Aktivitas am dan ma sifat
I.
Kompentensi umum
Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk mengetahui
aktivitas antimikroba dari ekstrak etanolik daun jamblang (Eugenia
cumini) metode perkolasi dengan metode difusi agar dan KLT
biautografi terhadap beberapa mikroba uji.
II. Kompetensi Khusus
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk menetukan
aktivitas antimikroba dari ekstrak etanolik daun jamblang (Eugenia
cumini) metode perkolasi dengan metode difusi agar dan KLT
biautografi terhadap beberapa mikroba uji.
III. Prinsip
Pada penentuan aktivitas antimikroba dari ekstrak etanolik
daun jamblang (Eugenia cumini) metode perkolasi, dilakukan dengan
melakukan uji skrining terlebih dahulu terhadap bakteri EC,SA, ST,
SE, SM, PA, VC, CA, BS, SD. Kemudian dilakukan uji aktivitas
antimikroba dari ekstrak etanolik daun jamblang dengan kosentras
0,1%, 1% dan 5% dengan menggunakan metode difusi agar dan KLT
biautografi terhadap Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa
IV. Dasar Teori
Sebagian besar antimikroba dibedakan atas dua bagian, yaotu
berdasarkan zat digunka dalam pengobatan infeksi penyakit yaitu
antibiotic, jenis ini biasanya diproduksi oleh bagian tertentu dari
bagian mikroorganisme, dan zat kemoterapeutik tang pembuatannya
secara kimia. Salah satu jenis hybrid adalah semisintetik antibiotic,
dimana suatu molekuk yang diprodusi oleh mikroba kemudian
dimodifikasi dengan aktif untukmendapatkan apa yang diinginkan
(Dwyana, 2011).
Pengujian mikrobilogi memenfaatkan mikroorganisme sebagai
indikator pengujian. Dalm hal ini mikroorganisme digunakan sebgai
penentu konsentrasi komponene tertentu pada campuran kompleks
kimia untuk mendiagnosis penyakit tertentu , serta untuk menguji
bahan kimia guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik
suartu bahan. Macam-macam uji yag dapat dilakukan adalah uji
antibiotik/ antau anti mikroba, bioautografi, uji vitamin dan asam
amino, uji ames, dan penggunaan mikroorganisme sebagai model
metabolisme (Pratiwi,2008).
Uji antimikroba. Pada uji ini diukur pertumbuhan populasi
mikroorganisme terhadap agen antimikroba,tujuan assay antimikroba
adalah menentukan potensi kontrol kualitas selama proses produksi
senyawa antimikroba di pabrik. Kegunaanuji antimikroba adalah
diperolehnya
suatu
sistem
pengobatan
yang
efektif
dan
efesien(Pratiwi,2008).
Pada
mulanya
ddga
mekanismes
anti
mikroba
adalah
antagonis kompetitif, tetapi nyatanya antagonisme kompetitif jarang
terjadi, salah satu contoh yang berdasarkan kejadian ini ialah
sulfonsmid
yang
dapat
mengantikan
kedudukan
PABA
yang
merupakan metabolit esensial dalam sinstesis asam folat. Sulfonamid
dalam
stkukturnya
anaog
PABA dn
bersaing
dengan
PABA
menempatkan diri dalam pusat enzim yang aktif,ingga terbentuk asam
folat tetapi mencegah pertumbuhan bakteri (Irianto,2006).
Diantara banyak faktor yang mempengaruhi aktias anmikroba
in vitro, hal tersebut dibawani perlu diperhatikan,karena sangat
mempegaruhi hasil-hasil mempengaruhi hasil-hasil pengujian :
1. pH lingkungan
2. Komponen-komponen medium
3. Stabilitas obat
4. Takaran inokulum
Metode difusi. Metode disc diffusion (tes Kirby & bauer) untuk
menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen
antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakan pada
media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi
pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya
hambatan pertumbuhan mikroorganise oleh agen anti mikroba pada
permukaan media agar(Pratiwi,2008).
