Studi Inhibisi Faktor Virulens Mycobacterium tuberculosis (Mtb) “Protein Tirosin Fosfatase A (PtpA)” dengan Inhibitor Asam Lemak Eikosenoat - Repository UNRAM

  Studi Inhibisi Faktor Virulens Mycobacterium tuberculosis (Mtb ) “Protein Tirosin Fosfatase A

  sebesar 17,51 μM dan Asam lemak trans-2-eikosenoat sebesar

  eicosenoic fatty acid derivatives as potential inhibitors for Mtb modulator protein.

  17.51 μM and 19.76 μM, respectively. Possible interaction between PtpA with trans-2-eicosenoic fatty acid was shown by docking assay that revealed that trans-2-eicosenoic fatty acid that was found forming polar hydrogen bond with residues Arg30, Thr41, and Gly35, and unknown interaction between trans-2-eicosenoic fatty acid with residues Arg39 and Thr69. All together, these finding suggests a possibility to explore

  

eicosenic fatty acid are able to inhibit PtpA, whereas insignificant inhibition is shown by

trans-11-eicosenoic fatty acid . Furthermore, trans-2-eicosenoic fatty acid and cis-2-eicosenoic

fatty acid have IC 50 value of

  This research is a preliminary study of PtpA inhibition with eicosenoic acids. PtpA is a virulence factor of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) that responsible for latent Mtb infection. Prior to inhibition assay, expression of PtpA was confirmed by SDS-PAGE analysis, and time course profile or PtpA activity in hydrolyzing pNPP substrate was determined. Inhibition assays showed that both trans-2-eicosenoic fatty acid and cis-2-

  

Kata Kunci : Protein tirosin fosfatase A, Asam lemak eikosenoat, Mycobacterium

tuberculosis Abstract

  19,76 μM, serta Asam lemak trans-11-eikosenoat dapat menginhibisi PtpA namun tidak signifikan. Selain itu, penelitian ini menghasilkan docking yang menunjukkan interaksi antara ligand (inhibitor) dengan receptor (enzim) yakni jenis interaksi ikatan hidrogen polar dengan residu asam amino Arg30, Thr41, dan Gly35, serta kemungkinan interaksi lain juga terjadi antara Asam lemak trans-2-eikosenoat dengan asam amino Arg39 dan Thr69. Oleh sebab itu, penemuan ini menunjukkan kemungkinan untuk mengeksplorasi derivat asam lemak eikosenoat sebagai inhibitor yang potensial untuk protein modulator Mtb.

  50

  (PtpA)” dengan Inhibitor Asam Lemak Eikosenoat

  eikosenoat dengan nilai IC

  dilakukan uji inhibisi enzim PtpA oleh senyawa isomer Asam lemak eikosenoat. Didapatkan hasil berupa enzim PtpA dapat diinhibisi secara signifikan oleh senyawa Asam lemak cis-2-

  

course atau penentuan aktivitas PtpA dalam menghidrolisis substrat p-NPP, kemudian

  Telah dilakukan studi inhibisi enzim PtpA yang merupakan protein virulensi dari

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) menggunakan inhibitor Asam lemak eikosenoat.

Beberapa tahap yang dilakukan dalam studi inhibisi adalah dilakukan analisis SDS-PAGE terlebih dahulu untuk mengkonfirmasi ekspresi PtpA, selanjutnya dilakukan penentuan time

  Abstrak

  Baiq Repika Nurul Furqan Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Mataram

  

Key Words: Protein tyrosine phosphatase A, Eicosenoic fatty acid, Mycobacterium

tuberculosis.

  1. PENDAHULUAN

  Penyakit yang masih menjadi masalah utama bagi dunia kesehatan hingga saat ini adalah Tuberkulosis (TB) yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis (Mtb) (Mascarello et al., 2013) yakni mengakibatkan 1,4 juta orang meninggal setiap tahunnya, dan telah menginfeksi secara laten 1/3 populasi dunia (WHO, 2014). TB laten adalah kondisi pada saat Mtb di tubuh sedang dormant (tidur) namun masih hidup. Mtb akan tidur selama tubuh penderita TB laten dapat melawannya dan tidak dapat ditularkan kepada orang lain. Apabila penderita TB laten sedang mengalami penurunan sistem imun, maka

  Mtb akan "bangun" dan berkembang biak yang dikenal dengan TB aktif atau kasus TB (Meena dan Rajni, 2010).

  Dalam keadaan TB laten, bakteri Mtb dapat menginfeksi dan resisten di dalam sel makrofag. Hal ini disebabkan kemampuan Mtb untuk mensekresi beberapa protein virulens seperti: Protein lipoamida dehidrogenase C (PpdC), Protein kinase G (PknG),

  Protein tirosin fosfatase A (PtpA), Protein tirosin fosfatase B (PtpB), dan beberapa protein

  lain yang mampu memodulasi dan mencegah pembentukan fusi fagosom dengan lisosom yang bersifat degradatif terhadap bakteri Mtb (Wiliams, et al., 2010).

