Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.) - USD Repository
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DPPH
DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL
ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP (Erythrina
subumbrans (Hassk.) Merr.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Aldo Kristian
NIM : 098114038
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2013
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Skripsi ini kupersembahkan untuk :
Tuhanku Yesus Kristus atas segala berkat dan penyertaan-Nya
Bapak, Ibu dan Kakak-kakakku atas kasih sayang
dan segala hal yang diberikan
Sahabat-sahabatku dan almamaterku
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis kepada Tuhan atas segala rahmat, berkat, anugrah
dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN
METODE DPPH DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL
FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP
(Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.)” ini dengan baik. Skripsi ini disusun
untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
(S.Farm) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Penulis ingin berterima kasih kepada segala pihak yang telah memberikan
bantuan baik dukungan, bimbingan, sarana, materil maupun moril dalam
penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis
mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada:
1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
2. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan perhatian, bimbingan dan arahan dari awal pengusulan skripsi
sampai penulisan skripsi ini selesai.
3. Lucia Wiwid Wijayanti,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya
untuk menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.
4. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya untuk
menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Rini Dwiastuti S.Far.,Apt, M.Sc., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
telah membimbing dan memberi nasihat kepada penulis.
6. Sahabat seperjuangan skripsi DPPH, Anthony Felix, Mikhael Gustandy,
Willigis Danu Patria yang selalu membantu dan bekerjasama dengan luar biasa.
7. Teman-teman FSM dan FST A 2009, atas kerjasama, dukungan dan bantuan
yang diberikan.
8. Segenap laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.
9. Pemerintah Kabupaten Bengkayang, Kal-Bar, atas bantuan dana yang
diberikan.
10. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat
disebut satu per satu.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat ketidaksempurnaan dalam
penulisan skripsi ini. Dengan segala kerendahan hati penulis akan menerima
segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga
skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan banyak pihak.
Yogyakarta, 10 Maret 2013
Penulis
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………………. i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………...
ii
HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………..
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..……………………………….
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA….
vi
KATA PENGANTAR.………………………………………………….
vii
DAFTAR ISI……………………………………………………………..
ix
DAFTAR TABEL………………………………………………………..
xiii
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….. xv
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………... xvi
INTISARI………………………………………………………………... xvii
ABSTRACT……………………………………………………………...
xviii
BAB I PENGANTAR…………………………………………………….
1
A. Latar Belakang…………………………………………………...
1
B. Permasalahan……………………………………………………..
3
C. Keaslian Penelitian……………………………………………..…
3
D. Manfaat penelitian…………………………………………….......
4
E. Tujuan Penelitian…………………………………………………...
5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………….....
6
A. Dadap Serep………………..........................................................
6
1. Keterangan botani…………………………………………………
ix
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Nama tumbuhan………………………………………………….
6
3. Klasifikasi dadap serep…..………………………………………
6
4. Gambaran umum…………………………………………………
7
5. Kandungan kimia dadap serep……………………………………
7
B. Senyawa Fenolik…………………………………………………….
8
C. Radikal Bebas……………………………………………………
9
D. Antioksidan………………………………………………………
11
E. Penyarian…………………………………………………………
13
F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu……………………………....
14
G. Validasi Metode……………………………………………...……
16
H. Landasan Teori…………………………………………………….
18
I. Hipotesis…………………………………………………………..
19
BAB III METODOLOGI PENELITIAN…………………………………
20
A. Jenis dan Rancangan Penelitian…………………………………..
20
B. Variabel……………………………………………………………
20
C. Definisi Operasional…………………..……………………….…
20
D. Bahan dan Alat Penelitian…………………………………………
21
1. Bahan penelitian………………………………………………..
21
2. Alat penelitian…………………………………………….……
21
E. Tatacara Penelitian…………………………………………………
22
1. Determinasi tumbuhan…………………………………………
22
2. Pengumpulan bahan……………………………………….……
22
3. Preparasi sampel…………………………………………….…
22
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji…………………….…
23
5. Uji pendahuluan……………………………………………..…
24
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………………..……
25
7. Uji aktivitas antioksidan………………………………….……
26
8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total………….
27
9. Penetapan kandungan fenolik total…………………………….
27
F. Analisis Hasil………………………………………………………
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………….…
31
A. Determinasi………………………………………………………..
31
B. Hasil Pengumpulan Bahan…………………………………………
31
C. Hasil Preparasi Sampel……………………………………….……
34
1. Ekstraksi sampel……………………………………………..…
34
2. Fraksinasi ekstrak…………………………………………….…
35
D. Hasil Uji Pendahuluan…………………………………………….......
37
1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan……………………….…
37
2. Uji pendahuluan senyawa fenolik………………………………
39
E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan…………………….
40
1. Penentuan panjang gelombang maksimun (λ maks)……………
40
2. Penentuan Operating Time (OT)………………………………...
41
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan……………………….
43
1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan …………………………
45
2. Linearitas metode uji antioksidan………………………………..
46
3. Spesifisitas metode uji antioksidan………………………………… 47
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH………………
48
H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total………..
55
1. Penentuan operating time (OT)………………………………………..
55
2. Penentuan panjang gelombang maksimum……………………………
56
I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total…………
57
1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total……………..
57
2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total…………………
58
3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total……………….
59
J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total…………………………….
59
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………………………………….
62
A. Kesimpulan……………………………………………………….…….
62
B. Saran……………………………………………………………….......
62
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………..
63
LAMPIRAN…………………………………………………………….…
66
BIOGRAFI PENULIS……………………………………………………..
95
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I.
Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan
antioksidan sebagai penetral…………………………….
13
Tabel II.
Kisaran recovery hasil analisis yang diterima…………..
17
Tabel III.
Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima………...
17
Tabel IV.
Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH…
40
Tabel V.
Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin
yang direaksikan dengan radikal DPPH…………………
Tabel VI.
43
Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat
ekstrak etanol daun dadap serep yang direaksikan
dengan DPPH……………………………………………
44
Tabel VII.
Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin…….
45
Tabel VIII.
Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat……… 45
Tabel IX.
Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode
DPPH…………………………………………………….
Tabel X.
Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak
etanol daun dadap serep dengan metode DPPH………….
Tabel XI.
52
Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat
ekstrak etanol daun dadap serep………………………….
Tabel XII.
51
53
Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin
dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep…… 54
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel XIII.
Hasil scanning panjang gelombang maksimum………….. 57
Tabel XIV.
Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter………
Tabel XV.
Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang
direaksikan dengan Folin-Ciocalteu……………………
Tabel XVI.
58
58
Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat
ekstrak etanol daun dadap serep………………………
xiv
60
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.
Beberapa struktur senyawa isoflavonoid………………… 8
Gambar 2.
Klasifikasi flavonoid produk alam……………………….
Gambar 3.
Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH……….. 12
Gambar 4.
Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan.. 15
Gambar 5.
Skema jalannya penelitian……………………………….. 30
Gambar 6.
Blanko DPPH , Fraksi etil asetat, Kuersetin…………..…. 38
Gambar 7.
