OPTIMASI VOLUME AIR DAN ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL SKRIPSI Disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

  OPTIMASI VOLUME AIR DAN ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL SKRIPSI Disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

  Diajukan oleh : Natalia Dwi Hartono

  NIM : 058114158

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

  

HALAMAN PERSEMBAHAN

Special dedicated to . . .

  Jesus Christ Mom and Dad

  OPTIMASI VOLUME AIR DAN ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii M.) DENGAN APLIKASI DESAIN FAKTORIAL

  INTISARI

  Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii. M.), merupakan herba yang mengandung steviosida, yang berpotensi sebagai pemanis alami non kalori dan dapat digunakan sebagai pengganti gula. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan pengaruh perbedaan volume penyari air-etanol 96% pada proses maserasi dengan suhu 50

  C, mengetahui efek dominan yang mempengaruhi kadar steviosida yang dihasilkan serta kadar optimum yang diperoleh. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Identifikasi maserat dilakukan secara Kromatografi Lapis Tipis dengan fase diam kieselgel 60 F dan

  254

  fase gerak kloroform:methanol:aquabides = 10:15:2 serta penampak bercak larutan iodium dan vanillin-asam sulfat pekat. Harga Rf kromatogram maserat yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan harga Rf standard steviosida. Penetapan kadar steviosida dalam kromatogram dilakukan secara densitometri dengan software ImageJ. Analisis kuantitatif dilakukan dengan aplikasi desain faktorial yang dilanjutkan dengan Yate’s treatment dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui perbedaan dari setiap faktor serta interaksi volume air-etanol dalam mempengaruhi respon.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa volume air dan etanol memberikan perbedaan terhadap kadar steviosida yang diperoleh. Hal ini terlihat dari nilai F hitung volume etanol (39,8185) dan volume air (16,2786) yang lebih tinggi daripada nilai F tabel (10,128). Faktor volume etanol merupakan faktor dominan yang mempengaruhi kadar steviosida yang diperoleh. Dari hasil perhitungan diperoleh respon kadar optimum sebesar 3-4%.

  

Keyword: steviosida, maserasi, Kromatografi Lapis Tipis, imageJ, kadar

  steviosida, desain faktorial

  

ABSTRACT

  Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) is a herb consists of stevioside, which is a potential compound to be a non-calorie natural sweetener and therefore, it can be sugar-substitute. The objective of this research is to prove the influence of water-ethanol 96% volume difference in maceration process with 50 C heating and the dominant effect influenced stevioside concentration.

  This research is an experimental research. Extract identification was done by Thin Layer Chromatography method with kieselgel 60 F 254 as stationary phase, chloroform:methanol:aquabides = 10:15:2 as mobile phase and also iodium and vanillin-sulphuric acid solution as spray reagent for chromatogram detection. The Rf value of extract then compared with the Rf value of stevioside reference compound. The concentration of stevioside in extract was measured by densitometry with ImageJ software. Quantitative analysis was done by factorial design application and Yate’s treatment with 95% significance level were designed to know the effect of water and ethanol 96% volume and their interaction to stevioside concentration.

  The results of this research showed that either ethanol or water gave different stevioside concentration. It could be compared from the F value of ethanol (39,8185) and water (16,2786) which were higher than the table F value (10,128). Ethanol volume had to be the dominant factor influenced stevioside concentration The optimum concentration was 3-4%.

  

Keyword: stevioside, maceration, Thin Layer Chromatography, ImageJ, stevioside

  concentration, factorial design

  

PRAKATA

  Penulis memanjatkan puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala berkat, bimbingan dan rahmatNya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian payung dengan judul “Optimasi Volume Air dan Etanol dalam Proses Maserasi Daun Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii M.) dengan Aplikasi Desain Faktorial” yang dibiayai oleh Program Hibah PHK A3 Dikti.

  Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Dalam penyelesaian skripsi ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

  1. Rita Suhadi, M.Si, Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

  2. Pihak PHK A3 atas segala bantuan dan kesempatan yang telah diberikan dalam pengerjaan penelitian ini

  3. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (BP

  2 TO

  2 T) atas bantuannya dalam penyediaan bahan penelitian.

  4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si, selaku pembimbing utama dalam skripsi ini,

  5. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt, selaku pembimbing dalam skripsi ini, atas segala masukan yang diberikan kepada penulis, dan kesabaran serta dukungan selama membimbing penulis dalam penyusunan skripsi ini

  6. Ign. Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku penguji, atas segala kritik, dan masukan yang diberikan dalam penyusunan skripsi ini

  7. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt, selaku penguji, atas segala kritik, dan masukan yang diberikan dalam penyusunan skripsi ini

  8. Yohanes Martono, S.Si., atas segala masukan dan kerjasamanya selama ini serta atas bantuannya dalam penyediaan bahan untuk penelitian

  9. Antonius Tri Priantoro, M.For.Sc., selaku pembimbing akademik penulis, atas dukungan dan bimbingannya selama penulis menyelesaikan program S1 Farmasi

  10. Mas Wagiran dan mas Sigit, selaku laboran di bagian farmakognosi fitokimia atas segala bantuannya selama penulis melakukan penelitian

  11. Pak Parlan, mas Bimo dan mas Kunto selaku laboran di bagian analisis atas segala bantuannya selama penulis melakukan penelitian

  12. Petugas keamanan kampus Sanata Dharma, atas kerjasamanya sehingga penulis dapat melakukan penelitian di luar jam.

  13. Hartono Suwana dan Kristianawati Prasetyo, atas segala cinta yang telah diberikan hingga aku bisa menjadi seperti sekarang. I miss you