Bioatografi
adalah
suatu
metode
pedeteksian
untuk
mennemukan suatu senyawa anti mikroba yang belum teridentifikasi
dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pasa suatu
kromatogram. Metode ini memanfaatkan pengerjaan
kromatografi
lapis tipis (KLT). Pada biografi ini didasarkan atas efek biologik berupa
antibakteri antiprotozoa, antitumor dan lain lain dari substansi yang
diteliti.
V. Metode Kerja
1. Alat
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum Ini
adalah Autoklaf, Botol coklat, Botol eluen, Cawan petri steril,
Chamber, Erlenmeyer, Inkubator, Lampu spiritus, Lampu UV,
Pinset, Pipa kapiler, Ose bulat, Rak tabung, Spoit 1 ml, 5 ml, 10 ml,
Tabung reaksi, dan vial.
2. Bahan
1. Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini
adalah air steril, alkohol, biakan Staphylococcus aureus,
Salmonella thyposa, Shigella dysentriae.
E-coli, Pseudomonas aureginosa
, Vibrio sp, Candida albicans, DMSO, disk blank, kapas,
medium GNA, NA, PDA dan tissue.
3. Cara Kerja
a. Skrining
1) Ditimbang ekstrak daun asam sebanyak 10 mg
2) Dimasukkan dalam vial steril, ditambahkan 0,2 ml DMSO
3) Ditambahkan medium NA untuk suspense bakteri dan
medium PDA untuk suspense jamur sebanyak 9,8 ml
4) Dihomogenkan
5) Dimasukkan dalam cawan petri steril (satu cawanpetri untuk
PDA dan dua cawan petri untuk NA), dihomogenkan
6) Cawan petri PDA dibagi dua, dan cawan petri NA pertama
dibagi 4 dan yag kedua dibagi 3
7) Untuk medium NA, digoreskan suspensi bakteri SD, E.coli,
Pseudomonas
aeruginosa,
Staphylococcus
aureus,
Salmonella thyposa, Vibrio cholera, Basillus subtilis.
8) Untuk medium PDA, dogoreskan suspensi jamur Candida
albicans.
9) Diinkubasi (untuk bakteri pada incubator dan jamur pada
enkas)
10)Diamati 1 x 24 jam untuk bakteri dan 3 x 24 jam untuk jamur
b. Metode KLT Bioautografi
2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
3. Dibuat eluen kloroform : methanol dengan perbandingan nheksan : etil asetat dengan perbandingan 4 : 1, dan
kloroform : methanol dengan perbandingan 1 : 1 masingmasing dalam 50 ml
4. Dimasukkan sampel ekstrak daun asam secukupnya dalam
vial
5. Dilarutkan dengan kloroform : methanol 1 : 1
6. Ditotolkan pada 2 lempeng KLT
7. Dimasukkan dalam camber untuk dielusi yang berisi eluen
pada eluen n-heksan : etil asetat untuk
8. Dilihat pada sinar Ultra Violet 254 nm dan 366 nm
9. Diamati dan difoto
10. Lempeng yang telah diamati dimasukkan dalam
cawan
petri yang berisi medium NA dan mikroorganisme E-coli dan
Pseudomonas aureginosa
11. Dibiarkan selama 30 menit, lempeng dibuka dari medium
lalu dihitung nilai RF tiap noda
12. Diinkubasi 1 x 24 jam untuk bakteri (dalam incubator) dan 3
x 24 jam untuk jamur (dalam enkas)
c. Metode Difusi Agar
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Ditimbang ekstrak daun asam dengan konsentrasi 0,1 %, 1
% dan 10 % masing-masing sebanyak
3. Dimasukkan kedalam vial dan dilarutkan dengan DMSO 2
ml
4. Ditambahkan dengan air steril 9,8 ml dan dimasukkan disk
blank ke dalam vial dan dibiarkan selama 30 menit
5. Kemudian airnya dibuang dan disk blank ditempelkan pada
dinding vial
6. Medium NA 10 ml dimasukkan ke dalam vial steril dan
dimasukkan susupensi mikroba sebanyak 1 ose
7. Dimasukkan dalam medium cawan petri yang telah dibagi
menjadi 3 bagian, diabiarkan memadat
8. Dimasukkan disk blank yang telah direndam kedalam
ekstark daun asam dengan konsentrasi yang berbeda
9. Dilakukan hal yang sama untuk suspensi mikroba yang lain
VI. Hasil Praktikum
1. Foto
2. Tabel Pengamatan
a. Uji skrining
Ke
l
Sampel
1.
