Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri (Apium graveolens L.) - USD Repository
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELEDRI (Apium graveolens L.) SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh:
Andy Kurniawan NIM : 078114076
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2011
ii UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELEDRI (Apium graveolens L.) SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh:
Andy Kurniawan NIM : 078114076
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2011
iii iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
v
I will lift up my eyes to the hills; From whence comes my help?
My help comes from The Lord, Who made heaven and earth. He will not allow your foot to be moved;
He who keeps you will not slumber.
Prevailing prayer is almost an impossibility where there is neglect of the study of the Word of God
(Reuben Archer Torrey) (Psalms 121 : 1-3)
Karya ini Kupersembahkan untuk : Mama, Papa, dan kakakku tercinta Para sahabat yang kusayangi Almamater
PRAKATA
Puji syukur Penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena atas segala berkat yang dianugerahkan-Nya, sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-
2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil
Asetat Ekstrak Etanolik Herba Seledri (Apium graveolens L.)”. Skripsi ini
disusun untuk memenuhi salah satu syarat yang diwajibkan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam membuat skripsi ini, Penulis menyadari telah mendapat banyak bantuan, bimbingan, dukungan, dan semangat dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan hati Penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada :
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
2. Bapak Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan pengarahan kepada Penulis mulai saat penyusunan proposal penelitian hingga penyelesaian skripsi ini.
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi ini.
4. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.
vi
5. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., dan Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt., yang telah berkenan meluangkan waktu untuk berdiskusi dan memberikan masukan kepada Penulis.
6. Segenap staf pengajar, laboran, dan karyawan Fakultas Farmasi, terima kasih atas bantuan, dukungan, dan motivasi yang diberikan kepada Penulis serta kerja sama yang terjalin baik selama ini.
7. Rekan seperjuanganku, Damianus Listyanta Edhi Sambada dan Yosafat Rubbyanto Widodo yang telah berjuang bersama dengan Penulis melakukan penelitian di laboratorium menyelesaikan skripsi ini, terima kasih untuk kebersamaan yang indah selama ini.
8. Sahabat-sahabatku, Fandri Astika Maranantan, Ardi Prasetyo, Petrus Wicaksono, serta Anggun Aji Mukti, terima kasih atas dukungan, semangat, dan kebersamaan kita selama ini serta suka duka yang kita lewati bersama.
9. Teman-teman kelompok praktikum B1 FST 2007 yang dikenal dengan “Team Fun”, terima kasih untuk kebersamaan dan keakraban kita saat praktikum selama ini.
10. Rekan-rekan mahasiswa Fakultas Farmasi angkatan 2007 terutama kelas FST, terima kasih untuk kebersamaan dan canda tawa yang telah kita rasakan bersama selama ini.
11. Teman-teman KKN angkatan XL pedukuhan Destan, terima kasih untuk kebersamaan kita dan kerjasama yang baik, walaupun hanya dalam waktu yang singkat.
vii
12. Semua pihak yang tidak dapat Penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan dukungan dan bantuan sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati Penulis memohon maaf apabila terdapat hal-hal yang kurang berkenan serta Penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun.
Akhir kata, Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi pihak- pihak yang membutuhkan dan dapat memberikan sumbangan bagi kemajuan ilmu pengetahuan terutama di bidang kefarmasian.
Penulis
viii
ix
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. v PRAKATA .................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... ix DAFTAR ISI ............................................................................................... x DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvi
INTISARI .................................................................................................... xvii
ABSTRACT .................................................................................................. xviii
BAB I PENGANTAR .................................................................................1 A. Latar Belakang ................................................................................
1 B. Perumusan Masalah .........................................................................
4 C. Keaslian Penelitian ..........................................................................
4 D. Manfaat ............................................................................................
5 E. Tujuan ..............................................................................................
6 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.........................................................
7 A. Seledri ..............................................................................................
7 B. Senyawa Fenolik .............................................................................
9
x
xi
25 D. Bahan dan Alat Penelitian ...............................................................
32 9. Penetapan kandungan fenolik total .............................................
31 8. Optimasi penetapan kandungan fenolik total .............................
