Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.).

xvii INTISARI

Dalam pengobatan tradisional di Indonesia, daun dari tanaman dadap serep berkhasiat untuk mengobati sakit kepala, batuk serta untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan. Senyawa fenolik merupakan salah satu kandungan bioaktif dari daun dadap serep. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep secara in vitro yang didasarkan pada efek peredaman radikal bebas larutan 1,1-difenil-pikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dengan inhibition concentration 50 (IC50).

Kandungan fenolik total juga ditentukan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan baku standar asam galat yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat. Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi dalam suasana basa dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 245,15 ± 4,26 µg/mL

dan kandungan fenolik total sebesar 8,51 ± 0,18 ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

Kata kunci: daun dadap serep(Erythrina subumbrans Hassk), fraksi etil asetat, antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total

xviii ABSTRACT

In Indonesian traditional medicine, the leaves of dadaps (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.) are efficacious to cure headaches, cough and can also be used as a drink for women after childbirth. Phenolic compound is one of the bioactive contents in dadaps leaves. This research was conducted to determine the antioxidant activities of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves in vitro based on the reducing effect of free radical of 1,1-diphenyl-pikrilhidrazil (DPPH) solution expressed by inhibition concentration 50 (IC50). The total

phenolic contents was also determined by using the Folin-Ciocalteu reagent with gallic acid standard expressed by the mass of gallic acid equivalents. The principle of this method is oxidized phenolic compounds in alkaline medium and Folin-Ciocalteu reagent is reduced to a blue solution that can be measured by the visible spectrophotometer at a wavelength of 750 nm. The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves had antioxidant activities with IC50 valued in the amount of 245.15 ± 4.26 µg/mL and the total phenolic content

of 8.51 ± 0.18 gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves and the method has not been validated.

Keywords : dadaps leaves (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), ethyl acetate fraction, antioxidant, DPPH, total phenolic content

i

UJIAKTIVITASANTIOKSIDANMENGGUNAKANMETODEDPPH

DANPENETAPANKANDUNGANFENOLIKTOTALFRAKSIETIL

ASETATEKSTRAKETANOLIKDAUNDADAPSEREP(Erythrina subumbrans (Hassk.)Merr.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh : Aldo Kristian NIM : 098114038

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini kupersembahkan untuk :

Tuhanku Yesus Kristus atas segala berkat dan penyertaan-Nya

Bapak, Ibu dan Kakak-kakakku atas kasih sayang

dan segala hal yang diberikan

Sahabat-sahabatku dan almamaterku

vii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis kepada Tuhan atas segala rahmat, berkat, anugrah dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN

METODE DPPH DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL

FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP

(Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.)” ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Penulis ingin berterima kasih kepada segala pihak yang telah memberikan bantuan baik dukungan, bimbingan, sarana, materil maupun moril dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada: 1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

2. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan perhatian, bimbingan dan arahan dari awal pengusulan skripsi sampai penulisan skripsi ini selesai.

3. Lucia Wiwid Wijayanti,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya untuk menguji dan juga memberikan masukan dan saran dalam skripsi ini. 4. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Penguji atas ketersediaannya untuk

viii

5. Rini Dwiastuti S.Far.,Apt, M.Sc., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah membimbing dan memberi nasihat kepada penulis.

6. Sahabat seperjuangan skripsi DPPH, Anthony Felix, Mikhael Gustandy, Willigis Danu Patria yang selalu membantu dan bekerjasama dengan luar biasa. 7. Teman-teman FSM dan FST A 2009, atas kerjasama, dukungan dan bantuan

yang diberikan.

8. Segenap laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium. 9. Pemerintah Kabupaten Bengkayang, Kal-Bar, atas bantuan dana yang

diberikan.

10.Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat disebut satu per satu.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat ketidaksempurnaan dalam penulisan skripsi ini. Dengan segala kerendahan hati penulis akan menerima segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan banyak pihak.

Yogyakarta, 10 Maret 2013

ix DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………... ii

HALAMAN PENGESAHAN……….. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN……… iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..………. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA…. vi KATA PENGANTAR.………. vii

DAFTAR ISI……….. ix

DAFTAR TABEL……….. xiii

DAFTAR GAMBAR……….. xv

DAFTAR LAMPIRAN………... xvi

INTISARI………... xvii

ABSTRACT………... xviii

BAB I PENGANTAR………. 1

A. Latar Belakang………... 1

B. Permasalahan……….. 3

C. Keaslian Penelitian………..… 3

D. Manfaat penelitian………... 4

E. Tujuan Penelitian………... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA………... 6

A. Dadap Serep………... 6

x

2. Nama tumbuhan………. 6

3. Klasifikasi dadap serep…..……… 6

4. Gambaran umum……… 7

5. Kandungan kimia dadap serep……… 7

B. Senyawa Fenolik………. 8

C. Radikal Bebas……… 9

D. Antioksidan……… 11

E. Penyarian……… 13

F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu……….... 14

G. Validasi Metode………...…… 16

H. Landasan Teori………. 18

I. Hipotesis……….. 19

BAB III METODOLOGI PENELITIAN……… 20

A. Jenis dan Rancangan Penelitian……….. 20

B. Variabel……… 20

C. Definisi Operasional………..……….… 20

D. Bahan dan Alat Penelitian……… 21

1. Bahan penelitian……….. 21

2. Alat penelitian……….…… 21

E. Tatacara Penelitian……… 22

1. Determinasi tumbuhan……… 22

2. Pengumpulan bahan……….…… 22

xi

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji……….… 23

5. Uji pendahuluan………..… 24

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………..…… 25

7. Uji aktivitas antioksidan……….…… 26

8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total…………. 27

9. Penetapan kandungan fenolik total………. 27

F. Analisis Hasil……… 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……….… 31

A. Determinasi……….. 31

B. Hasil Pengumpulan Bahan……… 31

C. Hasil Preparasi Sampel……….…… 34

1. Ekstraksi sampel………..… 34

2. Fraksinasi ekstrak……….… 35

D. Hasil Uji Pendahuluan………... 37

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan……….… 37

2. Uji pendahuluan senyawa fenolik……… 39

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan………. 40

1. Penentuan panjang gelombang maksimun ( maks)……… 40

2. Penentuan Operating Time(OT)………... 41

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan………. 43

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan ……… 45

2. Linearitas metode uji antioksidan……….. 46

xii

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH……… 48

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total……….. 55

1. Penentuan operating time(OT)……….. 55

2. Penentuan panjang gelombang maksimum……… 56

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total………… 57

1. Presisi metode penetapan kadar kandungan fenolik total……….. 57

2. Linieritas metode penetapan kandungan fenolik total……… 58

3. Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total………. 59

J. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total………. 59

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………. 62

A. Kesimpulan……….……. 62

B. Saran………... 62

DAFTAR PUSTAKA……….. 63

LAMPIRAN……….… 66

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan

antioksidan sebagai penetral………. 13 Tabel II. Kisaran recoveryhasil analisis yang diterima………….. 17 Tabel III. Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima………... 17 Tabel IV. Hasil Scanningpanjang gelombang maksimum DPPH… 40 Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin

yang direaksikan dengan radikal DPPH……… 43 Tabel VI. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep yang direaksikan

dengan DPPH……… 44

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin……. 45 Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat……… 45 Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode

DPPH………. 51

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dengan metode DPPH…………. 52

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan Fraksi etil asetat

ekstrak etanol daun dadap serep………. 53

Tabel XII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin

xiv

Tabel XIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum………….. 57

Tabel XIV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter……… 58

Tabel XV. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang

direaksikan dengan Folin-Ciocalteu……… 58

Tabel XVI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid……… 8 Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam………. 9 Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH……….. 12 Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan.. 15 Gambar 5. Skema jalannya penelitian……….. 30