Ekstrak Daun Jamblang
Perkolasi
S
D
S
A
S
M
Bakteri Uji
S
E
V
PA
T
C
C
-
-
-
-
+
Keterangan : (+)
= Tidak ada pertumbuhan koloni (Aktif)
(-)
= Ada pertumbuhan koloni (Tidak aktif)
-
+
B
S
SE
-
-
EC
= Escherichia coli
PA
= Pseudomonas aeruginosa
SA
= Staphylococcus aureus
VC
= Vibrio cholera
ST
= Salmonella thyposa
CA
= Candida albicans
SE
= Streptococus epididimis
BS
= Bacillus subtilis
SM
= Streptococcus mutans
SD
= Shigella dysentri
C
A
-
b. Uji aktivitas antimikroba
Ke
Bakteri Uji
SampeL
PA
l
2.
Ekstrak Daun jamblang
(0,1 % )
(0,5 % )
(1% )
EC
9
9,3
9,6
10
11,6
11
Keterangan :
EC
= Escherichia coli
1. Perhitungan
Bakteri
Diameter rata-rata
0,1%
1%
10%
Jumlah
(y)
Rata-rata
Pseudomonas aeruginosa
9
9,3
9,6
27,9
9,3
Escherichia coli
10
11,6
11
32.6
10.87
Jumlah
19
20,9
20,6
60,5
10,17
Rata-rata
9,5
10,45
10,3
a. Perhitungan Faktor Koreksi (FK)
FK
y
¿
¿
=
¿2
¿
¿
60,5
¿
¿
=
¿2
¿
¿
3660,25
=
6
= 610,041
b. Perhitungan Jumlah Kuadrat (JK)
JK Total
= (27,92 + 32,62) – FK
= (778,41 + 1062,76) – 341,33
= 1841,17 – 610,041
= 1231,129
JK Perlakuan =
=
60,5 2
– FK
3
3660,25
– FK
3
= 1220,083 -610,041
= 610,0423
JK Kelompok =
JK Galat
60,5 2
2
– FK
= 1830,125 – 610,041
= 1220,084
= JKT – JKP – JKK
= 1231,129– 610,0423-1220,084
= -598,9973
c. Perhitungan Derajat Bebas (DB)
DB Total
=6–1
=5
DB Kelompok = 3 – 1
=2
DB Perlakuan = 2 – 1
=1
DB Galat
= 5-2-1
=2
d. Perhitungan Kuadrat Tengah (KT)
KT Perlakuan =
=
JKP
DBP
610,0423
1
= 610,0423
KT Kelompok =
=
JKK
DBK
1220,084
2
= 610,042
KT Galat
=
JKG
DBG
=
−598,9973
2
= -299,49865
e. Perhitungan F-Hitung
F-Hitung Kelompok
KT Kelompok
KT Galat
610,042
=
−299,49865
=
= -2,03
F-Hitung Perlakuan
KT Perlakuan
KT Galat
610,0423
=
−299,49865
= −2,036
=
Tabel ANAVA
Sumber
Keseragaman
Kelompok
F
DB
JK
KT
2
2,03
-
−2,036
Perlakuan
1
Galat
2
1220,084
610,0423
-598,9973
1231,12
Total
5
9
Hitung
F Tabel
5%
1%
–
–
–
64,665
Keterangan:
Tidak ada nilai pada F Tabel karena Derajat Bebas bernilai 0.
