Isolasi DNA Genom dan Amplifikasi Gen rpoB Mycobacterium tuberculosis dari Sputum Pasien Positif Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) - Universitas Negeri Padang Repository

  

Isolasi DNA Genom dan Amplifikasi Gen rpoB Mycobacterium tuberculosis dari Sputum

Pasien Positif Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA)

Yuni Ahda, Hesti Riany, Dwi Hilda Putri

  

Jurusan Biologi FMIPA Univ. Negeri Padang

Abstrak

  Tuberculosis (TB) merupakan penyakit serius yang dihadapi dunia kesehatan. Masalah ini diperparah dengan meningkatnya kasus multi drug resistence (MDR) TB. Resistensi terjadi karena adanya mutasi pada daerah gen rpoB bakteri Mycobacterium tuberculosis. Untuk mengetahui ada atau tidaknya mutasi pada gen rpoB, harus dilakukan isolasi DNA genom M.tuberculosis dan amplifikasi gen rpoB. Secara umum isolasi DNA genom M.tuberculosis dilakukan dari bakteri hasil kultur. Namun teknik ini memerlukan waktu relatif lama dan biaya yang cukup besar sehingga perlu difikirkan cara lain untuk menghemat waktu dan biaya. Penelitian ini bertujuan mendapatkan cara isolasi DNA genom M.tuberculosis langsung dari sputum penderita TB dan mendapatkan gen rpoB dari DNA genom hasil isolasi. Isolasi langsung dari sputum pasien yang positif tes basil tahan asam (BTA) dilakukan dengan metode pemanasan dan dilanjutkan dengan amplifikasi gen rpoB dengan teknik PCR. Kemurnian dan konsentrasi DNA genom M.tuberculosis hasil isolasi langsung dari sputum dianalisis menggunakan spektrofotometer sedangkan hasil amplifikasi gen rpoB dianalisis menggunakan gel agarosa 1%. Isolasi langsung DNA genom M.tuberculosis dari sputum pasien positif BTA dan amplifikasi gen rpoB telah berhasil dilakukan. Isolasi berhasil dilakukan terhadap 53 sampel, namun hanya 26 sampel yang berhasil diampilifikasi untuk gen rpoB. Hasil analisis kemurnian dan konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer menunjukkan perbedaan yang kecil antara DNA genom yang berhasil diamplifikasi gen rpoBnya dan yang tidak. Dari hasil penelitian ini diduga masih terdapat inhibitor yang mengganggu proses amplifikasi.

  PENDAHULUAN

  Tuberkulosis merupakan masalah serius yang dihadapi dunia kesehatan, pembunuh orang dewasa kedua setelah penyakit kardiovaskuler. Tuberkulosis disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis. Sampai saat ini tidak ada satu negarapun di dunia yang bebas TB. Setiap tahun terdapat 8 juta kasus TB baru dan diduga bisa meningkat menjadi 16 juta kasus dengan tingkat kematian 3 juta orang tiap tahunnya (Tjandra, 2004). Data WHO menunjukkan bahwa Indonesia adalah Negara dengan kasus TB nomor 3 terbesar di dunia setelah Cina dan India (Matroni, 2005). Setiap tahun jumlah penderita TB baru lebih kurang 262.000 orang dengan jumlah total penderita 583 orang. Diperkirakan 140.000 orang Indonesia meninggal per tahun akibat tuberculosis (Tjandra, 2004). Kasus multi drug resistence (MDR) ikut menambah jumlah penderita TB di Indonesia. WHO memperkirakan ada 425.000 kasus MDR TB setahun (Tjandra, 2006; Geo, 2001). Multi drug resistence adalah kondisi dimana penderita TB resisten terhadap dua obat anti tuberculosis primer yaitu rifampisin dan isoniazid. Lebih dari 95% resistensi rifampisin terjadi karena adanya mutasi pada daerah 81-bp-hot-spot (kodon 507-533) gen rpoB M.tuberkulosis.