Gambar 6. Blanko DPPH , Fraksi etil asetat, Kuersetin…………..…. 38 Gambar 7. Blanko reagen Folin-ciocalteau , Fraksi+reagen

Folin-ciocalteau, Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu…… 39 Gambar 8. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)……….. 42 Gambar 9. Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)……... 42 Gambar 10. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa……….. 48 Gambar 11. Struktur senyawa kuersetin……….. 49 Gambar 12. Usulan mekanisme reaksi kuersetin dan radikal DPPH…… 49 Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan

kuersetin……….. 51

Gambar 14. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan

fraksi etil asetat……… 52 Gambar 15. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)……… 56 Gambar 16. Reaksi pembentukan kompleks molybdenum-blue……….. 60

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat determinasi tanaman dadap serep………. 66 Lampiran 2. Gambar tanaman dadap serep……… 67 Lampiran 3. Perhitungan rendemen………...… 68 Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian

aktivitas antioksidan……….. ... 69 Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi pengujian

aktivitas antioksidan………. 70

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi………... 72 Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………. 73 Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH.. 74 Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi air

ekstrak metanol daun dadap serep………... 84 Lampiran 10. Penimbangan bahan pengujian kandungan fenolik total... 85 Lampiran 11. Perhitungan konsentrasi pengujian fenolik total………… 85 Lampiran 12. Scanning kontrol asam galat………. 88 Lampiran 13. Optimasi penentuan kandungan fenolik total……… 88 Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total……… 93 Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1…….. 94

xvii INTISARI

Dalam pengobatan tradisional di Indonesia, daun dari tanaman dadap serep berkhasiat untuk mengobati sakit kepala, batuk serta untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan. Senyawa fenolik merupakan salah satu kandungan bioaktif dari daun dadap serep. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep secara in vitro yang didasarkan pada efek peredaman radikal bebas larutan 1,1-difenil-pikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dengan inhibition concentration 50 (IC50). Kandungan fenolik total juga ditentukan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan baku standar asam galat yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat. Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi dalam suasana basa dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 245,15 ± 4,26 µg/mL dan kandungan fenolik total sebesar 8,51 ± 0,18 ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol daun dadap serep dan metode yang digunakan belum tervalidasi.

Kata kunci: daun dadap serep(Erythrina subumbrans Hassk), fraksi etil asetat, antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total

xviii

ABSTRACT

In Indonesian traditional medicine, the leaves of dadaps (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.) are efficacious to cure headaches, cough and can also be used as a drink for women after childbirth. Phenolic compound is one of the bioactive contents in dadaps leaves. This research was conducted to determine the antioxidant activities of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves in vitro based on the reducing effect of free radical of 1,1-diphenyl-pikrilhidrazil (DPPH) solution expressed by inhibition concentration 50 (IC50). The total phenolic contents was also determined by using the Folin-Ciocalteu reagent with gallic acid standard expressed by the mass of gallic acid equivalents. The principle of this method is oxidized phenolic compounds in alkaline medium and Folin-Ciocalteu reagent is reduced to a blue solution that can be measured by the visible spectrophotometer at a wavelength of 750 nm. The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves had antioxidant activities with IC50 valued in the amount of 245.15 ± 4.26 µg/mL and the total phenolic content of 8.51 ± 0.18 gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol extract of dadaps leaves and the method has not been validated.

Keywords : dadaps leaves (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.), ethyl acetate fraction, antioxidant, DPPH, total phenolic content

1 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang

Paparan sistem biologis dari xenobiotik, polusi, radiasi pengion atau cahaya UV dan perkembangan kondisi patologis tertentu menyebabkan tekanan oksidatif, akibatnya meningkatkan produksi oksigen radikal. (Sapakal et al., 2008). Pembentukan radikal bebas dan reaksi oksidasi pada biomolekul akan berlangsung sepanjang hidup. Inilah penyebab utama dari proses penuaan dan berbagai penyakit degeneratif (Silalahi, 2006). Radikal oksigen terus dibentuk pada semua organisme hidup, dengan efek merusak yang menyebabkan cedera dan kematian sel (Sapakal et al., 2008). Jenis Reaktif Oksigen Spesies (ROS) termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, radikal nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida mampu bereaksi dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al., 2008).

Antioksidan adalah zat yang berperan penting dalam menunda atau mencegah penyakit degeneratif oleh kerusakan oksidatif dari komponen sel hidup yang disebabkan oleh radikal bebas. Didalam tubuh secara alami telah mengandung enzim-enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Namun karena

2

tekanan oksidatif berlebih didalam tubuh, menyebabkan produksi radikal bebas menjadi meningkat didalam tubuh yang berakibat dibutuhkannya tambahan antioksidan yang cukup untuk menanggulangi tekanan oksidatif yang tinggi tersebut sehingga dapat mengurangi dampak kerusakan sel sebagai akibat dari reaksi radikal bebas.

Antioksidan sintetik seperti butylated hidroksitoluen (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) dan propil gallate (PG) telah digunakan selama bertahun-tahun, namun senyawa tersebut sedang diperiksa untuk kemungkinannya dalam menimbulkan toksisitas. Oleh karena itu, sekarang ini dilakukan penelitian intensif tentang antioksidan polifenol alami yang berasal dari tumbuhan untuk menggantikan antioksidan sintetis (Qader et al.,2011).

Dadap serep (Erythrina subumbrans) adalah salah satu tanaman yang secara tradisional digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala. Rebusan daunnya juga digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007). Dalam tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Senyawa fenolik tersebut memiliki peranan penting dalam kaitan penggunaan tanaman terhadap manfaatnya bagi kesehatan. Salah satu manfaat dari kandungan senyawa fenolik pada tanaman dadap serep telah dibuktikan dalam penelitian Rukachaisirikul et al.,(2007) yang menunjukan tanaman dadap serep (Erythrina subumbrans) mengandung senyawa fenolik yang beraktivitas antibakteri lebih kuat dibanding standar antibiotik vancomycin dan oxacillin terhadap beberapa strain bakteri streptococcus dan staphylococcus.

Senyawa fenolik merupakan senyawa bioaktif dari tumbuhan yang merupakan sumber antioksidan alami yang aman. Untuk melihat potensi antioksidan dari tanaman dadap serep, dalam penelitian ini dilakukan pemeriksaan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang dilakukan dengan metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) secara spektrofotometri. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Aktivitas diukur dengan menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan pengurangan konsentrasi larutan DPPH. Peredaman tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning (Zuhra, Tarigan dan Sihotang, 2008). Penentuan kandungan fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dilakukan menggunakan metode Folin-Ciocalteu dimana merupakan salah satu metode yang cepat dan sederhana dalam menentukan kandungan fenolik total (Fu et al., 2011).

B. Permasalahan

1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50 ?

2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?

4

C. Keaslian Penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan daun dadap pernah dilakukan oleh :

Estrada, E.I., 2010, dengan judul “Actividad Antioxidante De Alcaloides De

Erythrina Americana Miller”. Penelitian ini menggunakan daun dadap spesies

Erythrina Americana Miller yang diperoleh di universitas nacional autonoma de Mexico (Mexico) dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl).

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah bahwa dalam penelitian ini daun dadap serep spesies Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr. yang digunakan dipanen dari dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

2. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan daun dadap serep sehingga bisa dimanfaatkan sebagai alternatif untuk pemeliharaan kesehatan manusia.

E. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50 dan mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.