  15. Kakak-kakakku tercinta: Ci Fanny, Ko Yudhi, Ci Ika, Geb, atas segala doa dan semangat yang diberikan selama ini

  16. Yohanes Andi Wijaya, part of my life, atas segala kesabaran, dukungan, kasih sayang yang tak henti-hentinya, yang senantiasa menghibur di kala penulis merasa sedih dan putus asa

  17. Teman-teman Wisma Surya, atas doa dan semangatnya selama ini

  18. Teman-teman penelitian stevia: Siska, Nia, Diana, Retha, Tyas, Pak rete, Totok, Febrian, atas kerjasama, dan suka dukanya selama penelitian ini berlangsung. Mohon maaf apabila penulis pernah berbuat kesalahan, baik sengaja maupun tidak sengaja

  19. Teman-teman kelas C angkatan 2005, atas segala keceriaan dan kekompakannya yang telah menjadi semangat tersendiri bagi penulis

  20. Teman-teman kelompok praktikum F angkatan 2005, atas kerjasama dan suka dukanya selama praktikum

  21. Gibay, Riri, Cyn, dan Ira, sahabat-sahabat yang selalu mendukungku di kala senang dan susah

  22. Pihak-pihak lain yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini, yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu Penulis sadar bahwa masih banyak kekurangan dalam segala aspek penyusunan skripsi ini, oleh karena itu penulis mengharapkan adanya kritik dan

  DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL.................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.......................................... iii HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................... v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA....................................................... vi

  INTISARI..................................................................................................... viii

  

ABSTRACT ................................................................................................... ix

  PRAKATA................................................................................................... x DAFTAR ISI................................................................................................ xiii DAFTAR TABEL........................................................................................ xvi DAFTAR GAMBAR.................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xviii BABI. PENDAHULUAN.............................................................................

  1 A. Latar Belakang...................................................................................

  1 1. Permasalahan penelitian......................................................................

  4 2. Keaslian penelitian..............................................................................

  4 3. Manfaat penelitian...............................................................................

  4 B. Tujuan penelitian..............................................................................

  5

  C. Steviosida............................................................................................ 8

  D. Penyarian.............................................................................................. 10

  E. Maserasi............................................................................................... 11

  F. Sokletasi.............................................................................................. 12

  G. Cairan penyari..................................................................................... 13 H. Kromatografi Lapis Tipis...................................................................

  14 I. Desain Faktorial.................................................................................. 16 J. Densitometri....................................................................................... 17 K. ImageJ................................................................................................ 18 L. Landasan Teori.................................................................................... 18 M. Hipotesis............................................................................................ 19 BAB III. METODE PENELITIAN..............................................................

  20 A. Jenis dan rancangan penelitian..........................................................

  20 B. Variabel penelitian.............................................................................

  20 C. Definisi opersional.............................................................................

  20 D. Alat.................................................................................................... 22

  E. Bahan................................................................................................. 22 F. Tata cara penelitian............................................................................

  23 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN...................................................... 27 A. Pengumpulan bahan dan determinasi................................................

  27

  E. Analisis Kualitatif Sampel................................................................

  31 F. Analisis Kuantitatif Sampel..............................................................

  33 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN......................................................

  41 A. Kesimpulan....................................................................................... 41

  B. Saran................................................................................................. 41 DAFTAR PUSTAKA...................................................................................

  42 LAMPIRAN................................................................................................. 45 BIOGRAFI PENULIS..................................................................................

  60

  DAFTAR TABEL Table I. Notasi Formula Desain Faktorial....................................................... 17 Tabel II. Perbandingan volume air dan etanol untuk maserasi 4 gram serbuk.................................................................................. 24 Tabel III. Perbandingan volume air dan etanol untuk maserasi 4 gram serbuk................................................................................. 29 Tabel IV. Nilai Rf sampel dan baku steviosida............................................. 33 Tabel V. Kadar steviosida dalam maserat daun stevia.................................. 35 Tabel VI. Efek air, etanol dan interaksi air-etanol terhadap kadar steviosida........................................................................... 36 Tabel VII. Perhitungan Yate’s treatment dengan taraf kepercayaan 95% ... 37

  DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur steviosida............................................................................ 9 Gambar 2. Profil kromatogram maserat dan baku.............................................. 32 Gambar 3. Grafik hubungan jumlah steviosida dengan AUC............................. 34 Gambar 4. Grafik hubungan antara peningkatan volume air dengan etanol pada level rendah dan tinggi terhadap kadar steviosida................. 38 Gambar 5. Grafik hubungan antara peningkatan volume etanol dengan air pada level rendah dan tinggi terhadap kadar steviosida................. 39 Gambar 6. Contour plot hubungan antara volume air dan volume etanol........... 40

  DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat keterangan determinasi...................................................... 45 Lampiran 2. Perhitungan seri larutan baku dan sampel................................... 46 Lampiran 3. Perhitungan data dengan Yate’s treatment…………………….. 54 Lampiran 4. Tanaman stevia dan simplisia daun stevia……………………... 57 Lampiran 5. Kromatogram sampel dan baku steviosida.................................. 58 Lampiran 6. Prosedur penggunaan ImageJ………………………………….. 59

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Perkembangan penggunaan tanaman sebagai bahan tambahan makanan

  semakin meningkat dewasa ini. Penggunaan tanaman sebagai bahan tambahan makanan, dalam hal ini untuk menggantikan bahan tambahan sintetik, disadari masyarakat sebagai suatu langkah penting dalam pencegahan suatu penyakit. Salah satu bahan tambahan makanan yang banyak digunakan dalam kehidupan sehari-hari adalah pemanis makanan.