Blanko reagen Folin-ciocalteau , Fraksi+reagen
9
Folin-ciocalteau, Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu…… 39
Gambar 8.
Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)…………….. 42
Gambar 9.
Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)……... 42
Gambar 10.
Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa…………….. 48
Gambar 11.
Struktur senyawa kuersetin……………………………….. 49
Gambar 12.
Usulan mekanisme reaksi kuersetin dan radikal DPPH…… 49
Gambar 13.
Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
kuersetin………………………………………………….. 51
Gambar 14.
Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
fraksi etil asetat…………………………………………… 52
Gambar 15.
Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)…………… 56
Gambar 16.
Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue……….. 60
Gambar 17.
Kurva kalibrasi asam galat………………………………... 60
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1.
Surat determinasi tanaman dadap serep……………….
66
Lampiran 2.
Gambar tanaman dadap serep…………………………
67
Lampiran 3.
Perhitungan rendemen……………………………... …
68
Lampiran 4.
Data penimbangan untuk pengujian
aktivitas antioksidan……………………………….. ...
Lampiran 5.
69
Data perhitungan konsentrasi pengujian
aktivitas antioksidan………………………………….
70
Lampiran 6.
Scanning pengkoreksi………………………………...
72
Lampiran 7.
Optimasi metode uji aktivitas antioksidan…………….
73
Lampiran 8.
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH..
74
Lampiran 9.
Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air
ekstrak metanol daun dadap serep……………………...
84
Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total...
85
Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total…………
85
Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat…………………………….
88
Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total……………
88
Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total……………………
93
Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1……..
94
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Dalam pengobatan tradisional di Indonesia, daun dari tanaman dadap
serep berkhasiat untuk mengobati sakit kepala, batuk serta untuk minuman bagi
wanita sehabis melahirkan. Senyawa fenolik merupakan salah satu kandungan
bioaktif dari daun dadap serep. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep secara in
vitro yang didasarkan pada efek peredaman radikal bebas larutan 1,1-difenilpikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dengan inhibition concentration 50 (IC50).
Kandungan fenolik total juga ditentukan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu
dengan baku standar asam galat yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam
galat. Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi dalam suasana basa
dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang dapat
diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep
mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 245,15 ± 4,26 µg/mL
dan kandungan fenolik total sebesar 8,51 ± 0,18 ekivalen asam galat per g fraksi
etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dan metode yang digunakan belum
tervalidasi.
Kata kunci: daun dadap serep (Erythrina subumbrans Hassk), fraksi etil asetat,
antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total
xvii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
In Indonesian traditional medicine, the leaves of dadaps (Erythrina
subumbrans (Hassk.) Merr.) are efficacious to cure headaches, cough and can also
be used as a drink for women after childbirth. Phenolic compound is one of the
bioactive contents in dadaps leaves. This research was conducted to determine the
antioxidant activities of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves
in vitro based on the reducing effect of free radical of 1,1-diphenyl-pikrilhidrazil
(DPPH) solution expressed by inhibition concentration 50 (IC50). The total
phenolic contents was also determined by using the Folin-Ciocalteu reagent with
gallic acid standard expressed by the mass of gallic acid equivalents. The principle
of this method is oxidized phenolic compounds in alkaline medium and FolinCiocalteu reagent is reduced to a blue solution that can be measured by the visible
spectrophotometer at a wavelength of 750 nm. The results showed that the ethyl
acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves had antioxidant activities with
IC50 valued in the amount of 245.15 ± 4.26 µg/mL and the total phenolic content
of 8.51 ± 0.18 gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol
extract of dadaps leaves and the method has not been validated.
Keywords : dadaps leaves (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), ethyl acetate
fraction, antioxidant, DPPH, total phenolic content
xviii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Paparan sistem biologis dari xenobiotik, polusi, radiasi pengion atau
cahaya UV dan perkembangan kondisi patologis tertentu menyebabkan tekanan
oksidatif, akibatnya meningkatkan produksi oksigen radikal. (Sapakal et al.,
2008). Pembentukan radikal bebas dan reaksi oksidasi pada biomolekul akan
berlangsung sepanjang hidup. Inilah penyebab utama dari proses penuaan dan
berbagai penyakit degeneratif (Silalahi, 2006). Radikal oksigen terus dibentuk
pada semua organisme hidup, dengan efek merusak yang menyebabkan cedera
dan kematian sel (Sapakal et al., 2008). Jenis Reaktif Oksigen Spesies (ROS)
termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, radikal
nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida mampu bereaksi
dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya,
yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al., 2008).
Antioksidan adalah zat yang berperan penting dalam menunda atau
mencegah penyakit degeneratif oleh kerusakan oksidatif dari komponen sel hidup
yang disebabkan oleh radikal bebas. Didalam tubuh secara alami telah
mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti
enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT),
glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif
dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen
reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Namun karena
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
tekanan oksidatif berlebih didalam tubuh, menyebabkan produksi radikal bebas
menjadi meningkat didalam tubuh yang berakibat dibutuhkannya tambahan
antioksidan yang cukup untuk menanggulangi tekanan oksidatif yang tinggi
tersebut sehingga dapat mengurangi dampak kerusakan sel sebagai akibat dari
reaksi radikal bebas.
Antioksidan sintetik seperti butylated hidroksitoluen (BHT), butylated
hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) dan propil gallate (PG)
telah digunakan selama bertahun-tahun, namun senyawa tersebut sedang diperiksa
untuk kemungkinannya dalam menimbulkan toksisitas. Oleh karena itu, sekarang
ini dilakukan penelitian intensif tentang antioksidan polifenol alami yang berasal
dari tumbuhan untuk menggantikan antioksidan sintetis (Qader et al., 2011).
Dadap serep (Erythrina subumbrans) adalah salah satu tanaman yang
secara tradisional digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan
untuk mengobati sakit kepala. Rebusan daunnya juga digunakan untuk mengobati
batuk (Anonim, 2007). Dalam tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa
bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Senyawa
fenolik tersebut memiliki peranan penting dalam kaitan penggunaan tanaman
terhadap manfaatnya bagi kesehatan. Salah satu manfaat dari kandungan senyawa
fenolik pada tanaman dadap serep telah dibuktikan dalam penelitian
Rukachaisirikul et al.,(2007) yang menunjukan tanaman dadap serep (Erythrina
subumbrans) mengandung senyawa fenolik yang beraktivitas antibakteri lebih
kuat dibanding standar antibiotik vancomycin dan oxacillin terhadap beberapa
strain bakteri streptococcus dan staphylococcus.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Senyawa fenolik merupakan senyawa bioaktif dari tumbuhan yang
merupakan sumber antioksidan alami yang aman. Untuk melihat potensi
antioksidan dari tanaman dadap serep, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan
aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang
dilakukan
dengan
metode
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH)
secara
spektrofotometri. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka
serta hanya memerlukan sedikit sampel. Aktivitas diukur dengan menghitung
jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan
pengurangan konsentrasi larutan DPPH. Peredaman tersebut dihasilkan oleh
bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang
dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil
Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke
kuning (Zuhra, Tarigan dan Sihotang, 2008). Penentuan kandungan fenolik total
dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dilakukan menggunakan
metode Folin-Ciocalteu dimana merupakan salah satu metode yang cepat dan
sederhana dalam menentukan kandungan fenolik total (Fu et al., 2011).