  Untuk mengatasi masalah resistensi tersebut, maka diperlukan suatu pencarian target obat baru yakni didasarkan pada inhibisi protein yang disekresi oleh Mtb, sehingga pematangan fagosom dan degradasi Mtb di dalam sel makrofag dapat berlangsung. Salah satu protein Mtb yang banyak dipelajari adalah PtpA yang diketahui mengganggu sinyal makrofag pada pembentukan fagosom-lisosom (Bach et al., 2008).

  Usaha mencegah infeksi laten TB dilakukan dengan pencarian inhibitor bagi PtpA melalui pendekatan biokimia yaitu menguji aktivitas PtpA setelah penambahan inhibitor. Studi terkait mengenai senyawa potensial yang dapat menginhibisi faktor virulensi dari

  Mtb telah dilaporkan oleh Dhanjal et al (2014), yang menggunakan pendekatan

  bioinformatika untuk menemukan senyawa yang dapat menginhibisi PtpB, yaitu asam

  lemak trans-2-eikosenoat (Dhanjal et al, 2014). Dalam beberapa penelitian, senyawa yang

  mampu menginhibisi PtpB juga mampu menginhibisi PtpA (Chiaradia, et al., 2008, Macarello, et al., 2010, dan Mascarello, et al., 2013). Oleh sebab itu, dalam penelitian ini dilakukan inhibisi PtpA dengan Asam lemak trans-2-eikosenoat dan isomernya (Asam

  lemak cis-2-eikosenoat dan Asam lemak trans-11-eikosenoat ) dengan berbagai konsentrasi.

  2. BAHAN DAN METODE

  Bahan- bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak kasar enzim PtpA, NaCl, agar, kanamisin (Bioworld), Buffer Assay (Terlampir), akrilamida (Bio Basic Canada), bis-akrilamida (Bio Basic Canada), Tris-HCl 2 M (Bio Basic Canada), Sodium Dodecyl sulphate (SDS) 10% (Bio Basic Canada), Aquades,

  TEMED (N, N, N’, N’, tetrametilen-etilendiamin) (Bio Basic Canada), APS (ammonium persulfat) (Bio Basic Canada), gliserol 50%,

  • merkaptoetanol (sigma), bromfenol biru (Bio Basic Canada), Buffer lisis, Marker protein (GEhealth), N- butanol, Coomassie Brilliant Blue (CBB) R250 (Sigma), methanol, asam asetat glacial, substrat p-NPP (Sigma), Imidazol 100 mM, miliQ,

  Asam lemak trans-2-eikosenoat (Larodan AB, Swedia), Asam lemak cis-2-eikosenoat

  (Larodan AB, Swedia), Asam lemak trans-11-eikosenoat (Sigma), etanol p.a, ddH

  2 O, Penelitian ini dilakukan dengan menguji inhibisi Protein tirosin fosfatase A (PtpA) dari Mycobacterium tuberculosis (Mtb) dengan melakukan ekspresi gen PtpA dalam E.

  

coli BL21 (DE3) terlebih dahulu. Setelah terekspresi dengan baik, dilanjutkan dengan

menguji inhibitor Asam lemak eikosenoat dalam menginhibisi enzim PtpA.

  Ekspresi PtpA dalam E. coli BL21 (DE3)

  Ekpresi PtpA dikonfirmasi menggunakan alat Elektroforesis gel

  d

  Sodium Dodesil Sulfat (SDS-PAGE) ilakukan dengan metode Laemmli (1970) yang dimodifikasi.

  

Pengukuran konsentrasi protein dengan Spektroskopi Serapan Ultraviolet Nanodrop

  Pengukuran konsentrasi protein menggunakan spektroskopi serapan ultraviolet

  

Nanodrop (A 280nm untuk protein serta A 260nm untuk DNA dan RNA). Disiapkan blanko

  dan protein yang akan diukur konsentrasinya. Kemudian masing-masing diukur menggunakan instrument Nanodrop yang mengukur serapan A 280nm dan A 260nm dari sampel,dan menghitung konsentrasi protein dengan rumus empiris: Konsentrasi Protein (mg/mL) = 1,55A 280nm 260nm (Noble and Bailey, 2009).

  • – 0,76A Penentuan time course.

