OPTIMASI VOLUME AIR DAN SUHU DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
OPTIMASI VOLUME AIR DAN SUHU DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh : Virginia Permatasari
NIM : 058114063
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008
OPTIMASI VOLUME AIR DAN SUHU DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh : Virginia Permatasari
NIM : 058114063
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Perjalanan ini telah kulalui Setiap detik Mencandu pelik Menafsir pekik Dan perjalanan ini telah kulalui Karena pinta Karena cerita Karena cinta Sampai kini Jiwaku suka Telah lampaui Telah lewati Terima kasih Untuk mereka yang kupersembahkan karya ini Memberi embun di antara duri Hadiri senyum di antara sepi Keluarga, almamater, dan yang kucintai [Karina]
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Optimasi Volume
Air dan Suhu dalam Proses Maserasi Daun Stevia (Stevia rebaudiana
Bertonii M.) dengan Aplikasi Desain Faktorial”, sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penelitian ini merupakan bagian dari hibah Penelitian Payung yang berjudul “Optimasi Proses Ekstraksi dan Studi Preformulasi Steviosida sebagai Pemanis Pengganti Gula” yang dibiayai oleh Program Hibah PHK-A3 Dikti.
Dalam proses penyusunan skrispsi ini, penulis banyak mendapat bantuan berupa bimbingan, dorongan, sarana, maupun financial dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. PHK-A3 yang telah memberikan kesempatan dan bantuan dalam penelitian ini.
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing I atas bimbingan dan pengarahan selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini.
4. Ibu Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing II atas bimbingan dan pengarahan selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini.
5. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik untuk kesempurnaan skripsi ini.
6. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik untuk kesempurnaan skripsi ini.
7. Bapak Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt., Ibu Dr. Sri Noegrohati, Bapak Dr. Sabikis, Apt., Rm. Drs. Petrus Sunu Hardiyanta, M.Sc., SJ., Bapak Jeffry Julianus, M.Si., dan Bapak Yohanes Martono, S.Si. atas konsultasi selama berlangsungnya penelitian ini.
8. Papi, mami, dan koko tercinta atas seluruh kasih sayang, dukungan, dan perhatian selama ini.
9. Mas Wagiran, Pak Parlan, Mas Bimo, Mas Agung, Mas Andri, dan Pak Kasiran yang telah membantu jalannya penelitian.
10. Teman-teman Penelitian Payung Stevia Siska Romana, Diana, Tyas, Febrian, Retha, Lia, Ferri, dan Totok atas kerja sama tim yang solid.
11. Teman-teman Kos Dewi terutama Siska Suryanto, Dina, Fetri, Nana, Eva, dan Lisa atas persahabatan yang indah selama ini.
12. Teman-teman FST terutama Feli, Aya, Vanny, Omega, Rias, Ong, Rio, Lina, dan Yokhe serta teman-teman FKK terutama Rita, Cory, Dhita, Dewi, Sukma, Ika Reny, Bambang, Yesi, dan Maya atas dukungan dan keceriaan kalian serta suka duka yang telah kita jalani bersama.
13. Sahabat setiaku Karina, Ayu, Riri, Devi, Stella, dan Agatha yang jauh di mata namun dekat di hati yang selalu memberi semangat selama ini.
14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Yogyakarta, Desember 2008 Penulis
INTISARI
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii M.) merupakan suatu tanaman yang mengandung steviosida pada daunnya. Steviosida merupakan senyawa yang memiliki rasa manis. Ekstraksi steviosida dilakukan dengan maserasi menggunakan cairan penyari air dan etanol 96% pada suhu tertentu.
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental menggunakan desain faktorial dengan dua faktor yaitu volume air dan suhu. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan steviosida dengan kadar optimal menggunakan metode desain faktorial dengan dua faktor dan dua level. Penentuan kadar steviosida dilakukan secara densitometri dengan menggunakan program ImageJ di mana program ini dapat menganalisis area under curve (AUC) dari bercak sampel yang dihasilkan pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT).
Analisis hasil dengan Yate’s treatment menunjukkan bahwa nilai F
hitung
dari volume air adalah 36,913; F dari suhu adalah 15,113; dan F dari
hitung hitung
interaksi volume air dan suhu adalah 0,291. F yang digunakan dengan taraf
tabel
kepercayaan 95% adalah 10,128 sehingga dapat disimpulkan yang berpengaruh terhadap kadar steviosida pada proses maserasi adalah volume air dan suhu. Daerah optimal untuk kadar steviosida yang dihasilkan dalam ekstrak menggunakan variasi volume air dan suhu dengan aplikasi desain faktorial adalah 4,01%b/b sampai 9,23%b/b. Kata kunci: daun stevia, steviosida, maserasi, volume air, suhu, desain faktorial, ImageJ, Yate’s treatment, daerah optimal
ABSTRACT
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii M.) is a kind of plant which contains stevioside in each leaves. Stevioside is a compound that has sweet tasted. Extraction of stevioside has to be done by maceration using water and ethanol 96% solvent in conditional temperature.
