTAKA
Bradford,MM.1976.A rapid and sensitive method for quantitation of protein
utilization. The principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.
72:248-254
Dunn MJ.1989.Electrophoretic analysis methods. Di dalam E.L.V. Harris
ELV,Angal S,editor. Protein Purification Methods. A Practical
Approach. Oxford:IRL Press.hlm 18-40.
Hames BD, Hooper NM.2000, Biochemistry.The instant Notes. Ed ke-2.
Hongkong: Spinger,Verlag.hlm.83-84.
Laemmli UK.1970 Cleavage of structural protein during the assembly of head
of bacteriophage T-4. Nature:227:680-685
Mangunwidjaja.D,Suryani.A,1994.Teknologi Bioproses.Penebar
Swadaya.Jakarta
Walter HE.1984.Method with haemoglobin, casein, and azocoll as substrate
In. Bergmeyer. HU (ed). Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie.
Deerfield Beach Florida Basel.
Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah
(Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk)
Oleh:
Wendry Setiyadi Putranto,SPt.,MSi.
Disampaikan pada:
Seminar Nasional Bioteknologi “ Capturing Opportunities through
Biotechnology” Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI 15-16 November 2006
Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan
Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah
(Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk)
Wendry Setiyadi Putranto
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung
ABSTRAK
Enzim protease dengan aktivitas proteolitik yang rendah telah dimurnikan dengan
kromatografi yang konvensional dari Lactobacillus acidophilus. Enzim tersebut
memiliki aktivitas optimum pada pH 5,5 pada suhu 370C. Pemurnian enzim
dengan pengendapan amonium sulfat 45% dan kromatographi kolom dengan
Sephadex G-100. Aktivitas protease dihambat oleh pengkelat logam dengan
konsentrasi 1 mM dan 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Berat
molekul diukur dengan sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
adalah 72 kD.
Kata kunci
:
aktivitas proteolitik, pemurnian,
ABSTRACT
A proteolytic with low activation was purified by conventional chromatographic
techniques from Lactobacillus acidophilus. The pH optimum of the enzymes was
5,5 at 370C. The enzymes was purified using 45% ammonium sulfate
precipitation and column chromatography using Sephadex G-100. The protease
activity was inhibited by chelating agent at the concentrations as follows: 1 mM
and 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). The molecular weight value
as determined by sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis was
72 kD.
Key words : proteolytic activation, purification
Pendahuluan
Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan
maupun non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya
adalah untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada
industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease
dapat diperoleh dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan
kemampuan hewan dan tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah
mendorong berkembangnya protease mikroba.
Mikroba memiliki peran penting sebagai penghasil protease karena
memiliki beberapa keunggulan antara lain, mikroba memiliki siklus hidup yang
singkat, efisiensi waktu dan tempat, produktivitas tinggi dan memudahkan kita
untuk melakukan manipulasi genetik (melalui rekayasa genetika mikroba)
maupun manipulasi dalam proses fermentasi (rekayasa bioproses). Mikroba yang
telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara lain
Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Aspergillus
oryzae, dan Aspergillus niger.
Lactobacilus acidopillus merupakan kelompok bakteri asam laktat (BAL)
“friendly bacteria” yang merupakan kelompok bakteri yang banyak dimanfaatkan
dalam industri fermentasi susu, baik dalam pembuatan yoghurt maupun keju.
Bakteri tersebut mempunyai kemampuan menghidrolisis kasein yang ada pada
susu dengan mengekskresikan enzim proteolitik.
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui karakter biokimia
protease intra seluler dari beberapa bakteri asam laktat seperti Lactobacillus
bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, sedangkan karakter biokimia protease
intra seluler maupun ekstraseluler dari Lactobacilus acidopillus belum banyak
dilakukan terutama untuk isolat yang berasal dari Indonesia.
Berdasarkan uraian diatas, peneliti merasa tertarik untuk mengkaji lebih
jauh tentang karakter biokimia dari protease ekstraseluler dari
acidopillus
PAGE.
secara kuantitatif maupun kualitatif
Lactobacilus
menggunakan metoda SDS
Metode Penelitian
Strain Bakteri Asam Laktat yang digunakan adalah Lactobacilus acidopillus,
media propagasi menggunakan MRS broth, sedangkan media produksi
menggunakan susu sapi perah.
Lactobacilus acidopillus
diinokulasikan pada media propagasi
dari media padat
MRS broth (10 ml) inkubasi 37 0C,
dilakukan pengamatan pertumbuhannya pada dengan spektrofotometer (600 nm)
Selanjutnya sebanyak 2% (v/v) diinokulasikan pada media susu sapi perah (UHT).
Pengambilan sampel dilakukan tiap jam terhadap kedua media produksi tersebut,
dilakukan pengamatan pertumbuhan mikrobanya, dan pengukuran aktivitas
protease (Walter,1984) serta kadar protein (Bradford,1978).
Pengukuran densitas bakteri pada media produksi susu sapi perah.
Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan 9 ml EDTA (2g/l,pH 12) selanjutnya dilihat
absorbansinya pada 600 nm ( Metoda Kanasaki )
Isolasi protease intra seluler Lactobacilus acidopillus
Sampel disentrifugasi 12000 g, pada suhu 40C, selama 15 menit. Supernatan yang
didapat merupakan enzim protease kasar selanjutnya dianalisis kadar protein dan
aktivitas proteplitiknya.
Isolasi protease ekstraseluler Lactobacilus acidopillus
Crude extract ektraseluler protease diperoleh dengan memisahkan media (susu
sapi perah) dengan sel bakteri, dialkukan sentrifugasi 12000 g, supernatant yang
diperoleh dilakukan pengukuran aktivitas protease (Walter,1984) serta kadar
protein (Bradford,1978).
Pengendapan dengan Amonium sulfat
Untuk menggumpalkan protein, supernatan hasil sentrifugasi
ditambahkan
ammonium sulfat sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirrer
dengan konsentrasi (30%, 40%, 45%, 60%) dan dibiarkan selama satu malam
pada suhu 40C. Selanjutnya disentrifugasi 10000 rpm, suhu 4 0C, selama 15
menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dengan buffer Tris-HCl 10 mM pH
8, kemudian dilakukan pengujian aktivitas proteasenya dengan metode Walter
(1984) dan penentuan kadar proteinnya dengan metode Bradford (1976).
Dialisis
Dialisis dilakukan untuk menghilangkan kadar garam yang tersisa dari proses
pengendapan dengan ammonium sulfat menggunakan kantong dialisis. Kantong
diikat dengan benang jahit, lalu dimasukkan 10 ml larutan enzim, dan kemudian
ujung lain diikat dengan benang. Kantung dimasukkan dalam larutan Tris HCl 20
mM dengan volume 100 kali volume filtrat dan diagitasi secara perlahan pada
suhu 40C selama 1 jam. Setelah 30 menit bufer diganti dengan bufer segar. Enzim
hasil dialisis dipekatkan menjadi setengah volume dengan freeze dryer dan
disimpan pada suhu 40C untuk segera dilakukan kromatografi filtrasi gel.
Kromatografi Filtrasi Gel
Kolom kromatografi filtrasi gel
Sephadex G-100
diekuilibrasi dengan
mengalirkan bufer Tris HCL 10 M sebanyak 200 ml dan didiamkan selama
semalam pada suhu 4 0C. Larutan protease sebanyak 2 ml dimasukkan dengan
pipet secara perlahan kedalam kolom tepat di atas permukaan gel.
Enzim
dibiarkan mengalir perlahan sampai seluruh enzim berada dibawah permukaan
gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu bufer Tris HCl 10 mM pH 8. Fraksinasi
sebanyak 20 fraksi sebanyak 70 tetes pada masing-masing fraksi menggunakan
fraction collector. Setiap fraksi diukur aktivitas protease dan kadar proteinnya.
Pengukuran konsentrasi protein (Bradford, 1976)
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum
Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Sebanyak 100 l sampel
ditambah 5 ml pereaksi Bradford, selanjutnya dihomogenkan dan diinkubasi
selama 5 menit pada suhu 370C dan kemudian diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada 595 nm. Pengukuran Aktivitas Protease (Walter,1984)
pH optimum
Ditentukan dengan cara mengubah bufer universal yang digunakan sesuai dengan
pH yang diinginkan pada suhu 50 0C. Nilai pH yang diuji anatar 6- 10. Aktivitas
enzim diukur dengan metode Walter (1984).
Pengaruh inhibitor (Chaotropic agent)
Ditentukan dengan penambahan Phenyl Methil Sulfonil Flouride (PMSF) dan
Ethylena Diamina Tetra Acetat (EDTA) yang ditambahkan pada konsentrasi 1mM
dan 5 mM. Aktivitas enzim diukur dengan metode Walter (1984).
SDS-PAGE
Protein hasil pemurnian dianalisa dengan Sodium Dodecyl Sulphate
polyachrilamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE). Peralatan elektroforesis yang
digunakan adalah tipe vertikal. Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan sistem
gel diskontinue yang terdiri dari stacking gel dan separating gel. Marker yang
digunakan adalah High molecular Weight
Hasil dan Pembahasan
Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus aktivitas proteolitiknya
Pertumbuhan dan produksi protease Dilakukan pengamatan terhadap data
turbiditas suspensi sel (panjang gelombang 600 nm) yang diukur tiap selang
waktu tertentu, disamping itu pula dilakukan pengambilan suspensi sel untuk
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Absorbansi 600 nm
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
20
25
Aktivitas spesifik (U/mg)
pengukuran aktivitas protease dan kadar proteinnya.
30
Jam ke
Absorbansi 600 nm
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar.1. Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus dan aktivitas spesifik
protease yang dihasilkannya pada fermentasi susu sapi perah.
Berdasarkan data pada Gambar 1. terlihat bahwa kurva pertumbuhan
diawali dengan fase awal (lag) yang merupakan masa penyesuaian mikroba. Pada
fase tersebut terjadi sintesis enzim oleh sel yang dipergunakan untuk metabolisme
metabolit.