  Pengujian time course dilakukan dengan memodifikasi metode Mascarello, et al., (2013). Sebanyak 156

  L Imidazol 100 mM, pH 6 dimasukkan ke dalam plate-96 well, kemudian ditambahkan 24 l substrat p-NPP 50 mM, terakhir ditambahkan enzim PtpA sebanyak 20

  L (konsentrasi 1 mg/ml). Setelah itu, dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan alat Multi Skan Go dengan urutan : plate out, pause (user action), plate in, shake (5 detik), inkubasi (2 menit), diatur suhu 37

  C, Kinetik Loop (waktu 2 menit, interval 22 kali), dan Photometric (pada panjang gelombang 410 nm).

  Uji daya inhibisi enzim PtpA oleh Asam lemak eikosenoat.

  Pengujian inhibisi dilakukan dengan memodifikasi metode Mascarello, et al., (2013). Dalam hal ini dilakukan uji inhibisi dengan 3 jenis inhibitor, yaitu Asam lemak trans-2-eikosenoat, Asam lemak cis-2- eikosenoat, dan Asam lemak trans-11-eikosenoat.

  Diambil imidazol 100 mM pH 6 (volume bervariasi, tergantung volume inhibitor, yakni 115,2 µL imidazol untuk 0,8 µL inhibitor; 114,4 µL imidazol untuk 1,6 µL inhibitor; 112,8 µL imidazol untuk 3,2 µL inhibitor; 109,6 µL imidazol untuk 6,4 µL inhibitor; 104 µL imidazol untuk 12 µL inhibitor; 92 µL imidazol untuk 24 µL inhibitor) yang dimasukkan kedalam plate 96-well, kemudian ditambahkan dengan 24 µL substrat p-NPP 50 mM, terakhir ditambahkan 20 µL enzim PtpA (20 mg/ml) dan inhibitor dengan variasi konsentrasi 2 µM (0,8 µL), 4 µM (1,6 µL), 8 µM (3,2 µL), 16 µM (6,4 µL), 30 µM (12 µL), dan 60 µM (24 µL). Diketuk-ketuk pinggiran plate kemudian dimasukkan ke dalam Multiskan GO, yang diatur dengan urutan sebagai berikut: plate out, pause (user action), plate in, shake (5 detik kecepatan medium), inkubasi (2 menit), di atur suhu 37

  C, Kinetik Loop (waktu 2 menit, interval 15 kali), dan photometric (pada panjang gelombang 410 nm).

  Analisis bioinformatika inhibisi PtpA oleh Asam lemak eikosenoat.

  Untuk mengetahui kemungkinan interaksi yang terjadi antara PtpA dengan Asam

  docking . Adapun beberapa software yang digunakan di antaranya: Struktur PtpA telah

  tersimpan didalam Protein Data Bank (PDB) dengan ID 1U2P dan resolusi 2,5 (www.pdb.org). Setelah ID PtpA (1U2P) didapatkan, dilakukan analisis dengan software

  Docking Blaster untuk melihat kemungkinan interaksi enzim dengan Asam lemak eikosenoat , hasilnya kemudian ditampilkan dengan software Chimera 1.10.2. Studi

  bioinformatika ini, dianalisis juga menggunakan Vina Autodock-MGL tools, lalu hasilnya diview menggunakan program Pymol.

3. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekspresi PtpA dalam E. coli BL21 (DE3)

  Hasil analisis SDS-PAGE seperti yang terlihat pada Gambar 1. menunjukkan bahwa gen PtpA yang dibawa oleh plasmid pET30b terekspresi dengan sangat baik di dalam E.

  coli BL21 (DE3). Pita tebal pada lajur 1 dan 2 adalah ekstrak kasar pET30b-PtpA dengan

  berat molekul 18 kDa, yang sesuai dengan penelitian Silva et al., 2015 yang menyatakan bahwa PtpA termasuk dalam kelompok protein posfatase yang memiliki berat molekul rendah (LMW PTPs) yakni hanya sebesar 18 kDa yang dikodekan oleh asam fosfatase gen lokus 1 (ACP1).

  Gambar 1. Gel hasil SDS-PAGE, ekspresi PtpA dalam E. coli BL21 (DE3). Lajur 1&2: ekstrak kasar PtpA. Lajur M: marker protein. Lajur 3: ekstrak kasar E. coli BL21 .

  Berat molekul 18 kDa diindikasikan dengan melihat lajur M yang merupakan marker protein, di mana pada gambar terlihat PtpA sejajar dengan pita marker yang bernilai 18 molekul 18 kDa adalah dengan melihat lajur 3 yang merupakan ekstrak kasar sel E. coli BL21

  (E. coli BL21 yang tidak memiliki enzim PtpA) yang dalam hal ini bertindak sebagai kontrol atau pembanding, di mana pita tebal pada ekstrak kasar PtpA tidak terdapat dalam ekstrak kasar BL21

  . Hal inilah yang mengindikasikan bahwa pET30b- PtpA telah berhasil diekspresikan dengan sangat baik dan kuat di dalam E. coli BL21 (DE3).