6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA A. Dadap Serep

1. Keterangan botani

Dadap serep termasuk tanaman legum pohon, berasal dari Asia Tenggara dan tersebar di seluruh kepulauan nusantara. Varietas tanaman ini dibedakan berdasarkan ada tidaknya duri pada kulitnya (Purwanto, 2007).

2. Nama tumbuhan

Nama latin : Erythrina subumbrans Hassk. (Anonim, 2007). Nama sinonim : Erythrina hypaphorus Boerl., Erythrina lithosperma

Miquel (Anonim, 2007).

Nama daerah : dadap minyak, dadap limit (sunda); dadap lengan, dadap lisah (jawa); dadap lenga, thetheuk oleng (Madura) (Purwanto, 2007).

3. Klasifikasi dadap serep menurut USDA (2011)

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae Genus : Erythrina

4. Gambaran umum

Dadap serep merupakan tanaman legum pohon, tumbuh tinggi agak bengkok, ketinggian mencapai 15-22 m dengan diameter batang 40-100 cm, sistem perakaran dalam. Kulit batang berwarna hijau, batang yang tua bercampur garis-garis kecoklatan, cabang tumbuh lurus ke atas membentuk sudut 45o. Daunnya beranak tiga helai, berbentuk delta atau gemuk bundar ujung agak meruncing, bagian bawah daun membundar, bila diremas terasa lunak ditangan. Ukuran panjang tangkai daun 10-20,5 cm; panjang daun 9-19 cm; dan lebar daun 6-17 cm. Daun atas berukuran lebih besar daripada kedua daun penumpu. Bunganya tumbuh diantara ketiak daun, daun mahkota bunyanya berwarna merah kekuningan, berbentuk terompet. Polongnya berukuran kecil, berbentuk sabit, berisi 4-8 biji per polong (Purwanto, 2007).

Dalam penggunaannya, bagian kulit kayu dan daun dadap serep secara empiris digunakan untuk pengobatan tradisional sebagai campuran dengan tanaman obat lainnya. Di Indonesia ditemukan daun mudanya digunakan untuk minuman bagi wanita sehabis melahirkan dan untuk mengobati sakit kepala. Rebusan daunnya digunakan untuk mengobati batuk (Anonim, 2007).

5. Kandungan kimia dadap serep

Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan lektin. Flavonoid dan isoflavonoid yang terkandung dalam tanaman dadap merupakan senyawa bioaktif yang menarik perhatian para peneliti karena selain memiliki struktur senyawa yang

8

baru, senyawa bioktif tersebut juga menunjukan potensi sebagai senyawa antimikroba (Rasooli, 2011).

O O

Isoflavan

Isoflavone O

O

O

Isoflavanone

O

Isoflavan-3-ene

O

OH Isoflavanol

O O

3-arylcoumarin

Gambar 1. Beberapa struktur senyawa isoflavonoid (Samanta, Das, dan Das, 2011)

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder dari alam dengan jumlah senyawa yang besar (lebih dari 8.000) yang tersebar luas diseluruh kingdom

tanaman dan dikarakterisasi dengan setidaknya memiliki satu cincin aromatis dengan satu atau lebih terikat dengan gugus hidroksil. Senyawa fenolik dapat diklasifikasikan berdasarkan susunan dari atom karbon dalam flavonoid (flavonol, flavon, flavan-3-ol, antosianidin, flavanon, isoflavon dan lainnya) dan non-flavonoid (asam fenolat, hidroksinamat, stilben dan lainnya) dan senyawa-senyawa tersebut umumnya berada terkonjugasi dengan gula dan asam organik (Cartea, Francisco, Soengas, dan Velasco, 2010).

Flavonoid merupakan salah satu kelompok metabolit sekunder terbesar sebagai senyawa fenolik. Flavonoid melindungi tanaman terhadap berbagai ancaman biotik dan abiotik yang menunjukkan spektrum dengan beragam fungsi biologis dan memainkan peran penting dalam interaksi antara tanaman dan lingkungannya (Samanta et al., 2011). Senyawa fenolik mayoritas yang ada di alam berada sebagai glikosida. Adanya gula dan gugus hidroksil membuat senyawa fenolik larut dalam air sedangkan adanya gugus metil dan unit isopentil membuat flavonoid menjadi lipofilik (Samanta et al., 2011).

Sebagian besar koleksi metabolit dari produk alam disebut dengan istilah flavonoid yang mencakup senyawa dengan karbon berstruktur C6-C3-C6. Tergantung pada posisi keterkaitan dari cincin aromatik ke bagian benzopiren, kelompok produk alam ini dibagi menjadi tiga kelas: Flavonoid (2 - fenilbenzopiren), isoflavonoid (3-benzopiren) dan Neoflavonoid (Samata et al., 2011).

O

O

Flavonoids Isoflavonoids

(3-benzopyrans)

O

Neoflavonoids

Gambar 2. Klasifikasi flavonoid produk alam (Samata et al., 2011)

C. Radikal Bebas

Reaktif oksigen spesies (ROS) adalah istilah yang meliputi semua molekul yang sangat reaktif yang mengandung atom oksigen yang merupakan

10

golongan radikal bebas. Jenis ROS termasuk radikal hidroksil, radikal anion superoksida, hidrogen peroksida, singlet oksigen, radikal nitrat oksida, radikal hipoklorit, dan berbagai lipid peroksida. Semua mampu bereaksi dengan membran lipid, asam nukleat, protein, enzim dan molekul kecil lainnya, yang mengakibatkan kerusakan sel (Sapakal et al, 2008).

Banyak bukti yang telah dikumpulkan untuk melihat kerusakan seluler yang timbul akibat dari spesies oksigen reaktif (ROS), setidaknya sebagian, dalam etiologi dan patofisiologi penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif (misalnya penyakit alzheimer, penyakit parkinson, multipel sklerosis, syndrom down), peradangan, infeksi virus, autoimun patologi, dan gangguan sistem pencernaan seperti peradangan pencernaan dan ulkus. Dalam sistem metabolisme tubuh, radikal bebas dihasilkan sebagai bagian dari proses normal metabolisme tubuh, dan reaksi berantai radikal bebas biasanya diproduksi di rantai pernapasan mitokondria, campuran oksidase fungsi hati, dengan leukosit bakteri, melalui aktivitas xantin oksidase, polusi atmosfer, dan dari transisi logam katalis, obat dan xenobiotik. Selain itu, mobilisasi kimia dari cadangan lemak di bawah berbagai kondisi seperti menyusui, olahraga, demam, infeksi dan bahkan puasa, dapat menghasilkan peningkatan aktivitas radikal dan meningkatkan kerusakan, khususnya yang berhubungan dengan kekebalan tubuh dan sistem saraf. Hormon stres (adrenalin dan noradrenalin) yang disekresikan oleh kelenjar adrenal di bawah kondisi stres emosional yang berkelanjutan dan berlebihan, yang kemudian dimetabolisme menjadi lebih sederhana seperti molekul radikal bebas, juga dapat meningkatkan produksi senyawa radikal dalam tubuh (Atawodi, 2005).

D. Antioksidan

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang mampu menunda, memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh. Antioksidan mampu menstabilkan, atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel dalam tubuh. Antioksidan merupakan senyawa yang penting untuk menjaga kesehatan seluler dan kesehatan sistemik tubuh (Sapakal et al., 2008).