  Pemanis buatan/sintetik, menurut Anonim (2008f), adalah bahan tambahan pangan yang dapat menyebabkan rasa manis pada produk pangan yang tidak/sedikit mempunyai nilai gizi/kalori, dan hanya boleh ditambahkan ke dalam produk pangan dalam jumlah tertentu. Pemanis sintetik mempunyai kemanisan lebih besar daripada gula. Saat ini terdapat banyak bahan yang digunakan sebagai pemanis sintetik, akan tetapi banyak pula yang penggunannya dilarang karena dicurigai sebagai pemicu berbagai penyakit, seperti kanker. Resiko yang buruk akibat penggunaan bahan pemanis sintetik membuat masyarakat lebih selektif dalam memilih bahan pemanis yang akan digunakan.

  Salah satu tanaman yang potensial untuk dijadikan bahan pemanis alami adalah Stevia rebaudiana Bertonii M., yang dikenal dengan nama stevia. digunakan sebagai bahan pemanis pengganti gula, terutama bagi penderita diabetes. Komponen glikosida steviol yang terdapat dalam stevia antara lain: steviol, steviolbiosida, steviosida, rebaudiosida A, rebaudiosida B, rebaudiosida C, rebaudiosida D, rebaudiosida E, rebaudiosida F, rubusodida, dan dulcoside A.

  Di antara kandungan-kandungan senyawa tersebut, steviosida dan rebaudiosida A merupakan komponen pemanis utama pada stevia (Wallin, 2007). Steviosida sebagai bahan pemanis pengganti gula memiliki beberapa keunggulan, antara lain dapat menurunkan kadar gula dalam darah serta tekanan darah (Jeppesen, Gregersen, Rolfsen, Jepsen, Colombo, Agger, 2003), bersifat non kalori, dapat memperlambat pembentukan plak dan karies gigi (Geuns, 2003), serta tidak toksik. Hasil pengujian toksisitas kronik pada tikus selama 24 bulan membuktikan bahwa steviosida tidak toksik (Anonim, 2008f).

  Keunggulan-keunggulan tersebut telah menjadikan steviosida sebagai bahan pemanis alami pengganti gula yang banyak diminati oleh masyarakat. Hal ini terlihat dari banyaknya negara-negara yang mengkonsumsi steviosida sebagai bahan pemanis pengganti gula, antara lain Jepang, China, Korea, Taiwan,

  

Uruguay, Brazil, Paraguay, Inggris, Filipina dan Kanada (Anonim, 2008f).

Masyarakat di Jepang bahkan telah mulai menggunakan steviosida dalam produk

makanan sejak tahun 1970 (Anonim, 2008f). Namun di Indonesia, masyarakat

belum begitu mengenal steviosida sehingga penggunaannya masih sangat jarang. dalam proses maserasi. Pada penelitian sebelumnya dilakukan proses penyarian menggunakan etanol 96% (Martono, 2007) dan proses penyarian dengan air (Silva, F.V., Bergamasco, R., Andrade, C.M.G., Pinheiro, N., Machado, N.R.C.F., Reis, M.H.M. (2007). Proses ekstraksi secara maserasi memiliki keunggulan, yakni metodenya sederhana. Penggunaan etanol 96% sebagai cairan penyari terkait dengan metode analisis data yang digunakan, yakni desain faktorial, di mana faktor-faktor yang akan diamati efeknya harus dalam keadaan murni sehingga dapat ditentukan faktor yang mempengaruhi respon. Volume air dan etanol 96% yang digunakan dalam proses maserasi dapat mempengaruhi efektivitas penyarian, yang pada akhirnya akan mempengaruhi kadar steviosida yang diperoleh sehingga perlu dilakukan optimasi agar diperoleh kadar steviosida yang optimum.

  Dalam penelitian ini proses maserasi dilakukan dengan menggunakan pemanasan, yakni pada suhu 50 C. Kadar steviosida yang diperoleh akan semakin tinggi dengan semakin tingginya suhu pada proses ekstraksi dalam cairan penyari air dan etanol 96% (Yatka, 1991; McHugh, M., Krukonis, V., 1994) . Adanya panas akan meningkatkan kecepatan reaksi sehingga proses ekstraksi dapat berlangsung dalam waktu yang relatif lebih singkat dan jumlah steviosida yang diperoleh optimum.

B. Permasalahan

  Permasalahan dalam penelitian ini dapat dirumuskan dalam pertanyaan sebagai berikut :

  1. Apakah perbedaan volume air dan etanol 96% yang digunakan dalam proses maserasi daun stevia dengan suhu 50 C berpengaruh terhadap kadar steviosida yang diperoleh ?

  2. Manakah faktor yang dominan antara volume air dan etanol 96% yang mempengaruhi dalam proses maserasi daun stevia dengan suhu 50 C ?

  3. Berapakah kadar steviosida optimum yang dapat diperoleh pada proses maserasi daun stevia dengan suhu 50 C?

  C. Keaslian penelitian

  Setelah dilakukan penelusuran pustaka, optimasi proses maserasi dengan melihat pengaruh volume air dan etanol 96% terhadap kadar steviosida belum pernah dilakukan sebelumnya.