  

Pengukuran konsentrasi protein dengan Spektroskopi Serapan Ultraviolet

Nanodrop.

  Ekstrak kasar protein yang sudah di analisis SDS-PAGE ditentukan konsentrasinya dengan metode spektroskopi serapan ultraviolet (dengan panjang gelombang A 280nm untuk protein serta A 260nm untuk DNA dan RNA) menggunakan instrumen Nanodrop. Didapatkan konsentrasi protein sebesar 34.350 μg/mL untuk PtpA dan 66.150 μg/mL untuk BL21

  .

  Penentuan time course.

  Pada penelitian ini, didapatkan nilai aktivitas tertinggi dan terbaik pada penggunaan imidazol 100 M pH 6, ekstrak kasar enzim PtpA 1 g/mL, dan substrat p-NPP 8 mM.

  Adapun untuk waktu inkubasi, didapatkan waktu 30 menit dengan nilai absorbansi 0,713 (Gambar 2) yang sesuai dengan Hukum Lambert-Beer, dimana absorbansi maksimum tidak boleh lebih dari 0,8 sehingga tingkat kesalahan dari penelitian tidak terlalu tinggi.

  2

  1.8

  1.6

  1.4

  1.2

  1 ansi b

  0.8 sor b

0.6 A

  0.4

  0.2

  4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Waktu Inkubasi (menit) Gambar 2. Penentuan time course aktivitas enzim. Uji daya inhibisi enzim PtpA oleh Asam lemak eikosenoat.

  Didapatkan hasil inhibisi untuk Asam lemak trans-2-eikosenoat berturut-turut sebesar

  • 5
  • 5

  36,1 x 10 Unit untuk penambahan 0 Unit untuk penambahan 4 M inhibitor, 26,7 x 10

  • 2
  • 5

  Unit untuk penambahan 16 Unit M inhibitor, 18,6 x 10 M inhibitor, dan 13,2 x 10 aktivitas ekstrak kasar enzim PtpA seiring bertambahnya konsentrasi inhibitor Asam

  

lemak trans-2-eikosenoat (Gambar 2), di mana penurunan ini terjadi cukup signifikan

  dengan penambahan inhibitor dalam ukuran M.

  Adapun aktivitas enzim dapat diketahui melalui persamaan: ( ) ( ))

  ( ( )

  ( ) Di mana enzim turnover number = aktivitas enzim (Unit) x berat molekul enzim

  • 1 -1 dengan :  adalah koefisien extinction (M cm ).

  4 -1 -1

  pNPP = 1,78x 10 M cm (Gresham, et al., 2000)

  

  • 1 -1

  A (cm ) adalah absorbansi pada 410 nm (cm ) V adalah volume akhir pengujian.

  Tabel. 1 Nilai aktivitas PtpA dengan penambahan inhibitor

  Konsentrasi Nilai Aktivitas dengan Penambahan Inhibitor (Unit) Inhibitor Asam lemak trans- Asam lemak cis- Asam lemak trans-

  ( 2-eikosenoat 2-eikosenoat 11-eikosenoat M)

  • 5 -5 -5

  36,1 x 10 36,1 x 10 36,1 x 10

  • 5 -5 -5

  4 26,7 x 10 31,9 x 10 33,3 x 10

  • 5 -5 -5

  16 18,6 x 10 19,9 x 10 38,8 x 10

  • 2 -2 -2

  30 13,2 x 10 7,3 x 10 24,5 x 10 Uji inhibisi PtpA selanjutnya dilakukan dengan Asam lemak cis-2-eikosenoat. Data yang didapatkan tidak jauh berbeda dengan inhibisi menggunakan Asam lemak trans-2-

  

eikosenoat . Seperti yang terlihat pada Tabel 4.1 didapatkan nilai aktivitas berturut-turut

  • 5
  • 5

  sebesar 36,1 x 10 Unit untuk penambahan 0 Unit untuk M inhibitor, 31,9 x 10

  • 5

  penambahan 4 Unit untuk penambahan 16 M inhibitor, 19,9 x 10 M inhibitor, dan 7,3

  • 5

  x 10 Unit untuk penambahan 30 M inhibitor. Penurunan nilai aktivitas tersebut dapat dilihat pada Gambar 3. Untuk data dari pengujian inhibisi PtpA menggunakan Asam

  

lemak trans-11-eikosenoat , didapatkan hasil yang berbeda dengan inhibisi menggunakan

Asam lemak trans-2-eikosenoat dan Asam lemak cis-2-eikosenoat yakni secara berturut-

  • 5

  turut didapatkan nilai aktivitas enzim sebesar 36,1 x 10 Unit untuk penambahan 0 M

  • 5
  • 5

  inhibitor, 33,3 x 10 Unit untuk penambahan 4 Unit untuk M inhibitor, 38,8 x 10

  • 5

  penambahan 16 Unit untuk penambahan 30 M inhibitor, dan 24,5 x 10 M inhibitor

  (Tabel 1). Nilai aktivitas yang masih naik turun (Gambar 3) menunjukkan ketidakstabilan dari Asam lemak trans-11-eikosenoat dalam menginhibisi ekstrak kasar enzim PtpA.

