Cloning Of Termophilic Lipase Gene From A Bacterium Isolated From Hot Spring At Seram Island, Molluccas
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kloning Gen Penyandi Lipase
Termofilik dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku adalah
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini.
Bogor, Mei 2012
Edwin Thomas Apituley
P051090161
ABSTRACT
EDWIN THOMAS APITULEY. Cloning of Termophilic Lipase Gene from a
Bacterium Isolated from Hot Spring at Seram Island, Molluccas. Under direction
of ANTONIUS SUWANTO, and NISA RACHMANIA MUBARIK
Thermophilic bacteria often possess enzymes that are stable and active at
high temperature which are valuable for some biotechnological and industrial
applications such as lipase enzyme for lipid hydrolysis and esterification
reactions. The objectives of this research were to isolate and characterize lipase
produced by the thermophilic bacterium, and to isolate and cloned its lipase
encoding gene. Isolat T I.2 was thermophilic bacterium isolated from hot spring at
Seram island, which had temperature 89°C and pH 6,3. Comparison of 16SrDNA
sequence to GenBank database using Basic Local Alignment Search Tools for
nucleotides (BLASTn) showed that isolat T I.2 was cosely related to Geobacillus
stearothermophilus with 99% homology. The phylogenetic tree for 16S rRNA
which was constructed using Neighbour Joining Method and distance was
estimated using Kimura’s two parameter method with one hundred bootstrap
replicates showed that the thermophile isolat T I.2 is clustered to other members
of Geobacillus and closely related to Geobacillus stearothermophilus. Titrimetric
method was used to measure activity of crude lipase preparation of isolat T I.2 at
various temperature and pH with the result showed that optimum temperature and
pH of lipase activity were 80°C and 6,5. Isolation of lipase gene was conducted
using degenerate primers pair, primers pairs F1-R1 and primers pair F2-R1.
Primer pair F1-R1 could amplified only 600 bp of DNA fragment however 1180
bp of isolat T I.2 lipase gene amplified by primer pair F2-R1 was successfully
cloned to pGEM-T Easy and transformed to E.coli TOP 10. Crude lipase
preparation of E. coli TOP 10 transforman which carry recombinan plasmid, and
measured under optimal temperature 80°C and optimal pH 8,5, was 3,11 Unit/ml.
Sequence of 390 amino acids deduced from lipase gene of isolat T I.2 was
compared to GeneBank database using Basic Local Alignment Search Tools for
protein (BLASTp) and the result showed that it was closely related to lipase of
Geobacillus stearothermophilus L1 with 90% homology.
Keywords:
bacteria.
cloning,
Geobacillus
stearothermophilus,
lipase,
thermophilic
RINGKASAN
EDWIN THOMAS APITULEY. Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik dari
Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku. Dibimbing oleh
ANTONIUS SUWANTO, and NISA RACHMANIA MUBARIK
Bakteri termofilik seringkali memiliki enzim yang stabil dan aktif pada
suhu tinggi yang bermanfaat untuk diaplikasikan dalam bidang bioteknologi dan
industri, seperti enzim lipase yang digunakan dalam reaksi hidrolisis dan
esterifikasi. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi bakteri termofilik
penghasil lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengisolasi
serta mengklon gen penyandi lipase.
Isolat T I.2 adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber mata air
panas yang terdapat di pulau Seram yang memiliki suhu 89°C dan pH 6,3. Isolasi
dilakukan menggunakan media Basal Salt Medium dengan minyak zaitun sebagai
sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase. Pembandingan
sekuen 16S rDNA terhadap basis data pada GenBank menggunakan Basic Local
Alignment Search Tools for nucleotides (BLASTn) menunjukkan bahwa isolat T
I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus stearothermophilus
dengan homologi 99%. Primer yang digunakan dikonstruksi oleh Marchesi et al
untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan merupakan primer universal yang spesifik
terhadap domain bakteri,. Analisis filogenetik untuk 16S rRNA dilakukan dengan
menggunakan metode Neighbour Joining, dengan jarak diperkirakan
menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates.