30 7. Uji aktivitas antioksidan .............................................................
29 6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan..................................
28 5. Uji pendahuluan ..........................................................................
27 4. Pembuatan larutan DPPH, pembanding, dan uji ........................
27 3. Preparasi sampel .........................................................................
27 2. Pengumpulan bahan ....................................................................
27 1. Determinasi tanaman ..................................................................
26 E. Tatacara Penelitian ..........................................................................
25 C. Definisi Operasional ........................................................................
C. Antioksidan .....................................................................................
25 B. Variabel ...........................................................................................
25 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................
24 BAB III. METODE PENELITIAN ............................................................
23 J. Hipotesis ..........................................................................................
22 I. Landasan Teori ................................................................................
19 H. Kesalahan dalam Metode Analisis ..................................................
17 G. Kesahihan Metode Analisis .............................................................
16 F. Ekstraksi ..........................................................................................
15 E. Metode Folin-Ciocalteu ...................................................................
10 D. Metode DPPH .................................................................................
32
xii
54 G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ...................
75 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................
70 LAMPIRAN ................................................................................................
69 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
69 B. Saran ..................................................................................................
69 A. Kesimpulan ........................................................................................
67 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................
63 I. Hasil Analisis Statistik .......................................................................
57 H. Hasil Uji Penetapan Kandungan Fenolik Total .................................
47 2. Penetapan kandungan fenolik total ...............................................
F. Analisis Hasil ..................................................................................... 33 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................
47 1. Uji aktivitas antioksidan ...............................................................
44 F. Validasi Metode Analisis ...................................................................
42 2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ...................
42 1. Penentuan OT ................................................................................
40 E. Optimasi Metode ...............................................................................
37 D. Hasil Uji Pendahuluan .......................................................................
36 C. Hasil Pembuatan Ekstrak ...................................................................
36 B. Hasil Pengumpulan Bahan .................................................................
36 A. Hasil Determinasi Tanaman ..............................................................
87
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Rentang akurasi yang masih dapat diterima ..................................
20 Tabel II. Rentang KV yang masih dapat diterima.......................................
21 Tabel III. Data recovery larutan pembanding rutin .....................................
49 Tabel IV. Data recovery larutan uji.............................................................
50 Tabel V. Data Coefficient of Variation (CV) larutan pembanding rutin.....
51 Tabel VI. Data Coefficient of Variation (CV) larutan uji ...........................
52 Tabel VII. Data recovery asam galat...........................................................
55 Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV) larutan asam galat ............
56 Tabel IX. Data aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH ..............
59 Tabel X. Data aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri dengan metode DPPH ............................................................
61 Tabel XI. Tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji dengan metode penangkapan radikal DPPH ........................................................................
63 Tabel XII. Konsentrasi asam galat dan absorbansinya setelah ditambah pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm..............
64 Tabel XIII. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri yang dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg GAE/g) ...............................................................................
67
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ...............
14 Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen reaktif ......................
15 Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan ...............................
16 Gambar 4. Skema jalannya penelitian .........................................................
35 Gambar 5. Uji pendahuluan senyawa fenolik .............................................
41 Gambar 6. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ......................................
42 Gambar 7. Kurva penentuan Operating Time (OT) uji aktivitas antioksidan ..................................................................................................
43 Gambar 8. Kurva penentuan Operating Time (OT) penetapan kandungan fenolik total .............................................................
44 Gambar 9. Scanning panjang gelombang maksimum larutan DPPH ......... 45 Gambar 10. Scanning panjang gelombang maksimum asam galat + pereaksi Folin-Ciocalteu + natrium karbonat ........................
46 Gambar 11. Kurva regresi linier antara konsentrasi rutin dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH ..................
48 Gambar 12. Kurva regresi linier antara konsentrasi fraksi dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH ..................
48 Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat dengan absorbansinya setelah ditambahkan pereaksi .................................
54 Gambar 14. Reaksi terbentuknya warna kuning oleh adanya antioksidan .. 58 Gambar 15. Struktur rutin ..........................................................................
59
xiv
Gambar 16. Struktur asam galat ..................................................................