Senyawa antioksidan dapat dibedakan berdasarkan komposisi, sifat fisik dan kimia, mekanisme dan tempat aksi dari senyawa antioksidan tersebut. Enzim-enzim yang berperan sebagai antioksidan dalam tubuh seperti Enzim-enzim glutation reduktase (GSH), superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), glutation peroksidase (GPX), diketahui dapat melemahkan spesies oksigen reaktif dengan menghilangkan potensi oksidan atau dengan mengubah spesies oksigen reaktif dan spesies nitrogen reaktif menjadi senyawa yang stabil. Senyawa dengan bobot molekul tinggi seperti protein : albumin, ceruplasmin, transferin, haptoglobin mengikat logam aktif redoks dan membatasi produksi radikal bebas katalis logam. Senyawa dengan berat molekul rendah dibagi menjadi antioksidan larut lemak (tokoferol, karotenoid, kina dan beberapa polifenol) dan antioksidan yang larut air (asam askorbat, asam urat dan beberapa polifenol). Senyawa antioksidan jenis mineral: selenium, mangan, tembaga, dan seng diakui sebagai antioksidan yang serbaguna. Senyawa antioksidan jenis vitamin: vitamin A, C, dan E ternyata memiliki peran penting dalam mencegah atau meminimalkan kerusakan peroksidasi dalam sistem biologis. Tanaman kaya antioksidan merupakan sumber antioksidan alami yang dapat ditemukan dalam sayuran, kacang kedelai, kulit

12

jeruk, biji sesame, daun teh hijau, biji kakao, anggur, tomat, jeruk, apel, biji-bijian, zaitun, wortel (Sapakal et al.,2008).

Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) ternyata dapat meracuni binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumber-sumber antioksidan alami baru (Zuhra et al., 2008).

Gambar 3. Usulan mekanisme reaksi antara BHT dan DPPH ((a) donasi kedua atom hidrogen, (b) dimerisasi, (c) kompleksasi) (Bondet,

Tabel I. Berbagai Reactive Oxygen Species (ROS) dan antioksidan sebagai penetral (Sapakal et al., 2008)

Reactive Oxygen Species

(ROS) Senyawa antioksidan

Radikal hidroksil vitamin C, glutation, flavonoid, asam lipoid

Radikal superoksida _{vitamin C, glutation, flavonoid, SOD}

Hidrogen peroksida

vitamin C, glutation, betakaroten, vitamin E, CoQ10, flavonoid, asam

lipoid

Lipid peroksida beta karoten, vitamin E, ubiquinon, flavonoid, glutation peroksidase

E. Penyarian

Penyarian adalah kegiatan penarikan zat atau metabolit aktif yang semula berada didalam sel yang kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif tersebut larut dalam cairan penyari (Harborne, 1987). Secara umum, penyarian dapat dibedakan menjadi infudasi, maserasi, perkolasi dan penyarian berkesinambungan. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran etanol air (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).

Maserasi merupakan metode yang melibatkan perendaman dan penggojogan bahan tanaman didalam pelarut tertentu yang kemudian pelarutnya diuapkan (Raaman, 2006). Remaserasi merupakan modifikasi cara penyarian maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi menjadi dua bagian. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah

14

diendap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua (Depkes, 1986). Alkohol didalam banyak penelitian merupakan pelarut yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan dalam tahapan ekstraksi (Harborne, 1998).

Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakukan sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin menganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan “pada

konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur”. Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (Kd) dan digambarkan dengan rumus :

Kd = � �

Dimana [S]org dan [S]aq masing-masing merupakan konsentrasi analit dalam fase organik dan dalam fase air; Kd merupakan koefisien partisi. Efiseiensi proses ekstraksi tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada volume relative kedua fase. Adanya ekstaksi berulang (bertingkat) akan meningkatkan efisiensi ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).

F. Metode DPPH dan Folin-Ciocalteu

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan. Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal

ini dapat dicapai dengan cara mengintepretasikan data eksperimental dari metode tersebut (Molyneux, 2004).

Uji kuantitatif daya antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) secara spektrofotometri sinar tampak. Metode ini didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH. Perubahan warna tersebut disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning. Pada metode ini absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan (Josephy, 1997).

NO₂

O₂N O₂N

N

N _{+ AH O}

2N

NO₂

NO₂

H

N N

DPPH Free Radical Phenolic Compounds DPPH Reduced Form

+ A

Gambar 4. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan (Irshad, Zafaryab, Singh, dan Rizvi, 2012)

Dalam metode DPPH, dengan adanya elektron bebas yang tidak berpasangan pada senyawa radikal DPPH, senyawa tersebut memberikan serapan maksimum yang kuat pada panjang gelombang 517 nm dan memberikan warna ungu. Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning sebagai bentuk berkurangnya

16

absorptivitas molar radikal DPPH pada 517 nm dari 9660 ke 1640 ketika elektron bebas radikal DPPH dipasangkan dengan hidrogen dari senyawa antioksidan radikal bebas untuk membentuk senyawa DPPH-H. Dengan demikian hasil dekolorisasi yang terjadi memberikan nilai stoikiometri sehubungan dengan jumlah elektron yang ditangkap (Prakash, 2001).

Metode Folin-Ciocalteu (F-C) merupakan metode kolorimetri yang sering digunakan yang berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara spektrofotometri ( Cicco dan Lattanzio, 2011).

G. Validasi Metode

Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007).

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya atau nilai rujukan. Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (International Conference on Harmanization) merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (recovery) (Gandjar dan Rohman, 2007). Rata-rata persen recovery yang dihasilkan seharusnya berada dalam kisaran sebagai berikut :

Tabel II. Kisaran recovery hasil analisis yang diterima (APMVA, 2004)

% Senyawa

impuritis/aktif Rata-rata recovery yang diterima

≥ 10 98-102 %

≥ 1 90-110 %

0,1-1 80-120 %

< 1 75-125 %

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Tabel III. Kriteria nilai presisi yang masih dapat diterima (APVMA, 2004)

Kadar zat aktif (%)

Nilai KVyang masih dapat diterima (%)

≥ 10 ≤ 2

1-10 ≤ 5

0,1-1 ≤ 10

<0,1 ≤ 20

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks (Gandjar dan Rohman, 2007). Jika respon yang dihasilkan dari suatu metode dapat membedakan senyawa yang dituju dengan respon yang lainnya, maka metode

18

tersebut dapat dikatakan selektif. Selektifitas suatu metode analisis dapat ditunjukan dengan menampilkan data yang menggambarkan tidak adanya interferensi dari hasil produk degradasi dan senyawa yang dapat menyebabkan interferensi lainnya dalam matriks (APVMA, 2004).

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x) (Gandjar dan Rohman, 2007).

H. Landasan Teori

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif yang merupakan salah satu faktor penyebab kerusakan sel dalam tubuh. Untuk mengurangi dampak kerusakan yang diakibatkan dari radikal bebas, dibutuhkan senyawa antioksidan yang merupakan suatu senyawa yang mampu menunda, memperlambat atau menghambat reaksi oksidasi didalam tubuh yang dapat berasal dari radikal bebas. Antioksidan mampu menstabilkan atau menonaktifkan radikal bebas sebelum menyerang sel dalam tubuh. Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami yang berasal dari tanaman.

Secara empiris tanaman dadap serep digunakan sebagai bahan obat tradisional yang digunakan untuk mengobati batuk, sakit kepala, demam dan minuman bagi wanita sehabis melahirkan. Tanaman dadap serep memiliki kandungan senyawa bioaktif seperti alkaloid, flavonoid, isoflavonoid, saponin dan

lektin. Adanya berbagai kandungan senyawa fenolik disamping saponin dan lektin dalam tanaman dadap serep tersebut memberikan kemungkinan besar bahwa tanaman ini memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Pengujian aktivitas antioksidan dari suatu sampel uji dapat dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Metode ini didasarkan pada perubahan warna radikal DPPH yang disebabkan oleh reaksi antara radikal bebas DPPH dengan senyawa antioksidan yang menyumbangkan satu atom hidrogen yang dilepaskan senyawa yang terkandung dalam bahan uji untuk membentuk senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning, sisa DPPH yang tidak bereaksi diukur secara spektrofotometri sinar tampak.