Setelah fase awal selesai, baru mulai terjadi reproduksi selular.
Konsentrasi selular meningkat, mula-mula perlahan kemudian makin lama makin
meningkat sampai pada suatu saat laju pertumbuhan atau reproduksi seluler
mencapi titik maksimal dan terjadi pertumbuhan secara logaritmik atau
eksponesial.
Selanjutnya setelah subtrat atau persenyawaan tertentu yang
diperlukan untuk pertumbuhan bakteri dalam media biakan mendekati habis dan
terjadi penumpukan produk-produk penghambat , maka terjadi penurunan laju
pertumbuhan bakteri tersebut. Fase penurunan ditandai oleh berkurangnya jumlah
sel hidup (viable) dalam media akibat terjadinya kematian (mortalitas).
(Mangunwidjaja,et al.1994).
Lactobacillus acidophilus
mengekskresikan protease
dengan aktivitas tertinggi adalah pada saat jam ke- 18
ektraseluler
( 0,752 U/mg) masa
pertumbuhan bakteri tersebut (fase logaritma pertumbuhan).
Data waktu
produksi tersebut dapat kita gunakan untuk melakukan produksi enzim dalam
skala yang lebih besar. Selanjutnya dilakukan pengendapan amonium sulfat 45%
dan pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel
SDS-PAGE
Tingkat kemurnian enzim dapat diketahui dengan menggunakan teknik
elektroforesis gel poliakrilmida, SDS-PAGE. Gel disusun oleh akrilamida dan
N,N’-metilen – bis – akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme radikal
bebas dengan bantuan katalisator N,N,N’,N’,- tetrametilen diamina (TEMED) dan
inisiator amoniumpersulfat (APS) (Dunn,1989). Prinsip analisis SDS-PAGE yaitu
pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul.
75 kD
Gambar 2. SDS-PAGE protease Lactobacillus acidophilus
Pada sumur no. 4 dan 5 adalah hasil pemurnian dengan kolom Sephadex G-100
yang menunjukan satu pita dengan berat molekul 75 kD. Sedangkan sumur 6 dan
7 merupakan ekstrak kasar protease, dan sumur 8 adalah marker.
Aktivitas spesifik
protease (U/mg)
Penentuan pH Optimum
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
pH
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar.3. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease Lactobacillus
acidophillus pada suhu 370C.
Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya
aktivitas enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya.
Gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk
mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi
besar, perubahan pH akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena
adanya gangguan terhadap berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga
kestabilan struktur tiga dimensi enzim (Hames,et al.2000)
Pengaruh EDTA terhadap aktivitas protease
Tabel.3. Pengaruh EDTA terhadap aktivitas protease Lactobacillus acidophillus
Konsentrasi EDTA (mM)
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
1
8,6
5
1,5
Penggunaan EDTA menunjukkan penuruan aktivitas yang signifikan. Hal ini
menunjukan bahwa EDTA merupakan inhibitor bagi aktivitas enzim tersebut.
Kesimpulan dan Saran
Protease Lactobacillus acidophilus memiliki aktivitas yang sangat rendah
(0,752 U/mg). Karakterisasi biokimia dari protease tersebut meunujukkan pH
optimum 5,5, serta dihambat oleh pengkelat logam EDTA. Hasil pemurnian
dengan kolom Sephadex G -100 menunjukkan satu pita pada SDS-PAGE dengan
ukuran berat molekul sekitar 75 kD
Berdasarkan hasil karakterisasi dapat memberikan informasi untuk
penelitian lebih jauh dalam bidang bioteknologi pangan dan disarankan untuk
mengkaji lebih jauh tentang karakter gen yang menyandikan protease tersebut.
Ucapan Terimakasih
Penulis ucapkan terimaksih sebesarnya kepada semua pihak yang berperan demi
terselesainya penelitian ini, khususnya bagi Lembaga Penelitian Universitas
Padjadjaran yang memberikan pendanaan.
DAFTAR
PUSTAKA
Bradford,MM.1976.A rapid and sensitive method for quantitation of protein
utilization. The principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.
72:248-254
Dunn MJ.1989.Electrophoretic analysis methods. Di dalam E.L.V. Harris
ELV,Angal S,editor. Protein Purification Methods. A Practical
Approach. Oxford:IRL Press.hlm 18-40.
Hames BD, Hooper NM.2000, Biochemistry.The instant Notes. Ed ke-2.
Hongkong: Spinger,Verlag.hlm.83-84.
Laemmli UK.1970 Cleavage of structural protein during the assembly of head
of bacteriophage T-4. Nature:227:680-685
Mangunwidjaja.D,Suryani.A,1994.Teknologi Bioproses.Penebar
Swadaya.Jakarta
Walter HE.1984.Method with haemoglobin, casein, and azocoll as substrate
In. Bergmeyer. HU (ed). Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie.
Deerfield Beach Florida Basel.