This research was experimental study using factorial design with two factors, water volume and temperature. The aim of this research was to obtain stevioside with optimal concentration using factorial design with two factors and two levels. Stevioside’s assay has to be done by densitometry using ImageJ, where this program can analyze area under curve (AUC) from sample spot resulted on thin layer chromatography (TLC) plate.
Result analyze using Yate’s treatment showed that the value of F
experimental
of water volume was 36,913; F of temperature was 15,113; and
experimental
F of inteaction water volume and temperature was 0,291. F which is
experimental table
used with significancy 95% is 10,128 so can be concluded that water volume and temperature influence stevioside concentration in maceration process. The optimal area for stevioside’s concentration which was resulted in extracts using water volume and temperature variation with factorial design application was 4,01%w/w to 9,23%w/w. Key word: stevia leaves, stevioside, maceration, water volume, temperature, factorial design, ImageJ, Yate’s treatment, optimal area
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL..................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING............................................ iii HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................... v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.................................. vi PRAKATA..................................................................................................... vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA........................................................ x
INTISARI...................................................................................................... xi
ABSTRACT .................................................................................................... xii
DAFTAR ISI................................................................................................. xiii DAFTAR TABEL......................................................................................... xvi DAFTAR GAMBAR..................................................................................... xvii
BAB I. PENGANTAR............................................................................... 1 A. Latar Belakang......................................................................... 1
1. Perumusan Masalah........................................................... 3
2. Keaslian Penelitian.............................................................3
3. Manfaat Penelitian............................................................. 3
B. Tujuan Penelitian..................................................................... 3
1. Tujuan Umum.................................................................... 3
2. Tujuan Khusus................................................................... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 5
A. Simplisia.................................................................................. 5
B. Stevia........................................................................................5
C. Steviosida................................................................................. 7
D. Ekstraksi................................................................................... 9
E. Maserasi................................................................................... 11
F. Defatisasi..................................................................................11
G. Kromatografi Lapis Tipis......................................................... 12
H. KLT Densitometri.................................................................... 13
I. ImageJ...................................................................................... 14 J. Desain Faktorial....................................................................... 15 K. Landasan Teori......................................................................... 16 L. Hipotesis.................................................................................. 17
BAB III. METODE PENELITIAN............................................................... 18 A. Jenis dan Rancangan Penelitian............................................... 18 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.......................... 18
1. Variabel Penelitian............................................................. 18
2. Definisi Operasional.......................................................... 18
C. Bahan dan Alat......................................................................... 20
1. Bahan................................................................................. 20
2. Alat..................................................................................... 20
D. Tata Cara Penelitian................................................................. 21
1. Determinasi Herba Stevia.................................................. 21
2. Pembuatan Serbuk Daun.................................................... 21
3. Defatisasi............................................................................21
4. Maserasi............................................................................. 22
5. Analisis Ekstrak................................................................. 22
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 24 A. Determinasi Herba Stevia........................................................ 24 B. Pembuatan Serbuk Daun.......................................................... 24 C. Defatisasi..................................................................................25 D. Maserasi................................................................................... 26 E. Analisis Kualitatif.................................................................... 28 F. Analisis Kuantitatif.................................................................. 31 G. Analisis Hasil........................................................................... 33 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN..................................................... 37 A. Kesimpulan........................................................................................ 37 B. Saran.................................................................................................. 37 DAFTAR PUSTAKA.................................................................................... 38 LAMPIRAN................................................................................................... 41 BIOGRAFI PENULIS................................................................................... 53
DAFTAR TABEL
Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial...................................................... 16 Tabel II. Perbandingan Volume Air dan Suhu............................................... 22 Tabel III. Rf Sampel dan Baku Steviosida..................................................... 30 Tabel IV. AUC Sampel dan Baku Steviosida................................................ 32 Tabel V. Kadar Sampel Ekstrak Daun Stevia................................................ 33 Tabel VI. Perhitungan Nilai Efek.................................................................. 33 Tabel VII. Analisis Variansi Yate’s Treatment.............................................. 34 Tabel VIII. Analisis Desain Faktorial............................................................ 35
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Steviosida....................................................................... 7 Gambar 2. Kromatogram Sampel dan Baku Steviosida dengan Fase Diam Kieselgel 60 F dan Fase Gerak Kloroform p.a. : Metanol p.a.
254
: Aquabidest (10:15:2(v/v)).......................................................... 30 Gambar 3. ImageJ Kromatogram Sampel dan Baku Steviosida.................... 31 Gambar 4. Kurva Baku Steviosida................................................................. 32 Gambar 5. Grafik Hubungan antara Level Rendah dan Level Tinggi Volume
Air dengan Peningkatan Suhu terhadap Kadar Steviosida.......... 35 Gambar 6. Grafik Hubungan antara Level Rendah dan Level Tinggi Suhu dengan Peningkatan Volume Air terhadap Kadar Steviosida...... 35 Gambar 7. Contour Plot Kadar Steviosida.................................................... 36
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Beberapa tahun belakangan ini, kesadaran akan kualitas hidup meningkat
sehingga mendorong masyarakat untuk melakukan gaya hidup sehat. Salah satu dari gaya hidup sehat itu adalah mengurangi asupan makanan yang mengandung gula. Jika terlalu banyak mengkonsumsi gula maka dapat menyebabkan diabetes, obesitas, dan lain-lain. Oleh karena itu, dikenal suatu zat yang bisa menggantikan gula yang disebut dengan pemanis.