B. Permasalahan
1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun
dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50
?
2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap
serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
C. Keaslian Penelitian
Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan
daun dadap pernah dilakukan oleh :
Estrada, E.I., 2010, dengan judul “Actividad Antioxidante De Alcaloides De
Erythrina Americana Miller”. Penelitian ini menggunakan daun dadap spesies
Erythrina Americana Miller yang diperoleh di universitas nacional autonoma
de Mexico (Mexico) dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl).
Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah
bahwa dalam penelitian ini daun dadap serep spesies Erythrina subumbrans
(Hassk.) Merr. yang digunakan dipanen dari dari kebun tanaman obat Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas
antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan
menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.
2. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas
antioksidan daun dadap serep sehingga bisa dimanfaatkan sebagai alternatif untuk
pemeliharaan kesehatan manusia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
E. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi etil asetat
ekstrak etanolik daun dadap serep.
2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun
dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50
dan mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik
daun dadap serep yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Dadap Serep
1. Keterangan botani
Dadap serep termasuk tanaman legum pohon, berasal dari Asia Tenggara
dan tersebar di seluruh kepulauan nusantara. Varietas tanaman ini dibedakan
berdasarkan ada tidaknya duri pada kulitnya (Purwanto, 2007).
2. Nama tumbuhan
Nama latin
: Erythrina subumbrans Hassk. (Anonim, 2007).
Nama sinonim
: Erythrina hypaphorus Boerl., Erythrina lithosperma
Miquel (Anonim, 2007).
Nama daerah
: dadap minyak, dadap limit (sunda); dadap lengan,
dadap lisah (jawa); dadap lenga, thetheuk oleng
(Madura) (Purwanto, 2007).
3. Klasifikasi dadap serep menurut USDA (2011)
Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Tracheobionta
Superdivisi
: Spermatophyta
Divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Sub Kelas
: Rosidae
Ordo
: Fabales
Famili
: Fabaceae
Genus
: Erythrina
Spesies
: Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
4. Gambaran umum
Dadap serep merupakan tanaman legum pohon, tumbuh tinggi agak
bengkok, ketinggian mencapai 15-22 m dengan diameter batang 40-100 cm,
sistem perakaran dalam. Kulit batang berwarna hijau, batang yang tua bercampur
garis-garis kecoklatan, cabang tumbuh lurus ke atas membentuk sudut 45 o.
Daunnya beranak tiga helai, berbentuk delta atau gemuk bundar ujung agak
meruncing, bagian bawah daun membundar, bila diremas terasa lunak ditangan.
Ukuran panjang tangkai daun 10-20,5 cm; panjang daun 9-19 cm; dan lebar daun
6-17 cm. Daun atas berukuran lebih besar daripada kedua daun penumpu.
Bunganya tumbuh diantara ketiak daun, daun mahkota bunyanya berwarna merah
kekuningan, berbentuk terompet. Polongnya berukuran kecil, berbentuk sabit,
berisi 4-8 biji per polong (Purwanto, 2007).
Dalam penggunaannya, bagian kulit kayu dan daun dadap serep secara
empiris digunakan untuk pengobatan tradisional sebagai campuran dengan
tanaman obat lainnya. Di Indonesia ditemukan daun mudanya digunakan untuk
minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala.
Rebusan daunnya digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007).
5. Kandungan kimia dadap serep
Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti
alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Flavonoid dan isoflavonoid
yang terkandung dalam tanaman dadap merupakan senyawa bioaktif yang
menarik perhatian para peneliti karena selain memiliki struktur senyawa yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
baru, senyawa bioktif tersebut juga menunjukan potensi sebagai senyawa
antimikroba (Rasooli, 2011).
O
Isoflavan
O
O
O
O
O
Isoflavone
O
Isoflavanone
O
O
OH
Isoflavan-3-ene
Isoflavanol
3-arylcoumarin
Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid (Samanta, Das,
dan Das, 2011)
B. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder dari alam dengan jumlah
senyawa yang besar (lebih dari 8.000) yang tersebar luas diseluruh kingdom
tanaman dan dikarakterisasi dengan setidaknya memiliki satu cincin aromatis
dengan satu atau lebih terikat dengan gugus hidroksil. Senyawa fenolik dapat
diklasifikasikan berdasarkan susunan dari atom karbon dalam flavonoid (flavonol,
flavon, flavan-3-ol, antosianidin, flavanon, isoflavon dan lainnya) dan nonflavonoid (asam fenolat, hidroksinamat, stilben dan lainnya) dan
senyawa-
senyawa tersebut umumnya berada terkonjugasi dengan gula dan asam organik
(Cartea, Francisco, Soengas, dan Velasco, 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Flavonoid merupakan salah satu kelompok metabolit sekunder terbesar
sebagai senyawa fenolik. Flavonoid melindungi tanaman terhadap berbagai
ancaman biotik dan abiotik yang menunjukkan spektrum dengan beragam fungsi
biologis dan memainkan peran penting dalam interaksi antara tanaman dan
lingkungannya (Samanta et al., 2011). Senyawa fenolik mayoritas yang ada di
alam berada sebagai glikosida. Adanya gula dan gugus hidroksil membuat
senyawa fenolik larut dalam air sedangkan adanya gugus metil dan unit isopentil
membuat flavonoid menjadi lipofilik (Samanta et al., 2011).
Sebagian besar koleksi metabolit dari produk alam disebut dengan istilah
flavonoid yang mencakup senyawa dengan karbon berstruktur C6-C3-C6.
Tergantung pada posisi keterkaitan dari cincin aromatik ke bagian benzopiren,
kelompok produk alam ini dibagi menjadi tiga kelas: Flavonoid (2 fenilbenzopiren), isoflavonoid (3-benzopiren) dan Neoflavonoid (Samata et al.,
2011).
O
O
Flavonoids
O
Isoflavonoids
(3-benzopyrans)
Neoflavonoids
Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam (Samata et al., 2011)
C. Radikal Bebas
Reaktif oksigen spesies (ROS) adalah istilah yang meliputi semua
molekul yang sangat reaktif yang mengandung atom oksigen yang merupakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
golongan radikal bebas. Jenis ROS termasuk radikal hidroksil, radikal anion
superoksida, hidrogen peroksida, singlet oksigen, radikal nitrat oksida, radikal
hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida. Semua mampu bereaksi dengan membran
lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang
mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al, 2008).