Pohon filogenetik yang dikonstruksi menunjukkan bahwa isolat T I.2
mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillus dan memiliki kemiripan
yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus.
Metode titrimetri digunakan untuk mengukur aktivitas lipase ekstrak kasar
dari isolat T I.2 pada berbagai suhu dan pH. Hasil yang diperoleh menunjukkan
aktivitas lipase optimal suhu 80°C dan pH 6,5. Prakiraan adanya gen lipase
dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen gen lipase menggunakan primer yang
dikonstruksi oleh Bell et al. Primer tersebut tidak dapat mendeteksi adanya gen
lipase, untuk prakiraan keberadaan gen lipase pada isolat T I.2. Isolasi gen lipase
kemudian dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi
oleh Jiang et al. Primer degenerate digunakan untuk menghasilkan beberapa
fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda, dan fragmen yang berukuran kurang
lebih 1200 bp digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan
menggunakan pasangan primer F1-R1 yang dikonstruksi untuk amplifikasi gen
lipase beserta sekuen signalnya, dan primer F2-R1 untuk mengamplifikasi gen
lipase tanpa menyertakan signal sekuen. Pasangan primer F1-R1 hanya dapat
mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 600 bp. Gen lipase isolat T I.2
berukuran 1180 bp berhasil diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer
F2-R1, dan diklon ke pGEM-T Easy sehingga diperoleh plasmid rekombinan
pGEM-TGeolipFull dengan ukuran 4204 bp. Plasmid rekombinan kemudian
ditransformasikan ke Escherichia coli TOP 10. Aktivitas enzim lipase ekstrak
kasar yang dihasilkan E.coli TOP 10 transforman yang membawa plasmid
rekombinan ialah sebesar 3,11 U/ml pada kondisi optimal yaitu suhu 80°C dan pH
8,5, hal ini menunjukkan bahwa gen lipase pada plasmid rekombinan dapat
terekspresi dengan baik.
Sekuen yang terdiri dari 390 asam amino hasil deduksi gene lipase isolat T
I.2 dibandingkan terhadap basis data GenBank menggunakan Basic Local
Alignment Search Tools for protein (BLASTp) menunjukkan bahwa gen lipase
isolat T I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus
stearothermophilus L1 dengan tingkat keidentikan mencapai 90%. Berdasarkan
hasil pembandingan BLASTp tingkat keidentikan maksimal antara sekuen asam
amino protein lipase T I.2 terhadap sekuen asam amino protein lipase Geobacillus
yang lain adalah sebesar 93%, meskipun demikian berdasarkan skor maksimal
pada hasil pembandingan dengan BLASTp, dapat disimpulkan bahwa isolat T I.2
memiliki kedekatan secara evolusi terhadap Geobacillus stearothermophilus L1
meskipun hanya memiliki tingkat keidentikan 90%. Analisis filogenetik sekuen
asam amino hasil deduksi gen lipase dilakukan dengan menggunakan metode
Neighbour Joining, dimana jarak diperkirakan dengan metode Poisson dan
menggunakan 100 bootstrap replicates. Hasil analisis pohon filogenetik
menunjukkan bahwa lipase yang berasal dari isolat T I.2 memiliki kemiripan yang
lebih dekat kepada lipase dari genus Geobacillus dan dikelompokkan ke dalam
Family I.5 dari enzim lipolitik. Analisis filogenetik protein lipase T I.2 terhadap
beberapa proein enzim lipase yang berasal dari beberapa spesies Geobacillus
dengan menggunakan Neighbour Joining Method menunjukkan bahwa enzim
lipase isolat T I.2 terletak pada percabangan awal dari pohon filogenetik bersama
dengan sumber awal lipase dari beberapa Geobacillus yang lain dalam pohon
filogenetik.
