METODE Waktu dan Tempat Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Praktikum dilakukan pada hari Rabu, 14 September sampai 19 Oktober 2016 pukul 13.00
WIB sampai selesai di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu mortar, perangkat elektroforesis, sentrifus, tabung
sentrifus, neraca,pipet mikro, tip, tabung effendorf, gelas piala, labu takar, pH meter, tabung
Erlenmeyer, gelas piala, Uv transiluminator, incubator dan vortex.
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun jahe merah, daun kunyit, Tris Hcl 25 mM,
EDTA 10 mM, sukrosa 15 %, NaOH 0.2 M, SDS 1 %, larutan Na asetat 3 M pH 4.6, larutan
fenol:kloroform, etanol absolut, etanol 70 %, dH2O steril, akuades, media NB, 0.5 g ekstral
khamir, 1 g tripton, 0.5 g NaCl, 50 ppm ampicillin, DNA plasmid, Buffer restriksi, enzim
retriksi, pewarna Etbr, buffer ekstraksi, buffer lisis 1 (SDS 20 %), buffer lisis 2 (potassium asetat
5 M), larutan kloroform;isoamilalkohol (24:1), alcohol dingin 100%, buffer TE, agarosa, asam
borat, loading dye, es batu dan DNA marker 1 kb.
Prosedur
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Plasmid
Larutan isolasi DNA plasmid terdiri dari larutan 1 (Tris-HCl 1 M pH 7.5, EDTA 0.5 M,
Sukrosa 20%), larutan 2, larutan 3, buffer TE, dan Nutrient Broth (NB).
Stok Tris-HCl 1 M pH 7.5 pada larutan 1. Dibuat dari 3.0285 g Tris-HCl yang dilarutkan
dalam 25 mL akuades. Stok EDTA 0.5 M dibuat dari 4.655 g EDTA yang dilarutkan dalam 25
mL akuades. Stok sukrosa 20% dibuat dengan melarutkan 5 g sukrosa dalam 25 mL akuades.
Larutan 1 akhir dibuat dengan mencampur 1,25 mL Tris-HCl, 2 mL EDTA dan 37.5 mL sukrosa
dan dilarutkan dengan akuades hingga volume akhirnya 50 mL.
Stok NaOH 0.2 M larutan 2. Dibuat dari 0.5 g NaOH yang dilarutkan dalam 25 mL
akuades. Stok SDS 1% dibuat dengan melarutkan 2.5 g SDS dalam 25 mL akuades. Larutan 2
akhir dibuat dengan mencampur 20 mL NaOH dan 5 mL SDS 1% lalu dilarutkan dengan akuades
hingga volume akhirnya 50 mL.
Na-asetat 3 M pH 4.6. Dibuat dengan melarutkan 6.1570 g Na-asetat dalam akuades lalu
diadjust pHnya dengan asetat glasial hingga pH menjadi 4.6 lalu akuades ditambahkan hingga
volume akhirnya 25 mL.
Buffer TE. Dibuat dengan mencampur Tris-HCL dan EDTA dengan konsentrasi sama
yaitu 0.025 M
Stok Nutrient Broth (NB). Dibuat dengan melarutkan 3.25 g bubuk NB dalam 250 mL
akuades dan stok ampisilin dibuat dengan melarutkan 0.05 g dalam 100 mL akuades (50 ppm).
Larutan akhir NB dibuat dengan melarutkan 32 mL NB dan 8 mL ampisilin sehingga kelarutan
ampisilin menjadi 10 ppm dalam 40 mL.
