Isolasi Senyawa Flavonoida Serta Uji Aktivitas Antibakteri Dari Daun Tumbuhan Kareumbi (Homalanthus Populneus (Geiseler) Pax) Chapter III V

42

BAB 3

METODE PENELITIAN
3.1.Alat-alat

1. Spektroskopi UV-Vis
2. Spektroskopi 1H-NMR

500MHZ

Jeol/Delta2NMR

3. Spektroskopi FT-IR

2Shimadzu

4. Rotarievaporator

Bűchi R-114

5. Labu Rotarievaporator

1000 mL

Schoot/Duran

6. Ekstraktor

5000 mL

Schoot/Duran

7. Kolom Kromatografi

Pyrerx

8. Alat Destilasi
9. Lampu UV

254nm/356 nm

UVGL 58

10. Neraca Analitis

Mettler AE 200

11. Corong Kaca

Pyrex

12. Corong Pisah

500 mL

Pyrex

13. Gelas Ukur

10 mL

Pyrex

14. Labu Takar

250 mL

Pyrex

15. Tabung Reaksi

Pyrex

16. Botol Vial

15 mL

17. Gelas Erlenmeyer

250 mL

Pyrex

18. Beaker Gelass

1000 mL

Pyrex

75 mm

Nesco

19. Statif dan Klem
20. Penangas Air
21. Batang Pengaduk
22. Chamber
23. Pipa Kapiler
24. Spatula

25. Pipet Tetes
26. Toples Kaca
27. Tissue

Paseo

Universitas Sumatera Utara

43

28. Sendok Besar
29. Jeregen

20 L/10 L/5 L

BKK

30. Serbet
31. Brus Tabung
32. Pingset

33. Penjepit Tabung

3.2. Bahan-bahan

1. Daun tumbuhan Kareumbi
2. Metanol

Destilasi

3. Etil Asetat

Teknis

4. Aquadest

Suling

5. N-heksana

Teknis

6. Silika Gel 40

(70-230 mesh) ASTM

E.Merck. KgA

7. FeCl3 5%
8. NaOH 10%
9. Serbuk Mg
10. HCl(p)
11. H2SO4(p)
12. Kapas
13. Kloroform

p.a.E.Merck

14. Plat KLT Silika Gel 60 F254

E.Merck.Art 554

15. Aluminium Foil

8 m x 30 cm

Klin Pak

16. Kertas Saring

Universitas Sumatera Utara

44

3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyedian Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Kareumbi yang diperoleh dari daerah Berastagi,
Kabupaten Tanah Karo, Sumatera Utara. Daun tumbuhan Kareumbi dikeringkan diudara
terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan Kareumbi sebanyak 2100 g.

3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Kareumbi

Serbuk kering halus daun tumbuhan Kareumbi diidentifikasi dengan menggunakan cara
Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam
daun tumbuhan Kareumbi maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi
warna sebagai berikut:
1. Diamasukkan 10 gram serbu daun tumbuhan kareumbi yang telah dikeringkan
kedalam dua gelas Erlenmeyer
2. Ditambahkan 100 mL metanol kedalam gelas Erlenmeyer
3. Didiamkan selama 1 malam
4. Disaring
5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel kedalam 3 tabung reaksi
6. Ditambahkan masing-masing pereaksi
7. Dilakukan perlakuan yang sama dengan menggunakan pelarut etil asetat dan
diperoleh hasil yang sama sebagai berikut:
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam
b. Tabung II : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan
c. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl(p) menghasilkan larutan merah muda

3.3.3. Ekstraksi Daun Tumbuhan Kareumbi
Serbuk daun tumbuhan kareumbi ditimbang sebanyak 2100 g, kemudian dimaserasi dengan
metanol sebanyak ± 11 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam.

Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga
diperoleh ekstrak pekat metanol dan diuji dengan FeCl 3 5%. Kemudian diuapkan dengan
penangas air hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin
dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan aquadest lalu dipartisi berulang-ulang

Universitas Sumatera Utara

45

dengan etil asetat, hingga negatif flavonoida diuji dengan FeCl 3 5%. Filtrat kemudian
dirotarievaporator lalu diuapkan dengan penangas air hingga semua pelarut etil asetat
menguap. Lalu ekstrak pekat etil asetat diuji dengan FeCl 3 5%. Ekstrak pekat etil asetat
dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksan sampai
lapisan n-heksan bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksan, lalu diuji dengan
FeCl3 5% dan dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga
diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 34,63 g.