Kandungan senyawa fenolik dari suatu sampel dapat diukur dengan metode Folin-Ciocalteu (F-C). Metode ini berdasarkan reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan senyawa alkali, umumnya menggunakan sodium karbonat, yang akan menghasilkan ion fenolat yang cukup besar. Senyawa fenolat yang terbentuk mereduksi warna kuning F-C menjadi berwarna biru, yang dapat diukur secara spektrofotometri.

I.Hipotesis

Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mempunyai aktivitas antioksidan yang dapat diukur dengan metode DPPH yang dinyatakan dengan

IC50. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep

dapat diukur dengan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.

20

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan dan cara panen.

4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, cuaca, kelembaban, curah hujan.

C. Definisi Operasional

1. Daun dadap serep adalah daun (folium) segar dari tanaman dadap serep yang dipanen dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (Yogyakarta) dengan bentuk daun belah ketupat, dengan lebar ± 10-17 cm, berwarna hijau.

2. Ekstrak etanolik daun dadap serep adalah sari hasil proses maserasi daun dadap serep dengan penyari etanol.

3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik daun dadap serep dengan menggunakan pelarut etil asetat.

4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep untuk menangkap radikal DPPH.

5. Nilai inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun dadap serep yang diambil dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin kualitas Sigma Chem. Co., USA; bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV. General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.

2. Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath

(labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000 L; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

22

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tumbuhan

Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Tanaman dadap serep diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma di Yogyakarta. Pengumpulan pada musim kemarau bulan Agustus tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman saat pagi hari.

3. Preparasi sampel

Daun dadap serep segar dicuci dengan air mengalir, dikering-anginkan, dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan grinder. Ketika dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol 76%). Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang 100 g dan dituang kedalam bejana maserasi, ditambah etanol 76% sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol 76% secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya dicampurkan dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator

Ekstrak etanol daun dadap serep ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian atas.

Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan

vacuum rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik serta aluminium foil lalu disimpan dalam desikator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok kuersetin

Sebanyak 2,5 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL.

c. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL larutan stok kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 g/mL.

24

d. Pembuatan larutan uji

1. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Sebanyak 12,5 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu di add metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 75; 150; 225; 300; 375 g/mL.

2. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 5,0 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 500,0 µg/mL.

e. Pembuatan larutan asam galat

Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µg/mL dalam akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.

5. Uji pendahuluan

a. Uji fenolik

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 500,0 µg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µg/mL dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi. Lalu ditambahkan 5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit. Tambahkan 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna larutan tersebut.

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 g/mL , dan larutan uji 200,0 g/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.

6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing 3 labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding kuersetin 5; 10 dan 15 g/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 75; 225; 375 g/mL.

26

7. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando (2012).

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH. Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.

c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).

% CV = � � � � �� �

d. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri.

a. Penentuan OT

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.

9. Penetapan kandungan fenolik total

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 g/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M.

28

Setelah OT, absorbansinya dibaca pada maksimum terhadap blanko yang terdiri

atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1 M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total

Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).

% CV = � � � � �� �

− � x 100%

c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 500 g/mL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Lakukan 3 kali replikasi.

F. Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus : Absorbansi (larutan kontrol) – Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji) X 100%

Absorbansi larutan control

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik

untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.

30

Gambar 5. Skema jalannya penelitian

Determinasi tanaman

Pengumpulan dan preparasi bahan

Pembuatan ekstrak etanol daun dadap serep

Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air

Fraksi wasbensin

Fraksi air

Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Fraksi etil asetat Fraksi air II

Uji Pendahuluan

Optimasi uji antioksidan

Validasi metode uji aktivitas antioksidan

Estimasi aktivitas antioksidan

Analisis statistik Optimasi metode

penetapan kandungan fenolik total

Validasi metode penetapan kandungan

fenolik total

Estimasi kandungan fenolik total

31

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi

Dalam penelitian ini langkah pertama yang dilakukan adalah determinasi tanaman yang akan digunakan sebagai sampel uji. Tujuan dilakukannya determinasi adalah untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan serta untuk menghindari kesalahan dalam penggunaan tanaman saat dilakukan penelitian. Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan buku Flora of Java (Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965). Dari hasil determinasi (lampiran 1) yang dilakukan terbukti bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah dadap serep (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.).

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun dadap serep yang digunakan diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Daun dipanen tanggal 21 september 2012. Daun dadap serep dipilih yang tidak layu, tidak terdapat bekas luka daun, masih berwarna hijau dan masih segar. Adanya luka daun pada tanaman dapat menyebabkan timbulnya respon enzimatik terhadap luka pada daun tanaman tersebut. Polifenol oksidase merupakan suatu enzim ekstraseluler yang akan mengoksidasi senyawa fenolik menjadi bentuk radikal dan membentuk polimer yang digunakan untuk menutup luka pada daun. Menurut Harborne

32

(1987), senyawa fenol pada tanaman sangat peka terhadap adanya proses oksidasi enzim yang mungkin dapat berakibat hilangnya senyawa fenol. Berkurangnya senyawa fenolik pada daun maka dapat mengakibatkan pada berkurangnya aktivitas antioksidan. Seleksi ini dilakukan untuk menjaga kualitas daun yang akan digunakan sehingga kemungkinan terjadinya pengurangan mutu sampel daun akibat sudah terjadinya perubahan kandungan kimia daun dari proses perubahan metabolisme tumbuhan dapat dihindari. Daun kemudian dicuci, dibersihkan dengan air bersih yang mengalir untuk menghilangkan sisa-sisa partikel debu, pengotor lain serta kontaminan yang masih tertinggal di daun.

Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan proses yang dapat menentukan mutu simplisia daun dadap serep yang akan digunakan sebagai sampel uji, oleh karena itu diperlukan prosedur baku dalam proses tersebut. Waktu terbaik untuk pemanenan daun (kualitas pada puncak musim atau waktu pada hari pemanenan) harus ditentukan sesuai dengan kualitas dan kuantitas konstituen aktif biologis dari hasil vegetatif total bagian tanaman obat yang ditargetkan. Dalam pemanenan daun dadap serep dipilih pada saat pagi hari untuk mendapatkan hasil metabolit sekunder dari tanaman secara maksimal dan tidak dalam kondisi basah (hujan atau embun) atau dalam kondisi kelembaban tinggi untuk mengurangi kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh mikroba pada tanaman. Kontaminasi mikroba pada tanaman dapat mengakibatkan berubahnya metabolisme dari tanaman tersebut. Hal ini dikarenakan adanya senyawa fitotoksin yang dihasilkan oleh mikroba yang merupakan hasil sintesis mikroba pada tanaman saat mikroba tersebut menyerang tanaman. Fitotoksin dapat

menginduksi tanaman untuk memproduksi senyawa fitoaleksin yang merupakan senyawa hasil metabolisme tanaman sebagai pertahanan atas serangan mikroba. Menurut Harborne (1987), senyawa fitoaleksin pada tanaman dapat berupa seskuiterpenoid, isoflavonoid, asetilena, atau senyawa fenol. Apabila senyawa fitoaleksin diproduksi berlebih pada tanaman sebagai tanggapan atas serangan mikroba, maka jumlah senyawa fenol yang dibutuhkan sebagai sumber fitoaleksin akan bertambah. Hal ini dapat menimbulkan kandungan senyawa fenol yang merupakan metabolit sekunder tanaman yang dapat berfungsi sebagai senyawa antioksidan akan berkurang akibat digunakannya senyawa fenol sebagai sumber fitoaleksin.