Isolasi dan pemurnian DNA plasmid
Kultur bakteri yang telah dibiakkan semalaman dalam media NB (Nutrient Broth)
sebanyak 1.5 mL di pipet ke dalam tabung eppendorf lalu disentrifugasi 8.000 rpm selama 3
menit. Pelet diambil dan dicuci 3 kali dengan buffer TE dengan perbandingan 1 mL Tris HCl dan
1 mL EDTA. Larutan 1 ditambahkan ke supernatan sebanyak 1 mL kemudian larutan divorteks
sehingga pelet tersuspensi. Tabung diinkubasi di atas es selama 5 menit kemudian ditambahkan
larutan 2 sebanyak 2 mL lalu tabung ditutup dan isinya dihomogenkan dengan membolak-balik
tabung. Tabung disimpan di atas es selama 5 menit dan ditambahkan larutan 3 sebanyak 1.5 mL
lalu tabung ditutup dan dibolak-balik agar homogen kemudian diinkubasi di atas es selama 5
menit. Tabung lalu disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4°C dan diambil supernatannya
kemudian ditambahkan larutan fenol/kloroform sebanyak 300 µL. Supernatan kemudian
divorteks lalu disentrifugasi selama 5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung eppendorf baru
dengan hati-hati lalu ditambahkan etanol absolut 1 mL kemudian divorteks dan diinkubasi pada
suhu ruang selama 5 menit. Tabung disentrifugasi selama 5 menit, diambil peletnya dan
disuspensi dengan 1 mL etanol 70% lalu divorteks 1 menit dan disentrifugasi. Pelet diambil dan
dikeringkan lalu disuspensi dalam 20-50 µL dH 2O/ Buffer TE (10 mL Tris HCl pH 7.5-8 dan 1
mM EDTA).
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Kromosom
Pembuatan buffer lisis 1 dibuat dari 10 g SDS yang diencerkan dalam labu takar 50 mL
sehingga konsentrasinya menjadi 20%. Buffer lisis 2 dibuat dari 24.53 g K-asetat yang dilarutkan
dalam 50 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 5 M. Buffer ekstraksi terdiri dari
akuades steril, Tris-HCl 1 M pH 8, EDTA 0.5 M pH 8, NaCl 5 M, CTAB 2%, β-merkaptoetanol
2% dan buffer TE 0.01 M pH 7.6. Stok Tris-HCl 4 M diencerkan menjadi 1 M dengan
melarutkan 625 mL stok dalam 25 mL akuades steril. Stok EDTA 0.79 M diencerkan menjadi 0.5
M dengan melarutkan 15.82 mL stok dalam 25 mL akuades steril. NaCl 5 M dibuat dari 7.3125 g
serbuk NaCl yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. CTAB 2% dibuat dari 0.5 g CTAB
yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. β-merkaptoetanol 2% dibuat dengan melarutkan 0.5
mL larutan dalam 25 mL akuades steril. Buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 7.6 dicampur
1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8.
Isolasi Kromosom Daun Jahe Merah dan Kunyit
Daun Jahe merah dan kunyit dipotong-potong dan digerus sampai halus dalam mortar
yang disimpan dalam baskom yang diisi es. Hasil gerusan dimasukan ke tabung effendorf.
Kemudian ditambahkan buffer ektraksi dengan volume 4 kali volume awal sampel dan 50 µL
larutan buffer 1. Selanjutnya panaskan pada suhu 65 oC selama 15 menit. Kemudian
ditambahkan 100 µL larutan buffer 2 dan kocok selama 10 menit dan sentrifus pada kecepatan
14000 rpm selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus dipindahkan pada tabung effendorf baru
dan pellet dibuang. Selanjutnya supernatant ditambahkan larutan kloroform sebanyak setengah
dari volume awal sampel. Tabung dibulak balik sampai homogen dan disentrifus kembali dengan
kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan pada tabung effendorf baru dan
ditambahkan larutan isopropanol dingin sebanyak 2 kali volume awal sampel. Selanjutnya
tabung didiamkan dalam wadah berisi es selama 30 menit dan selanjutnya disentrifugasi dengan
kecepatan 14000 rpm dalam waktu 5 menit. Supernatant dibuang, kemudian pellet ditambahkan
dengan 1 mL etanol dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung. Selanjtnya
dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14000 rpm dalam 5 menit. Supertanan
dibuang, dan pellet dikeringkan dengan cara membalikan tabung. Setelah kering, pellet
ditambahkan dengan 50 µL larutan TE maka didapatkan DNA kromosom. DNA kromosom
tersebut didimpan pada lemari es.
Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Retriksi
Sebanyak 16 µL NFW (Nuklease Free Water) dimasukan kedalam tabung effendorf
dalam keadaan dingin. Selanjutnya ditambahkan 2 µL buffer enzim, 1 µL DNA plasmid dan 1
µL enzim retriksi. Setiap penambahan larutan dilakukan homogenasi dengan pipeting.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Kemudian ditambahakan Etbr dan
diinkubasi kembali pada suhu 65 sampai 70 oC selama 1 jam. Kemudian dilakukan elektroforesis
dengan 75 sampai 100 volt selama 1 sampai 2 jam. Hasil plasmid pemotongan dibandingkan
dengan DNA plasmid utuh.
Pembuatan Larutan dan Gel untuk Elektroforesis Agarosa
Larutan buffer TBE 5X dibuat dari Tris HCl 1 M pH 8.3, asam borat 0.83 M dan EDTA 10
mM. Gel agarosa terbuat dari agarosa yang ditimbang 0.5 g lalu dilarutkan dalam 50 mL buffer
TBE 5X. Gel lalu dituang ke dalam cetakan gel agarosa dan setelah membeku diletakkan ke
dalam tangki elektroforesis yang telah diisi buffer TBE 5X sampai gel terendam.
Elektroforesis Gel Agarosa
Sebanyak 5 µL masing-masing DNA dicampur dengan 1 µL loading dye lalu disuspensi.
Suspensi loading dye diinjeksi ke dalam sumur pada gel elektroforesis. Power supply perangkat
elektroforesis DNA dengan voltase 60 V selama 2 jam dinyalakan setelah semua sumur terisi.
Gel hasil elektroforesis diangkat dan divisualisasi menggunakan transiluminator.
Waktu dan Tempat Penelitian
Praktikum dilakukan pada hari Rabu, 14 September sampai 19 Oktober 2016 pukul 13.00
WIB sampai selesai di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu mortar, perangkat elektroforesis, sentrifus, tabung
sentrifus, neraca,pipet mikro, tip, tabung effendorf, gelas piala, labu takar, pH meter, tabung
Erlenmeyer, gelas piala, Uv transiluminator, incubator dan vortex.
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun jahe merah, daun kunyit, Tris Hcl 25 mM,
EDTA 10 mM, sukrosa 15 %, NaOH 0.2 M, SDS 1 %, larutan Na asetat 3 M pH 4.6, larutan
fenol:kloroform, etanol absolut, etanol 70 %, dH2O steril, akuades, media NB, 0.5 g ekstral
khamir, 1 g tripton, 0.5 g NaCl, 50 ppm ampicillin, DNA plasmid, Buffer restriksi, enzim
retriksi, pewarna Etbr, buffer ekstraksi, buffer lisis 1 (SDS 20 %), buffer lisis 2 (potassium asetat
5 M), larutan kloroform;isoamilalkohol (24:1), alcohol dingin 100%, buffer TE, agarosa, asam
borat, loading dye, es batu dan DNA marker 1 kb.
Prosedur
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Plasmid
Larutan isolasi DNA plasmid terdiri dari larutan 1 (Tris-HCl 1 M pH 7.5, EDTA 0.5 M,
Sukrosa 20%), larutan 2, larutan 3, buffer TE, dan Nutrient Broth (NB).
Stok Tris-HCl 1 M pH 7.5 pada larutan 1. Dibuat dari 3.0285 g Tris-HCl yang dilarutkan
dalam 25 mL akuades. Stok EDTA 0.5 M dibuat dari 4.655 g EDTA yang dilarutkan dalam 25
mL akuades. Stok sukrosa 20% dibuat dengan melarutkan 5 g sukrosa dalam 25 mL akuades.