Pemanis buatan adalah suatu bahan tambahan yang memiliki rasa manis lebih kuat dari gula dan mengandung sedikit energi. Banyak bahan yang dapat dipergunakan sebagai pemanis buatan namun banyak juga yang dilarang penggunaannya karena dicurigai sebagai pemicu kanker.
Pemanis buatan yang biasa digunakan adalah sakarin dan siklamat. Pada konsentrasi tinggi sakarin menimbulkan rasa pahit (Achyar, 2005). Hasil metabolisme siklamat yaitu sikloheksamina bersifat karsinogenik (Mudjajanto, 2005). Akibat merugikan yang ditimbulkan oleh pemanis buatan menyebabkan pentingnya dilakukan penelitian untuk mencari pemanis alami yang mempunyai rasa yang dapat diterima dan aman dalam pengkonsumsiannya.
Steviosida merupakan hasil ekstraksi dari daun stevia (Stevia rebaudiana Bertonii M.), tanaman asli dari daerah timur laut Paraguay. Steviosida dapat menjadi pemanis alami alternatif sebagai pengganti gula. Steviosida berbentuk
2 kristal, berwarna putih, tidak berbau, dan mempunyai tingkat kemanisan 300 kali dibandingkan dengan gula (larutan 0,4%) (Ognean, 2003).
Kelebihan dari steviosida ini adalah stabil, non-kalori, mampu menjaga kesehatan gigi dengan menurunkan asupan gula, baik digunakan oleh penderita diabetes, fenilketonuria, dan obesitas (Ognean, 2003).
Martono (2007) mengekstraksi steviosida dari daun stevia menggunakan cairan penyari etanol secara soxhletasi sedangkan Silva et. al (2007) mengekstraksi steviosida dari daun stevia menggunakan air. Sharma (2007) menyebutkan bahwa steviosida sangat larut dalam air dan etanol. Pasquel (2000) menyebutkan bahwa air dapat meningkatkan kelarutan glikosida dengan atau tanpa adanya etanol. Alupului (2008) menyatakan dengan peningkatan volume cairan pengekstraksi maka konsentrasi akan menurun sedangkan massa dapat tetap atau meningkat.
Suhu merupakan salah satu faktor yang dapat meningkatkan kecepatan difusi (Anonim, 1986). Kelarutan steviosida di dalam air pada 20°C paling sedikit 40%b/b dan meningkat dengan semakin tingginya suhu (Yatka, 1991). Dalam penelitian ini dilakukan optimasi volume air dan suhu dalam proses ekstraksi secara maserasi untuk mendapatkan steviosida dengan kadar yang optimal.
Maserasi merupakan proses ekstraksi di mana cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan bisa digunakan untuk mengekstraksi pada skala yang besar. Proses maserasi mudah untuk dilakukan modifikasi sehingga dapat memberikan hasil yang lebih baik.
3
1. Perumusan Masalah
a Adakah daerah optimal untuk kadar steviosida yang dihasilkan dalam ekstrak dengan adanya variasi volume air dan suhu pada proses maserasi? b Manakah faktor yang berpengaruh terhadap kadar steviosida pada proses maserasi?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka yang telah dipublikasikan, penulis belum pernah menemukan penelitian mengenai optimasi volume air dan suhu dalam proses maserasi daun stevia dengan aplikasi desain faktorial.
3. Manfaat Penelitian a. Manfaat Teoritis
Dari penelitian ini dapat diketahui variasi volume air dan suhu dalam proses maserasi untuk mendapatkan steviosida dengan kadar yang optimal.
b. Manfaat Praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bagi masyarakat mengenai ekstrak steviosida sebagai pemanis pengganti gula.
B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum
Dapat mengetahui daerah optimal untuk kadar steviosida yang dihasilkan dalam ekstrak dengan adanya variasi volume air dan suhu pada proses maserasi.
4
2. Tujuan Khusus
Dapat mengetahui faktor yang berpengaruh terhadap kadar steviosida pada proses maserasi.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Simplisia Simplisia ialah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang
belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia nabati ialah simplisia yang berupa tanaman utuh, bagian tanaman atau eksudat tanaman. Eksudat tanaman ialah isi sel yang secara spontan keluar dari tanaman atau isi sel yang dengan cara tertentu dikeluarkan dari selnya, atau zat-zat nabati lainnya yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tanamannya dan belum berupa zat kimia murni (Anonim, 1977).