63 Gambar 17. Oksidasi fenol dalam suasana basa .........................................
65 Gambar 18. Reaksi fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu ........................
66
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman ...................................
75 Lampiran 2. Foto tanaman seledri ...............................................................
76 Lampiran 3. Foto percobaan .......................................................................
77 Lampiran 4. Perhitungan rendemen ............................................................
78 Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan stok DPPH ...........................
78 Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan stok rutin ..............................
79 Lampiran 7. Spektra pelarut metanol ..........................................................
79 Lampiran 8. Penentuan OT rutin .................................................................
80 Lampiran 9. Spektra larutan pembanding rutin ...........................................
80 Lampiran 10. Perhitungan pembuatan stok larutan uji ...............................
81 Lampiran 11. Penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri ................................................................................................ 81 Lampiran 12. Spektra larutan uji .................................................................
82 Lampiran 13. Perhitungan pembuatan stok asam galat ...............................
83 Lampiran 14. Spektra asam galat ................................................................
83 Lampiran 15. Penimbangan larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total .................................................................................................
84 Lampiran 16. Penentuan OT untuk penetapan kandungan fenolik total .....
84 Lampiran 17. Perhitungan kandungan fenolik total ....................................
84 Lampiran 18. Hasil uji statistik menggunakan program PASW Statistics 18 ......................................................................................
86
xvi
INTISARI
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan efek buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan sumber antioksidan alami yang biasanya terdapat dalam tumbuhan. Herba seledri merupakan salah satu tumbuhan yang berkhasiat dalam pengobatan dan memiliki kandungan flavonoid serta senyawa golongan fenol. Hal tersebut mendorong untuk melakukan pengujian aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total dalam herba seledri. Pengujian aktivitas antioksidan herba seledri (Apium graveolens L.) dilakukan secara kualitatif (uji pendahuluan) maupun kuantitatif menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Prinsip metode ini adalah penurunan intensitas warna atau absorbansi larutan DPPH yang sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan. Hasilnya dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC ) yang menunjukkan
50
konsentrasi suatu senyawa antioksidan yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH. Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin- Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu menghasilkan larutan berwarna biru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki aktivitas antioksidan yang lemah dengan nilai IC sebesar 316,294
50
µg/mL. Kandungan fenolik totalnya sebesar 3,27 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Kata kunci : antioksidan, Apium graveolens L., fraksi etil asetat, DPPH, fenolik total
xvii
ABSTRACT
Antioxidants are compounds that can counteract the bad effects of free
radicals in the body. Phenolic and flavonoid compounds is a source of natural antioxidants that are usually present in plants. Celery herb is one efficacious plant in the treatment and have the content of flavonoids and phenolic group compound. It is encouraging to test the antioxidant activity and total phenolic content in celery herb. Testing the antioxidant activity of celery herb (Apium graveolens L.) was qualitative (preliminary test) and quantitatively using 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical. The principle of this method is the reduction of color intensity or absorbance of DPPH solution that proportional to the increase in the concentration of antioxidant compounds. The result is expressed with a value of Inhibition Concentration 50 (IC ) which indicates the concentration of an
50
antioxidant compound that produces the arrest of 50% DPPH radical. The content of total phenolic determined by the Folin-Ciocalteu method. The principle of this method is the oxidation of phenolic compounds under alkaline conditions by the Folin-Ciocalteu reagent produces a blue solution. The results showed that the ethyl acetate fraction ethanolic extract of celery herb has a weak antioxidant activity with IC value of 316,294 µg/mL. Total phenolic content is 3,27 mg
50 gallic acid equivalent per g ethyl acetate fraction.
Keywords : antioxidant, Apium graveolens L., ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic
xviii
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan efek
buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Berdasarkan sumbernya, terdapat dua macam antioksidan yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik (buatan) (Dalimartha dan Sudibyo, 1999). Suatu antioksidan umumnya memiliki kelebihan pasangan elektron bebas sehingga dapat menyumbangkan elektronnya kepada suatu radikal dan dapat menstabilkan radikal tersebut sehingga tidak lagi reaktif.
