Pages from AGRIA %28 Yulia P.Astuti%29

r{,6E:e

Vol.1, No.1, 27-29 (Agustus 2004)

TOKSISITAS KRISTAL PROTEIN DAN SPORA ISOLAT Bacillus thuringiensis
PADA LARVA LEPIDOPTERA
Toxicity of Crystal Protein and Spore Isolated from Bscillus thuringiensis
toward Lcpidopteran Larvae

Yulia Pujiastuti
Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian Universitas Srirvijaya
E-nrai I : yuluusri@yahoo.corn

ABSTRACT
3:cillus thuringiensis,

an entomopathogenic bacterium, produced spores and crystat proteins during sporulation.
were
toxic to insect pests. B. thuringiensis subsp. wuhonensis possessed three types of crystal protein (Cry1Ab,
-ey
it'r,1 Db, and mixing of CrylAb and Cryl Db), as their gene expression. The purpose of the research vras to identify

-:'e toxjcity of the spores and crystal proteins of B. thuringiensis subsp. wuhanensis. The resutts showed that Type 2
iryl Db) was very toxic to Spodotero lifuro white Type 1 (Cryl Ab) was more toxic to Plutello xylostella than 5.

-:uro.Type3wastoxicontyagainstS.litura.Thebioassay ofB.thuringiensis'sporesagainstP.xylostelloshowed

:at

Type 2 was very

toxic compared with two other types.

i',3'"drcrds: Bacillus thuringiensis, Spodoptera litura, Plutella xylostela, toxicity

PBNDAHT]LUAN

and Whiteley (1981). Gen yang diperoleh dari isolat B.

J,;..ifuis thuringiensis (B.t) adalah salah satu bakteri gram

thuringinesis sLrbsp. kurstaki itu selanjutnya disebut sebagai

pmx : : penrbentuk spot'a. Pada proses sporulasi, B.t
mrts *:esa protein yang berbentult rnasif sehingga disebut
rotu-rsl. ;rvstal protein. Dalarn perkenrbangannya, karena

antara lain disebutkan bahwa Cry digunakan untuk

iersebut bersifat toxin telhadap serangga, maka

penyebutan nama protein, sedangkan cry untuk nrenunjuk

lprmrr,:r:

gen

cryiA(a). Dalam klasiflkasi crystal protein berdasarkan

kanclungan gen yang dibuat oleh l{ofte and Whiteley (1989),

ltfrumTrr

-:-:l\.a banyal< disebut sebagai insecticidal crystal protein

gen. Dengan denrikian cry I A(a) dirnaksud untuk menyebut

,Llfli[i?'

i::u

gen, sedangkan Cryl A(a) adalah protein yang terekspresikan.

delta endotoksin. Protein yang dihasilkan sekitar

3ll lr:pai 30 persen dari sel yang bersporulasi (Hofte &
W mr:r:i- 1989).
- r r:iahui pertama kali sebagai penyebab penyakit pada
rlr.liffi'. r-:era (Bombyx mori) pada tahun l90l oleh peneliti
.@l',ui Ishiwata. Saat itu diberi narna dengan "sotto" yang
hm n" :akteri tersebut sangat cepat rnenimbulkan kematian.
iPuum snun 1915, Berliner memberi nama bakteri yang

*rili:i.n,: r.i dari ngengat tepung, Anagasta kLrhniella (Zelle$ di
m\tlir :ia. Germany, dengan sebutan Baciilus thuringiensis.
1ltw,u::nangan pesat pada penelitian B. thuringiensis
tmrrllnr.:a terjadi setelah ditemukan kandungan gen crystal
Wlmle:,-en_s dilalukan oleh Schnepf and \Vhiteley (1981).Gen
iyumiu :. :ero leh dari i so I at B . th w.ingin

rflErrn - ir\ a disebut sebagai gen cry

I

es

is s ubsp. kurs

tak

i itu

A(a).