Daun dadap yang telah diperoleh dan dicuci kemudian dikeringkan sebelum ekstraksi. Menurut World Health Organization (2003), dalam proses pengeringan, kelembapan udara pada tempat pengeringan diperhatikan dan dijaga untuk menghindari kelembapan udara berlebih yang dapat menimbulkan tumbuhnya kontaminan jamur pada daun. Pengeringan dilakukan dalam keadaan terawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang mungkin terjadi. Daun dadap serep yang diperoleh dikeringkan segera tanpa menggunakan suhu tinggi dan dalam aliran udara yang baik. Setelah daun dadap serep benar-benar kering, daun tersebut disimpan diwadah yang kering dan bersih.

34

C. Hasil Preparasi Sampel

1. Ekstraksi sampel

Serbuk simplisia yang digunakan kemudian diekstraksi dengan cairan penyari etanol 76%. Menurut Harborne (1998), etanol didalam banyak penelitian merupakan pelarut yang cocok untuk berbagai tujuan ekstraksi sebagai pelarut awal yang digunakan dalam tahapan ekstraksi. Metode penyarian yang digunakan adalah dengan maserasi. Pemilihan metode ini karena dengan metode ini sampel yang digunakan tidak mengalami perlakuan pemanasan sehingga senyawa yang tidak cocok dengan pemanasan terjaga stabilitasnya. Maserasi dilakukan selama dua hari dan dilanjutkan remaserasi selama dua hari. Selama proses maserasi dilakukan, digunakan juga shaker sebagai alat untuk membantu penggojogan. Penggojogan dilakukan untuk meningkatkan kontak antara cairan penyari yang digunakan dengan sampel, sehingga proses ekstraksi metabolit yang terkandung dalam sampel dapat berjalan lebih efektif dan mendapatkan hasil penyarian yang maksimal. Remaserasi dalam penelitian ini dilakukan untuk memaksimalkan hasil perolehan penyarian dari senyawa yang belum tersari akibat sudah jenuhnya cairan penyari yang digunakan.

Hasil dari proses maserasi dan remaserasi dikumpulkan yang kemudian disaring dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring dan diintegrasikan dengan pompa vacuum sehingga proses penyaringan lebih cepat. Filtrat hasil penyaringan tersebut kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan alat vacuum rotary evaporator. Alat tersebut dapat menguapkan pelarut yang digunakan dengan titik didih yang lebih rendah dari titik didih pelarut dengan adanya pompa

vakum, sehingga dapat memperkecil kemungkinan rusaknya senyawa yang terkandung didalamnya. Perolehan bobot ekstrak daun dadap serep adalah sebesar 14,235 g.

2. Fraksinasi ekstrak

Struktur senyawa aktif dalam tanaman sangat bervariasi. Perbedaaan ini dipengaruhi golongan dan substituen dari senyawa tersebut. Hal ini dapat menyebabkan perbedaan polaritas dari tiap-tiap senyawa tersebut sehingga untuk mengekstraksi senyawa aktifnya diperlukan pelarut dengan polaritas yang bertingkat. Menurut Snyder (1997), proses fraksinasi akan memisahkan komponen aktif dari ekstrak daun kedalam fraksi polar, semi polar dan fraksi non polar. Etanol merupakan salah satu pelarut universal yang dapat menyari banyak senyawa kimia seperti klorofil, minyak, vitamin dan mineral. Oleh sebab itu dalam penelitian ini dilakukan fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan senyawa didalam ekstrak sehingga yang didapat adalah senyawa-senyawa yang dituju yaitu senyawa-senyawa fenolik. Dalam melakukan fraksinasi dalam penelitian ini menggunakan prinsip ektraksi cair-cair dimana merupakan teknik ekstraksi yang menggunakan dua pelarut yang tidak tercampurkan yang menimbulkan perpindahan senyawa terlarut dari satu pelarut ke pelarut kedua.

Ekstrak yang didapat kemudian dilarutkan dengan air hangat agar lebih mudah untuk melarutkan ekstrak kental. Fraksinasi dilakukan dengan wasbensin

yang merupakan pelarut non polar. Penggunaan wasbensin yang merupakan senyawa non polar dimaksudkan untuk mengekstraksi senyawa-senyawa non polar seperi minyak, lemak, klorofil dan vitamin. Fraksinasi dilakukan

36

menggunakan corong pisah. Dalam corong pisah, fraksi air akan berada dibagian bawah sedangkan fraksi wasbensin ada di bagian atas. Hal ini dikarenakan adanya perbedaan bobot jenis antara wasbensin dan air. Fraksi air yang mengandung senyawa polar seperti fenolik disimpan, sedangkan fraksi wasbensin yang mengandung klorofil, minyak, lemak dan vitamin tidak digunakan dalam penelitian ini.

Tahap selanjutnya melakukan fraksinasi kembali dari fraksi air yang diperoleh menggunakan pelarut etil asetat. Menurut Robinson (1995), pengekstraksian kembali fraksi air dengan pelarut organik yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar sering kali bermanfaat untuk memisahkan golongan fenolik seperti senyawa-senyawa flavonoid dari senyawa yang lebih polar seperti karbohidrat. Etil asetat merupakan pelarut yang baik untuk ini. Fraksi air akan berada dibagian bawah dan fraksi etil asetat yang berbobot jenis lebih kecil dari bobot jenis air akan berada diatas. Fraksi etil asetat akan mengkestraksi senyawa fenolik aglikon sedangkan senyawa seperti antosianin, glikosida flavonoid akan berada dalam fraksi air.

Dalam melakukan fraksinasi, dilakukan dengan perbandingan yang sama antara pelarut etil asetat, wasbensin dan air dengan masing-masing menggunakan 100 mL fraksi. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), fraksinasi juga dilakukan secara berulang sebanyak tiga kali karena ekstraksi berulang dengan volume yang sama akan lebih efektif dibanding melakukan ekstraksi tunggal dengan volume yang besar. Bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan bentuk

aglikonnya bersifat cenderung non polar, sehingga tidak menutup kemungkinan adanya senyawa tersebut larut dalam air maupun etil asetat.

Setelah didapat fraksi etil asetat, fraksi kemudian diuapkan menggunakan

vaccum rotary evaporator untuk meminimalkan pemaparan pemanasan supaya stabilitas senyawa fenolik tetap terjaga. Sisa fraksi etil asetat kemudian dimasukkan kedalam oven dengan suhu 40 oC untuk menguapakan sisa pelarut sehingga didapatkan ekstrak kental. Fraksi kental etil asetat dalam cawan petri kemudian dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium foil supaya tidak terkena udara dan tidak terpapar sinar UV yang dapat mendegradasi senyawa fenolik yang ada didalam fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukan didalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,424 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,424 %.

D. Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Tujuan uji pendahuluan aktivitas antioksidan adalah untuk mengetahui secara kualitatif adanya senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan di dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Uji ini menggunakan radikal DPPH dengan kuersetin sebagai pembanding dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik sebagai sampel uji. Uji ini perlu dilakukan sebelum uji kuantitatif dimana dapat menentukan langkah perlu dilakukannya uji kuantitatif aktivitas antioksidan atau tidak.