Simplisia nabati harus bebas dari serangga, fragmen hewan atau kotoran hewan; tidak boleh menyimpang bau dan warnanya; tidak boleh mengandung lendir dan cendawan atau menunjukkan tanda-tanda pengotoran lain; tidak boleh mengandung bahan lain yang beracun atau berbahaya. Pembuatan serbuk simplisia dilakukan dengan membersihkan simplisia dari bahan organik asing dan pengotoran lain secara mekanik atau dengan cara lain yang cocok, keringkan pada suhu yang cocok, haluskan, ayak. Kecuali dinyatakan lain, seluruh simplisia harus dihaluskan menjadi serbuk (4/18) (Anonim, 1977).
B.
Stevia
Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) termasuk dalam famili Asteraceae.Stevia merupakan herba yang dapat tumbuh sepanjang tahun (Bruneton, 1991).
6 Daun stevia mengandung glikosida diterpen dengan rasa yang manis tetapi tidak termetabolisme dan tidak mengandung kalori. Komponen terbesar dari glikosida yang manis ini adalah molekul steviosida (Sharma, 2007).
Pada seluruh bagian tanaman, glikosida steviol cenderung terakumulasi dalam jaringan sesuai dengan umurnya. Daun yang lebih tua yang berada di bagian bawah memiliki rasa yang lebih manis dibandingkan dengan daun yang lebih muda yang berada di bagian atas. Jaringan yang tidak memiliki klorofil seperti akar dan batang bagian bawah, mengandung glikosida yang sangat sedikit atau tidak mengandung sama sekali. Konsentrasi glikosida pada daun mulai berkurang ketika tanaman mulai berbunga (Anonim, 2008c). Food dehydrator dapat mengeringkan daun dengan pemanasan rendah (100-110°F) sehingga daun menjadi garing, rapuh, dan berwarna hijau terang (Richard, 2008).
Senyawa yang terdapat di dalam daun stevia adalah 2-pentil furan; 5,7,3’- trihidroksi-3,6,4’-trimetoksi flavon; 6-deoksiaustroinulin; 6-o-asetilaustroinulin; 6-o-austroinulin; a-bergamoten; a- dan t-kadinol; a-kalakoren; a-kopaen; a- dan b- kubeben; a-humulen; a- dan b-pinen; a-terpineol, aluminium, anetol; apigenin-4’- o-glukosida; asam askorbat; austroinulin; benzil alkohol; b-amirin asetat; b- bourbonen; b-karoten; b-kariofilen; b- dan y-elemen; b-ionon; b-selinen; b- sitosterol; bisabolen; kalamenen; kalsium; kampesterol; kariofilen; kariofilen oksida; sentaureidin; kromium; cis-hex-3-en-1-ol; cis-linalool oksida; kobalt; kosmosiin; kuminaldehid; d- dan y-kadinen; glikosida diterpen; dulkosida A; epoksi-b-ionon; eugenol; lemak; serat; y-terpinen; geraniol; germakren D; glukosa; heks-3-enil-2-metilbutanoat, heks-3-enil-asetat; besi; jhanol; kamferol-3-
7 o-rhamnosida; limonen; linalool; lupeol; lupeol ester; luteolin-7-o-glukosida; magnesium; mangan; metil eugenol; mirsen; mirtenal; mirtenol; n-heksanal; nerolidol, niasin; ok-1-en-3-ol; okta-2,3-dion; oktan-3-ol; p-simen; asam pentanoat; feniletilvalerat; fosfor; pinokarveol; pinokarvon; kalium; protein; kuersetin-3-o-arabinosa; kuersetin-3-o-glukosida; kuersetin-3-o-rhamnosida; kuersitrin; rebaudiosida A, B, C, D, E, F; riboflavin; sabinen; selenium; silikon; natrium; sterebin A, B, C, D, E, F, G, H; steviolbiosida; steviosida, stigmasterol; stigmasterol-b-d-glukosida; sukrosa; tanin; terpinen-4-ol; terpinolen; tiamin; timah; toreyol; trans-b-farnesen; trans-heks-2-en-1-ol; trans-linalool-oksida; trans- verbenol; air; dan seng (Duke, 2008).
C.
Steviosida
HO OH O OH HO O HO O OH O HO OH O O HO O HO OH
Gambar 1. Struktur Steviosida
8 Steviosida merupakan molekul besar yang bersifat netral dengan dua bagian yaitu polar dan hidrofobik, steviol mengandung cincin hidrofobik dan satu muatan negatif pada gugus karboksilat (Srimaroeng, 2005).
Steviosida merupakan pemanis dengan intensitas tinggi yang tidak mempunyai nilai nutrisi, diekstraksi dari daun stevia yang merupakan tanaman asli di daerah timur laut Paraguay (Ognean, 2003). Kalori merupakan pengukuran energi yang dihasilkan ketika makanan dimetabolisme. Substansi yang tidak dimetabolisme tidak menghasilkan energi atau non-kalori (Purves, 2006).
Steviosida berbentuk kristal, berwarna putih, tidak berbau, dan mempunyai tingkat kemanisan 300 kali dibandingkan dengan gula (larutan 0,4%) (Ognean, 2003). Rasa manis yang ditimbulkan karena terjadi ikatan molekul dengan reseptor protein spesifik pada sel di lidah yaitu T1r3. T1r3 mempunyai “kantong” di mana molekul kecil dapat masuk dan mungkin berikatan. Ikatan yang terjadi berhubungan dengan bentuk molekul yang sesuai dan adanya gugus fungsi yang berinteraksi untuk menstabilkan ikatan. Rasa manis yang ditimbulkan tidak ada hubungannya dengan metabolisme suatu molekul (Purves, 2006).