Larutan 1 akhir dibuat dengan mencampur 1,25 mL Tris-HCl, 2 mL EDTA dan 37.5 mL sukrosa
dan dilarutkan dengan akuades hingga volume akhirnya 50 mL.
Stok NaOH 0.2 M larutan 2. Dibuat dari 0.5 g NaOH yang dilarutkan dalam 25 mL
akuades. Stok SDS 1% dibuat dengan melarutkan 2.5 g SDS dalam 25 mL akuades. Larutan 2
akhir dibuat dengan mencampur 20 mL NaOH dan 5 mL SDS 1% lalu dilarutkan dengan akuades
hingga volume akhirnya 50 mL.
Na-asetat 3 M pH 4.6. Dibuat dengan melarutkan 6.1570 g Na-asetat dalam akuades lalu
diadjust pHnya dengan asetat glasial hingga pH menjadi 4.6 lalu akuades ditambahkan hingga
volume akhirnya 25 mL.
Buffer TE. Dibuat dengan mencampur Tris-HCL dan EDTA dengan konsentrasi sama
yaitu 0.025 M
Stok Nutrient Broth (NB). Dibuat dengan melarutkan 3.25 g bubuk NB dalam 250 mL
akuades dan stok ampisilin dibuat dengan melarutkan 0.05 g dalam 100 mL akuades (50 ppm).
Larutan akhir NB dibuat dengan melarutkan 32 mL NB dan 8 mL ampisilin sehingga kelarutan
ampisilin menjadi 10 ppm dalam 40 mL.
Isolasi dan pemurnian DNA plasmid
Kultur bakteri yang telah dibiakkan semalaman dalam media NB (Nutrient Broth)
sebanyak 1.5 mL di pipet ke dalam tabung eppendorf lalu disentrifugasi 8.000 rpm selama 3
menit. Pelet diambil dan dicuci 3 kali dengan buffer TE dengan perbandingan 1 mL Tris HCl dan
1 mL EDTA. Larutan 1 ditambahkan ke supernatan sebanyak 1 mL kemudian larutan divorteks
sehingga pelet tersuspensi. Tabung diinkubasi di atas es selama 5 menit kemudian ditambahkan
larutan 2 sebanyak 2 mL lalu tabung ditutup dan isinya dihomogenkan dengan membolak-balik
tabung. Tabung disimpan di atas es selama 5 menit dan ditambahkan larutan 3 sebanyak 1.5 mL
lalu tabung ditutup dan dibolak-balik agar homogen kemudian diinkubasi di atas es selama 5
menit. Tabung lalu disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4°C dan diambil supernatannya
kemudian ditambahkan larutan fenol/kloroform sebanyak 300 µL. Supernatan kemudian
divorteks lalu disentrifugasi selama 5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung eppendorf baru
dengan hati-hati lalu ditambahkan etanol absolut 1 mL kemudian divorteks dan diinkubasi pada
suhu ruang selama 5 menit. Tabung disentrifugasi selama 5 menit, diambil peletnya dan
disuspensi dengan 1 mL etanol 70% lalu divorteks 1 menit dan disentrifugasi. Pelet diambil dan
dikeringkan lalu disuspensi dalam 20-50 µL dH 2O/ Buffer TE (10 mL Tris HCl pH 7.5-8 dan 1
mM EDTA).
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Kromosom
Pembuatan buffer lisis 1 dibuat dari 10 g SDS yang diencerkan dalam labu takar 50 mL
sehingga konsentrasinya menjadi 20%. Buffer lisis 2 dibuat dari 24.53 g K-asetat yang dilarutkan
dalam 50 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi 5 M. Buffer ekstraksi terdiri dari
akuades steril, Tris-HCl 1 M pH 8, EDTA 0.5 M pH 8, NaCl 5 M, CTAB 2%, β-merkaptoetanol
2% dan buffer TE 0.01 M pH 7.6. Stok Tris-HCl 4 M diencerkan menjadi 1 M dengan
melarutkan 625 mL stok dalam 25 mL akuades steril. Stok EDTA 0.79 M diencerkan menjadi 0.5
M dengan melarutkan 15.82 mL stok dalam 25 mL akuades steril. NaCl 5 M dibuat dari 7.3125 g
serbuk NaCl yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. CTAB 2% dibuat dari 0.5 g CTAB
yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. β-merkaptoetanol 2% dibuat dengan melarutkan 0.5
mL larutan dalam 25 mL akuades steril. Buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 7.6 dicampur
1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8.