  D. Manfaat penelitian

  1. Manfaat teoritis : penelitian ini diharapkan menambah khasanah pengetahuan bidang farmasi Sains Teknologi khususnya mengenai pengaruh penyari air dan etanol 96% dalam proses maserasi steviosida dari daun stevia

  2. Manfaat praktis : hasil penelitian ini dapat digunakan untuk

E. Tujuan penelitian

  1. Tujuan umum : secara umum penelitian ini bertujuan untuk menambah pengetahuan mengenai proses maserasi yang optimum untuk memperoleh steviosida dari stevia.

  2. Tujuan khusus :

  a. Membuktikan adanya pengaruh perbedaan volume air dan etanol 96% pada proses maserasi daun stevia dengan suhu 50 C terhadap kadar steviosida yang diperoleh.

  b. Mengetahui faktor yang dominan antara volume air dan etanol 96% yang mempengaruhi dalam proses maserasi daun stevia dengan suhu 50

  C.

  c. Mengetahui kadar steviosida optimum yang dapat dihasilkan pada proses maserasi daun stevia dengan suhu 50 C.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Stevia

  1. Keterangan botani

  Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii M.) merupakan tanaman dari famili Compositae (Bakal & Nabors, 1986), yang ditemukan pada akhir abad 19 oleh Dr. Moises Santiago Bertoni (Anonim, 2008f).

  Stevia berupa tanaman perdu berdaun hijau, tumbuh perennial, berbunga kecil pada pucuk berwarna putih dengan bagian dalam berwarna ungu muda. K etika pertumbuhannya telah maksimal, tingginya dapat

  mencapai 80 cm. Pada daun yang kering, terkandung 42% komponen yang larut air (Bakal & Nabors , 1986). Memiliki d aun tunggal, berhadapan,

  bentuk bulat telur, tepi rata, ujung tumpul, pangkal runcing, pertulangan menyirip, berwarna hijau, panjang 2-4 cm, lebar 1-5 cm. Bagian batang berbentuk bulat, berbulu, beruas, bercabang, berwarna hijau . Bunganya majemuk, bentuk malai, di ujung dan di ketiak daun, kelopak bentuk tabung, berbagi lima, tangkai benang sari dan tangkai putik pendek, kepala sari kuning, putik bentuk silindris. Buah berbentuk kotak, berambut coklat dan biji berbentuk jarum, putih serta ber akar tunggang (Anonim, 2008e).

  2. Nama lain

  (Afrika), tian jü atau tian jü ye (Cina), honingkruid (Belanda), candy leaf atau sugar leaf atau sweet herb of Paraguay (Inggris), sweetleaf (Amerika Serikat), sweet honey leaf (Australia), Süßkraut atau Süßblatt atau Honigkraut (Jerman dan Switzerland), jázmin pakóca (Hungaria), amaha sutebia (Jepang), estévia (Brazil), hierba / yerba dulce atau estevia atau ka´a he´ê (Spanyol) (Anonim, 2008d).

  2. Asal tanaman

  Stevia merupakan herba asal Paraguay Timur (gugus pegunungan Amambay, lembah Rio Monday), oleh karena itu stevia dikenal pula dengan sebutan “Sweet Herb of Paraguay” (Bakal & Nabors , 1986) .

  3. Ekologi dan penyebaran

  Stevia telah sukses dibudidayakan di Jepang, Korea, Taiwan, dan RRC, serta negara-negara lain di dunia (Bakal & Nabors , 1986).

  4. Kandungan kimia Daun stevia mengandung senyawa glikosida steviol selain itu juga terdapat senyawa lain seperti saponin, sterol, tanin dan karotenoid. Selain itu stevia mengandung protein, serat, fosfor, besi, kalsium, kalium, natrium, magnesium, rutin (flavonoid), zat besi, zink, vitamin C serta vitamin A (Anonim, 2008f).

B. Glikosida Steviol

  Glikosida steviol merupakan suatu glikosida yang terdiri dari 2 bagian,

  Komponen glikosida steviol yang terdapat dalam tanaman stevia antara lain: steviol, steviolbiosida, steviosida, rebaudiosida A, rebaudiosida B, rebaudiosida C, rebaudiosida D, rebaudiosida E, rebaudiosida F, rubusodida, dan dulcoside A. Di antara kandungan-kandungan senyawa tersebut, steviosida dan rebaudiosida A merupakan komponen pemanis utama pada stevia (Wallin, 2007).

  Pada daun stevia terkandung steviosida (3-10% dari bobot kering), rebaudiosida A (1%) (Gardana, Simonetti, Canzi, Zanchi, Pietta, 2003), selain itu juga terdapat rebaudiosida C (1-2%), rebaudiosida B, rebaudiosida D, rebaudiosida E, steviolbioside dalam jumlah sedikit serta dulcoside A (0.4-0.7%) (Anonim, 2008b).

  Ekstrak stevia mengandung glikosida diterpen dalam jumlah tinggi. Glikosida steviol larut dalam air dan etanol, serbuknya tidak/sedikit berbau dan memiliki tingkat kemanisan sekitar 200-300 kali dari kemanisan sukrosa.

  Berdasarkan pengujian, diketahui bahwa glikosida steviol stabil terhadap panas dan terhadap hidrolisis dalam tujuannya untuk digunakan dalam makanan, termasuk minuman-minuman yang bersifat asam, di bawah kondisi proses dan penyimpanan yang normal. Glikosida steviol sebagai pemanis telah banyak digunakan, antara lain dalam minuman buah, susu serta yoghurt (Wallin, 2007).