  Untuk mengetahui adanya mutasi pada daerah 81-bp-hot-spot, perlu disediakan DNA M.tuberkulosis terlebih dahulu. Selama ini isolasi genom M.tuberculosis dilakukan dari bakteri hasil kultur melalui teknik boiling (Yuliati, 2005; Donna, 2005). Namun kendalanya kultur M.tuberculosis jarang dilakukan karena harga medium yang mahal dan waktu pertumbuhan bakteri yang lama (2-3 minggu) (Robert, 1994). Oleh karena itu diupayakan melakukan isolasi DNA M.tuberculosis langsung dari sputum pasien positif tes BTA. Hasil penelitian Mursyida (2007) menunjukkan adanya pertumbuhan M.tuberculosis pada sputum yang dihomogenisasi. Penelitian ini bertujuan mendapatkan prosedur isolasi DNA genom Mycobacterium tuberculosis dari sputum pasien positif pewarnaan basil tahan asam (BTA).

  Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium mikrobiologi dan bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA UNP dan laboratorium Mikrobiologi FKUI pada bulan Maret

• – Mei 2008.

  Sampel Penelitian

  Sampel dalam penelitian ini adalah sputum dari pasien TB positif BTA yang dikoleksi dari Rumah Sakit Paru Lubuk Alung, Puskesmas Air Tawar Barat dan Balai Laboratorium Kesehatan Padang.

  Pelaksanaan Penelitian

  Isolasi DNA genom bakteri dari sputum Isolasi DNA genom bakteri dilakukan dengan metoda pemanasan, dimana satu bagian sputum dimasukkan ke tabung reaksi yang sudah berisi 1,5 bagian NaOH 4%. Campuran lalu divorteks selama 10 menit bersama dengan bola-bola kaca untuk menghomogenkan. Campuran selanjutnya diinkubasi pada suhu 37C selama 15 menit, lalu disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dari proses sentrifugasi selanjutnya dibuang dan pellet dilarutkan dengan 400 ul 1/5 x buffer TE, divorteks, kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk selanjutnya dibuang dan pellet dilarutkan dengan 100 ul 1/5 x buffer TE. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 100C selama 30 menit untuk memisahkan DNA dan menonaktifkan bakteri. Campuran selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan disimpan pada suhu -20C sampai digunakan untuk tahap berikutnya.

  Amplifikasi gen rpoB dengan PCR

  Amplifikasi dilakukan menggunakan sepasang primer yaitu: primer forward (rpo Bfor) 5’-TGC TCC GCT TGC ACG AGG GTC AGA-

  3’ dan primer reverse (rpoBrev) 5’- CTC AGG GGT TTC GAT CGG GCA CAT -3’ (Victor et al., 1999). Dua setengah mikroliter DNA sampel diamplifikasi dalam campuran 36,85 ul H2O, 5 ul 10x buffer, 1 ul MgCl2, 4 ul dNTP, 0,15 ul Taq DNA polymerase dan masing-masing 0,25 ul rpoBfor dan rpoBrev. Amplifikasi dilakukan sebanyak 45 siklus dengan temperatur PCR 94C selama 1 menit (denaturasi), 58C selama 1 menit (annealing), 72C selama 1 menit (elongasi). Pada akhir siklus, proses elongasi diperpanjang selama 10 menit (Victor et al., 1999).

  Pengukuran konsentrasi DNA

  Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi ditentukan dengan rumus: [DNA] = A260 x 50 x faktor pengenceran Dimana A260 = nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm; 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml.

  Kemurnian DNA diketahui dengan mengukur perbandingan rasio absorbansi (OD) pada panjang gelombang 260 dan 280 (Fatchiyah dkk., 2008; Sambrook et al., 1989).

  Teknik Analisis Data

  Data dianalisis secara deskriptif berupa persentase gen rpoB yang dapat diamplifikasi, konsentrasi dan kemurnian dari DNA genom Mycobacterium tuberculosis hasil isolasi dari sputum.

  HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi dan Amplifikasi

  Jumlah sputum BTA positif yang berhasil dikoleksi dari laboratorium Rumah Sakit dan Puskesmas dari tanggal 27 Maret sampai 8 April 2008 adalah sebanyak 53 sampel. Kepada setiap sampel selanjutnya dilakukan isolasi DNA genom. Karena DNA genom hasil isolasi memiliki konsentrasi yang sangat rendah maka tidak dilakukan elektroforesis terhadap DNA genom. Untuk membuktikan apakah isolasi DNA genom berhasil dilaksanakan, maka hasil isolasi digunakan sebagai cetakan dalam reaksi PCR. Hasil amplifikasi selanjutnya dianalisis dengan teknik elektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Hasil elektroforesis dapat dilihat pada Gambar 1.