38

Uji ini dilakukan menggunakan tabung reaksi dengan menambahkan sejumlah larutan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep ke larutan DPPH. Keberadaan senyawa antioksidan dapat menyebabkan terjadinya peluruhan warna larutan dari ungu ke kuning.

Gambar 6. Blanko DPPH (B), Fraksi etil asetat (A), Kuersetin (C)

Dalam uji ini digunakan kontrol positif berupa larutan DPPH yang ditambah kuersetin untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar 5). Kontrol negatif dalam penelitian ini menggunakan larutan DPPH untuk menunjukan warna larutan apabila hasil uji negatif (Gambar 5). Dari hasil uji yang dilakukan terlihat adanya penurunan intensitas warna larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari warna ungu menjadi kuning (Gambar 5). Ini menunjukan bahwa hasil pengujian positif dan didalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan.

1. Uji pendahuluan senyawa fenolik

Uji ini bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Pengujian dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau yang didasarkan pada reaksi oksidasi-reduksi dalam suasana basa. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dengan pereaksi Folin-Ciocalteau. Menurut Cicco dan Lattanzio (2011), reaksi yang terjadi yaitu adanya oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa, yang pada umumnya menggunakan sodium karbonat, yang mana biasanya akan menghasilkan ion fenolik yang cukup banyak. Ion fenolat yang terbentuk akan mereduksi warna kuning dari reagen Folin-ciocalteau. Reaksi positif dari metode ini membentuk kompleks warna biru. Semakin tinggi kadar fenol pada sampel, semakin banyak produk molekul berwarna biru, akibatnya intensitas warna biru semakin tinggi.

Gambar 7. Blanko reagen ciocalteau (A), Fraksi+reagen Folin-ciocalteau (B), Asam galat+ragen Folin-ciocalteatu (C)

40

Uji ini menggunakan kontrol negatif, yaitu pereaksi Folin-Ciocalteu untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya negatif (Gambar 6). Kontrol positif dalam uji ini menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu yang ditambah asam galat untuk menunjukan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar 6). Dari hasil penelitian yang dilakukan, fraksi etil asetat yang diberi reagen Folin-Ciocalteu menunjukan warna biru. Dapat disimpulkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep mengandung senyawa fenolik.

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( maks)

Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum adalah untuk menentukan panjang gelombang dimana larutan DPPH yang digunakan memberikan absorbansi yang paling optimum. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), pada panjang gelombang maksimum, perubahan yang sedikit dari konsentrasi akan memberikan perubahan yang paling besar pada absorbansi yang dihasilkan. Dengan demikian diperoleh sensitivitas yang maksimum.

Panjang gelombang maksimum dilakukan dengan scanning tiga konsentrasi larutan DPPH. Scanning panjang gelombang dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm.

Tabel IV. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH

Konsentrasi larutan

DPPH maks hasil scanning maks rata-rata maks teoritis

0,02 mM 515,5 nm

515,5 nm 515-520 nm

0,04 mM 515,5 nm

Menurut Molyneux (2004), panjang gelombang teoritis untuk pengukuran DPPH berkisar antara 515 nm-520 nm. Hasil scanning tiga konsentrasi larutan DPPH didapatkan hasil panjang gelomabang maksimum rata-rata adalah 515,5 nm (Tabel IV). Panjang gelombang ini masih masuk dalam kisaran panjang gelombang teoritis DPPH, yaitu 515-520 nm.

2. Penentuan Operating Time (OT)

Operating time merupakan waktu dimana reaksi yang terjadi sudah optimal. Menurut Mustariche (2012), pada rentang waktu tersebut senyawa uji dan larutan pembanding berada dalam keadaan reaksi sempurna dengan DPPH yang ditunjukan dengan diperolehnya absorbansi DPPH yang stabil. Pengukuran pada waktu OT bertujuan untuk meminimalkan kesalahan dalam memperoleh hasil pengukuran. Penetuan OT dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan DPPH yang sudah direaksikan dengan larutan pembanding, yaitu kuersetin serta larutan uji, yaitu fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep. Pengukurun dilakukan pada konsentrasi rendah, tengah dan tinggi. Absorbansi diukur tiap 5 menit selama 60 menit.

42

Gambar 8. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)

Gambar 9. Grafik Penetuan OT Fraksi Etil Asetat (Replikasi 1)

Dari hasil pengukuran OT yang terlihat pada gambar 7 dan gambar 8 menunjukan bahwa absorbansi stabil pada menit ke-30 hingga menit ke-60. Dengan demikian, secara teoritis dapat disimpulkan bahwa pada menit ke-30

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

0 20 40 60 80

Operating time

kuersetin

Waktu (menit) A b so rb a n si 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

0 10 20 30 40 50 60 70

75 µg/mL 225 µg/mL 375 µg/mL

Penentuan OT Fraksi Etil Asetat

Waktu (menit) Ab so rb a n si

seluruh senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan pada larutan pembanding dan larutan uji sudah bereaksi dengan radikal DPPH, sehingga OT yang akan digunakan untuk reaksi radikal DPPH dengan larutan pembanding dan larutan uji adalah 30 menit.

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Validasi metode merupakan serangkaian prosedur yang digunakan untuk menjamin bahwa metode analisis dapat memberikan hasil seperti yang diharapakan dengan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Hasil dari suatu analisis dengan metode yang valid akan memberikan hasil yang dapat dipertanggung jawabkan. Parameter metode analisis yang dinilai dalam pengujian ini yaitu presisi, linearitas dan spesifisitas.

Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin yang direaksikan dengan radikal DPPH

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi Kuersetin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Kuersetin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Kuersetin (µg/mL) Absorbansi

5,2 0,653 5 0,663 5 0,656

7,8 0,563 7,5 0,572 7,5 0,559

10,4 0,475 10 0,473 10 0,480

13 0,377 12,5 0,385 12,5 0,395

15,8 0,288 15 0,292 15 0,311

Persamaan regresi linear y = -0,035x + 0,833

r = -0,9997

Persamaan regresi linear y = -0,037x + 0,849

r = -0,9998

Persamaan regresi linear y = -0,028x + 0,82

44

Dari tiga replikasi yang dilakukan memberikan persamaan regresi linear yang berbeda tiap replikasinya. Berdasarkan nilai persamaan regresi linear seri baku kuersetin yang dihasilkan, dipilih persamaan dari hasil replikasi dua yaitu y = -0,037x + 0,849 yang akan digunakan untuk menghitung nilai presisi (Coefficient of variation) dari kuersetin. Persamaan tersebut dipilih karena nilai r dari replikasi dua menghasilkan nilai yang paling mendekati 1 atau 1, yaitu r = -0,9998.

Tabel VI. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang direaksikan dengan DPPH

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi Fraksi (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Fraksi (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Fraksi (µg/mL) Absorbansi

75,6 0,612 75 0,603 75 0,617

151,2 0,506 150 0,531 150 0,514

226,8 0,442 225 0,449 225 0,435

302,4 0,334 300 0,367 300 0,345

378 0,255 375 0,27 375 0,263

Persamaan regresi linear y = -0,088x + 0,695

r = -0,9975

Persamaan regresi linear y = -0,001x + 0,693

r = -0,9986

Persamaan regresi linear y = -0,001x + 0,697

r = -0,9991

Berdasarkan hasil (pada tabel VI) dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang dilakukan dipilih persamaan replikasi tiga yaitu y = -0,001x + 0,697 dengan nilai r = 0,9991 sebagai persamaan yang akan digunakan untuk menghitung coefficient of variation (CV) untuk fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan

Presisi merupakan keterulangan dan ketertiruan dari perolehan hasil analisis beberapa kali terhadap sampel yang dianalisis dengan metode yang digunakan. Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam Coeffisien of Variant

(CV). Menurut Kingstone (2004), CV yang baik adalah CV ≤ 20% untuk

konsentrasi analit <0,1%b/v.