C. Steviosida

  Steviosida merupakan komponen pemanis utama dari stevia (Wallin, 2007), yang memiliki kemanisan 300 kali kemanisan larutan 0,4% sukrosa menaikkan kadar gula darah dan tidak memungkinkan pertumbuhan bakteria dan ragi pada pangan yang menggunakan stevia sebagai pemanis. Steviosida stabil terhadap panas hingga suhu 200

  C, dapat memperlambat pembentukan plak dan karies gigi serta tidak toksis. Suatu studi mengenai toksisitas steviosida menyebutkan bahwa dari hasil studi toksisitas kronik pada tikus selama 24 bulan, termasuk studi mutagenik, terbukti stevia tidak toksik (Anonim, 2008f).

  Steviosida bersifat non kalori, hal ini terkait dengan steviosida yang tidak dimetabolisme. Steviosida di dalam tubuh akan mengalami hidrolisis di usus halus menjadi steviolbiosida yang dengan segera akan menjadi steviol. Steviol yang terbentuk akan meningkatkan kerja insulin di dalam tubuh sehingga kadar glukosa dalam darah akan menurun (Geuns, 2003).

  Menurut Bakal & Nabors (1986), hasil uji organoleptis steviosida menunjukkan aftertaste pahit, yang akan berkurang dengan meningkatnya kemurnian produk. Larutan steviosida yang dijaga pada suhu 100 C dengan pH antara 3-9 selama 1 jam menunjukkan tidak ada perubahan yang terjadi/stabil.

  Namun, hasil pengujian juga menunjukkan bahwa pada pH 10 terjadi dekomposisi komponen.

  Menurut Alupului (2008), peningkatan volume cairan penyari akan meningkatkan jumlah steviosida yang tersari. Kelarutan steviosida di dalam air pada 20 C minimal sebanyak 40% b/b, yang akan meningkat dengan semakin tingginya suhu (Yatka, 1991). Kekuatan/daya melarutkan penyari (solvent) atau campuran penyari secara langsung berhubungan dengan polaritas campuran terkait dengan interaksi intermolekuler yang dapat terjadi, yakni antara solvent dengan cosolvent, solvent dengan solute, dan cosolvent dengan solute (McHugh & Krukonis, 1994).

D. Penyarian

  Kecepatan melintasi lapisan batas dipengaruhi oleh faktor yang mempengaruhi pemindahan massa, yaitu: derajat perbedaan konsentrasi, tebal lapisan batas, serta koefisien difusi (Anonim, 1986).

  Jika penyarian dilakukan dengan mencelupkan sejumlah serbuk simplisia begitu saja pada cairan penyari maka penyarian tidak dapat sempurna karena suatu keseimbangan akan terjadi antara larutan zat aktif yang terdapat dalam sel dengan larutan zat aktif yang terdapat di luar butir sel (Anonim, 1986).

  Penyarian dipengaruhi oleh:

  1. Derajat kehalusan serbuk

  2. Perbedaan konsentrasi yang terdapat mulai dari pusat butir serbuk simplisia sampai ke permukaannya, maupun pada perbedaan konsentrasi yang simplisia, makin panjang jarak sehingga konsentrasi zat aktif yang terlarut dan tertinggal dalam sel makin banyak.

  3. Kelarutan zat dalam cairan penyari Zat aktif yang semula berada di dalam sel akan ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari (Anonim, 1986).

E. Maserasi

  Maserasi (macerare, yang artinya mengairi, melunakkan) adalah cara ekstraksi yang paling sederhana (Voigt., 1994). Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cara penyarian ini digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel maka larutan akan terpekat akan didesak ke luar. Peristiwa tersebut terulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim, 1986).

  Menurut Voigt (1994), melalui pengocokan dijamin suatu keseimbangan konsentrasi bahan ekstraktif yang lebih cepat ke dalam cairan.

  Keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif. Semakin besar perbandingan serbuk terhadap cairan ekstraksi, akan semakin baik hasil yang diperoleh. dengan maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyarian kuranag sempurna (Anonim, 1986).

  Pada penyarian secara maserasi perlu dilakukan pengadukan. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan dalam sel dengan larutan di luar sel (Anonim, 1986).

  Menurut Anonim (1986), pada penyarian secara maserasi dapat dilakukan modifikasi dengan menggunakan pemanasan lemah yakni dengan suhu 40 -50

  C. Keuntungan maserasi dengan pemanasan antara lain:

  1. Kekentalan pelarut akan berkurang sehingga akan mengurangi lapisan batas antara serbuk dengan cairan penyari

  2. Daya melarutkan zat akan meningkat sehingga pemanasan akan mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan

  3. Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu absolut sehingga kecepatan difusi akan meningkat seiring dengan meningkatnya suhu

F. Sokletasi

  Merupakan metode penyarian senyawa alam tumbuhan yang paling luas digunakan. Metode sokletasi menggunakan ekstraksi berkelanjutan oleh cairan penyari dengan polaritas yang semakin tinggi (Heinrich dkk, 2004).

  Bahan yang akan diekstraksi berada dalam sebuah kantung ekstraksi pipa. Labu berisi bahan pelarut, yang akan menguap dan mencapai ke dalam pendingin aliran balik melalui pipa, kemudian akan berkondensasi di dalamnya, menetes ke atas bahan yang diekstraksi dan membawa keluar bahan yang diekstraksi. Larutan berkumpul di dalam wadah gelas dan setelah mencapai tinggi maksimal secara otomatis akan ditarik ke dalam labu. Dengan demikian zat yang terekstraksi tertimbun melalui penguapan continue dari bahan pelarut murni (Voigt, 1994).