  Berdasarkan uraian perbandingan nilai aktivitas oleh ketiga inhibitor di atas, maka dapat diketahui bahwa inhibitor Asam lemak cis-2-eikosenoat dan Asam lemak trans-2-

  

eikosenoat memiliki kemampuan menginhibisi yang signifikan, sedangkan Asam lemak

trans-11-eikosenoat tidak signifikan dalam menginhibisi PtpA. Hal tersebut menunjukkan

  bahwa perbedaan posisi ikatan rangkap atom karbon pada senyawa asam lemak eikosenoat lebih berpengaruh dibandingkan dengan perbedaan posisi cis dan trans nya, karena posisi ikatan rangkap pada atom C nomor 2 memiliki halangan sterik yang lebih kecil untuk berikatan dengan enzim PtpA sehingga memungkinkan enzim PtpA untuk berikatan sterik yang cukup besar sehingga kemungkinan inhibitor ini tidak mudah berinteraksi dengan enzim PtpA (Kozt, 2006). Untuk lebih memudahkan membaca kekuatan inhibisi dari ketiga inhibitor, maka nilai aktivitas dikonversi menjadi %inhibisi dengan nilai pada Tabel 2.

  40

  38

  36

  34

  32

  30

  28

  26

  24 )

  • -5

  22

  20

  10

  18 (

  16 s a

14 Trans 2

  it

  12 (Unit)

  10 tiv

  Cis 2

  8

  6 Ak

  4 Trans 11

  2

  4

  16

  30 Gambar 3. Nilai aktivitas enzim PtpA dengan Asam lemak trans-2-eikosenoat, Asam lemak cis-2-eikosenoat, dan Asam lemak trans-11-eikosenoat.

  

Tabel 2. Persentase inhibisi enzim PtpA dengan 3 isomer senyawa Asam lemak eikosenoat.

  Konsentrasi Nilai Persentase Inhibisi dengan Penambahan Inhibitor (%) Inhibitor Asam lemak trans-2- Asam lemak cis-2- Asam lemak trans-

  ( eikosenoat eikosenoat 11-eikosenoat M) 4 26,04 11,69 7,65

  16 48,43 44,98 -7,45 30 63,32 79,56 32,11 Adapun %inhibisi tersebut, didapatkan dengan rumus:

  % Inhibisi PtpA = [(A-B)

  • – (C-D)/(A-B)] x 100% Dengan A adalah absorbansi enzim tanpa penambahan inhibitor, B adalah absorbansi blanko tanpa penambahan inhibitor, C adalah absorbansi enzim dengan penambahan inhibitor, D adalah absorbansi blanko dengan penambahan inhibitor.
Dari Tabel 2 dapat dilihat bahwa pada inhibitor Asam lemak trans-2-eikosenoat dan asam

  

lemak cis-2-eikosenoat semakin besar konsentrasi inhibitor yang ditambahkan maka daya

  inhibisinya semakin besar. Sementara itu untuk Asam lemak trans-11-eikosenoat, pada konsentrasi 16 μM memiliki daya inhibisi dengan nilai negatif. Pada konsentrasi sampel yang sama, ketiga sampel memperlihatkan daya inhibisi yang berbeda-beda.

  92

  82

  72 i

  62 is

  52 ib h trans 2

  42 n

  32 cis 2

  % I

  22

  12 trans 11

  2

  30

  • 8

  16

  4 Gambar 4. Inhibisi enzim PtpA dengan 3 Asam Lemak Eikosenoat.

  Data yang ditunjukkan oleh ketiga variasi konsentrasi inhibisi yang diuji (4, 16, dan 30 μM) memperlihatkan bahwa Asam lemak cis-2-eikosenoat dan Asam lemak trans-2-

  eikosenoat memiliki daya inhibisi lebih kuat dengan penurunan nilai aktivitas yang lebih

  signifikan dibandingkan Asam lemak trans-11-eikosenoat (Gambar 4). Perbedaan daya inhibisi ini diduga karena adanya perbedaan aktivitas biologi akibat perbedaan cis dan

  trans serta perbedaan letak ikatan rangkap atom C dari ketiga senyawa isomer tersebut

  yang berfungsi sebagai inhibitor ekstrak kasar enzim PtpA (Chang, 2001). Menurut Kim

  et al., (2004) nilai IC 50 penting diketahui untuk menentukan berapa besar potensi

  inhibitor dalam menginhibisi reaksi enzimatis. Untuk menentukan nilai IC

  50 maka

  dibuatlah kurva hubungan konsentrasi inhibitor dengan aktivitas inhibisi untuk asam

  lemak cis-2-eikosenoat seperti yang terdapat pada Gambar 5, dan kurva hubungan

  konsentrasi inhibitor dengan aktivitas inhibisi untuk asam lemak trans-2-eikosenoat seperti yangterlihat pada Gambar 6.