Steviosida sangat larut dalam air dan etanol (Sharma, 2007). Kelarutan steviosida di dalam air pada 20°C paling sedikit 40%b/b dan meningkat dengan semakin tingginya suhu (Yatka, 1991).
Steviosida dapat berada sampai 10% dari berat kering daun stevia. Steviosida dapat diisolasi dengan ekstraksi menggunakan air, diekstraksi ulang dengan butanol, dan secara umum dimurnikan dengan filtrasi (charcoal) dan kristalisasi (Bruneton, 1991).
9 Inkubasi padatan steviosida pada suhu tinggi selama 1 jam menunjukkan stabilitas yang baik sampai 120°C, sedangkan dekomposisi terjadi pada suhu lebih dari 140°C. Steviosida pada larutan sangat stabil pada pH 2-10 dengan perlakuan sampai 80°C; bagaimana pun di bawah kondisi asam kuat (pH 1), terjadi penurunan konsentrasi steviosida secara signifikan (Kroyer et al., 1999). Larutan steviosida pada pH 3-9 pada 100°C selama 1 jam menunjukkan penurunan kadar yang tidak bermakna. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dekomposisi senyawa terjadi pada pH 10 (Bakal and Nabors, 1986).
Steviosida tidak diserap usus dan tidak dimetabolisme oleh enzim pada saluran pencernaan karena ikatan glukosa pada steviosida adalah ikatan b- glukosidik. Steviosida didegradasi menjadi steviol dan glukosa oleh bakteri pada kolon manusia. Sebanyak 400 mg steviosida hanya dihasilkan 240 mg glukosa pada kolon. Glukosa yang dihasilkan ini,
⅓ bagian dimetabolisme oleh bakteri kolon, ⅓ bagian diekskresi, dan ⅓ bagian (± 80 mg) diserap sehingga jumlah glukosa tersebut dapat diabaikan. Steviol yang dihasilkan dari 400 mg steviosida adalah sebanyak 160 mg. Sekitar 90% dari bentuk steviol ini diekskresi bersama dengan feses. Sejumlah kecil steviol diserap kolon dan dikonjugasikan agar dapat diekskresi dalam urin (Perret, 2006).
D. Ekstraksi
Penyarian merupakan peristiwa pemindahan massa. Zat aktif yang semula berada di dalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari tersebut. Penyarian dipengaruhi oleh derajat kehalusan
10 serbuk dan perbedaan konsentrasi yang terdapat mulai dari pusat butir serbuk simplisia sampai ke permukaannya, maupun pada perbedaan konsentrasi yang terdapat lapisan batas, sehingga suatu titik akan dicapai, oleh zat-zat yang tersari jika ada daya dorong yang cukup untuk melanjutkan pemindahan massa (Anonim, 1986).
Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin luas. Semakin halus serbuk simplisia seharusnya makin baik penyariannya tetapi dalam pelaksanaannya tidak selalu demikian, karena penyarian masih tergantung juga pada sifat fisik dan kimia simplisia yang bersangkutan (Anonim, 1986).
Simplisia yang terlalu halus akan memberikan kesulitan pada proses penyaringan. Serbuk yang terlalu halus akan mempersulit penyaringan, karena butir-butir halus tadi membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dengan hasil penyarian. Hasil penyarian tidak murni lagi tetapi tercampur dengan partikel- partikel halus tadi. Penyerbukan yang terlalu halus menyebabkan banyak dinding sel yang pecah, sehingga zat yang tidak diinginkan pun ikut ke dalam hasil penyarian (Anonim, 1986).
Pada pengeringan tumbuhan segar maka protoplasma akan mengkerut. Mengalirnya bahan pelarut ke dalam ruang sel juga menyebabkan protoplasma membengkak, dan bahan kandungan sel akan terlarut sesuai dengan kelarutannya.
Bahan kandungan sel berpindah, sejauh bahan tersebut terlarut molekuler, mengikuti difusi melalui ruang antarmiselar. Faktor pendorong yang bekerja adalah adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan cairan
11 ekstraksi yang mula-mula masih tanpa bahan aktif yang mengelilinginya. Bahan kandungan sel akan mencapai ke dalam cairan di sebelah luar selama difusi melintasi membran sampai terbentuknya suatu keseimbangan konsentrasi antara larutan di sebelah dalam dan di sebelah luar sel (Voigt, 1994).
E. Maserasi
Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim, 1986).
Pada penyarian dengan cara maserasi, perlu dilakukan pengadukan. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel. Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus-menerus, waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam (Anonim, 1986).
F. Defatisasi
Defatisasi merupakan proses untuk menghilangkan senyawa lemak dari sesuatu (Anonim, 2008a). Daun didefatisasi menggunakan pelarut non polar
12 seperti kloroform atau heksan untuk memindahkan minyak atsiri, lipid, klorofil, dan komponen non polar lainnya (Kuznesof, 2007).