Saat ini antioksidan alami lebih diminati dibandingkan antioksidan sintetik karena dianggap lebih aman. Antioksidan sintetik seperti BHT (butylated
hidroxy toluene ) dan BHA (butylated hidroxy anisole) telah diragukan
keamanannya karena memiliki efek samping yang besar dan dapat menyebabkan kerusakan hati. Hal ini menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang sangat dibutuhkan oleh masyarakat saat ini (Rohdiana, 2001; Sunarni, 2005).
Antioksidan alami mampu melindungi tubuh dari kerusakan akibat oksidasi oleh reactive oxygen species (ROS), menghambat terjadinya penyakit degeneratif serta menghambat terjadinya peroksidasi lipid pada makanan (Sunarni, 2005).
Radikal bebas adalah suatu spesies yang sangat reaktif karena terdapat elektron yang tidak berpasangan pada bagian terluarnya. Hal ini mengakibatkan tidak stabilnya atom atau molekul tersebut. Untuk menjadi stabil, radikal bebas
1
memerlukan elektron yang berasal dari elektron molekul disekitarnya, sehingga terjadi perpindahan elektron dari molekul donor ke molekul radikal bebas untuk menjadikan molekul radikal bebas tersebut stabil. Beberapa contoh radikal bebas antara lain: radikal hidroksil (OH·), nitrit oksida (NO·), hidrogen peroksida (H O ), dan sebagainya (Windono, Soediman, Yudawati, Ermawati, Srielita, dan
2
2 Erowati, 2001).
Sebenarnya dalam tubuh sendiri secara alami terdapat antioksidan endogen seperti enzim SOD (superoxyde dismutase), glutation, dan katalase yang dapat menetralkan radikal bebas yang masuk, akan tetapi jumlahnya terbatas sehingga membutuhkan suplai antioksidan dari luar tubuh untuk mengatasi paparan radikal bebas dalam jumlah yang berlebih.
Antioksidan alami dapat diperoleh dari buah-buahan maupun sayuran. Salah satu sumber antioksidan alami dapat berasal dari herba seledri (Apium
graveolens L.). Pada seledri terdapat kandungan flavonoid seperti graveobiosid A
dan B serta senyawa golongan fenol yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Selain itu pada herba seledri terdapat pula glikosida apiin (glikosida flavon), isokuersetin, dan umbelliferon (Sudarsono dkk., 1996).
Seledri memiliki banyak manfaat untuk kesehatan, di antaranya sebagai antihipertensi, penambah nafsu makan, peluruh air seni, mengurangi rasa sakit pada rematik dan gout. Seledri juga sering ditambahkan sebagai sayur dan lalap untuk penyedap masakan (Sudarsono dkk., 1996).
Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk proses pemurnian (Robinson, 1995). Dalam penelitian
tentang antioksidan herba ketul (Bidens pilosa L.), didapatkan fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi dibandingkan rutin, fraksi kloroform, dan ekstrak metanoliknya (Nusarini, 2007; Wiyatsih, 2007)
Metode yang digunakan untuk pengujian antioksidan pada penelitian ini adalah metode DPPH (1,1 difenil-2-pikrilhidrazil). Berdasarkan metode ini, kemampuan antioksidan suatu senyawa dinyatakan oleh nilai IC . Metode DPPH
50 memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.
DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005).
Penentuan kandungan fenolik total dalam herba seledri pada penelitian ini menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah reaksi oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu menghasilkan kompleks berwarna biru yang memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 750 nm. Intensitas warna biru yang terbentuk meningkat sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada dalam sampel. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat tiap g sampel.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan penelitian dapat dirumuskan sebagai berikut.
1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan
IC ?
50
2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?
C. Keaslian Penelitian
Beberapa penelitian mengenai aktivitas antioksidan yang telah dilakukan dengan menggunakan bahan tanaman seledri antara lain :
1. Penelitian mengenai aktivitas antioksidan ekstrak air beberapa tanaman.
Bahan yang digunakan adalah 25 macam tanaman, termasuk daun seledri yang dikeringkan kemudian diblender dan diekstraksi menggunakan air deionisasi. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode DPPH serta Ferric reducing antioxidant potential assay. Selain itu dilakukan pula penetapan kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Wong, Leong, dan Koh, 2005).