–
Ket
Kompentensi umum
Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk mengetahui
aktivitas antimikroba dari ekstrak etanolik daun jamblang (Eugenia
cumini) metode perkolasi dengan metode difusi agar dan KLT
biautografi terhadap beberapa mikroba uji.
II. Kompetensi Khusus
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk menetukan
aktivitas antimikroba dari ekstrak etanolik daun jamblang (Eugenia
cumini) metode perkolasi dengan metode difusi agar dan KLT
biautografi terhadap beberapa mikroba uji.
III. Prinsip
Pada penentuan aktivitas antimikroba dari ekstrak etanolik
daun jamblang (Eugenia cumini) metode perkolasi, dilakukan dengan
melakukan uji skrining terlebih dahulu terhadap bakteri EC,SA, ST,
SE, SM, PA, VC, CA, BS, SD. Kemudian dilakukan uji aktivitas
antimikroba dari ekstrak etanolik daun jamblang dengan kosentras
0,1%, 1% dan 5% dengan menggunakan metode difusi agar dan KLT
biautografi terhadap Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa
IV. Dasar Teori
Sebagian besar antimikroba dibedakan atas dua bagian, yaotu
berdasarkan zat digunka dalam pengobatan infeksi penyakit yaitu
antibiotic, jenis ini biasanya diproduksi oleh bagian tertentu dari
bagian mikroorganisme, dan zat kemoterapeutik tang pembuatannya
secara kimia. Salah satu jenis hybrid adalah semisintetik antibiotic,
dimana suatu molekuk yang diprodusi oleh mikroba kemudian
dimodifikasi dengan aktif untukmendapatkan apa yang diinginkan
(Dwyana, 2011).
Pengujian mikrobilogi memenfaatkan mikroorganisme sebagai
indikator pengujian. Dalm hal ini mikroorganisme digunakan sebgai
penentu konsentrasi komponene tertentu pada campuran kompleks
kimia untuk mendiagnosis penyakit tertentu , serta untuk menguji
bahan kimia guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik
suartu bahan. Macam-macam uji yag dapat dilakukan adalah uji
antibiotik/ antau anti mikroba, bioautografi, uji vitamin dan asam
amino, uji ames, dan penggunaan mikroorganisme sebagai model
metabolisme (Pratiwi,2008).
Uji antimikroba. Pada uji ini diukur pertumbuhan populasi
mikroorganisme terhadap agen antimikroba,tujuan assay antimikroba
adalah menentukan potensi kontrol kualitas selama proses produksi
senyawa antimikroba di pabrik. Kegunaanuji antimikroba adalah
diperolehnya
suatu
sistem
pengobatan
yang
efektif
dan
efesien(Pratiwi,2008).
Pada
mulanya
ddga
mekanismes
anti
mikroba
adalah
antagonis kompetitif, tetapi nyatanya antagonisme kompetitif jarang
terjadi, salah satu contoh yang berdasarkan kejadian ini ialah
sulfonsmid
yang
dapat
mengantikan
kedudukan
PABA
yang
merupakan metabolit esensial dalam sinstesis asam folat. Sulfonamid
dalam
stkukturnya
anaog
PABA dn
bersaing
dengan
PABA
menempatkan diri dalam pusat enzim yang aktif,ingga terbentuk asam
folat tetapi mencegah pertumbuhan bakteri (Irianto,2006).
Diantara banyak faktor yang mempengaruhi aktias anmikroba
in vitro, hal tersebut dibawani perlu diperhatikan,karena sangat
mempegaruhi hasil-hasil mempengaruhi hasil-hasil pengujian :
1. pH lingkungan
2. Komponen-komponen medium
3. Stabilitas obat
4. Takaran inokulum
Metode difusi. Metode disc diffusion (tes Kirby & bauer) untuk
menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen
antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakan pada
media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi
pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya
hambatan pertumbuhan mikroorganise oleh agen anti mikroba pada
permukaan media agar(Pratiwi,2008).