Penyarian berkesinambungan merupakan penyempurnaan alat ekstraksi, alat tersebut disebut alat “Soxhlet”. Soxhlet merupakan salah satu cara untuk mendefatisasi. Serbuk simplisia dalam kertas saring diisikan pada tabung lalu cairan penyari diisikan pada labu. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih.
Uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa samping, kemudian diembunkan oleh pendingin tegak. Cairan turun ke labu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia.
Cairan penyari turun sambil melarutkan zat aktif dalam serbuk simplisia. Karena adanya sifon maka setelah cairan mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan kembali ke labu. Cara ini lebih menguntungkan karena uap panas tidak melalui serbuk simplisia, tetapi melalui pipa samping (Anonim, 1986).
G. Kromatografi Lapis Tipis
Dua fase diam utama yang dipakai ialah silika gel [(SiO ) ] dan alumina
2 x
[(Al O ) ], dan karena atom oksigen yang polar dan adanya gugus hidroksi pada
2 3 x
permukaan, keduanya merupakan bahan yang betul-betul polar. Jika zat terlarut polar dan terjerap kuat pada permukaan, kita harus memakai pelarut yang sangat polar untuk menggerakkan zat terlarut itu. Jika asam dikromatografi pada alumina, ia akan terikat kuat pada permukaan oleh gaya ion dan sukar digerakkan dan dipisahkan (Gritter, 1991).
Molekul pelarut cenderung bersaing dengan molekul zat terlarut untuk mendapat tempat pada permukaan fase diam dan menggerakkan zat terlarut
13 dengan mendorongnya ke luar dari tempatnya. Jenis kromatografi yang didasarkan kepada gagasan ini disebut analisis pendesakan, dan molekul yang menjadi pendesak mungkin molekul pelarut atau bahkan molekul pereaksi yang dilarutkan di dalam pelarut dengan tujuan mendesak zat terlarut asli (Gritter, 1991).
Fase diam normal yang tidak diaktifkan, seluruh permukaannya dilapisi air. Dengan perkataan lain, tempat-tempat pada fase diam yang disebutkan di atas semuanya diduduki oleh molekul air yang sangat polar dan membentuk ikatan hidrogen. Sebagian dari molekul air itu harus dihilangkan dengan pemanasan atau pengaktifan, biasanya pada suhu 100-110°C, agar diperoleh fase diam aktif sebelum kromatografi dilaksanakan (Gritter, 1991).
H. KLT Densitometri
KLT densitometri merupakan salah satu dari metode analisis KLT kuantitatif. Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan bercak standar yang dielusi bersama-sama. Syarat-syarat untuk senyawa standar adalah murni, inert, dan stabil (Sastrohamidjojo, 1985).
Ada 2 cara penetapan kadar dengan alat densitometer, pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi bersama dalam suatu lempeng, kemudian AUC (luas area di bawah kurva) sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Kedua, dengan membuat
14 kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada plat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi (minimal 3 macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari AUC- nya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan garis lurus y = bx + a, di mana x adalah kadar zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan, 1987).
Penggunaan densitometri ditujukan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar sangat kecil yang sebelumnya telah dipisahkan secara KLT.
Penentuan kadar analit dihubungkan dengan area bercak pada KLT (Mulja dan Suharman, 1995).
I. ImageJ
ImageJ merupakan suatu domain publik dengan program pengolahan gambar berbasis Java yang dikembangkan oleh NIH (National Institute of Health).
ImageJ didesain dengan arsitektur terbuka yang menyediakan jangkauannya melalui Java plugins dan recordable macros. Hasil yang diperoleh, analisis, dan pengolahan plugins dapat dikembangkan menggunakan ImageJ's built-in editor dan Java compiler. Pengguna memungkinkan untuk memecahkan berbagai pengolahan gambar dan menganalisis masalah, dari gambar sel 3 dimensi sampai pengolahan gambar radiologi, berbagai perbandingan data gambar sampai sistem hematologi (Anonim, 2008b). Lempeng yang telah dielusi kemudian discan. Intensitas dari bercak dihitung dengan menggunakan program ImageJ (Zeligs and Bradlow, 2006).
15 Syarat penggunaan ImageJ untuk densitometri adalah gambar dalam format JPEG, TIFF, GIF, atau BMP, bercak harus berwarna hitam atau putih, dan
lanes harus vertikal. Cara mengolah data menggunakan ImageJ adalah sebagai
berikut: 1. Open > Choose File.
2. Analyze > Calibrate > Function > Uncalibrated OD.
3. Pilih marquee tool yang berbentuk kotak pada toolbar untuk memilih lane pertama; pemilihan tinggi harus lebih besar dari pada lebarnya.