2. Penelitian mengenai perbedaan metode untuk mengontrol dan membandingkan aktivitas antioksidan sayur-sayuran.
Bahan yang digunakan adalah bermacam sayuran, termasuk daun seledri yang diblender dan diekstraksi menggunakan pelarut aseton 80% dalam asam
format 0,2%. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode
TRAP , ORAC, dan HORAC. Dilakukan pula penetapan kandungan polifenol total
menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Ciz et al., 2010).3. Penelitian mengenai peningkatan aktivitas antioksidan setelah perlukaan, tergantung jenis jaringan pada buah dan sayuran.
Bahan yang digunakan adalah bermacam buah dan sayur, termasuk seledri yang dilukai menggunakan pisau dan disimpan pada suhu 15°C untuk meningkatkan respon jaringan. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode DPPH, sedangkan kandungan fenolik total ditetapkan dengan metode Folin-Ciocalteu (Reyes, Villarreal, dan Cisneros-Zevallos, 2007).
Uji aktivitas antioksidan yang dilakukan pada penelitian ini berbeda dengan penelitian sebelumnya. Perbedaannya terletak pada sampel yang digunakan, yaitu fraksi etil asetat ekstrak etanol herba seledri. Berdasarkan pengamatan penulis, uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH serta penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri belum pernah dilakukan.
D. Manfaat
1. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan dan bukti ilmiah mengenai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC .
50
2. Manfaat metodologis
Penelitian ini dapat dijadikan acuan metode uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dan penentuan kandungan fenolik total pada suatu bahan tumbuhan.
3. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan herba seledri, sehingga bisa dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif pemeliharaan kesehatan manusia.
E. Tujuan
1. Tujuan umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan serta menetapkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC .
50
b. Mengetahui kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Seledri
7
1. Keterangan botani Seledri (Apium graveolens L.) termasuk dalam familia Apiaceae.
2. Nama tumbuhan Nama latin: Apium graveolens Linn. (Anonim, 2005).
Nama Indonesia: seledri (Anonim, 2005). Nama daerah: Jawa: sledri. Sunda: saledri (Dalimartha, 2000).
Common name : Inggris: celery. Perancis: celeri. Italia: seleri. Jerman: selinon;
parsley (Anonim, 2005).3. Morfologi tanaman Batang : Tidak berkayu, beralur, beruas, bercabang, tegak, hijau pucat.
Daun : Tipis majemuk, daun muda melebar atau meluas dari dasar, hijau mengkilat, segmen dengan hijau pucat, tangkai di semua atau kebayakan daun merupakan sarung. Daun bunga : Putih kehijauan atau putih kekuningan ½ - ¾ mm panjangnya. Bunga : Tunggal, dengan tangkai yang jelas, sisi kelopak yang tersembunyi, daun bunga putih kehijauan atau merah jambu pucat dengan ujung yang bengkok. Bunga betina majemuk yang jelas, tidak bertangkai atau bertangkai pendek, sering mempunyai daun berhadapan atau berbatasan dengan tirai bunga.
Tirai bunga : Tidak bertangkai atau dengan tangkai bunga tidak lebih dari 2 cm panjangnya.
Buah : Panjangnya sekitar 3 mm, batang angular, berlekuk, sangat aromatik.
Akar : Tebal (Iqbal dan Endang, 2008).
4. Kandungan kimia seledri
Seluruh herba seledri mengandung glikosida apiin (glikosida flavon), isoquersetin, dan umbeliferon. Juga mengandung manitol, inositol, asparagina, glutamina, choline, linamarose, pro vitamin A, vitamin C, dan B. Kandungan asam-asam dalam minyak atsiri pada biji antara lain asam-asam lemak terutama palmitat, oleat, linoleat, dan petroselinat. Senyawa kumarin lain ditemukan dalam biji, yaitu bergapten, seselin, isomperatorin, osthenol, dan isopimpinelin (Sudarsono dkk., 1996).