3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan
fase diam silika gel 60F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan

perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fase gerak yang digunakan
adalah campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30;
60:40; 50:50 (v/v).
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak kloroform : metanol 90:10 (v/v)
kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada
plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi campurn
pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi, dikeluarkan
dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian
difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf
yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut kloroform :
metanol dengan perbandingan 80:20; 70:30; 60:40; 50:50 (v/v).

3.3.5. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida dilakukan dengan kolom kromatografi terhadap ekstrak pekat
metanol. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fase gerak
yaitu kloroform 100%, campuran pelarut kloroform:metanol dengan perbandingan 90:10,
80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v).
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230
mesh) ASTM dengan menggunkan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan

Universitas Sumatera Utara

46

kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100%
hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 4 g ekstrak pekat metanol dengan silika
gel dengan pelarut metanol, kemudian dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah
berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak kloroform:metanol 90:10 (v/v) secara
perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya
dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa
gerak kloroform:metanol dengan perbandingan 80:20 (v/v), 70:30 (v/v), 60:40 (v/v), dan
50:50 (v/v). Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT
dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5%. Kemudian
diuapkan sampai terbentuk gum.

3.3.6. Pemurnian
Gum yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan
metanol lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni
atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk KLT preparatif. Kloroform:etil
asetat 50:50 (v/v) adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan yang paling baik untuk
selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Sedangkan gum yang
telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah
plat KLT yang telah diaktifkan. Plat diamasukkan kedalam bejana yang berisi campuran
pelarut yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari
bejana, dikeringkan, dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan
dikeruk lalu dielusi dengan kloroform:etil asetat (1:1). Hasil elusi diuapkan hingga diperoleh
gum kuning.

3.3.7. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian gum dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa
diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak metanol:etil asetat 50:50 (v/v) dan kloroform:etil
asetat 50:50 (v/v).
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak kedalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu
dijenuhkan. Ditotolkan gum yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT.

Universitas Sumatera Utara

47

Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh.
Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana,
dikeringkan, diamati dibawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3
5% dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa
flavonoida dan dihitung harga Rf yang diperoleh.

3.3.8. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan uji dengan tiga jenis spektroskopi yaitu
Spektofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR), dan Spektrofotometer
Resonansi Magnet Inti Proton (1HNMR).

3.3.8.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Penelitian
dan Pengujian Terpadu UGM Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Urata Yogyakarta dengan
menggunakan pelarut aseton.

3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Analisis dengan alat Sprektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan
Pengujian Terpadu UGM Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Urata Yogyakarta dengan menggunakan
pelarut ATR.

3.3.8.3. Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1HNMR)
Analisis dengan alat Sprektrofotometer 1H-NMR diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan
Pengujian Terpadu UGM Jl. Kaliurang Km. 4 Sekip Urata Yogyakarta dengan menggunakan
pelarut aseton.

Universitas Sumatera Utara

48

3.4.Bagan Skrining Fitokimia
3.4.1. Maserasi dengan menggunakan pelarut metanol

Universitas Sumatera Utara

49

3.4.2. Maserasi dengan menggunakan pelarut etil asetat

Universitas Sumatera Utara

50

3.5. Bagan Penelitian

Universitas Sumatera Utara

51

3.6.Pengujian Sifat Antibakteri dari Daun Kareumbi (Homalanthus populneus
(Geiseler) Pax)
3.6.1. Pembuatan Media Nutrien Agar (NA) Miring Dan Stok Kultur Bakteri

Universitas Sumatera Utara

52

3.6.2. Pembuatan media Mueller Hinton Agar (MHA)

3.6.3. Penyiapan inokulum Bakteri

Universitas Sumatera Utara

53

3.6.4. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol dari daun karreumbi (Homalanthus
populneus (Geiseler) Pax)

Universitas Sumatera Utara

54

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari daun tumbuhan
kareumbi (Homalanthus populneus (Geiseler) Pax) menggunkan pereaksi FeCl3 5%
menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat sampel positif mengandung
senyawa flavonoida.
Hasil elusi dari pebandingan eluen kloroform : metanol 90:10 v/v pada fraksi 28-42,
dilakukan KLT preparatif dengna eluen kloroform : etil asetat (50:50) v/v untuk mendapatkan
senyawa murni. Sehingga diperoleh senyawa murni berupa pasta berwarna coklat
kekuningan, seberat 18,08 mg dan nilai Rf = 0,62.
Spektrum Ultraviolet-Visible (UV-Vis) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan
pelarut aseton ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini :

Gambar 4.1 Spektrum Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Senyawa Hasil Isolasi

Universitas Sumatera Utara

55

Dari hasil karakterisasi dan elusidasi menggunakan Spektrofotometer UltravioletVisible (UV-Vis) menunjukkan adanya dua serapan panjang gelombang maksimum (λ maks)
menunjukkan bahwa golongan dari struktur flavonoida yang diperoleh termasuk golongan
flavonol yaitu ditunjukkan pada tabel 4.1 dibawah ini:
Tabel 4.1 Panjang Gelombang UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi
Panjang gelombang (nm)

Absorbansi

364

0,666

266

0,677

Spektrum FT-IR dari pasta hasil isolasi menghasilkan puncak-puncak serapan pada
daerah bilangan gelombang (cm-1) ditunjukkan pada Gambar 4.2 sebagai berikut:

Gambar 4.2 Spektrum Infra Merah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi

Universitas Sumatera Utara

56

Hasil analisis Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) dari pasta hasil isolasi
menghasilkan pita serapan pada daerah bilangan gelombang (cm-1) ditunjukkan pada tabel 4.2
sebagai berikut :
Tabel 4,.2 Hasil Analisis Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi
Bialanga Gelombang (cm-1)

Intensitas

Gugus Fungsi

3425,56

Sedang

Vibrasi Ulur -OH

2924,09

Rendah

Vibrasi Ulur -CH Aromatis

1705,07

Sedang

Vibrasi Ulur C=O

1442,75-1620,21

Sedang

Vibrasi Ulur C=C

1342,46

Sedang

Vibrasi Ulur C-O-C

Hasil analisis Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1H-NMR) terhadap
senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut aseton-d6 dan TMS pergeseran kimia
pada daerah (ppm) sebagai standart seperti Gambar 4.3 berikut:

Gambar 4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi pada δH = 0-12,0 ppm

Universitas Sumatera Utara

57

Berikut merupakan pergeseran kimia dan jenis spektrum 1H-NMR senyawa hasil
isolasi dapat dilihat pada tabel 4.3 berikut :
Tabel 4.3 Pergeseran kimia dan jenis peak 1H-NMR senyawa hasil isolasi
Daerah Pergeseran Kimia/

Atom H

Jenis Peak

3,778 ppm

H dari OCH3-3’

Puncak Singlet

6,268-6,272 ppm

H-6

Puncak Doublet

6,544 ppm

H-8

Puncak Doublet

7,030 ppm

H-5’

Puncak Doublet

8,153-8,170 ppm

H-2’ & H-6’

Puncak Doublet

12,189

OH

Puncak Singlet

Chemical Shift (δ)

4.2. Pembahasan
Dari hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan kareumbi (Homalanthus
populneus (Geiseler) Pax) mulai dari proses ekstraksi maserasi diperoleh ekstrak pekat
sebanyak 341,2719 g kemudian dilarutkan dengan menggunakan pelarut aquadest untuk
pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat non polar lalu dipartisi dengan menggunakan
pelarut etil asetat untuk pemisahan senyawa-senyawa yang diduga nerupakan tanin dan
diperoleh ekstrak pekat etil asetat sebanyak 34,63 g. Ekstrak pekat etil asetat yang diperoleh
dimabil sebanyak 5 g lalu dipartisi kembali dengan n-heksan hingga diperoleh 4,04 g. Dari
hasil analisis kromatografi lapis tipis sebelum kromatografi kolom didapat bahwa
perbandingan pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan
kareumbi adalah kloroform : metanol (90:10) v/v yang menunjukan pemisahan yang lebih
baik dari noda yang dihasilkan. Hal ini dibuktikan dengan analisis KLT yang menunjukkan
adanya tiga noda dengan jarak pisah antar noda yang baik (lampiran 3). Setelah pemisahan
dengan kromatografi kolom kemudian dilakukan analisis KLT untuk penggabungan fraksi
dengan menggunakan eluen kloroform : metanol (90:10) v/v dan didapatkan 6 fraksi
(Lampiran 4), dimana bahwa noda yang dihasilkan pada plat kromatografi lapis tipis pada
fraksi 35-38 dengan pereaksi FeCl3 5% merupakan pemisahan noda yang paling baik yaitu
fraksi empat dan lima sebanyak 230 mg lalu dianalisis KLT kembali dengan kloroform : etil
asetat (50:50) v/v (lampiran 5), yang selanjutnya dikromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan

Universitas Sumatera Utara

58

sistem pelarut yang sesuai adalah kloroform : etil asetat (50:50) v/v, diamati dengan lampu
UV, lalu diambil noda ke dua dari batas atas, kemudian silika gel dikerok dan dielusi dengan
perbadingan pelarut metanol : etil asetat (1:1) v/v, didalam kolom kecil. Senyawa yang
diperoleh dilakukan kembali pemurnian dengan rekristatilasi menggunakan pelarut metanol
dan n-heksan, kemudian diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan eluan kloroform :
etil asetat (60:40) v/v (lampiran 6) yang menunjukkan hanya satu noda pada senyawa yang
dihasilkan dengan harga Rf sebesar 0,62.
Dari hasil interpretasi spektrum UV-Visible dengan pelarut aseton-d6 (Gambar 4.1)
memberikan serapan dengan panjang gelombang (λ maks) 364 nm pada pita I dan 266 nm
pada pita II, hal ini menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi sesuai dengan spektrum UVVisible dari senyawa pembanding flavonoida yaitu Flavonol (Lampiran 7).
Dari hasil interpretasi Spektrum Inframerah (FT-IR) (Gambar 4.2) dan Spektrum 1HNMR dengan menggunakan pelarut aseton-d6 dalam gambar standar TMS (Gambar 4.3)
diperolwh yaitu:
Pergeseran kimia pada daerah δ = 6,544-6,540 ppm dan 6,272-6,268 ppm puncak
doublet menunjukkan proton H-6 dan H-8 dan pada cicin A senyawa flavonoida yang sesuai
dengan peak spektrum standar pembanding pada lampiran 12. Sedangkan pergeseran kimia
pada daerah δ= 3,778 ppm puncak singlet menunjukkan proton dari –OCH3 , pada pergeseran
kimia pada daerah δ = 8,170-8,153 ppm puncak doublet menunjukkan proton-proton dari H2’ dan H-6’ dan pergeseran kimia pada daerah δ = 7,030-7,006 ppm puncak doublet
menunjukkan proton-proton dari H-5’ pada cincin B senyawa flavonoida yang sesuai dengan
peak spektrum standar pembanding pada lampiran 12.

Berdasakan analisis data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UV-Visible,
Spektrum Inframerah (FT-IR), Spektrum 1H-NMR disimpulkan bahwa besar kemungkinan
pasta yang diisolasi dari daun tumbuhan kareumbi (Homalanthus populneus (Geiseler) Pax)
adalah senyawa flavonoida golongan flavonol.
Meskipun demikian, penulis mengakui bahwa data hasil 1H-NMR masih kurang
murni karena adanya campuran dari senyawa hasil isolasi. Gambar 4.4 berikut ini merupakan
struktur flavonol yang diperoleh dari senyawa hasil isolasi :

Universitas Sumatera Utara

59

Gambar 4.4 Struktur Senyawa Hasil Isolasi (Flavonol)

Universitas Sumatera Utara

60

BAB 5

KESIMPULN DAN SARAN
5.1. KESIMPULAN
1. Hasil uji pendahuluan dengan menggunakan pereaksi warna yaitu FeCl 3 5%
menunjukkan bahwa ekstrak daun tumbuhan kareumbi (Homalanthus

populneus

(Geiseler) Pax) positif mengandung senyawa flavonoida.
2. Hasil isolasi yang diperoleh dari 2100 g daun tumbuhan kareumbi (Homalanthus
populneus (Geiseler) Pax) merupakan pasta berwarna coklat kekuningan, diperoleh
sebanyak 18,08 mg, Rf = 0,62 dengan eluen kloroform : etil asetat (60:40) v/v.
3. Hasil analisis dengan Spetrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah (FTIR) dan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1H-NMR) menunjukkan
bahwa senyawa hasil isolasi dari daun tumbuhan kareumbi (Homalanthus populneus
(Geiseler) Pax) diduga adalah senyawa flavonoida golongan flavonol.

5.2. SARAN
Untuk lebih mendukung struktur senyawa flavonoida hasil isolasi, maka sebaiknya perlu
dilakukan analisis Spektrofotometer Karbon (13C-NMR) dan Spektrofotometer Massa (MS).

Universitas Sumatera Utara