Berdasarkan klasifikasi tersebut, rnaka dikelornpokkan
protein yang toksik terhadap Lepi,lotera (Cryl), Lepidoptera
dan Diptera (Cryll), Coleoptera

(Crylll) clan Diptera (CrylV).
Apabila protein rnasuk dalam pencernaan makanan

(rnidgut) serangga, maka protein tersebut akan larut sebab

midgut dalam kondisi alkalis. Dengan adanya enzyme
trypsin, protein selanjutnya diubah menjadi toksin (pada
umurnnya berat molekul toksin meniadi setengah berat
rnolekul protein). Molekul toksin nrenenrbus perithrophic
merntrrarre dan kernudian terikat (bind) pada blush border
membrane vesicle (BBMV) yang berada di ujung sel
rnicrovilli. Proses selanjutnya adalah pernbentukan porus
(kanal) yang rnengakibatkan terjadinya perubahan osmotik
pada sel-sel dan rnolekul toksin bereelar keseluluh tiibuh

tlmllmr[:] mati, debu bahan sirnpanan dan daun pada beberapa

mengikuti aliran darah, yang kemudian akan berakhir dengan
kematian serangga (Hofte & Whiteley, 1981)

lptrs -naman conifer. Sejak penemuannya yang pertama

Aplikasi B, thuLingiensis dapat dilakukan dengan

3 : Jiisolasi dari berbagai habitat, antara lain dari tanah,

,ml,rurm

]::liner

pada tahun 1915, penelitian tentang B.t telah

mmrn::ami kernajuan pesat. Publikasi pertama tentarrg
i&muu :ian gen pada crystal protein dilalukan oleh Schnepf

menggunakan spora lnaupun kristal proteinnya. Kelernahan
penggunaan spora secara langsirng adalah apabila tidak
mendapatkan inangnya, maka kemungkinan spora tersebut

77

y. pujiastuti : Toksisitas kristal protein dan spora isolat Ba cillus lhuringiensis pada larva lepidoptera

larva S. litura dipelihara dengan rnedia buatan sedangkan
larva P. xylostela diperbanyak dengan pakan daun kubis. Uji

akan rnati atau terjadi penlrrunan viabilitasnya. Kelebihan
penggLrnaan spora adalah bahrva sekali aplikasi berhasil dan

Lryi,

bioassal' tnenguunakan lat'va instar ketiga S. littrra dan P.
xylostella, Karena B. thuringiensis merupakan racttn perut

spora masuk kedalarn tttbuh larva, rnaka perkembangannya

di alam akan berlanjut. PenggLrnaan kristal protein dalarn

rnaka dalatn aplikasinva. baik spora nraLlpLln kristalprotein

rnengendalikan serangga hatna dari segi aplikasinya Iebih

dioleskan pada media pakannya sesuai dengan

mudah karena apabita protein tersebut masttk kedalam

konsent|asinya. Kepadatan spora per rni masing-masing isolat

pgncernaan, maka proses peracunannya akan sernakin lebih

adalah 10r, 102, 103, 101 105 dan l06spora/ml. Setelah

cepat.

aplikasi, kentatian trlat diarnati setiap

Penelitian ini bertLrjuan untuk mcngetahui toksisitas kristal
protein dan spora yang diisolasi dari B. thuringiensis subsp'

6

jarn sekali. Kernatian

Iarva dianalisis secaratabulasi dan dihitLrng nilai LDro dengan
menggunakan tnetode analisis probit (Finney, 1970).

wuhanensis.

}IASILDANPBMBAIIASAN

BAHANDANMETODE
Isolat B.thuringiensis sr.rbsp, wuhanensis merupakan isolat

Bioassay kristal protcin pada ulat Spodoptera dan ulat

koleksi Lab. Applied Molecular Entomology, I{okkaido

University. Dari hasil ekspresi gen yang dikandungnya,

Plutella

terdapat 3 tipe protein yang dihasilkan meliputi tipe
(CrylAb), tipe 2 (CrylDb) dan tipe 3 (camptrran antara

subsp.wuhanensis, dengan menggunakatl Scanning Electron
Microscope, terlihat memiliki bentuk yang bervariasi agak