  Kelebihan dari sokletasi adalah jumlah pelarut yang dibutuhkan sedikit, dan penyarian terjadi dengan pelarut yang selalu baru secara terus- menerus. Kekurangan dari sokletasi adalah membutuhkan waktu ekstraksi yang lama (beberapa jam) sehingga dibutuhkan energi listrik yang tinggi (Voigt, 1994).

G. Cairan penyari

  Menurut Anonim (1986), pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut:

  1. Murah dan mudah diperoleh

  2. Stabil secara fisika dan kimia

  3. Bereaksi netral

  4. Tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar

  5. Selektif yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki

  6. Tidak mempengaruhi zat berkhasiat pada penggunaan cairan penyari air, etanol atau etanol-air. Air dipertimbangkan sebagai penyari karena murah dan mudah diperoeh, stabil, tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, serta tidak beracun Kerugian penggunaan air sebagai penyari adalah tidak selektif, sari dapat ditumbuhi kapang dan kuman serta cepat rusak, untuk pengeringan diperlukan waktu lama.

  Air di samping melarutkan garam alkaloid, minyak menguap, glikosida, tanin, dan gula, juga melarutkan gom, pati protein, lendir, enzim, lilin, lemak, pektin, zat warna, dan asam organik.

  Etanol dapat melarutkan glikosida, klorofil, flavonoid, minyak menguap. Etanol dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan, panas yang diperlukan untuk pemekatan lebih sedikit (Anonim, 1986).

H. Kromatografi Lapis Tipis

  Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode yang paling luas dan paling mudah digunakan untuk memurnikan komponen dalam jumlah kecil (2-4) (Heinrich dkk, 2004). KLT merupakan metode pemisahan komponen- komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campuran (Mulja & Suharman, 1995). Alat yang digunakan antara lain lempeng kaca/aluminium yang telah dilapisi dengan adsorbent dengan berbagai variasi ketebalan. Umumnya

  Proses pemisahan secara kromatografi lapis tipis tergantung pada kemampuan fase diam untuk menjerap zat terlarut. Dengan kata lain, metode kromatografi lapis tipis bergantung pada kemampuan zat terlarut untuk membentuk ikatan hidrogen dengan permukaan fase diam (Gritter, 1985).

  Menurut Gritter (1985), fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penyerap (absorbent). Fase diam yang banyak dipakai adalah silika gel (SiO

  2 ) x , alumina (Al

  2 O 3 ) x , kieselgel, dan lain-lain. Lempeng fase diam dapat

  dibuat dengan cara spreading, spraying, maupun dipping. Lempeng kemudian dikeringkan dan ”diaktifkan” dengan pemanasan pada suhu sekitar 100 C untuk pra-perlakuan sebelum digunakan (Stock & Rice, 1974). Baik silika gel, kieselgel maupun alumina, semuanya bersifat polar, dengan adanya atom O dan gugus hidroksi pada permukaan. Karena sifatnya yang polar maka fase diam akan menjerap molekul polar lebih kuat daripada molekul non polar (Gritter, 1985).

  Kepolaran fase gerak yang digunakan untuk mengelusi harus disesuaikan berdasarkan kemampuannya untuk bersaing dengan permukaan fase diam untuk berinteraksi dengan molekul yang terlarut (Gritter, 1985). Menurut Mulja dan Suharman (1995), pada kromatogram KLT dapat dihitung faktor retardasi (R ), yang dirumuskan sebagai berikut:

  f Jarak migrasi komponen

  R f =

  Jarak migrasi fase gerak

  Lempeng biasanya dilapisi adsorbent dengan indikator fluorescens alam yang tidak nampak dengan deteksi UV membutuhkan reagent semprot, seperti vanillin-asam sulfat, reagent Dragendorff, asam fosfomolibdat atau antimony triklorida (Heinrich dkk, 2004).

I. Desain faktorial

  Desain faktorial digunakan jika pada suatu penelitian terdapat 2 atau lebih variabel bebas / faktor yang diuji (Muth, 1999). Faktor-faktor rancangan penelitian tidak hanya merupakan suatu faktor yang lebih efektif melalui pengurangan jumlah yang diperlukan pada percobaan, melainkan juga melibatkan antaraksi di antara faktor-faktor ini. Pada prinsipnya dapat dibedakan menjadi faktor kuantitatif dan faktor kualitatif. Faktor kuantitatif antara lain meliputi jumlah bahan pembantu, suhu, kelembaban, dan sebagainya. Sedangkan faktor kualitatif misalnya cara pembuatan, pengemasan, dan sebagainya (Voigt, 1994) .

  Keuntungan utama desain faktorial adalah dapat mengevaluasi efek dari dua atau lebih faktor, baik efek dari masing-masing faktor maupun kombinasi dari faktor-faktor tersebut. Keuntungan lain desain faktorial yaitu diperlukan subjek atau penelitian yang lebih sedikit (Muth, 1999).

  Menurut Bolton (1990), pada desain faktorial dua level dan dua faktor

  n

  diperlukan empat percobaan (2 = 4, dengan 2 menunjukkan level dan n menunjukkan jumlah faktor), yaitu (1) A dan B masing-masing pada level rendah, (a) A pada level tinggi dan B pada level rendah, (b) A pada level rendah dan B pada level tinggi, (ab) A dan B masing-masing pada level tinggi dengan notasi

  Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial Formula Faktor A Faktor B Interaksi 1 - - + a + - - b - + - ab + + +

  Persamaan umum desain faktorial adalah sebagai berikut : Y = b + b1 (A) + b

  2 (B) +b 12 (A) (B).......................................................(1)

  Berdasarkan persamaan di atas, dengan substitusi secara matematis dapat dihitung besarnya efek masing-masing faktor, maupun efek interaksinya.