Banyak bukti yang telah dikumpulkan untuk melihat kerusakan seluler
yang timbul akibat dari spesies oksigen reaktif (ROS), setidaknya sebagian, dalam
etiologi dan patofisiologi penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif
(misalnya penyakit alzheimer, penyakit parkinson, multipel sklerosis, syndrom
down), peradangan, infeksi virus, autoimun patologi, dan gangguan sistem
pencernaan seperti peradangan pencernaan dan ulkus. Dalam sistem metabolisme
tubuh, radikal bebas dihasilkan sebagai bagian dari proses normal metabolisme
tubuh, dan reaksi berantai radikal bebas biasanya diproduksi di rantai pernapasan
mitokondria, campuran oksidase fungsi hati, dengan leukosit bakteri, melalui
aktivitas xantin oksidase, polusi atmosfer, dan dari transisi logam katalis, obat dan
xenobiotik. Selain itu, mobilisasi kimia dari cadangan lemak di bawah berbagai
kondisi seperti menyusui, olahraga, demam, infeksi dan bahkan puasa, dapat
menghasilkan peningkatan aktivitas radikal dan meningkatkan kerusakan,
khususnya yang berhubungan dengan kekebalan tubuh dan sistem saraf. Hormon
stres (adrenalin dan noradrenalin) yang disekresikan oleh kelenjar adrenal di
bawah kondisi stres emosional yang
berkelanjutan dan berlebihan, yang
kemudian dimetabolisme menjadi lebih sederhana seperti molekul radikal bebas,
juga dapat meningkatkan produksi senyawa radikal dalam tubuh (Atawodi, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
D. Antioksidan
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang mampu menunda,
memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh. Antioksidan
mampu menstabilkan, atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel
dalam tubuh. Antioksidan merupakan senyawa yang penting untuk menjaga
kesehatan seluler dan kesehatan sistemik tubuh (Sapakal et al., 2008).
Senyawa antioksidan dapat dibedakan berdasarkan komposisi, sifat fisik
dan kimia, mekanisme dan tempat aksi dari senyawa antioksidan tersebut. Enzimenzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti enzim glutation
reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation
peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan
menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif
dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Senyawa dengan bobot
molekul tinggi seperti protein : albumin, ceruplasmin, transferin, haptoglobin
mengikat logam aktif redoks dan membatasi produksi radikal bebas katalis logam.
Senyawa dengan berat molekul rendah dibagi menjadi antioksidan larut lemak
(tokoferol, karotenoid, kina dan beberapa polifenol) dan antioksidan yang larut air
(asam askorbat, asam urat dan beberapa polifenol). Senyawa antioksidan jenis
mineral: selenium, mangan, tembaga, dan seng diakui sebagai antioksidan yang
serbaguna. Senyawa antioksidan jenis vitamin: vitamin A, C, dan E ternyata
memiliki peran penting dalam mencegah atau meminimalkan kerusakan
peroksidasi dalam sistem biologis. Tanaman kaya antioksidan merupakan sumber
antioksidan alami yang dapat ditemukan dalam sayuran, kacang kedelai, kulit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
jeruk, biji sesame, daun teh hijau, biji kakao, anggur, tomat, jeruk, apel, bijibijian, zaitun, wortel (Sapakal et al.,2008).
Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun
antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi
karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan
sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) ternyata dapat meracuni
binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan
dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumbersumber antioksidan alami baru (Zuhra et al., 2008).
Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH ((a) donasi
kedua atom hidrogen, (b) dimerisasi, (c) kompleksasi) (Bondet, BrandWilliams, dan Berset, 1997)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan antioksidan sebagai
penetral (Sapakal et al., 2008)
Reactive Oxygen Species
Senyawa antioksidan
(ROS)
Radikal hidroksil
vitamin C, glutation, flavonoid, asam
lipoid
Radikal superoksida
vitamin C, glutation, flavonoid, SOD
Hidrogen peroksida
vitamin C, glutation, betakaroten,
vitamin E, CoQ10, flavonoid, asam
lipoid
Lipid peroksida
beta karoten, vitamin E, ubiquinon,
flavonoid, glutation peroksidase
E. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat atau metabolit aktif yang semula
berada didalam sel yang kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif
tersebut larut dalam cairan penyari (Harborne, 1987). Secara umum, penyarian
dapat
dibedakan
menjadi
infudasi,
maserasi,
perkolasi
dan
penyarian
berkesinambungan. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran
etanol air (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).
Maserasi
merupakan
metode
yang
melibatkan
perendaman
dan
penggojogan bahan tanaman didalam pelarut tertentu yang kemudian pelarutnya
diuapkan (Raaman, 2006). Remaserasi merupakan modifikasi cara penyarian
maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi menjadi dua bagian.
Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
diendap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang
kedua (Depkes, 1986). Alkohol didalam banyak penelitian merupakan pelarut
yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan
dalam tahapan ekstraksi (Harborne, 1998).
Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakukan sampel
untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin
menganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Ekstraksi cair-cair
ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan “pada
konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi
yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur”. Perbandingan
konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien
distribusi atau koefisien partisi (Kd) dan digambarkan dengan rumus :
Kd =
𝑆 𝑜𝑟𝑔
𝑆 𝑎𝑞
Dimana [S]org dan [S]aq masing-masing merupakan konsentrasi analit
dalam fase organik dan dalam fase air; Kd merupakan koefisien partisi. Efiseiensi
proses ekstraksi tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada
volume relative kedua fase. Adanya ekstaksi berulang (bertingkat) akan
meningkatkan efisiensi ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).
F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu
Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji
aktivitas antioksidan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter
konsentrasi yang ekivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
ini dapat dicapai dengan cara mengintepretasikan data eksperimental dari metode
tersebut (Molyneux, 2004).
Uji kuantitatif daya antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1difenil-2-pikrilhidrazil) secara spektrofotometri sinar tampak. Metode ini
didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH. Perubahan warna tersebut
disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen
yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk
senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Pada metode ini
absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi
dengan senyawa antioksidan (Josephy, 1997).
O2N
N
NO2
NO2
N
+ AH
O2N
O2N
DPPH Free Radical
H
N
N
+
A
NO2
Phenolic Compounds
DPPH Reduced Form
Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan
(Irshad, Zafaryab, Singh, dan Rizvi, 2012)
Dalam metode DPPH, dengan adanya elektron bebas yang tidak
berpasangan pada senyawa radikal DPPH, senyawa tersebut memberikan serapan
maksimum yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dan memberikan warna
ungu. Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning sebagai bentuk berkurangnya
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
absorptivitas molar radikal DPPH pada 517 nm dari 9660 ke 1640 ketika elektron
bebas radikal DPPH dipasangkan dengan hidrogen dari senyawa antioksidan
radikal bebas untuk membentuk senyawa DPPH-H. Dengan demikian hasil
dekolorisasi yang terjadi memberikan nilai stoikiometri sehubungan dengan
jumlah elektron yang ditangkap (Prakash, 2001).
Metode Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang
sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan
menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang
akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk
mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara
spektrofotometri ( Cicco dan Lattanzio, 2011).
G. Validasi Metode
Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat
memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel,
dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007).