  Hasil elektroforesis pada Gambar 1 menunjukkan adanya pita tunggal pada beberapa sampel yang diamplifikasi (sampel 1, 4, 18, 16, 32, 44 dan 42; sumur 1 - 6), dan sebaliknya tidak ada pita yang muncul pada beberapa sampel yang lain (sampel 53 dan 48; sumur 7 dan 8). Hasil perbandingan posisi pita dengan marker 50 bp DNA ladder menunjukkan bahwa pita hasil amplifikasi berada di antara marker 400 bp dan 450 bp. Berdasarkan hal tersebut dapat diyakini bahwa DNA yang teramplifikasi adalah fragmen gen rpoB karena panjang pita yang diharapkan adalah 412 bp. Secara keseluruhan, dari 53 sampel yang ada, 26 sampel (49,1%) di antaranya berhasil diamplifikasi (mengasilkan PCR positif) dan 27 sampel (50,9%) lainnya tidak berhasil diamplifikasi (menghasilkan PCR negatif). Dari data tersebut terlihat hanya separoh dari seluruh sampel yang ada yang dapat dilacak keberadaan DNA genom M.tuberculosisnya. Hal ini sekaligus juga menunjukkan bahwa tingkat keberhasilan amplifikasi gen rpoB M.tuberculosis dari DNA genom yang diisolasi langsung dari sputum cukup rendah.

  450 bp 412 bp 400 bp 50 bp

  Gambar 1. Visualisasi hasil elektroforesis pada agarosa 1%. Sumur 1 – 8 adalah sampel uji dengan nomor sampel berturut-turut 1, 4, 18, 16, 32, 44, 42. Sumur 9 adalah kontrol negatif dan sumur 10 adalah marker DNA ladder 50 bp.

  Analisis Konsentrasi dan Kemurnian DNA Genom Hasil Isolasi

  Untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasi DNA genom M. tuberculosis hasil isolasi langsung dari sputum, maka sebanyak masing-masing empat sampel DNA hasil isolasi yang menghasilkan PCR positif dan negatif diambil secara acak, selanjutnya dianalisis menggunakan spektrofotometer. Hasil analisis dengan spektrofotometer dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Konsentrasi dan Tingkat Kemurnian DNA Genom M. tuberculosis Hasil Isolasi Langsung dari Sputum dari

  Beberapa Sampel yang Diuji No. Sampel Konsentrasi DNA Kemurnian DNA Hasil PCR

  (ng/ul)

  60 1,57

• 4

  6

• 60 1,57

  36 60 1,33 +

  44 50 1,50 +

  20 4,00

• 22

  24

• 60 1,50

  39 20 3,00 -

  49 30 5,00 - Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa konsentrasi DNA genom M. tuberculosum hasil isolasi berkisar dari 20 ng/ul sampai 60 ng/ul dengan tingkat kemurnian dari 1,57 sampai 5,00.

  PEMBAHASAN

  Untuk mengisolasi DNA genom dari suatu sel bakteri dapat dilakukan dengan berbagai cara, salahsatunya yang cukup sederhana adalah dengan teknik pemanasan (Donna, 2005). Menurut Technical Manual Wizard Genomic DNA Purification Kit dengan memanaskan bakteri dapat melisis dinding sel. Berdasarkan Pelozar (2005) dan Stansfield (1991), bakteri (M. tuberculosis) termasuk kedalam protista prokariotik yang tidak mempunyai kromosom diskrit (tersendiri), nukleolus, dan membran nukleus. DNA didalam sel menempati posisi dekat pusat sel, sehingga tidak diperlukan komponen kimia untuk melisis komponen selain dinding sel dan membrane sel, sehingga dapat diprediksi dengan lisisnya dinding sel DNA genom bakteri dapat diisolasi, hal ini telah dilakukan terhadap Staphylococcus aureus (Yuliati, 2005) dan M. turberculosis (Donna, 2005) langsung dari kultur.