Bioatografi
adalah
suatu
metode
pedeteksian
untuk
mennemukan suatu senyawa anti mikroba yang belum teridentifikasi
dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pasa suatu
kromatogram. Metode ini memanfaatkan pengerjaan
kromatografi
lapis tipis (KLT). Pada biografi ini didasarkan atas efek biologik berupa
antibakteri antiprotozoa, antitumor dan lain lain dari substansi yang
diteliti.
V. Metode Kerja
1. Alat
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum Ini
adalah Autoklaf, Botol coklat, Botol eluen, Cawan petri steril,
Chamber, Erlenmeyer, Inkubator, Lampu spiritus, Lampu UV,
Pinset, Pipa kapiler, Ose bulat, Rak tabung, Spoit 1 ml, 5 ml, 10 ml,
Tabung reaksi, dan vial.
2. Bahan
1. Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini
adalah air steril, alkohol, biakan Staphylococcus aureus,
Salmonella thyposa, Shigella dysentriae.
E-coli, Pseudomonas aureginosa
, Vibrio sp, Candida albicans, DMSO, disk blank, kapas,
medium GNA, NA, PDA dan tissue.
3. Cara Kerja
a. Skrining
1) Ditimbang ekstrak daun asam sebanyak 10 mg
2) Dimasukkan dalam vial steril, ditambahkan 0,2 ml DMSO
3) Ditambahkan medium NA untuk suspense bakteri dan
medium PDA untuk suspense jamur sebanyak 9,8 ml
4) Dihomogenkan
5) Dimasukkan dalam cawan petri steril (satu cawanpetri untuk
PDA dan dua cawan petri untuk NA), dihomogenkan
6) Cawan petri PDA dibagi dua, dan cawan petri NA pertama
dibagi 4 dan yag kedua dibagi 3
7) Untuk medium NA, digoreskan suspensi bakteri SD, E.coli,
Pseudomonas
aeruginosa,
Staphylococcus
aureus,
Salmonella thyposa, Vibrio cholera, Basillus subtilis.
8) Untuk medium PDA, dogoreskan suspensi jamur Candida
albicans.
9) Diinkubasi (untuk bakteri pada incubator dan jamur pada
enkas)
10)Diamati 1 x 24 jam untuk bakteri dan 3 x 24 jam untuk jamur
b. Metode KLT Bioautografi
2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
3. Dibuat eluen kloroform : methanol dengan perbandingan nheksan : etil asetat dengan perbandingan 4 : 1, dan
kloroform : methanol dengan perbandingan 1 : 1 masingmasing dalam 50 ml
4. Dimasukkan sampel ekstrak daun asam secukupnya dalam
vial
5. Dilarutkan dengan kloroform : methanol 1 : 1
6. Ditotolkan pada 2 lempeng KLT
7. Dimasukkan dalam camber untuk dielusi yang berisi eluen
pada eluen n-heksan : etil asetat untuk
8. Dilihat pada sinar Ultra Violet 254 nm dan 366 nm
9. Diamati dan difoto
10. Lempeng yang telah diamati dimasukkan dalam
cawan
petri yang berisi medium NA dan mikroorganisme E-coli dan
Pseudomonas aureginosa
11. Dibiarkan selama 30 menit, lempeng dibuka dari medium
lalu dihitung nilai RF tiap noda
12. Diinkubasi 1 x 24 jam untuk bakteri (dalam incubator) dan 3
x 24 jam untuk jamur (dalam enkas)
c. Metode Difusi Agar
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Ditimbang ekstrak daun asam dengan konsentrasi 0,1 %, 1
% dan 10 % masing-masing sebanyak
3. Dimasukkan kedalam vial dan dilarutkan dengan DMSO 2
ml
4. Ditambahkan dengan air steril 9,8 ml dan dimasukkan disk
blank ke dalam vial dan dibiarkan selama 30 menit
5. Kemudian airnya dibuang dan disk blank ditempelkan pada
dinding vial
6. Medium NA 10 ml dimasukkan ke dalam vial steril dan
dimasukkan susupensi mikroba sebanyak 1 ose
7. Dimasukkan dalam medium cawan petri yang telah dibagi
menjadi 3 bagian, diabiarkan memadat
8. Dimasukkan disk blank yang telah direndam kedalam
ekstark daun asam dengan konsentrasi yang berbeda
9. Dilakukan hal yang sama untuk suspensi mikroba yang lain
VI. Hasil Praktikum
1. Foto
2. Tabel Pengamatan
a. Uji skrining
Ke
l
Sampel
1.