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai
rujukan. Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (International Conference on
Harmanization) merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan
kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali
replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (recovery)
(Gandjar dan Rohman, 2007). Rata-rata persen recovery yang dihasilkan
seharusnya berada dalam kisaran sebagai berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima (APMVA, 2004)
% Senyawa
impuritis/aktif
Rata-rata recovery yang diterima
≥ 10
98-102 %
≥1
90-110 %
0,1-1
80-120 %
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DPPH
DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL
ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP (Erythrina
subumbrans (Hassk.) Merr.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Aldo Kristian
NIM : 098114038
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2013
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Skripsi ini kupersembahkan untuk :
Tuhanku Yesus Kristus atas segala berkat dan penyertaan-Nya
Bapak, Ibu dan Kakak-kakakku atas kasih sayang
dan segala hal yang diberikan
Sahabat-sahabatku dan almamaterku
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis kepada Tuhan atas segala rahmat, berkat, anugrah
dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN
METODE DPPH DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL
FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP
(Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.)” ini dengan baik. Skripsi ini disusun
untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
(S.Farm) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Penulis ingin berterima kasih kepada segala pihak yang telah memberikan
bantuan baik dukungan, bimbingan, sarana, materil maupun moril dalam
penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis
mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada:
1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
2. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan perhatian, bimbingan dan arahan dari awal pengusulan skripsi
sampai penulisan skripsi ini selesai.
3. Lucia Wiwid Wijayanti,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya
untuk menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.
4. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya untuk
menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini.
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Rini Dwiastuti S.Far.,Apt, M.Sc., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
telah membimbing dan memberi nasihat kepada penulis.
6. Sahabat seperjuangan skripsi DPPH, Anthony Felix, Mikhael Gustandy,
Willigis Danu Patria yang selalu membantu dan bekerjasama dengan luar biasa.
7. Teman-teman FSM dan FST A 2009, atas kerjasama, dukungan dan bantuan
yang diberikan.
8. Segenap laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.
9. Pemerintah Kabupaten Bengkayang, Kal-Bar, atas bantuan dana yang
diberikan.
10. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat
disebut satu per satu.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat ketidaksempurnaan dalam
penulisan skripsi ini. Dengan segala kerendahan hati penulis akan menerima
segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga
skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan banyak pihak.
Yogyakarta, 10 Maret 2013
Penulis
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………………. i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………...
ii
HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………..
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..……………………………….
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA….
vi
KATA PENGANTAR.………………………………………………….
vii
DAFTAR ISI……………………………………………………………..
ix
DAFTAR TABEL………………………………………………………..
xiii
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….. xv
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………... xvi
INTISARI………………………………………………………………... xvii
ABSTRACT……………………………………………………………...
xviii
BAB I PENGANTAR…………………………………………………….
1
A. Latar Belakang…………………………………………………...
1
B. Permasalahan……………………………………………………..
3
C. Keaslian Penelitian……………………………………………..…
3
D. Manfaat penelitian…………………………………………….......
4
E. Tujuan Penelitian…………………………………………………...
5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………….....
6
A. Dadap Serep………………..........................................................
6
1. Keterangan botani…………………………………………………
ix
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Nama tumbuhan………………………………………………….
6
3. Klasifikasi dadap serep…..………………………………………
6
4. Gambaran umum…………………………………………………
7
5. Kandungan kimia dadap serep……………………………………
7
B. Senyawa Fenolik…………………………………………………….
8
C. Radikal Bebas……………………………………………………
9
D. Antioksidan………………………………………………………
11
E. Penyarian…………………………………………………………
13
F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu……………………………....
14
G. Validasi Metode……………………………………………...……
16
H. Landasan Teori…………………………………………………….
18
I. Hipotesis…………………………………………………………..
19
BAB III METODOLOGI PENELITIAN…………………………………
20
A. Jenis dan Rancangan Penelitian…………………………………..
20
B. Variabel……………………………………………………………
20
C. Definisi Operasional…………………..……………………….…
20
D. Bahan dan Alat Penelitian…………………………………………
21
1. Bahan penelitian………………………………………………..
21
2. Alat penelitian…………………………………………….……
21
E. Tatacara Penelitian…………………………………………………
22
1. Determinasi tumbuhan…………………………………………
22
2. Pengumpulan bahan……………………………………….……
22
3. Preparasi sampel…………………………………………….…
22
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji…………………….…
23
5. Uji pendahuluan……………………………………………..…
24
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………………..……
25
7. Uji aktivitas antioksidan………………………………….……
26
8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total………….
27
9. Penetapan kandungan fenolik total…………………………….
27
F. Analisis Hasil………………………………………………………
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………….…
31
A. Determinasi………………………………………………………..
31
B. Hasil Pengumpulan Bahan…………………………………………
31
C. Hasil Preparasi Sampel……………………………………….……
34
1. Ekstraksi sampel……………………………………………..…
34
2. Fraksinasi ekstrak…………………………………………….…
35
D. Hasil Uji Pendahuluan…………………………………………….......
37
1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan……………………….…
37
2. Uji pendahuluan senyawa fenolik………………………………
39
E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan…………………….
40
1. Penentuan panjang gelombang maksimun (λ maks)……………
40
2. Penentuan Operating Time (OT)………………………………...
41
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan……………………….
43
1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan …………………………
45
2. Linearitas metode uji antioksidan………………………………..
46
3. Spesifisitas metode uji antioksidan………………………………… 47
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH………………
48
H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total………..
55
1. Penentuan operating time (OT)………………………………………..
55
2. Penentuan panjang gelombang maksimum……………………………
56
I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total…………
57
1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total……………..
57
2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total…………………
58
3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total……………….
59
J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total…………………………….
59
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………………………………….
62
A. Kesimpulan……………………………………………………….…….
62
B. Saran……………………………………………………………….......
62
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………..
63
LAMPIRAN…………………………………………………………….…
66
BIOGRAFI PENULIS……………………………………………………..
95
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I.
Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan
antioksidan sebagai penetral…………………………….
13
Tabel II.
Kisaran recovery hasil analisis yang diterima…………..
17
Tabel III.
Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima………...
17
Tabel IV.
Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH…
40
Tabel V.
Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin
yang direaksikan dengan radikal DPPH…………………
Tabel VI.
43
Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat
ekstrak etanol daun dadap serep yang direaksikan
dengan DPPH……………………………………………
44
Tabel VII.
Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin…….
45
Tabel VIII.
Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat……… 45
Tabel IX.
Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode
DPPH…………………………………………………….
Tabel X.
Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak
etanol daun dadap serep dengan metode DPPH………….
Tabel XI.
52
Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat
ekstrak etanol daun dadap serep………………………….
Tabel XII.
51
53
Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin
dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep…… 54
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel XIII.
Hasil scanning panjang gelombang maksimum………….. 57
Tabel XIV.
Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter………
Tabel XV.
Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang
direaksikan dengan Folin-Ciocalteu……………………
Tabel XVI.
58
58
Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat
ekstrak etanol daun dadap serep………………………
xiv
60
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.
Beberapa struktur senyawa isoflavonoid………………… 8
Gambar 2.
Klasifikasi flavonoid produk alam……………………….
Gambar 3.
Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH……….. 12
Gambar 4.
Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan.. 15
Gambar 5.
Skema jalannya penelitian……………………………….. 30
Gambar 6.
Blanko DPPH , Fraksi etil asetat, Kuersetin…………..…. 38
Gambar 7.
Blanko reagen Folin-ciocalteau , Fraksi+reagen
9
Folin-ciocalteau, Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu…… 39
Gambar 8.
Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)…………….. 42
Gambar 9.
Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)……... 42
Gambar 10.
Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa…………….. 48
Gambar 11.
Struktur senyawa kuersetin……………………………….. 49
Gambar 12.
Usulan mekanisme reaksi kuersetin dan radikal DPPH…… 49
Gambar 13.
Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
kuersetin………………………………………………….. 51
Gambar 14.
Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
fraksi etil asetat…………………………………………… 52
Gambar 15.
Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)…………… 56
Gambar 16.
Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue……….. 60
Gambar 17.
Kurva kalibrasi asam galat………………………………... 60
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1.
Surat determinasi tanaman dadap serep……………….
66
Lampiran 2.
Gambar tanaman dadap serep…………………………
67
Lampiran 3.
Perhitungan rendemen……………………………... …
68
Lampiran 4.
Data penimbangan untuk pengujian
aktivitas antioksidan……………………………….. ...
Lampiran 5.
69
Data perhitungan konsentrasi pengujian
aktivitas antioksidan………………………………….
70
Lampiran 6.
Scanning pengkoreksi………………………………...
72
Lampiran 7.
Optimasi metode uji aktivitas antioksidan…………….
73
Lampiran 8.
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH..
74
Lampiran 9.
Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air
ekstrak metanol daun dadap serep……………………...
84
Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total...
85
Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total…………
85
Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat…………………………….
88
Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total……………
88
Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total……………………
93
Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1……..
94
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Dalam pengobatan tradisional di Indonesia, daun dari tanaman dadap
serep berkhasiat untuk mengobati sakit kepala, batuk serta untuk minuman bagi
wanita sehabis melahirkan. Senyawa fenolik merupakan salah satu kandungan
bioaktif dari daun dadap serep. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep secara in
vitro yang didasarkan pada efek peredaman radikal bebas larutan 1,1-difenilpikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dengan inhibition concentration 50 (IC50).
Kandungan fenolik total juga ditentukan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu
dengan baku standar asam galat yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam
galat. Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi dalam suasana basa
dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang dapat
diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep
mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 245,15 ± 4,26 µg/mL
dan kandungan fenolik total sebesar 8,51 ± 0,18 ekivalen asam galat per g fraksi
etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dan metode yang digunakan belum
tervalidasi.
Kata kunci: daun dadap serep (Erythrina subumbrans Hassk), fraksi etil asetat,
antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total
xvii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
In Indonesian traditional medicine, the leaves of dadaps (Erythrina
subumbrans (Hassk.) Merr.) are efficacious to cure headaches, cough and can also
be used as a drink for women after childbirth. Phenolic compound is one of the
bioactive contents in dadaps leaves. This research was conducted to determine the
antioxidant activities of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves
in vitro based on the reducing effect of free radical of 1,1-diphenyl-pikrilhidrazil
(DPPH) solution expressed by inhibition concentration 50 (IC50). The total
phenolic contents was also determined by using the Folin-Ciocalteu reagent with
gallic acid standard expressed by the mass of gallic acid equivalents. The principle
of this method is oxidized phenolic compounds in alkaline medium and FolinCiocalteu reagent is reduced to a blue solution that can be measured by the visible
spectrophotometer at a wavelength of 750 nm. The results showed that the ethyl
acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves had antioxidant activities with
IC50 valued in the amount of 245.15 ± 4.26 µg/mL and the total phenolic content
of 8.51 ± 0.18 gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol
extract of dadaps leaves and the method has not been validated.
Keywords : dadaps leaves (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), ethyl acetate
fraction, antioxidant, DPPH, total phenolic content
xviii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Paparan sistem biologis dari xenobiotik, polusi, radiasi pengion atau
cahaya UV dan perkembangan kondisi patologis tertentu menyebabkan tekanan
oksidatif, akibatnya meningkatkan produksi oksigen radikal. (Sapakal et al.,
2008). Pembentukan radikal bebas dan reaksi oksidasi pada biomolekul akan
berlangsung sepanjang hidup. Inilah penyebab utama dari proses penuaan dan
berbagai penyakit degeneratif (Silalahi, 2006). Radikal oksigen terus dibentuk
pada semua organisme hidup, dengan efek merusak yang menyebabkan cedera
dan kematian sel (Sapakal et al., 2008). Jenis Reaktif Oksigen Spesies (ROS)
termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, radikal
nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida mampu bereaksi
dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya,
yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al., 2008).
Antioksidan adalah zat yang berperan penting dalam menunda atau
mencegah penyakit degeneratif oleh kerusakan oksidatif dari komponen sel hidup
yang disebabkan oleh radikal bebas. Didalam tubuh secara alami telah
mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti
enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT),
glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif
dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen
reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Namun karena
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
tekanan oksidatif berlebih didalam tubuh, menyebabkan produksi radikal bebas
menjadi meningkat didalam tubuh yang berakibat dibutuhkannya tambahan
antioksidan yang cukup untuk menanggulangi tekanan oksidatif yang tinggi
tersebut sehingga dapat mengurangi dampak kerusakan sel sebagai akibat dari
reaksi radikal bebas.
Antioksidan sintetik seperti butylated hidroksitoluen (BHT), butylated
hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) dan propil gallate (PG)
telah digunakan selama bertahun-tahun, namun senyawa tersebut sedang diperiksa
untuk kemungkinannya dalam menimbulkan toksisitas. Oleh karena itu, sekarang
ini dilakukan penelitian intensif tentang antioksidan polifenol alami yang berasal
dari tumbuhan untuk menggantikan antioksidan sintetis (Qader et al., 2011).
Dadap serep (Erythrina subumbrans) adalah salah satu tanaman yang
secara tradisional digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan
untuk mengobati sakit kepala. Rebusan daunnya juga digunakan untuk mengobati
batuk (Anonim, 2007). Dalam tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa
bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Senyawa
fenolik tersebut memiliki peranan penting dalam kaitan penggunaan tanaman
terhadap manfaatnya bagi kesehatan. Salah satu manfaat dari kandungan senyawa
fenolik pada tanaman dadap serep telah dibuktikan dalam penelitian
Rukachaisirikul et al.,(2007) yang menunjukan tanaman dadap serep (Erythrina
subumbrans) mengandung senyawa fenolik yang beraktivitas antibakteri lebih
kuat dibanding standar antibiotik vancomycin dan oxacillin terhadap beberapa
strain bakteri streptococcus dan staphylococcus.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Senyawa fenolik merupakan senyawa bioaktif dari tumbuhan yang
merupakan sumber antioksidan alami yang aman. Untuk melihat potensi
antioksidan dari tanaman dadap serep, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan
aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang
dilakukan
dengan
metode
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH)
secara
spektrofotometri. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka
serta hanya memerlukan sedikit sampel. Aktivitas diukur dengan menghitung
jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan
pengurangan konsentrasi larutan DPPH. Peredaman tersebut dihasilkan oleh
bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang
dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil
Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke
kuning (Zuhra, Tarigan dan Sihotang, 2008). Penentuan kandungan fenolik total
dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dilakukan menggunakan
metode Folin-Ciocalteu dimana merupakan salah satu metode yang cepat dan
sederhana dalam menentukan kandungan fenolik total (Fu et al., 2011).