  Besarnya efek dapat dicari dengan menghitung selisih antara rata-rata respon pada level tinggi dan rata-rata respon pada level rendah. Konsep perhitungan efek menurut Bolton (1990) sebagai berikut :

  Efek faktor A = ((a-(1)+(ab-b))/2 Efek faktor B = ((b-(1)+(ab-a))/2 Efek interaksi = ((ab-b)+(a-1))/2

  Menurut hasil eksperimen yang telah tersedia, efek dan antaraksi dihitung menurut skema semu, misalnya Yate’s treatment.

  J. Densitometri

  KLT densitometri merupakan salah satu metode analisis KLT kuantitatif. Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yg dipisahkan dengan cara KLT. Pada ditujukan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang sebelumnya telah dipisahkan secara KLT. Penentuan kadar analit dihubungkan dengan area bercak pada KLT (Mulja & Suharman, 1995).

  

K. ImageJ

  ImageJ merupakan suatu domain publik dengan program pengolahan gambar berbasis Java yang dikembangkan pada institusi nasional mengenai kesehatan. ImageJ didesain dengan arsitektur terbuka yang menyediakan jangkauannya melalui Java plugins dan recordable macros. Hasil yang diperoleh, analisis, dan pengolahan plugins dapat dikembangkan menggunakan ImageJ's

  

built-in editor dan Java compiler. Pengguna memungkinkan untuk memecahkan

  berbagai pengolahan gambar dan menganalisis masalah, dari gambar sel 3 dimensi sampai pengolahan gambar radiologi, berbagai perbandingan data gambar sampai sistem hematologi (Anonim, 2008b). serta analisis kuantitatif lempeng Kromatografi Lpais Tipis (KLT) (Lobasso, Lopalco, Lattanzio, Corcelli, 2003).

  Software ImageJ telah digunakan pada banyak penelitian yang diawali

  dengan ekstraksi dan dilanjutkan dengan identifikasi secara KLT. Pada suatu penelitian mengenai cardyolipin pada membran Halobacterium salinarum, ekstrak lipid yang diperoleh dianalisis dengan software imageJ sebagai analisis kuantitatifnya (Lobasso et al, 2003).

  

L. Landasan Teori Salah satu cara untuk memperoleh steviosida dari tanaman stevia dapat dilakukan dengan maserasi. Metode ekstraksi secara maserasi memiliki beberapa keuntungan antara lain pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana sehingga sesuai untuk diaplikasikan dalam industri. Cairan penyari yang digunakan harus dapat melarutkan zat dari dalam sel tumbuhan sehingga pada penelitian ini digunakan air-etanol 96% sebagai cairan penyari. Peningkatan volume cairan penyari akan meningkatkan jumlah steviosida yang tersari. Penggunaan suhu akan meningkatkan kelarutan steviosida dalam air dan etanol 96%

  Efektivitas volume cairan penyari yang digunakan akan terlihat pada kadar steviosida yang diperoleh. Untuk memperoleh volume penyari yang optimum dilakukan dengan aplikasi desain faktorial. Metode ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi efek tiap faktor, maupun interaksi faktor-faktor. Selain itu, desain faktorial juga dapat digunakan untuk memperkirakan efek yang dominan dalam menentukan respon.

  M.

  

Hipotesis Penelitian

  Dari permasalahan dan teori yang ada, maka dapat disusun hipotesis sebagai berikut:

  1. Peningkatan volume air dalam proses maserasi daun stevia akan meningkatkan kadar steviosida

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental karena adanya intervensi terhadap fenomena yang diamati. B. Variabel Penelitian

  1. Variabel utama

  a. Variabel bebas : volume air dan volume etanol, yakni 20 mL dan 50 mL b. Variabel tergantung : kadar steviosida dalam serbuk daun (% b/b serbuk daun)

  2. Variabel pengacau terkendali

  a. Varietas tanaman stevia

  b. Suhu soxhlet

  3. Variabel pengacau tidak terkendali

  a. Lama pengeringan

  b. Cara pengeringan

  c. Cara penggojogan saat proses maserasi

C. Definisi operasional

  a. Ekstrak stevia adalah ekstrak daun Stevia rebaudiana Bertonii M. cair b. Maserasi pada penelitian ini dilakukan dengan cara merendam serbuk daun stevia dalam cairan penyari etanol 96% dan air pada suhu 50 C selama 6 jam dengan penggojogan setiap 15 menit.

  c. Penggojogan yang dilakukan proses maserasi daun stevia dalam penelitian ini adalah penggojogan manual menggunakan tangan yang dilakukan setiap 15 menit selama 1 menit.

  d. Air yang digunakan untuk proses maserasi dalam penelitian ini adalah akuades.

  e. Suhu yang digunakan dalam penelitian ini dalam derajat Celsius.

  f. Penetapan kadar steviosida dilakukan terhadap ekstrak stevia secara densitometri dengan menggunakan software imageJ melalui perhitungan luas kromatogram KLT.

  g. Steviosida yang dimaksud dalam penelitian ini adalah steviosida yang dinyatakan setara dengan baku steviosida (99,2% assay dengan HPLC BM 804,87 Wako, Jepang)

  h. Faktor besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini digunakan 2 faktor, yaitu volume air dan etanol 96%. i. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya, besarnya dapat dihitung. Dalam penelitian ini respon yang diamati adalah kadar steviosida (% b/b serbuk daun) yang diperoleh dari proses maserasi pada j. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level dan faktor.