Pemadanan sekuen lipase T I.2 terhadap sekuen dan elemen struktur
sekunder lipase L1 dari G. stearothermophilus L1 menunjukkan bahwa daerah
pentapeptida terkonservasi, triad katalitik dan daerah pengikatan ion Ca2+ dan
Zn2+ bersifat identik pada kedua lipase tersebut. Kedua sekuen tersebut
menunjukkan perbedaan hingga 43 asam amino, dan memiliki 346 asam amino
yang identik. Hasil pemadanan sekuen asam amino lipase T I.2 terhadap lipase L1
juga menunjukkan bahwa terdapat subtitusi asam amino ke 190 pada daerah heliks
α6, yaitu asam glutamat (G) yang bersifat polar negatif pada lipase L1, menjadi
lisin (K) yang bersifat polar positif. Heliks α6 akan berfungsi sebagai tudung (lid)
yang dapat membuka selama aktivasi enzim lipase Geobacillus
stearothermophilus. Subtitusi juga terjadi pada Histidin (H) 87 yang bersifat polar
netral pada daerah domain ekstra pada lipase L1, menjadi asam aspartat (D) yang
bersifat polar negatif pada lipase dari isolat T I.2. Protein enzim lipase dari
Geobacillus memiliki suatu domain ekstra, yang memiliki situs pengikatan Zn2+,
yang membentuk ikatan koordinasi dengan domain ekstra (Histidin 81 dan
Histidin 87) dan domain inti dari protein (Aspartat 61 dan Aspartat 238). Adanya
ikatan koordinasi ini berperan untuk meningkatkan termostabilitas enzim.
Kata kunci: kloning, Geobacillus stearothermophilus, lipase, bakteri termofilik.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas
berkat dan anugerahnya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema
yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2010
adalah kloning gen lipase, dengan judul Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik
dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius
Suwanto, M.Sc dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku pembimbing,
bapak Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA yang telah banyak memberikan saran dan
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi. Penulis
juga ingin mengucapkan terima kasih kepada PT. Wilmar Benih Indonesia atas
bantuan dana dan kesempatan untuk memanfaatkan fasilitas penelitian, kepada
Ibu Esti Puspitasari, M.S, Bapak Cahya Priatna, M.Sc, Bapak Yeppi Hardi
Rustam, S.Si, Griselda Herman S.Si beserta seluruh staf Departemen Research
and Development, PT Wilmar Benih Indonesia yang telah membantu selama
dilakukannya penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan staf Jurusan
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Universitas Pattimura,
dan kepada rekan-rekan angkatan 2009 pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah
Pascasarjana IPB. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada ibu dan
kakak-kakak, serta seluruh keluarga atas segala doa, kasih sayang dan dukungan
yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2012
Edwin Thomas Apituley
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ambon pada tanggal 1 Mei 1974 dari ayah Jacob J.
H. Apituley (Alm) dan ibu Merry Z. Apituley. Penulis merupakan putra bungsu
dari lima bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, lulus pada tahun 2000. Pada tahun
2002, penulis melanjutkan pendidikan pada program Magister Manajemen,
Universitas 17 Agustus, Surabaya dan menyelesaikannya pada tahun 2004. Pada
tahun 2009, penulis memperoleh kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke
Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB.
Sejak tahun 2004, penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Jurusan
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pattimura,
Ambon
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ……………………………………………………..
xiv
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………..
xv
DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………..
xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ………………………………………………...
1
Tujuan Penelitian ……………………………………………….
3
Manfaat Penelitian …………………………………………….
3
TINJAUAN PUSTAKA
Struktur dan Mekanisme Reaksi Enzim Lipolitik ……………..
5
Klasifikasi Enzim Lipolitik Bakteri …………………………..
9
EnzimTermostabil dari Mikroorganisme Termofilik ...………...
10
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen 16S rRNA ………….
11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian …………………………………..
13
Bahan dan Alat ………………………………………………...
13
Metode Penelitian ..…………………………………………….
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase …………………..
19
Identifikasi Bakteri …………………………………………….
21
Analisis Filogenetik 16S rRNA ………………………………..
24
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar ……………………………
25
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase …………………………….
28
Isolasi Gen Lipase ……………………………………………..
29
Kloning Gen Lipase ……………………………………………
31
Analisis Filogenetik Protein Lipase ...…………………………
37
SIMPULAN …………………………………………………………...