B. Permasalahan
1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun
dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50
?
2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap
serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
C. Keaslian Penelitian
Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan
daun dadap pernah dilakukan oleh :
Estrada, E.I., 2010, dengan judul “Actividad Antioxidante De Alcaloides De
Erythrina Americana Miller”. Penelitian ini menggunakan daun dadap spesies
Erythrina Americana Miller yang diperoleh di universitas nacional autonoma
de Mexico (Mexico) dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl).
Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah
bahwa dalam penelitian ini daun dadap serep spesies Erythrina subumbrans
(Hassk.) Merr. yang digunakan dipanen dari dari kebun tanaman obat Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas
antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan
menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.
2. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas
antioksidan daun dadap serep sehingga bisa dimanfaatkan sebagai alternatif untuk
pemeliharaan kesehatan manusia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
E. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi etil asetat
ekstrak etanolik daun dadap serep.
2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun
dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50
dan mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik
daun dadap serep yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Dadap Serep
1. Keterangan botani
Dadap serep termasuk tanaman legum pohon, berasal dari Asia Tenggara
dan tersebar di seluruh kepulauan nusantara. Varietas tanaman ini dibedakan
berdasarkan ada tidaknya duri pada kulitnya (Purwanto, 2007).
2. Nama tumbuhan
Nama latin
: Erythrina subumbrans Hassk. (Anonim, 2007).
Nama sinonim
: Erythrina hypaphorus Boerl., Erythrina lithosperma
Miquel (Anonim, 2007).
Nama daerah
: dadap minyak, dadap limit (sunda); dadap lengan,
dadap lisah (jawa); dadap lenga, thetheuk oleng
(Madura) (Purwanto, 2007).
3. Klasifikasi dadap serep menurut USDA (2011)
Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Tracheobionta
Superdivisi
: Spermatophyta
Divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Sub Kelas
: Rosidae
Ordo
: Fabales
Famili
: Fabaceae
Genus
: Erythrina
Spesies
: Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
4. Gambaran umum
Dadap serep merupakan tanaman legum pohon, tumbuh tinggi agak
bengkok, ketinggian mencapai 15-22 m dengan diameter batang 40-100 cm,
sistem perakaran dalam. Kulit batang berwarna hijau, batang yang tua bercampur
garis-garis kecoklatan, cabang tumbuh lurus ke atas membentuk sudut 45 o.
Daunnya beranak tiga helai, berbentuk delta atau gemuk bundar ujung agak
meruncing, bagian bawah daun membundar, bila diremas terasa lunak ditangan.
Ukuran panjang tangkai daun 10-20,5 cm; panjang daun 9-19 cm; dan lebar daun
6-17 cm. Daun atas berukuran lebih besar daripada kedua daun penumpu.
Bunganya tumbuh diantara ketiak daun, daun mahkota bunyanya berwarna merah
kekuningan, berbentuk terompet. Polongnya berukuran kecil, berbentuk sabit,
berisi 4-8 biji per polong (Purwanto, 2007).
Dalam penggunaannya, bagian kulit kayu dan daun dadap serep secara
empiris digunakan untuk pengobatan tradisional sebagai campuran dengan
tanaman obat lainnya. Di Indonesia ditemukan daun mudanya digunakan untuk
minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala.
Rebusan daunnya digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007).
5. Kandungan kimia dadap serep
Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti
alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Flavonoid dan isoflavonoid
yang terkandung dalam tanaman dadap merupakan senyawa bioaktif yang
menarik perhatian para peneliti karena selain memiliki struktur senyawa yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
baru, senyawa bioktif tersebut juga menunjukan potensi sebagai senyawa
antimikroba (Rasooli, 2011).
O
Isoflavan
O
O
O
O
O
Isoflavone
O
Isoflavanone
O
O
OH
Isoflavan-3-ene
Isoflavanol
3-arylcoumarin
Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid (Samanta, Das,
dan Das, 2011)
B. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder dari alam dengan jumlah
senyawa yang besar (lebih dari 8.000) yang tersebar luas diseluruh kingdom
tanaman dan dikarakterisasi dengan setidaknya memiliki satu cincin aromatis
dengan satu atau lebih terikat dengan gugus hidroksil. Senyawa fenolik dapat
diklasifikasikan berdasarkan susunan dari atom karbon dalam flavonoid (flavonol,
flavon, flavan-3-ol, antosianidin, flavanon, isoflavon dan lainnya) dan nonflavonoid (asam fenolat, hidroksinamat, stilben dan lainnya) dan
senyawa-
senyawa tersebut umumnya berada terkonjugasi dengan gula dan asam organik
(Cartea, Francisco, Soengas, dan Velasco, 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Flavonoid merupakan salah satu kelompok metabolit sekunder terbesar
sebagai senyawa fenolik. Flavonoid melindungi tanaman terhadap berbagai
ancaman biotik dan abiotik yang menunjukkan spektrum dengan beragam fungsi
biologis dan memainkan peran penting dalam interaksi antara tanaman dan
lingkungannya (Samanta et al., 2011). Senyawa fenolik mayoritas yang ada di
alam berada sebagai glikosida. Adanya gula dan gugus hidroksil membuat
senyawa fenolik larut dalam air sedangkan adanya gugus metil dan unit isopentil
membuat flavonoid menjadi lipofilik (Samanta et al., 2011).
Sebagian besar koleksi metabolit dari produk alam disebut dengan istilah
flavonoid yang mencakup senyawa dengan karbon berstruktur C6-C3-C6.
Tergantung pada posisi keterkaitan dari cincin aromatik ke bagian benzopiren,
kelompok produk alam ini dibagi menjadi tiga kelas: Flavonoid (2 fenilbenzopiren), isoflavonoid (3-benzopiren) dan Neoflavonoid (Samata et al.,
2011).
O
O
Flavonoids
O
Isoflavonoids
(3-benzopyrans)
Neoflavonoids
Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam (Samata et al., 2011)
C. Radikal Bebas
Reaktif oksigen spesies (ROS) adalah istilah yang meliputi semua
molekul yang sangat reaktif yang mengandung atom oksigen yang merupakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
golongan radikal bebas. Jenis ROS termasuk radikal hidroksil, radikal anion
superoksida, hidrogen peroksida, singlet oksigen, radikal nitrat oksida, radikal
hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida. Semua mampu bereaksi dengan membran
lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang
mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al, 2008).