  Adapun dalam penelitian ini didapatkan nilai IC

  50 dari Asam lemak-cis-2-eikosenoat

  sebesar 17,51

  50 dari Asam lemak-trans-2-eikosenoat sebesar 19,76

  μM, dan nilai IC μM. Nilai IC yang didapatkan pada penelitian ini menunjukkan bahwa Asam lemak-cis-2-

  50 eikosenoat dan Asam lemak-trans-2-eikosenoat berpotensi untuk dijadikan inhibitor

  enzim PtpA dengan kategori inhibitor kuat. Hal ini sesuai dengan teori yang menyatakan

  IC

  50 adalah bilangan yang menunjukkan konsentrasi senyawa inhibitor (dalam semakin tinggi aktivitas senyawa inhibitor. Suatu senyawa dikatakan sebagai inhibitor sangat kuat jika nilai IC

  50 kurang dari 50

  M, kuat 50-100 M, sedang 100-150 M, dan lemah 151-200 M (Rinidar et al., 2013). Selain itu, hasil tersebut menunjukkan senyawa dan asam lemak-cis-2-eikosenoat berhasil menginhibisi

  asam lemak trans-2-eikosenoat ekstrak kasar enzim PtpA juga dibuktikan dengan merujuk hasil penelitian Mascarello et.

al. (2010) yang menyatakan aktivitas inhibitor dari senyawa alami naftilchalcones

  berpotensi sebagai inhibitor PtpA dengan nilai IC

  50 sebesar 8,4 i

  • – 53,7 M (rentang K dari 5 sampai 21

  M) sehingga dapat dikatakan aktivitas penghambatannya signifikan terhadap pertumbuhan Mtb di makrofag yang terinfeksi (Mascarello et. al., 2010).

  90.0

  80.0

  70.0 y = 2.6491x + 3.5928

  60.0 R² = 0.9679 isi

  50.0 ib h

  40.0 In %

  30.0

  20.0 IC 50

  10.0

  0.0

  0.0

  10.0

  20.0

  30.0

  40.0 Konsentrasi Inhibitor (µM) Gambar 5. Penetuan IC 50 Asam lemak cis-2-eikosenoat terhadap PtpA.

  100.0

90.0 y = 1.8839x + 12.783

R² = 0.8242

  80.0

  70.0

  60.0 isi ib

  50.0 h In

  40.0 %

30.0 IC

  5

  20.0

  10.0

  0.0

  0.0

  10.0

  20.0

  30.0

  40.0 Konsentrasi Inhibitor (µM)

Gambar 6. Penetuan IC Asam lemak trans-2-eikosenoat terhadap PtpA.

  50

  Analisis bioinformatika inhibisi PtpA oleh Asam lemak eikosenoat.

  Gambar 7. Interaksi enzim PtpA dengan Asam lemak trans-2-eikosenoat.

  Hasil docking pada Gambar 7 menunjukkan interaksi antara enzim PtpA (molekul kecil berwarna hijau) dengan Asam lemak trans-2-eikosenoat (molekul besar warna- warni) secara kasar, yakni adanya interaksi ikatan hidrogen dari ligan Asam lemak trans- 2-eikosenoat dengan reseptor enzim PtpA.

  Hasil dari docking menggunakan Autodock Vina-MGL Tools juga menunjukkan interaksi antara ligand dan receptor dengan jenis interaksi ikatan hidrogen polar dengan residu asam amino Arg30, Thr41, dan Gly35. Kemungkinan interaksi lain terjadi antara

Asam lemak eikosenoat dengan residu asam amino Arg39 dan Thr69 (Gambar 8 dan 9).

Hasil tersebut merujuk pada hasil penelitian Dhanjal et al (2014) yang menyatakan salah satu satu senyawa senyawa isomer asam lemak eikosenoat yakni asam lemak trans-2-

  

eikosenoat memiliki jenis interaksi dengan PtpB (memiliki kemiripian struktur dengan

  PtpA) seperti ikatan hidrogen dengan residu Arg63 and Arg210, ikatan hidrofobik dengan residu Phe80, Pro81, Met126, Phe133, Ile203, Met206, Leu227, Val231 dan Leu232, serta ikatan van der Waal dengan residu Lys164, Asp165 dan Arg166.