5. Kegunaan seledri
Secara tradisional tanaman seledri digunakan sebagai pemacu enzim pencernaan atau sebagai penambah nafsu makan, peluruh air seni, dan penurun tekanan darah. Di samping itu digunakan pula untuk memperlancar keluarnya air seni, mengurangi rasa sakit pada rematik dan gout. Selebihnya daun dan batang seledri digunakan sebagai sayur dan lalap untuk penyedap masakan (Sudarsono dkk., 1996).
B. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik adalah substansi organik dimana terdiri dari senyawa aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen hidroksil (OH). Senyawa induk adalah fenol tetapi kebanyakan senyawa fenolik merupakan polifenol. Sumber senyawa fenolik sangat sedikit pada sumber hewani akan tetapi sangat melimpah pada sumber tumbuhan. Diantara 8000 senyawa polifenol tumbuhan yang diketahui, golongan yang terbanyak adalah flavonoid (Mann, Davidson, Hobbs, Banthorpe, dan Harborne, 1994).
Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman digunakan sehingga menjadi senyawa bioaktif dari suatu tumbuhan. Oleh karena itu, pada perkembangan penelitian akhir-akhir ini, perhatian peneliti telah tertuju pada identifikasi tumbuhan yang memiliki aktivitas antioksidan yang dapat digunakan untuk konsumsi manusia sehari-hari (Ebrahimzadeh, Pourmorad, Hafezi, 2007).
Aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik didapatkan dengan cara mereduksi radikal untuk tidak terjadinya reaksi samping yang merugikan. Untuk transfer atom hidrogen, senyawa fenolik mampu mengikat radikal bebas dengan mendonasikan atom hidrogen dalam transfer elektron tunggal dari senyawa fenolik kepada elektron tunggal dari radikal bebas (Marxen et al., 2007). Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat diukur secara kolorimetri dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat-fosfotungstat oleh adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki
serapan kuat pada panjang gelombang 750 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel (Waterhouse, 2002).
C. Antioksidan
Definisi antioksidan secara umum adalah senyawa yang melawan oksidasi atau menghambat reaksi yang dipicu oleh oksigen atau peroksida.
Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi) (Huang, Ou, dan Prior, 2005).
Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994).
Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoxyde dismutase (SOD); glutation peroksidase, katalase, tioredoksin reduktase dan peroksiredoksin (Masella, Di Benedeto, Vari, Filesi, dan Giovannini, 2005). Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai : a. Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E.
b. Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA.
c.
Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen.
d.
Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation peroksidase (Huang et al., 2005).
Aktivitas senyawa polifenol (flavonoid) sebagai antioksidan meliputi tiga mekanisme sebagai berikut.
a.
Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS) ataupun radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R·, RO·, dan ROO· dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen.
b.
Mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal seperti reaksi melalui khelasi metal.
c. Interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan penggabungan dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000).
Antioksidan dan peredam radikal bebas biologis dapat digolongkan sebagai berikut (Grieb, 1992 dan Himawati, 2001).
a. Berdasarkan sasaran 1) Preventative antioxidant, yaitu antioksidan yang dapat mencegah terbentuknya oksidan dan mencegah tertimbunnya oksidan. Misalnya : superoksida dismutase (SOD), katalase, bermacam-macam enzim peroksidase (misalnya glutation peroksidase), dan senyawa yang mengandung gugusan sulfidril (glutation, sistein, dan kaptopril). 2) Chain-breaking antioxidant, mekanismenya sebagai berikut.
L· + AH → LH + A·
LO· + AH → LOH + A·
LOO· + AH → LOOH + A·
Antioksidan (AH) akan mencegah dua tahapan meliputi tahapan inisiasi terjadi ketika radikal beraksi dengan Lipid (L) dan proses propagasi (beraksi dengan alkoksi (LO·) ataupun peroksil (LOO·) (Madhavi et al., 1996).
b.
Berdasarkan mekanisme kerja 1)
Antioksidan enzimatik, misalnya : katalase (CAT), superoxyde dismutase (SOD), dan glutation peroksidase (GSH-Px).