Banyak bukti yang telah dikumpulkan untuk melihat kerusakan seluler
yang timbul akibat dari spesies oksigen reaktif (ROS), setidaknya sebagian, dalam
etiologi dan patofisiologi penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif
(misalnya penyakit alzheimer, penyakit parkinson, multipel sklerosis, syndrom
down), peradangan, infeksi virus, autoimun patologi, dan gangguan sistem
pencernaan seperti peradangan pencernaan dan ulkus. Dalam sistem metabolisme
tubuh, radikal bebas dihasilkan sebagai bagian dari proses normal metabolisme
tubuh, dan reaksi berantai radikal bebas biasanya diproduksi di rantai pernapasan
mitokondria, campuran oksidase fungsi hati, dengan leukosit bakteri, melalui
aktivitas xantin oksidase, polusi atmosfer, dan dari transisi logam katalis, obat dan
xenobiotik. Selain itu, mobilisasi kimia dari cadangan lemak di bawah berbagai
kondisi seperti menyusui, olahraga, demam, infeksi dan bahkan puasa, dapat
menghasilkan peningkatan aktivitas radikal dan meningkatkan kerusakan,
khususnya yang berhubungan dengan kekebalan tubuh dan sistem saraf. Hormon
stres (adrenalin dan noradrenalin) yang disekresikan oleh kelenjar adrenal di
bawah kondisi stres emosional yang
berkelanjutan dan berlebihan, yang
kemudian dimetabolisme menjadi lebih sederhana seperti molekul radikal bebas,
juga dapat meningkatkan produksi senyawa radikal dalam tubuh (Atawodi, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
D. Antioksidan
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang mampu menunda,
memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh. Antioksidan
mampu menstabilkan, atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel
dalam tubuh. Antioksidan merupakan senyawa yang penting untuk menjaga
kesehatan seluler dan kesehatan sistemik tubuh (Sapakal et al., 2008).
Senyawa antioksidan dapat dibedakan berdasarkan komposisi, sifat fisik
dan kimia, mekanisme dan tempat aksi dari senyawa antioksidan tersebut. Enzimenzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti enzim glutation
reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation
peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan
menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif
dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Senyawa dengan bobot
molekul tinggi seperti protein : albumin, ceruplasmin, transferin, haptoglobin
mengikat logam aktif redoks dan membatasi produksi radikal bebas katalis logam.
Senyawa dengan berat molekul rendah dibagi menjadi antioksidan larut lemak
(tokoferol, karotenoid, kina dan beberapa polifenol) dan antioksidan yang larut air
(asam askorbat, asam urat dan beberapa polifenol). Senyawa antioksidan jenis
mineral: selenium, mangan, tembaga, dan seng diakui sebagai antioksidan yang
serbaguna. Senyawa antioksidan jenis vitamin: vitamin A, C, dan E ternyata
memiliki peran penting dalam mencegah atau meminimalkan kerusakan
peroksidasi dalam sistem biologis. Tanaman kaya antioksidan merupakan sumber
antioksidan alami yang dapat ditemukan dalam sayuran, kacang kedelai, kulit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
jeruk, biji sesame, daun teh hijau, biji kakao, anggur, tomat, jeruk, apel, bijibijian, zaitun, wortel (Sapakal et al.,2008).
Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun
antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi
karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan
sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) ternyata dapat meracuni
binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan
dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumbersumber antioksidan alami baru (Zuhra et al., 2008).
Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH ((a) donasi
kedua atom hidrogen, (b) dimerisasi, (c) kompleksasi) (Bondet, BrandWilliams, dan Berset, 1997)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan antioksidan sebagai
penetral (Sapakal et al., 2008)
Reactive Oxygen Species
Senyawa antioksidan
(ROS)
Radikal hidroksil
vitamin C, glutation, flavonoid, asam
lipoid
Radikal superoksida
vitamin C, glutation, flavonoid, SOD
Hidrogen peroksida
vitamin C, glutation, betakaroten,
vitamin E, CoQ10, flavonoid, asam
lipoid
Lipid peroksida
beta karoten, vitamin E, ubiquinon,
flavonoid, glutation peroksidase
E. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat atau metabolit aktif yang semula
berada didalam sel yang kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif
tersebut larut dalam cairan penyari (Harborne, 1987). Secara umum, penyarian
dapat
dibedakan
menjadi
infudasi,
maserasi,
perkolasi
dan
penyarian
berkesinambungan. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran
etanol air (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).
Maserasi
merupakan
metode
yang
melibatkan
perendaman
dan
penggojogan bahan tanaman didalam pelarut tertentu yang kemudian pelarutnya
diuapkan (Raaman, 2006). Remaserasi merupakan modifikasi cara penyarian
maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi menjadi dua bagian.
Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
diendap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang
kedua (Depkes, 1986). Alkohol didalam banyak penelitian merupakan pelarut
yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan
dalam tahapan ekstraksi (Harborne, 1998).
Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakukan sampel
untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin
menganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Ekstraksi cair-cair
ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan “pada
konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi
yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur”. Perbandingan
konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien
distribusi atau koefisien partisi (Kd) dan digambarkan dengan rumus :
Kd =
𝑆 𝑜𝑟𝑔
𝑆 𝑎𝑞
Dimana [S]org dan [S]aq masing-masing merupakan konsentrasi analit
dalam fase organik dan dalam fase air; Kd merupakan koefisien partisi. Efiseiensi
proses ekstraksi tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada
volume relative kedua fase. Adanya ekstaksi berulang (bertingkat) akan
meningkatkan efisiensi ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).
F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu
Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji
aktivitas antioksidan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter
konsentrasi yang ekivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
ini dapat dicapai dengan cara mengintepretasikan data eksperimental dari metode
tersebut (Molyneux, 2004).
Uji kuantitatif daya antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1difenil-2-pikrilhidrazil) secara spektrofotometri sinar tampak. Metode ini
didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH. Perubahan warna tersebut
disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen
yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk
senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Pada metode ini
absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi
dengan senyawa antioksidan (Josephy, 1997).
O2N
N
NO2
NO2
N
+ AH
O2N
O2N
DPPH Free Radical
H
N
N
+
A
NO2
Phenolic Compounds
DPPH Reduced Form
Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan
(Irshad, Zafaryab, Singh, dan Rizvi, 2012)
Dalam metode DPPH, dengan adanya elektron bebas yang tidak
berpasangan pada senyawa radikal DPPH, senyawa tersebut memberikan serapan
maksimum yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dan memberikan warna
ungu. Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning sebagai bentuk berkurangnya
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
absorptivitas molar radikal DPPH pada 517 nm dari 9660 ke 1640 ketika elektron
bebas radikal DPPH dipasangkan dengan hidrogen dari senyawa antioksidan
radikal bebas untuk membentuk senyawa DPPH-H. Dengan demikian hasil
dekolorisasi yang terjadi memberikan nilai stoikiometri sehubungan dengan
jumlah elektron yang ditangkap (Prakash, 2001).
Metode Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang
sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan
menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang
akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk
mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara
spektrofotometri ( Cicco dan Lattanzio, 2011).
G. Validasi Metode
Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat
memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel,
dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007).
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai
rujukan. Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (International Conference on
Harmanization) merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan
kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali
replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (recovery)
(Gandjar dan Rohman, 2007). Rata-rata persen recovery yang dihasilkan
seharusnya berada dalam kisaran sebagai berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima (APMVA, 2004)
% Senyawa
impuritis/aktif
Rata-rata recovery yang diterima
≥ 10
98-102 %
≥1
90-110 %
0,1-1
80-120 %