  

Gambar 8. Interaksi hidrogen polar ligan-reseptor.

Gambar 4.11 Kemungkinan interaksi lain Gambar 9. Kemungkinan interaksi lain.

4. PENUTUP Kesimpulan

  Diperlukan analisis lebih lanjut tentang studi docking dari enzim PtpA dengan senyawa Asam lemak eikosenoat sebagai inhibitor.

  Dari penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan: a.

  Ekstrak kasar enzim PtpA dapat diinhibisi dengan senyawa Asam lemak cis-2-

  eikosenoat dengan nilai IC 50 sebesar

  17,51 μM dan Asam lemak trans-2-eikosenoat sebesar 19,76 μM. Isomer Asam lemak eikosenoat lain yaitu Asam lemak trans-11-

  eikosenoat tidak dapat menginhibisi PtpA secara signifikan.

  b.

  Interaksi enzim PtpA dengan senyawa Asam lemak eikosenoat dapat dianalisis dengan studi bioinformatika. Analisis tersebut menunjukkan adanya interaksi ikatan hidrogen polar dari inhibitor dengan residu asam amino Arg30, Thr41, dan Gly35. Kemungkinan interaksi lain juga terjadi antara inhibitor dengan residu asam amino Arg39 dan Thr69.

  Saran

  Saran-saran yang dapat disampaikan oleh penulis adalah: a.

  Diperlukan analisis lebih lanjut tentang studi inhibisi dari enzim PtpA yang sudah dimurnikan dengan senyawa Asam lemak eikosenoat sebagai inhibitor.

  b.

DAFTAR PUSTAKA

  Abdalla, A.E., Q. Li, L. Xie, dan X. Jianping.2015. Biology of IL-27 and its Role in the Host

  Immunity against Mycobacterium Tuberculosis. Int J Biol Sci. 11(2): 168

  • –175 Bach, H., K.G. Pavavinasasundaram, D. Wong, Z. Hmama, dan Y. Av-Gay.2008.Mycobacterium

  tuberculosis Virulence Is Mediated by PtpA Dephosphorylation of Human Vacuolar Protein Sorting 33B 5):316-22

  Castillo, C.C., dan B. Song.2004.Dinamical Models of Tuberculosis and Their Aplication. Math.

  Biosci. and Eng. 361-404 Chang, R. 2004. Kimia Dasar Konsep-Konsep Inti Edisi Ketigaa Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

  Chiaradia, L.D., A. Mascarello, M. Purificação, J. Vernal, M.N. Cordeiro, M.E. Zenteno, A.

  Villarino, R.J. Nunes, R.A. Yunes, dan H. Terenzi.2008.Synthetic chalcones as efficient

  inhibitors of Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase PtpA . Bioorganic

  & Medicinal Chemistry Letters 18: 6227

  • –6230 Depkes RI.2010.Profil KesehatanIndonesia 2010.Jakarta : Kementrian Kesehatan RI. Dhanjal, J.K., G. Sonam, S. Sudhanshu, S.K. Ajeet, dan G. Abhinav.2014.Structural Insights

  into Mode of Action of Novel Natural Mycobacterium Protein Tyrosine Phosphatase B Inhibitors. Dhanjal et al . BMC Genomics, 15(Suppl 1):S3.

  http:www.biomedicentral.com/1471-2164/15/S1/S3 Gresham, H. dan C.L. Willman.2000. Negative Regulation of Phagocytosis in Murine Macrophages

  by the Src Kinase Family Member, Fgr . J Exp Med.191(3): 515

  • –528 Jaji.2012.Upaya Keluarga dalam Pencegahan Penularan Tuberkulosis (Tb) Paru ke Anggota

  Keluarga Lainnya Di Wilayah Kerja Puskesmas Sidorejo Pagaralam Tahun 2010 .Palembang : Universitas Sriwijaya.

  Jalili, V., M. Matteuci, M. Masseroli, dan M.J. Morelli.2015.Using combined evidence from

  replicates to evaluate ChIP-seq peaks. Bioinformatics.31 (17): 2761-2769 Kim, Y.J., K.J. Kyung, J.H. Lee, dan H.Y. Chung.2004.

  “4-4’-Dihydroxybiphenyl as a New Potent Tyrosinase Inhibitor”. J. Biol. Pharm. Bull. 28 (2) 323-327

  Kotz, J.C. 2006. Chemistry and Chemical Reactivity. Canada: Thomson Learning Academic Resource Center. Krupakaran, P.R., dan S. Arunkumar.2014.Sds-Page Analysis of Serum Proteins In Giriraja Fowl .India : Veterinary College and Research Institute. Laemmli, U.K.1970.Cleavage of Structural Protein During The Assembly of The Head of

  Bacteriophage : Nature (227) 680-685

  Meena. L.S., dan Rajni.2010. Survival Mechanisms of Pathogenic Mycobacterium tuberculosis

  H37Rv. FEBS Journal 277, 2416 –2427.