Ekstrak Daun Jamblang
Perkolasi
S
D
S
A
S
M
Bakteri Uji
S
E
V
PA
T
C
C
-
-
-
-
+
Keterangan : (+)
= Tidak ada pertumbuhan koloni (Aktif)
(-)
= Ada pertumbuhan koloni (Tidak aktif)
-
+
B
S
SE
-
-
EC
= Escherichia coli
PA
= Pseudomonas aeruginosa
SA
= Staphylococcus aureus
VC
= Vibrio cholera
ST
= Salmonella thyposa
CA
= Candida albicans
SE
= Streptococus epididimis
BS
= Bacillus subtilis
SM
= Streptococcus mutans
SD
= Shigella dysentri
C
A
-
b. Uji aktivitas antimikroba
Ke
Bakteri Uji
SampeL
PA
l
2.
Ekstrak Daun jamblang
(0,1 % )
(0,5 % )
(1% )
EC
9
9,3
9,6
10
11,6
11
Keterangan :
EC
= Escherichia coli
1. Perhitungan
Bakteri
Diameter rata-rata
0,1%
1%
10%
Jumlah
(y)
Rata-rata
Pseudomonas aeruginosa
9
9,3
9,6
27,9
9,3
Escherichia coli
10
11,6
11
32.6
10.87
Jumlah
19
20,9
20,6
60,5
10,17
Rata-rata
9,5
10,45
10,3
a. Perhitungan Faktor Koreksi (FK)
FK
y
¿
¿
=
¿2
¿
¿
60,5
¿
¿
=
¿2
¿
¿
3660,25
=
6
= 610,041
b. Perhitungan Jumlah Kuadrat (JK)
JK Total
= (27,92 + 32,62) – FK
= (778,41 + 1062,76) – 341,33
= 1841,17 – 610,041
= 1231,129
JK Perlakuan =
=
60,5 2
– FK
3
3660,25
– FK
3
= 1220,083 -610,041
= 610,0423
JK Kelompok =
JK Galat
60,5 2
2
– FK
= 1830,125 – 610,041
= 1220,084
= JKT – JKP – JKK
= 1231,129– 610,0423-1220,084
= -598,9973
c. Perhitungan Derajat Bebas (DB)
DB Total
=6–1
=5
DB Kelompok = 3 – 1
=2
DB Perlakuan = 2 – 1
=1
DB Galat
= 5-2-1
=2
d. Perhitungan Kuadrat Tengah (KT)
KT Perlakuan =
=
JKP
DBP
610,0423
1
= 610,0423
KT Kelompok =
=
JKK
DBK
1220,084
2
= 610,042
KT Galat
=
JKG
DBG
=
−598,9973
2
= -299,49865
e. Perhitungan F-Hitung
F-Hitung Kelompok
KT Kelompok
KT Galat
610,042
=
−299,49865
=
= -2,03
F-Hitung Perlakuan
KT Perlakuan
KT Galat
610,0423
=
−299,49865
= −2,036
=
Tabel ANAVA
Sumber
Keseragaman
Kelompok
F
DB
JK
KT
2
2,03
-
−2,036
Perlakuan
1
Galat
2
1220,084
610,0423
-598,9973
1231,12
Total
5
9
Hitung
F Tabel
5%
1%
–
–
–
64,665
Keterangan:
Tidak ada nilai pada F Tabel karena Derajat Bebas bernilai 0.
–
Ket