Cryl Ab dan Cryl Db). (Nakatani et al., 1994). Isolat bakteri
diturnbuhkan dengan tnenggrtnakan media CYS dan
kemudian diisotasi spoLa dan kristal protein. Sebelurn

sedikit membulat dan seperti bentttk hexagonal' Pada
B.thLrringiensis tipe l, tcrlihat lebih kecil dan tnembulat,
sedangkan pada Tipe 2 lebih banyak yang berbenttrk
hexagonal, sedangkan pada Tipe 3 bentuknya bervariasi

Kristal proteirr yang diisolasi dari B.tlruringiensis

1

aplikasi, kepadatan spora per ml dihitrrng dengatr
menggunakan heaemositotneter, sedangkan kristal pLotein
dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE elektLophoresis

anatar ntembulat dan bentuk hexagonal (PLrjiastLrti et al, 1999)

Dari hasil penehitunean nilai LD." dari rnasing-rnasing
sepefi i teftera
i solat B.tlruringiens is dipero ieh angka-angka

dan kandungan proteinnya dihitung dengan scantting
clensitometer (Yamarnoto, I 990). Pada persiapan selalrgga

Tabel

1 .

Nitai LD,o isolaf Bucillus thuringiensis

lsolat B. thuringiensis

pada Tabel I .

sLrbsp.

wnhqnensis pada larva S.littrrtt dan P.::vloslellct

S. litura+ (LDso

P

([g)-

xytostella+ (LDuo (ng))

to

Tipe 2 (Cryl Db)

1.70 (1.20

Tipe 3 (Campuran)

3.79

-

847 (332-10e0)

2.22)

(213- 5.77)

B, thuringiensis subsp, rvuhanensis tipe 2 sangat toksik
terhadap S.litura. Hal ini ditunjukkan denagn rendahnya nilai
LD,o yaitu 1,70 mg dibandingkan dengan nilai LD,u pada

53- 574)--

39 68(19 B4-- 56 07)

dengan tilat Plutella. kristal protein Cry I Ab tncrupakan protein
yang paling toksik. Kerlatian populasi serangga Lrii sebanyak

50 persen terdapat pada Crl'1Ab dengan dittrnjukkan nilai

B.thuringiensis yang lain' Kristat protein yang tertnasul<
dalam golongan Cry I secara umum toksik terhadap laLva

LD,o Yairg paling rendah. Franketthuyzen (1993)

Lepidoptera, sedangkan untuk golongan yang berbecla maka
kristal protein tersebLrtjuga rnempunyai serangga target yang

ulat P.xylosteila terutatna dari golongan Cryl Ab, Cryl Ac,

berbeda (Hofte & Whiteley, 1989). Secara lebih khusLrs lagi,
kristal protein Cry I D lebih rnemiliki target spesifik i'aitu

Spodoptera spp. F-rankenhuyzen (1993) tnencata balrrva
Spodoptera exigua secara khusu saangat peka terhadap protein
dalarn golongan Cryl C, Cryl D dan Cryl E' Pada trji bioassay

z8

mengemukakan bahwa golongan yang malllpll membunult
Cry I Aa, Cry'1 B dan Cry 1 C.

ilat Spotlopterc dan ulat Plulelkr
Spora )'ang diisolasi dari B. thuringiensis

Bioassay spora pacla

subsp.wuhanensis dibLrat dalatn suatu scLial kepadatan, tnulai

c.lari

l0r,

102,

l0r,

101, 105 dan 106 spora/rnl' Spora

:r

-i-:-:kan

: l i4;i
:gx;-

pada pakan (dioleskan) dan serangga uji

,lntuk makan (forced-feeding). Dari hasil

:-rngan analisis probit setelah 72

jan penganratan,

- ai LD,o yang diperoleh disajikan padaTabel2.
:,:. ujr bioassay dengan rnenggunakan ulat S.litura,

*.rn^i

:r' - ri :ahrva tipe 3 memberikan daya toksistas yang paling
T{.; Diduga adanya carnpllran kristal protein yang ada
; :r: ::rr\ a, lebih banyak didominasi olelr Cry I Db sehingga
:i{.i i :asnyapun menjadi lebih tinggi. Namun halyang agak
j*-:.la terjadi pada uji dengan ulat Plutella dimanajustru
Tabel 2.