  Mascarello, A., L.D. Chiaradia, J. Vernal, A. Villarino, R.V.C. Guido, P. Perizzolo, V. Poirier, D. Wong, P.G.A. Martins, R.J. Nunes, R.A. Yunes, A.D. Andricopulo, Y. Av-Gay, dan H.

  Terenzi.2010.Inhibition of Mycobacterium tuberculosis Tyrosine Phosphatase PtpA by

  syinthetic chalcones: kinetics, molecular modeling, toxicity, and effect on growth . Bioorg

  Med Chem 18: 3783-3789 Mascarello, A., M. Mori, L.D. Chiaradia-Delatorre, A.C.O. Menegatti, F.D. Monache, F. Ferrari,

  R.A. Yunes, R.J. Nunes, H. Terenzi, B. Botta, dan M. Botta.2013.Discovery of

  Mycobacterium tuberculosis Protein Tyrosine Phosphatase B (PtpB) Inhibitors from Natural Products . PLoS ONE 8(10): e77081

  Matthews, J.A., S.O. Dahl, A. Nesje, M.S. Berrisford, dan C.A. Dahl.2000. Holocene glacier

  variations in central Jotunheimen, southern Norway based on distal glaciolacustrine sediment cores*1. Quaternary Science Reviews 19(16): 1625-1647

  Menzies, D., H.A. Jahdali, dan B.A. Otaibi.2010.Recent developments in treatment of latent . Indian J Med Res 133, pp 257-266

  tuberculosis infection Murray, R.K., D.K. Granner, dan V.W. Rodwell.2006. Biokimia Harper edisi 27. Jakarta: EGC.

  McAvoy, T., dan A.C. Nairn.2011. Serine/Threonine Protein Phosphatase Assays. Curr Protoc

  3rd Nester, E.W.2001. Microbiology: A Human Perspective edition . New York: McGraw Hill.

  Ngili, Y.2008.Biokimia: Struktur & Fungsi Biomolekul. Bandung: Graha Ilmu. Noble, J.E., dan M.J.A Bailey.2009.Quantitation of Protein dalam Guide to Protein Purification,

  nd 2 Edition. USA: Academic Press.

  Pant, M., T.K. Nailwal, L.M. Tewari, S. Kumar, P. Kumari, H. Kholia, dan G.

  Tewari.2007.Molecular Characterization of Valeriana Species with PCR, RAPD and SDS PAGE .India : Kumaun University. Poedjiadi, A. 2012. Dasar-Dasar Biokimia.Jakarta : UI-Press. Rinaldhi, R.2012. sikmalaya: STIKES BTH. Savalas, L.R.T., A. Nurunnisa, dan H. Mulyasari.2013.Konstruksi dan Ekspresi Protein Tirosin

  Fosfatase A (PtpA) dari Mycobacterium tuberculosis. RD-2013-1343: 2

  Scopes, R.K.1994.Protein Purification: Principles and Practice. New York: Springer Verlag, New York. Silva, R.A., M.V. Palladino, R.P. Cavalheiro, D. Machado, B.L. Cruz, E.J. Paredes-Gamero, M.C. Gomes-Marcondes, W.F. Zambuzzi, L. Vasques, H.B. Nader, A.C. Souza, dan G.Z.

  Justo.2015.Activation of the Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase in

  Keratinocytes Exposed to Hyperosmotic Stress :e0119020 Sukardi.1994.Metodologi Penelitian.Jakarta: Balai Pustaka.

  Sukma, L.N., Zackiyah, dan G.G. Gumilar.2010.Pengkayaan Asam Lemak Tak Jenuh pada

  Bekatul dengan Cara Fermentasi Padat mengggubakan Aspergillus terreus .Bandung : Universitas Pendidikan Indonesia.

  Sylvia, A.P., dan L.Mc.C. Wilson.2005.Patofisiologi Konsep Klinik Proses-Proses Penyakit.Buku 2 Edisi4 . Jakarta : EGC. Trott, O., dan A.J. Olson.2010. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking

  with a new scoring function, efficient optimization and multithreading .

  

  • Williams, B.G., dan C. Dye.2010. The population and control of tuberculosis. Science 328:856-

  861 World Health Organization (WHO). 2012.Tuberculosis Control in south

  • – east asia region and western pacific region.


Dokumen baru

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

64 1408 16

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

23 374 43

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

24 333 23

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

6 211 24

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

18 310 23

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

27 416 14

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

21 379 50

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

8 229 17

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

13 387 30

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

21 441 23