  Keberhasilan reaksi PCR mengamplifikasi gen rpoB dari beberapa DNA hasil isolasi menunjukkan bahwa genom DNA M. tuberculosis dapat diisolasi langsung dari sputum, terdapat DNA genom hasil isolasi yang PCR positif sebanyak 26 sampel (49,1%). Sedangkan adanya hasil reaksi PCR DNA genom M tuberculosis hasil isolasi langsung dari sputum yang memperlihatkan PCR negatif (50,9%) lebih tinggi persentasenya dari PCR positif menunjukkan bahwa tingkat keberhasilan mengamplifikasi cukup rendah hal ini disebabkan ada perbedaan persentase yang tidak diharapkan (PCR negaitif lebih tinggi dari PCR positif) padahal diharapkan seluruh hasil reaksi PCR ini sama (PCR positif) kerena dalam penelitian ini digunakan teknik isolasi, teknik amplifikasi, teknik analisis dan komponen yang sama pada seluruh sampel dalam penelitian ini. Rendahnya hasil amplifikasi dengan PCR diduga disebabkan oleh berbagai faktor, diantaranya adalah perbedaan konsentrasi dan kemurnian DNA sampel yang akan diamplifikasi, adanya pengotor yang bersifat inhibitor masih tersisa pada DNA genom hasil isolasi yang akan diamplifikasi atau karena sampel yang diamplifikasi itu sendiri tidak mengandung DNA.

  Menurut Brown (2002) dan Fatchiyah, dkk. (2008), faktor yang mempengaruhi keberhasilan proses amplifikasi pada PCR dapat juga berupa konsentrasi enzim Taq polymerase, dNTP, konsentrasi magnesium, primer, waktu dan suhu denaturasi, jumlah siklus dan komponen PCR lain. Namun adanya beberapa sampel DNA yang bisa diamplifikasi menunjukkan bahwa factor di luar cetakan tidak mempengaruhi reaksi PCR. Pada awalnya perbedaan konsentrasi dan kemurnian DNA sampel hasil isolasi langsung dari sputum yang merupakan cetakan pada proses PCR ini diduga mempengaruhi reaksi amplifikasi (Fatchiyah, dkk. 2008). Namun berdasarkan hasil analisis konsentrasi dan kemurnian DNA menggunakan spektrofotometer DNA pada DNA sampel antara sampel yang PCR positif dan PCR negatif tidak memperlihatkan perbedaan jelas, seperti yang terlihat pada Tabel 1 dari sampel no. 4 yang diketahui PCR positif dan sampel no. 24 yang terdeteksi PCR negatif memiliki tingkat konsentrasi yang sama yaitu 0,06 mikrogram/ml dan kemurnian sampel no. 44 dan no. 24 yang masing-masingnya terdeteksi PCR positif dan PCR negatif juga memiliki tingkat kemurnian yang sama yaitu 1,50. Berdasarkan penelitian Yuliati (2005), konsentrasi DNA yang berkisar dari 60 ng/mikroliter-160 ng/mikroliter dapat diamplifikasi, bahkan pada Certificate of Analysis Hot Start Tag DNA Polymerase dinyatakan konsentrasi 10pg/50µl-0,5pg/50µl juga masih dapat diamplifikasi dengan PCR dan menurut Sambrook (1998), tingkat kemurnian DNA yang baik berada pada rentang 1,8-2 jika dilakukan penghitungan setelah diukur dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dan menurut Brown (2002) rasio yang kurang dari 1,8 menunjukkan bahwa DNA telah terkontaminasi baik oleh fenol maupun protein. Pada penelitian ini nilai kemurnian untuk seluruh sampel yang dianalisis (PCR positif dan PCR negatif) tidak ada yang memiliki kemurnian yang baik. Karena seperti yang terlihat pada Tabel 1 nilai seluruh sampel yang dianalisis tidak ada yang berada pada rentang1,8-2, tapi berada diluar nilai tersebut. Sehingga dapat disimpulkan secara umum bahwa tingkat konsetrasi dan kemurnian tidak mempengaruhi keberhasilan PCR.