4. Analyze > Gels > Select First Lane.
5. Klik dan geser border menuju lane berikutnya lalu Analyze > Gels > Select Next Lane .
6. Analyze > Gels > Plot Lanes.
7. AUC diukur menggunakan magic wand tool (area yang diinginkan harus berupa kurva yang tertutup).
8. Line tool digunakan untuk menutup kurva (Patnaik, 2004).
J. Desain Faktorial
Desain faktorial adalah desain yang dipilih untuk menentukan pengaruh secara simultan dari beberapa faktor dan interaksinya. Faktor adalah variabel yang ditentukan. Pemilihan faktor pada suatu penelitian bergantung pada tujuan dari penelitian. Level adalah nilai dari faktor. Notasi standar untuk kombinasi faktor dinyatakan dengan (1), a, b, dan ab. Efek adalah perubahan yang terjadi pada respon yang disebabkan karena variasi level dari faktor (Bolton, 1990).
16
Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial
Percobaan A B AB
- (1) - a + - -
Persamaan umum untuk desain faktorial adalah: Y = b + b X + b X + b
X X
1 A
2 B
12 A B
Y = respon hasil atau sifat yang diamati
X X = level A dan level B
A, B
b , b , b , b = koefisien, dapat dihitung dari hasil percobaan (Amstrong and
1
2
12 James, 1996).
Yate’s treatment merupakan metode yang sistematis untuk menganalisis n
data dari 2 faktor percobaan. Replikasi dalam percobaan merupakan cara yang terbaik. Duplikasi sudah cukup. Semakin sedikit replikasi maka experimental
error semakin besar (Bolton, 1991).
K. Landasan Teori
Steviosida merupakan salah satu senyawa yang memiliki rasa manis yang terdapat di dalam daun stevia. Salah satu cara untuk memperoleh steviosida adalah dengan melakukan maserasi menggunakan campuran cairan penyari air dan etanol pada suhu tertentu. Steviosida memiliki kelarutan yang tinggi dalam air dan etanol. Suhu merupakan salah satu bentuk energi panas yang dapat meningkatkan energi kinetik sehingga dapat meningkatkan proses maserasi.
17 Lipid yang terkandung di dalam simplisia dapat mempengaruhi kemurnian dan sifat dari kristal yang terbentuk tetapi dapat dihilangkan dengan defatisasi menggunakan pelarut heksan.
Cara penyarian dapat dilakukan dengan maserasi yaitu dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Jika hanya merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari dirasa kurang efektif dalam menarik senyawa yang diinginkan. Oleh karena itu dilakukan modifikasi pada maserasi seperti digesti dan maserasi dengan pengadukan.
L.
Hipotesis
1. Adanya peningkatan volume air dalam proses maserasi daun stevia akan meningkatkan kadar steviosida dalam ekstrak.
2. Adanya peningkatan suhu dalam proses maserasi daun stevia akan meningkatkan kadar steviosida dalam ekstrak.
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental karena ada intervensi pada subjek uji. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1.
a. Variabel Bebas
Volume air dan suhu masing-masing dengan 2 macam level. Volume air yang digunakan untuk level rendah adalah 20 ml sedangkan untuk level tinggi adalah 50 ml. Suhu yang digunakan untuk level rendah adalah 30°C sedangkan untuk level tinggi adalah 50°C.
b. Variabel Tergantung Kadar steviosida dalam ekstrak.
c. Variabel Pengacau Terkendali Umur tanaman dan varietas tanaman.
2. Definisi Operasional a. Air Air yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquadest.
b. Suhu Suhu yang dinyatakan dalam penelitian ini adalah dalam derajat Celcius.
19
c. Maserasi
Maserasi yang dilakukan adalah maserasi dengan pemanasan dan penggojogan manual setiap 15 menit masing-masing penggojogan dilakukan selama 1 menit.
d. Ekstrak
Ekstrak yang dimaksudkan dalam penelitian ini adalah cairan hasil maserasi serbuk daun stevia yang telah disaring dan didiamkan selama 30 menit.
e.
Steviosida yang dimaksudkan dalam penelitian ini adalah steviosida yang dinyatakan setara dengan baku steviosida (99,2% assay dengan HPLC BM 804,87 Wako Jepang).
f. Penyaringan
Penyaringan dilakukan dengan menggunakan kain di mana kain tersebut diperas hingga hasil maserasi tidak menetes lagi.
g. Faktor
Faktor yang dimaksud adalah variabel bebas yang ditentukan dalam penelitian yaitu volume air dan suhu.
h. Respon
Respon yang dimaksud adalah variabel tergantung yang ditentukan dalam penelitian yaitu kadar steviosida.
20
i. Level
Level yang dimaksud adalah nilai dari faktor. Terdiri dari level rendah dan level tinggi. Level rendah volume air adalah 20 ml dan level rendah suhu adalah 30°C. Level tinggi volume air adalah 50 ml dan level tinggi suhu adalah 50°C.
j. Efek
Efek yang dimaksud adalah perubahan yang terjadi pada respon yang disebabkan karena variasi level dari faktor.