2) Antioksidan non-enzimatik, misalnya: vitamin E (
α-tokoferol), vitamin C (asam askorbat), dan β-karoten.
c. Berdasarkan sifat-sifat fisiko-kimia 1) Antioksidan hidrofilik, yaitu antioksidan yang bekerja dalam sitosol dan cairan ekstrasel, misalnya: vitamin C, asam urat, glutation, sistein, kreatinin. 2) Antioksidan lipofilik, yaitu antioksidan yang bekerja pada membran sel
(terlarut dalam lipid membran), misalnya: vitamin E, β-karoten, ubikuinon, bilirubin, protein pengikat logam (transferin, laktoferin, seruloplasmin, dan albumin).
Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah suatu senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas. Metode ini dapat untuk memisahkan campuran antioksidan yang kompleks sekalipun.
Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan menjadi empat kelompok, yaitu : a. senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika tereduksi (kalium permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil, dan asam fosfomolibdat); b. senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti senyawa diazo, pereaksi diazo, magnesium sulfat, anisaldehid, vanillin dan pereaksi Gibbs yang membentuk indofenol (akan membentuk garam berwarna dalam kondisi basa); c. radikal bebas stabil yang menerima radikal hydrogen dari antioksidan (1,1- difenil-2-pikrilhidrazil); d. senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang berwarna (paladium klorida) (Davidek, 1997).
Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri. Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan adalah sebagai berikut.
1. Pengujian penangkapan radikal (radical scavenging test) Uji ini dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal sintetik dalam pelarut organik polar seperti metanol atau etanol dalam suhu kamar. Radikal sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap radikal DPPH. DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517 nm. Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil.
Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan
2. Pengujian aktivitas antioksidan dengan sistem linoleat tiosianat Prinsip : pengukuran intensitas warna kompleks feritiosianat yang terbentuk dari reaksi ion feri dengan amonium tiosianat. Ion feri terbentuk dari oksidasi ion fero oleh peroksida yang berasal dari oksidasi asam linoleat. Kompleks feritiosianat yang berwarna merah diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490 nm. Semakin tinggi absorbansinya (warna merah yang terbentuk semakin pekat) menunjukkan semakin banyak peroksida yang terbentuk. Dengan adanya senyawa yang berperan sebagai antioksidan intensitas warna yang terbentuk semakin rendah.
3. Pengujian dengan asam tiobarbiturat,
Prinsip uji ini adalah reaksi malondialdehid dengan asam tiobarbiturat menghasilkan kromogen merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm. Malondialdehid terbentuk dari asam lemak bebas tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan rangkap. Adanya senyawa yang bersifat antioksidan akan menghambat terbentuknya malondialdehid dari asam lemak bebas tidak jenuh.
4. Pengujian dengan sistem
β-karoten-linoleat Pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan pemucatan warna
β- karoten. Karotenoid dapat meredam oksigen yang reaktif menghasilkan oksigen yang lebih stabil. Energi dari oksigen tersebut dipindahkan ke senyawa karotenoid. Energi tersebut dilepaskan melalui interaksi rotasional dan vibrasional antara karotenoid dengan pelarut untuk mengembalikan karotenoid ke ground state.
Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen reaktif
D. Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Windono et al., 2001).
DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom N di tengah) serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida, 1994).
Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa
antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).
Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas (Dinis,
et al ., 1994). DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk
pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002).
Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan (Windono et al., 2001).
E. Metode Folin-Ciocalteu
Metode Folin-Ciocalteu merupakan oksidasi atau reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua senyawa fenolik. Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat, natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromin (Folin dan Ciocalteu, 1944). Pada kenyataannya reagen ini mengandung rangkaian polimerik
3-
yang memiliki bentukan umum dengan pusat unit tetrahedral fosfat (PO ) yang
4
dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Singleton dan Rossi, 1965).
Menurut Waterman dan Mole (cit. Khadambi, 2007), dasar metode Folin- Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten (Mo-W). Fenolat hanya terdapat pada larutan basa, tetapi pereaksi Folin-Ciocalteu dan produknya tidak stabil pada kondisi basa. Selama reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin- Ciocalteu, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi dengan spektrofotometer (Jansoon, 2005). Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi asam heteropoli sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Box, 1983; Singleton dan Rossi, 1965).
F. Ekstraksi
Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan
bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari semakin luas (Harborne, 1987).