Nilai

nilai LD,o pada tipe 3 lebih rendah dibanding Tipe i dan
Tipe2.
Apabila dilihat darijenis serangga uji, maka terdapat
perbedaan daya toksik spora B.thuringiensis. Penyebabnya
antara lain karena ukuran tubuh serangga uij yang beLbeda.

Larva instar ketiga Spodoptera berukuran rata-rata 1,5 -2
cm, sednagkan pada Plutella ukurannya jauh lebih kecil.
Perbedaan ukuran tubuh ini menyebabkan daya tahan tubuh
juga berbeda sehingga racun atau toksin yang berasal dali
spora dapat rnentatikan ulat uji dengan lebih cepat.

LDro perlakuan uji bioassay spora B. thuringicttsis subsp. wuhanensis pada Iarva lepidoptera

Perlakuan

LD5spada S. litura

LDt6 pada P. xylostellcr

Tipe2 (CrylDb)

3.8 x 1C3
2.1 x 103

0.5 x 102
3.0 x 10r

Tipe 3 (Campuran)

KESIMPUI,AN

.

i

iiristal protein yang terkandung dalam B.thuringiesnsi

Pujiastuti, Y., Asano, S-1., Sahara, K., Bando, H., & Iizuka,

: s:. rvuhanensis tipe 2 (Cry I D) sangat toksik terhadap larva

T. (1999). Toxicity of Bacillus thulingiensis subsp.
wuhanensis crystal plotein to Bombyx mori and

t,:ra d nlasing-masing dengan nilai LDro sebesar 1,70

r-.. sedangkan B. thuringiensis subsp. wuhancnsis Tipe

I

'.'::punyai daya bunuh yang tinggi pada P.xylostella
: :rndingkan dengan pada ulat grayak S. litura. Tipe 3
-:nunjukkan toksisitas tinggi hanya pada ulat S.litura saja.
Dari uj i bioassay spora terhadap

:
,,,

:huringiensis tipe
:

I

S.

Iitura tersebut ternyata

dan 3 mematikan larva

uji

pada

rsentrasiyang lebih rendah dibandingkan tipe 3. Sedangkan

:::r ujibioassayterhadap Ulat plutella, tipe rnerupakan isolat
.re paling toksik dibanding dengan dua tipe lain B.
.-

Spodoptera litura. J. SeLic. Sci. Japan 68(3): 165-169

Schnepf

, t'I.E. &

Whiteley, H.R. 1981, Cloning and

expression of the Bacill.us thuringiensis ctystal ptotein
gene in Escherichia coli. Ploc.Natl.Acad. Sci. USA. 78,

2893-2897.
Yanramoto, T. (1990): Identification of entomocidal toxins

of

Bacillus thuringiensis by high perforrnance liquid
chromatography. ACS Synrp. Ser. 432:46-60.

-ringensis subsp. wuhanensis.

DAFTARPUSTAKA

::ankenhuyzen, K.V. (1993): The Challenge of Bacillus
thuringiensis. In Bacillusthuringiensis, An Environmental

Biopesticide: Theory and Practice. Edited by Enwistle,
P,F., Cory, J.S., Bailey, M.J. & Higgs, S. John Wiley and
Sons, Inc., New York.

-:fte,

H. & Whiteley, H. R. 1989.InsecticidalcLystal

proteins of Bacillus thuLingiensis. Microbiol.Rev., 53,

:12-255.

,riatani , I., Asano, S-1., Bando, H. & Iizuka, T. (1994):
Cryl Ab gene from Bacillus thuringiensis subsp.
'*uhanensis; DNA sequence analysis and insecticidal
activity. J. Seric. Sci. Japan, 63(2),140-148.

79