  Berdasarkan hasil tersebut, adanya PCR negatif diduga disebabkan oleh komponen DNA hasil isolasi (DNA cetakan) dan diantaranya adalah adanya faktor-faktor yang menjadi pengotor pada DNA hasil isolasi bisa berupa komponen yang ada pada sputum yang digunakan, karena menurut Herdin (1992: 49), pada sputum purulen penderita tuberculosis selain terdapat bakteri M.tuberculosis juga mengandung eritrosit, limfosit, nanah dan protein lain. Pada penelitian yang dilakukan pun, sputum yang digunakan juga ada yang terlihat agak keruh yang kemungkinan tidak hanya mengandung mucus dan saliva saja. Dan kemungkinan faktor-faktor tersebut yang masih belum dapat dibersihkan dari DNA sampel sehingga mempengaruhi kemampuannya.

  Berdasarkan kemungkinan adanya inhibitor pada DNA, dilakukan pemurnian sekali lagi terhadap DNA yang sudah diisolasi (sampel 13 dan 17). Pertama ditambahkan larutan NaOH 3M pH 5,2 untuk menghancurkan membran sel yang masih tersisa. Selanjutnya ditambahkan larutan sodium perklorat untuk menggumpalkan protein tersebut. Untuk presipitasi DNA digunakan ethanol absolut. Pemurnian ulang tersebut menghasilkan produk PCR setelah diamplifikasi dan dielektroforesis. Hal ini menunjukkan bahwa DNA M.tuberculosis pada sampel 13 dan 17 masih tercampur dengan protein dan inhibitor lain pada proses isolasi pertama, dan protein serta inhibitor tersebut hilang setelah proses pemurnian kedua.

  Hasil negatif pada PCR juga dapat disebabkan kesalahan dalam mengidentifikasi sampel sputum. Adanya smear BTA positif palsu menyebabkan tidak terjadinya produk PCR, karena sesungguhnya bakteri M. tuberculosis tidak ada dalam sampel sputum tersebut sehingga tidak tersedia cetakan DNA untuk proses amplifikasi. Kemungkinan ini didasarkan pada hasil kultur yang dilakukan pada beberapa sampel yang diperkirakan mendukung hasil penelitian ini. Pada kultur yang dilakukan terhadap 42 sampel sputum, terdapat 37 sampel yang positif kultur dan 5 sampel negatif kultur yang artinya dari 45 sampel sputum yang dikultur 5 sampel tidak mengandung bakteri M. tuberculosis.

  DAFTAR PUSTAKA Brown TA. 2002. Genomes. Second Edition. BIOS Scientific Publishers Ltd. Oxford. UK.

  Donna M. 2005. Deteksi Mutai Gen Resistensi Isoniazid (katG) dari Micobacterium tuberculosis dengan Teknik Hibridisasi Dot-Blot. Jakarta: Tesis Magister Program Studi Ilmu Biomedik. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

  Geo FB, dkk. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika. Jakarta. Matroni SL. 2005. Informasi Obat-obatan. Restu Agung. Jakarta. Mursyida. 2007. Resistensi Obat Berganda pada Penderita Baru Tuberculosis di Balai Pengobatan Penyakit Paru- paru (BP4) Lubuk Alung Sumatera Barat. Jakarta: Skripsi Sarjana Sains, Fakultas Biologi Universitas

  Nasional Jakarta. Pelczar M dan Chan ECS. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta. Robert U dan Hasrul H. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Binarupa Aksara. Sambrook J and David WR. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

  New York Stansfield WD. 1991. Genetika. Erlangga. Jakarta. Tjandra YA. 2004. Tuberculosis. Kenapa Belum Hilang? diakses tanggal 14 Desember 2007. Tjandra YA. 2006.

  XDR-TB. Jurnal Tuberculosis Indonesia. (online) Vol.

  3 No.

  2 Victor et al. 1999. Detection of Mutation in Drug Resistance Genes of Micobacterium tuberculosis by A Dot Blot Hybridization Strategy. Tubercle and Lung Diseases, 79: 343 – 348. Yuliati, 2005. Deteksi Gen Mec A pada Methilin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) dengan Teknik

  Polymerase Chain Reaction (PCR). Tesis Magister Program Studi Ilmu Biomedik. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.