C. Bahan dan Alat 1. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk simplisia daun stevia yang diambil dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B P TO T) Tawangmangu, baku
2
2
2
steviosida (99,2% assay dengan HPLC BM 804,87 Wako Jepang), heksan (Brataco), aquadest, aquabidest (PT Ikapharmindo Putramas), etanol 96% (Asia Lab), kloroform p.a. (Merck), metanol p.a. (Merck), kieselgel 60 F
254
(Merck), KI (MKR Chemicals), Iodine crystal (MKR Chemicals) dan pereaksi semprot vanilin-H SO .
2
4 2.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah grinder, ayakan bertingkat elektrik (Indotest Multi Lab.), ayakan (Patraproduk), neraca elektrik (Mettler Toledo GB3002), neraca analitik (Mettler Toledo AB204 dan Scaltec
21 SBC 22), soxhlet, mantle-heater (Toshniwal), beker glass (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), erlenmeyer bertutup (Pyrex), labu ukur (Pyrex), pipet tetes, pipa kapiler 1
μl (IntraEND), corong, kertas saring, chamber, waterbath (Emerson dan Memmert), termometer, oven (Memmert dan Termaks), pemanas elektrik (Cenco), dan scanner (Canon MP 160).
D. Tata Cara Penelitian
Secara singkat langkah-langkah yang dikerjakan dalam penelitian adalah sebagai berikut:
1. Determinasi Herba Stevia
Determinasi herba stevia dilakukan oleh Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B P TO T)
2
2
2 Tawangmangu.
2. Pembuatan Serbuk Daun
Simplisia daun stevia dipisahkan dari batang dan ranting serta kerikil kemudian dimasukkan ke dalam oven 40-55°C. Daun diserbuk dengan grinder lalu dilakukan pengayakan dengan nomor mesh 50 selama 5 menit.
3. Defatisasi
Sebanyak 50 gram serbuk yang telah diayak dimasukkan ke dalam kantong yang terbuat dari kertas saring kemudian dimasukkan ke dalam soxhlet. Setelah itu ditambahkan pelarut heksan sebanyak 2 kali sirkulasi. Proses sirkulasi dilakukan selama 2x8 jam (Martono, 2007) dengan suhu 55-
22 65°C. Serbuk yang telah didefatisasi dikeringkan di dalam oven yang selanjutnya akan digunakan untuk proses maserasi.
4. Maserasi
Sebanyak 4 gram serbuk daun stevia dimasukkan masing-masing ke dalam 4 erlenmeyer bertutup.
Tabel II. Perbandingan Volume Air dan Suhu
Air (ml) Suhu (°C) 20 30 50 30 20 50 50 50
Etanol 96% dengan volume 50 ml ditambahkan ke dalam masing-masing erlenmeyer. Maserasi dilakukan selama 6 jam dipanaskan di atas waterbath dan dilakukan 1 kali replikasi. Hasil maserasi disaring lalu ditambahkan ke dalam labu ukur 100 ml hingga tanda dengan perbandingan pelarut yang sama dengan volume cairan penyari yang digunakan pada masing-masing erlenmeyer. Ekstrak yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk analisis selanjutnya.
5. Analisis Ekstrak a. Analisis Kualitatif
Kadar baku steviosida yang digunakan adalah 2 mg/ml. Untuk kurva kalibrasi digunakan baku dengan seri massa 2; 4; 6; 8; 10; 12; dan
14 μg. Untuk sampel dilakukan penotolan sebanyak 3 μl. Baku dan sampel ditotolkan pada lempeng KLT dengan fase diam kieselgel 60 F .
254
Kemudian fase diam dielusi menggunakan fase gerak kloroform p.a. : metanol p.a. : aquabidest (10:15:2(v/v)) (Martono, 2007). Penotolan
23 dilakukan 2 cm dari bawah dan dielusi dengan jarak 15 cm dari titik penotolan. Setelah pengelusian, lempeng KLT dikeringkan lalu direaksikan dengan pereaksi semprot KI dan setelah kering direaksikan dengan pereaksi semprot vanilin-H SO . Lempeng segera dipanaskan di
2
4 atas pemanas elektrik dengan suhu 70-80°C.
b. Analisis Kuantitatif
Lempeng kromatogram discan sehingga diperoleh gambar yang kemudian diolah dengan menggunakan program komputer yaitu imageJ.
Dari program imageJ akan didapatkan nilai AUC masing-masing bercak. Seri massa baku diregresi linier dengan AUC yang diperoleh. Setelah didapatkan persamaan kurva baku lalu dimasukkan AUC sampel untuk mendapatkan kadar steviosida (%b/b).
c. Analisis Hasil
Kadar steviosida yang diperoleh dari persamaan kurva baku kemudian dianalisis menggunakan Yate’s treatment dengan taraf kepercayaan 95%. Kadar steviosida dalam sampel dianalisis menggunakan desain faktorial. Persamaan desain faktorial adalah y = b + b (x ) + b (x )
1
1
2
2
- b (x )(x ). Dari persamaan ini dapat dibuat contour plot yang
12
1
2
menggambarkan daerah optimal untuk kadar steviosida yang dihasilkan dalam ekstrak dengan adanya variasi volume air dan suhu pada proses maserasi.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Herba Stevia Determinasi herba stevia dilakukan oleh Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B P TO T) Tawangmangu.
2
2