Isolasi Kromosom Daun Jahe Merah dan Kunyit
Daun Jahe merah dan kunyit dipotong-potong dan digerus sampai halus dalam mortar
yang disimpan dalam baskom yang diisi es. Hasil gerusan dimasukan ke tabung effendorf.
Kemudian ditambahkan buffer ektraksi dengan volume 4 kali volume awal sampel dan 50 µL
larutan buffer 1. Selanjutnya panaskan pada suhu 65 oC selama 15 menit. Kemudian
ditambahkan 100 µL larutan buffer 2 dan kocok selama 10 menit dan sentrifus pada kecepatan
14000 rpm selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifus dipindahkan pada tabung effendorf baru
dan pellet dibuang. Selanjutnya supernatant ditambahkan larutan kloroform sebanyak setengah
dari volume awal sampel. Tabung dibulak balik sampai homogen dan disentrifus kembali dengan
kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan pada tabung effendorf baru dan
ditambahkan larutan isopropanol dingin sebanyak 2 kali volume awal sampel. Selanjutnya
tabung didiamkan dalam wadah berisi es selama 30 menit dan selanjutnya disentrifugasi dengan
kecepatan 14000 rpm dalam waktu 5 menit. Supernatant dibuang, kemudian pellet ditambahkan
dengan 1 mL etanol dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung. Selanjtnya
dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14000 rpm dalam 5 menit. Supertanan
dibuang, dan pellet dikeringkan dengan cara membalikan tabung. Setelah kering, pellet
ditambahkan dengan 50 µL larutan TE maka didapatkan DNA kromosom. DNA kromosom
tersebut didimpan pada lemari es.
Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Retriksi
Sebanyak 16 µL NFW (Nuklease Free Water) dimasukan kedalam tabung effendorf
dalam keadaan dingin. Selanjutnya ditambahkan 2 µL buffer enzim, 1 µL DNA plasmid dan 1
µL enzim retriksi. Setiap penambahan larutan dilakukan homogenasi dengan pipeting.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Kemudian ditambahakan Etbr dan
diinkubasi kembali pada suhu 65 sampai 70 oC selama 1 jam. Kemudian dilakukan elektroforesis
dengan 75 sampai 100 volt selama 1 sampai 2 jam. Hasil plasmid pemotongan dibandingkan
dengan DNA plasmid utuh.
Pembuatan Larutan dan Gel untuk Elektroforesis Agarosa
Larutan buffer TBE 5X dibuat dari Tris HCl 1 M pH 8.3, asam borat 0.83 M dan EDTA 10
mM. Gel agarosa terbuat dari agarosa yang ditimbang 0.5 g lalu dilarutkan dalam 50 mL buffer
TBE 5X. Gel lalu dituang ke dalam cetakan gel agarosa dan setelah membeku diletakkan ke
dalam tangki elektroforesis yang telah diisi buffer TBE 5X sampai gel terendam.
Elektroforesis Gel Agarosa
Sebanyak 5 µL masing-masing DNA dicampur dengan 1 µL loading dye lalu disuspensi.
Suspensi loading dye diinjeksi ke dalam sumur pada gel elektroforesis. Power supply perangkat
elektroforesis DNA dengan voltase 60 V selama 2 jam dinyalakan setelah semua sumur terisi.
Gel hasil elektroforesis diangkat dan divisualisasi menggunakan transiluminator.