45
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………
47
LAMPIRAN ……………………………………………………………
53
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil BLASTn sekuen 16S rRNA isolat T I.2 ………………………
23
2 Hasil BLASTp sekuen lipase isolat T I.2 pada GenBank …………...
36
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Diagram topologi pelipatan umum dan minimal dari struktur
pelipatan protein enzim α/β hidrolase ……………………………...
5
2
Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase …………………………...
7
3
Mekanisme reaksi hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase …………
8
4
Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku ………………...
19
5
Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas …………...
20
6
Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung
rhodamin B ………………………………………………………….
7
21
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan
primer 63f dan 1387r ……………………………………………….....
22
8
Posisi filogenetik dari isolat T I.2 di antara spesies Geobacillus …….
24
9
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar ……………...
26
10 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar ………………..
27
11 Hasil amplifikasi genom isolat termofilik T I.2 dengan menggunakan
primer OXF-ACR …………………………………………………..
28
12 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dengan menggunakan primer
degenerate …………………………………………………………...
30
13 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dari isolat T I.2 dengan
menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ………………….
30
14 Hasil amplifikasi PCR untuk verifikasi transforman dengan
menggunakan pasangan primer M13f dan M13r …………………...
32
15 Peta plasmid rekombinan pGEM-T Geolip-Full …………………….
32
16 Peta plasmid pGEM-T Easy …………………………………………
33
17 Sekuen promotor dan situs multiple cloning dari plasmid
pGEM-TEasy ..………………………………………………………
33
18 Koloni E. coli TOP 10 transforman ditumbuhkan pada media
rhodamin B yang diberi Ampisilin (100 µg/ml), X-Gal 80µg/ml
dan IPTG (0,1 mM) …………………………………………………
34
19 Posisi filogenetik protein lipase T I.2 di antara protein enzim
lipolitik ........................................................................
38
Halaman
20 Posisi filogenetik protein lipase T I.2 di antara protein enzim lipase
dari beberapa spesies Geobacillus …………………………………..
39
21 Sekuen konsensus lipase dari beberapa spesies Geobacillus ………..
42
22 Pembandingan sekuen asam amino protein lipase T I.2 terhadap
sekuen asam amino protein lipase L1 ……………………………….
43
D L
Halaman
1
Matriks subtitusi BLOSUM62 …………………………………........
55
2
Sekuen 16S rRNA isolat T I.2 ………………………………………
56
3
Hasil pengukuran aktivitas enzim lipase isolat T I.2 pada kisaran
suhu 50°C hingga 90°C dan pH 7 …………………………………..
4
57
Hasil pengukuran aktivitas enzim lipase pada kisaran pH 5 hingga 9
dan suhu 80°C ………………………………………………………
58
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Minyak dan lemak berperan penting dalam diet manusia, dengan
menyediakan kalori dan asam lemak yang esensial. Asam lemak yang
teresterifikasi ke gliserol merupakan komponen utama penyusun minyak dan
lemak (Shahidi 2005). Minyak dan lemak digolongkan sebagai lipid sederhana
dan digunakan dalam industri untuk menghasilkan produk berupa makanan
maupun produk oleokimia. Berdasarkan karakteristik minyak dan lemak sebagai
bahan baku yang sesuai dengan kebutuhan perakitan suatu produk berbasis
minyak dan lemak dan perubahan persepsi tentang kandungan nutrisinya
mendorong dilakukannya modifikasi terhadap minyak dan lemak untuk memenuhi
kebutuhan tersebut.
Enzim lipase (EC 3.1.1.3, triasilgliserol asilhidrolase) menghidrolisis
lemak dan minyak
m
asam lemak dan gliserol. Enzim lipase
j dapat
mensintesis ester dan reaksi interesterifikasi. Oleh karena kemampuan katalisis
terhadap reaksi-reaksi tersebut, enzim lipase digunakan
s luas dalam industri
d
proses pengolahan makanan, sintesis kimia dan
farmasi, sintesis surfaktan, industri oleokimia, dan agrokimia (Vjs 1994).
untuk menghasilkan
Proses katalisis menggunakan enzim lipase memiliki beberapa keuntungan
dibandingkan proses katalisis
s k
m
seperti tingkat kespesifikan yang
tinggi terhadap substrat maupun situs target yang dikatalisis, proses pemurnian
yang lebih sederhana dan murah, aktivitas katalitik yang relatif lebih tinggi, proses
yang lebih bersahabat dengan lingkungan, dan bersifat biodegradable
(
et al.