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar kuersetin

Konsentrasi

Rerata konsentrasi

Rerata

%IC SD % CV

Rendah 5,067 23,654 0,0051 0,781 Tengah 10,133 44,716 0,0037 0,757 Tinggi 15,267 65,506 0,0122 4,137

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada tabel VII, didapat nilai % CV 0,0781 %, 0,757 %, 4,137 % untuk tiga konsentrasi standar kuersetin yang digunakan. Nilai ini masih masuk dalam persyaratan % CV menurut Kingstone (2004), dimana CV yang baik adalah CV ≤ 20% dengan konsentrasi analit <0,1%b/v.

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

Konsentrasi

Rerata konsentrasi

Rerata

%IC SD % CV

Rendah 86 26,475 0,0070 1,162

Tengah 255 46,792 0,0070 1,584

Tinggi 434,4 68,380 0,0075 2,857

Berdasarkan hasil yang diperoleh yang ditunjukan pada tabel VIII, didapat % CV fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep dari tiga konsentrasi

46

yaitu 1,162 %, 1,584 %, 2,857 %. Nilai ini juga masih masuk dalam persyaratan % CV menurut Kingstone (2004), dimana CV yang baik adalah CV≤ 20% dengan konsentrasi analit <0,1%b/v, sehingga dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan metode analisis yang digunakan memiliki presisi yang baik.

2. Lineritas metode uji antioksidan

Linearitas merupakan suatu gambaran mengenai kemampuan suatu prosedur analisis untuk menghasilkan hubungan yang proporsional antara konsentrasi analit dalam sampel dengan hasil yang diberikan, baik secara langsung atau dengan transformasi dari perhitungan matematik yang baik. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r). Dalam penentuan kurva kalibrasi yang baik, konsentrasi minimal terdiri dari lima konsentrasi dengan jarak antara 50-150%. Sedangkan menurut Chan et al., (2004), untuk koefisien korelasi adalah 0,995 ataupun diharapkan lebih dari nilai tersebut.

Berdasarkan hasil tiga repikasi yang ditunjukan pada tabel V untuk validasi metode analisis kuersetin, didapatkan persamaan regresi linear untuk replikasi satu, replikasi dua dan replikasi tiga berturut-turut adalah 0,9997, 0,9998, dan 0,9995. Dari tiga hasil tersebut nilai r yang dihasilkan masih memenuhi persyaratan linearitas menurut Chan et al (2005), dimana minimal koefisien korelasi linearitas yang baik minimal r = 0,995. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan dalam analisis kuersetin mempunyai linearitas yang baik.

Dari persamaan regresi linier fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep yang ditunjukan pada tabel VI, hasil dari tiga replikasi yang dilakukan didapatkan nilai koefisien korelasi berturut-turut adalah replikasi satu r

= 0,9975, r = 0,9986, dan r = 0,9991. Tiga hasil ini masih diatas nilai koefisien korelasi linearitas minimal menurut Chan et al (2005), yaitu r = 0,995. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan metode ini memiliki linieritas yang baik untuk menganalisis fraksi etil asetat ekstrak daun dadap serep.

3. Spesifisitas metode uji antioksidan

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis dalam mengukur dengan akurat respon analit dalam suatu matriks diantara komponen potensial lainnya didalam sampel. Dalam metode analisis ini yang menggunakan spektrofotometri visibel pada pengukuran kuersetin dan fraksi etil asetat sampel uji, spesifikasi metode dapat dilihat dengan tidak adanya serapan dari sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yang digunakan yaitu 515,5 nm.

Berdasarkan hasil scanning pada larutan pembanding kuersetin (Lampiran 6c ) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6e ) pada panjang gelombang 515,5 nm tidak terdapat serapan, sehingga ketika kuersetin maupun larutan uji fraksi etil asetat direaksikan dengan radikal DPPH maka yang terbaca hanya absorbansi DPPH hasil reaksi. Dari hasil tersebut maka dapat disimpulkan metode uji aktivitas antioksidan untuk kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki spesifitas yang baik.

Dari hasil validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam linearitas, presisi dan spesifisitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.

48

G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Radikal DPPH

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan. Aktivitas diukur secara spektrofotometri dengan menghitung jumlah pengurangan intensitas warna ungu larutan DPPH yang sebanding dengan jumlah DPPH yang beraksi dengan senyawa antioksidan. Menurut Zuhra et al., (2008), peredaman tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil Pikril Hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning. Dengan adanya penangkapan radikal DPPH menyebabkan terjadinya penurunan nilai absorbansi DPPH. Reaksi radikal DPPH terhadap senyawa fenolik adalah sebagai berikut :

NO2

O₂N O2N

N

N _{+ AH O}

2N

NO₂

NO2

H N N

DPPH Free Radical Phenolic Compounds DPPH Reduced Form

+ A

Gambar 10. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan (Irshad et al., 2012)

Mengenai pelarut yang digunakan, dalam penelitian ini menggunakan perlarut metanol karena menurut Molyneux (2004), telah diketahui metanol tidak memberikan interferensi pada reaksi yang terjadi. Pada penelitian ini digunakan kuersetin sebagai pembanding dalam uji aktivitas antioksidan. Digunakan

b. Penentuan maksimum

Lampiran 14. Perhitungan kandungan fenolik total

Sampel replikasi 1

Absorbansi sampel = 0,461

y = 0,004x + 0,129

0,461 = 0,004x + 0,129

x = 0,461− 0,129

0,004 = 83 µg/mL Kandungan fenolik total = x . v

m = 0,083 mg/mL. 0,5 mL 0,005 g

= 8,3 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Sampel replikasi 2

Absorbansi sampel = 0,472

y = 0,004x + 0,129

0,472 = 0,004x + 0,129

x = 0,472− 0,129

0,004 = 85,75 µg/mL Kandungan fenolik total = x . v

m = 0,0857 mg/mL. 0,5 mL 0,005 g

= 8,57 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Sampel replikasi 3

Absorbansi sampel = 0,475

y = 0.004x + 0.129

0,475 = 0.004x + 0.129

x = 0,475− 0,129

0,004 = 86,5 µg/mL Kandungan fenolik total = x . v

m = 0,0865 mg/mL. 0,5 mL 0,005 g

Lampiran 15. Hasil pengujian statistik dengan software R 2.14.1 a. Uji normalitas

BIOGRAFI PENULIS

Aldo Kristian, penulis skripsi dengan judul UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DPPH DAN PENETAPAN KANDUNGANFENOLIKTOTALFRAKSIETIL ASETATEKSTRAK ETANOLIK DAUN DADAP SEREP (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.),

dilahirkan di kota Pontianak 20 Desember 1991 dari pasangan Bapak Yosep Puna S,Pd dan Ibu Magdalena. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di SD N 17 Pontianak pada tahun 1997 hingga 2003 lalu melanjutkan pendidikan menengah di SMP Santo Fransiskus Asisi Pontianak pada tahun 2003 hingga 2006. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan di SMA N 5 Pontianak pada tahun 2006 hingga 2009 dan melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis aktif mengikuti berbagai kepanitian acara seperti acara Pharmacy Performance and Event Cup (2010) dan Temu alumni akbar (2012). Selain kegiatan dalam lingkungan kampus, penulis juga pernah menjadi relawan dalam pendataan demografis wilayah rawan bencana merapi yang diselenggarakan oleh United Nations Development Programme (UNDP) pada tahun 2012.