  Besarnya efek dapat dicari dengan menghitung selisih antara rata-rata respon pada level tinggi dan rata-rata respon pada level rendah.

D. Alat

  Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: 1 set alat soxhlet (Quickfit), mantel heater (Toshniwal), waterbath (Emerson dan Boom.B.V. Meppel), chamber, lempeng KLT Kieselgel 60 F 254 (Merck), pipa kapiler 1 µL (Einmal- Mikropipetten), blender, pengayak mesh 50, kain untuk menyaring, timbangan analitik (Metler Toledo), Hotplate Magnetic Stirer (Cenco Instrumen.b.v, Breda, the Netherland’s), oven (Memmert dan Termak’s), software Image J, scanner (Canon MP 160), dan alat-alat gelas

E. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: simplisia daun stevia, baku steviosida (99,2% assay dengan HPLC BM 804,87 dari Wako, Jepang), N-Heksan teknis (Brataco Chemika), etanol 96% teknis (Brataco Chemika), aquades (USD), aquabides (PT. Ikapharmindo Putramas), chloroform p.a (Merck), metanol p.a. (Merck), kalium iodida (MKRChemical’s), iodium kristal (MKRChemical’s), vanilin asam sulfat

F. Tata Cara Penelitian

  Pengumpulan bahan dan determinasi 1.

  Daun stevia diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, (BP

  2 TO

  2 T) Tawangmangu dalam kondisi sudah kering.

  2. Preparasi bahan penelitian Daun stevia kering kemudian dipisahkan dari ranting-ranting dan benda-benda asing yang ada, kemudian dikeringkan kembali dalam oven dengan suhu 40 C selama 1 hari. Setelah daun kering, dilakukan penyerbukan menggunakan blender. Daun selanjutnya diayak dengan ayakan mesh 50.

  3. Defatisasi awal Sebanyak 50 gram serbuk dimasukkan ke dalam kantung kertas saring, kemudian kantung dijahit dan dimasukkan ke dalam sokhlet. Sokhletasi dilakukan selama 2x8 jam, pada suhu berkisar 55 C-66 C dengan cairan penyari heksan. Setelah 8 jam pertama usai, penyari diganti dengan yang baru.

  Residu sampel yang diperoleh kemudian disimpan dalam oven suhu 40ºC untuk menguapkan heksan.

  4. Maserasi Serbuk sampel hasil soxhletasi yang telah kering selanjutnya dimaserasi dengan penyari air dan etanol 96% pada suhu 50ºC selama 6 jam

  Tabel II. Perbandingan volume air dan etanol yang digunakan untuk maserasi 4 gram serbuk Air (mL) Etanol 96% (mL) 20 20

  50 20 20 50 50 50 Replikasi 2 kali.

  5. Analisis kualitatif steviosida Maserat yang diperoleh kemudian ditotolkan pada lempeng KLT dan dielusi menggunakan fase gerak kloroform:metanol:aquabides (10:15:2).

  Selanjutnya lempeng disemprot dengan larutan iodium kemudian setelah kering dilanjutkan dengan disemprot larutan vanilin-asam sulfat pekat.

  Lempeng lalu dipanaskan untuk menampakkan bercak dan dihitung harga Rf untuk masing-masing bercak. Harga Rf sampel yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan harga Rf baku steviosida.

  6. Analisis kuantitatif steviosida

  a. Pembuatan kurva baku Membuat larutan baku steviosida dengan kadar 2 mg/mL.

  Kemudian larutan ditotolkan pada lempeng KLT yang sama dengan sampel. Larutan baku ditotolkan sebanyak 1 µL, 2 µL, 3 µL, 4 µL, 5 µL, 6 µL, dan 7 µL sehingga diperoleh seri kadar larutan baku yang mengandung 2 µg, 4 µg, 6 µg, 8 µg, 10 µg, 12 µg, dan 14 µg steviosida. dilanjutkan dengan penyemprotan larutan vanilin-asam sulfat pekat dan pemanasan lempeng. Kromatogram yang diperoleh kemudian di-scan dan dilakukan pengukuran AUC seri baku menggunakan software imageJ. Dari plot antara jumlah steviosida (mg) dan AUC dapat disusun suatu persamaan regresi linear y = Bx + A.

  b. Analisis kuantitatif sampel dengan software imageJ Dari persamaan regresi linear yang diperoleh kemudian dapat dihitung kadar steviosida yang terdapat dalam sampel (% b/b serbuk daun), dengan mensubstitusikan nilai AUC sampel ke dalam persamaan regresi linear sebagai nilai y sehingga diketahui nilai x sebagai kadar steviosida. Analisis kuantitatif sampel dengan aplikasi desain faktorial c.

  Hasil perhitungan kadar steviosida dalam sampel (% b/b serbuk daun) yang diperoleh kemudian dianalisis dengan aplikasi desain faktorial.

  Dari pengolahan data, dapat dihitung efek air, efek etanol 96%, dan interaksi keduanya dalam mempengaruhi kadar steviosida sehingga dapat diketahui efek dominan yang mempengaruhi kadar steviosida yang diperoleh dari proses maserasi daun stevia selain itu juga akan diperoleh persamaan desain faktorial Y =