2008).
Beberapa lipid terutama yang mengandung asam lemak rantai
p
j bersifat padat pada suhu ruang sehingga harus diubah ke dalam
bentuk
pada suhu di atas 50°C untuk dapat diproses lebih lanjut, karenanya
tidak
dibutuhkan enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi (Cho et al. 2000). Enzim
lipase yang stabil pada suhu tinggi dimanfaatkan untuk proses pengolahan limbah
yang mengandung lipid dalam jumlah yang tinggi, yang dihasilkan oleh proses
industri, seperti pengilangan minyak, pembuatan sabun, dan pemrosesan kulit.
2
Kandungan lipid yang tinggi pada limbah sering menimbulkan masalah seperti
bau tidak sedap yang dihasilkan, penyumbatan pipa saluran pembuangan, dan
menghambat proses pengolahan limbah
biologis karena lipid akan
membentuk lapisan pada permukaan air sehingga menurunkan transfer oksigen
pada proses aerobik (Lemus
& Lau 2002). Aplikasi mikroorganisme termofilik
dan enzim lipase untuk pengolahan limbah dengan kandungan lipid tinggi
memiliki keuntungan karena pada suhu di atas 50°C, lipid yang membentuk
agregat akan mencair dan akan terbentuk emulsi substrat yang stabil dengan luas
permukaan yang meningkat selama proses agitasi sehingga ketersediaan substrat
untuk dimanfaatkan oleh enzim maupun mikroorganisme menjadi meningkat.
Pada suhu tinggi laju difusi dan transfer massa akan meningkat dan mengurangi
jumlah patogen (Markossian et al. 2000).
Enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi (termostabil) seringkali dapat
diperoleh dari mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu menengah
(mesofilik), maupun dari mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu tinggi
(termofilik). Meskipun demikian, enzim dari mikroorganisme yang bersifat
termofilik bersifat lebih stabil pada kisaran pH yang lebar dalam pelarut organik
dan menunjukkan aktivitas yang relatif lebih tinggi pada suhu tinggi dibandingkan
mikroorganisme nontermofilik (Jiang et al. 2010).
Meskipun memiliki stabilitas yang tinggi pada kisaran pH yang luas dan
suhu yang tinggi, lipase yang berasal dari bakteri termofilik secara normal
dihasilkan dalam jumlah yang rendah sehingga dibutuhkan rekayasa secara
genetik untuk mengisolasi, mengubah regulasi gen dan untuk meningkatkan
produksi protein enzim. Informasi mengenai sekuen nukleotida suatu gen
memungkinkan untuk menentukan sekuen asam amino dari protein suatu enzim.
Berdasarkan sekuen asam amino akan dapat diperkirakan pelipatan tiga dimensi
polipeptida untuk menciptakan struktur tersier yang stabil. Salah satu metode
yang dapat digunakan untuk melakukan isolasi gen lipase ialah dengan
menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR telah berhasil
digunakan untuk melakukan isolasi gen lipase dari beberapa bakteri termofilik
antara lain dari genus Bacillus subtilis (Ma et al. 2006), maupun dari genus
Geobacillus (Jiang et al. 2010; Kim et al. 2000; Leow et al. 2007).
3
Lingkungan dengan kondisi suhu tinggi sering ditemukan pada berasosiasi
dengan fenomena vulkanik, seperti sumber air panas, fumarol maupun geothermal
vents (Madigan et al. 2009). Indonesia merupakan negara yang memiliki banyak
lokasi hidrotermal yang merupakan habitat bagi beragam mikroorganisme
termofilik sehingga merupakan salah satu sumber bagi enzim yang stabil pada
suhu tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini
b !"!#n
untuk mengisolasi bakteri termofilik penghasil
lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengklon gen
penyandi lipase.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diperoleh yaitu mendapatkan isolat bakteri potensial
untuk bioteknologi pertanian, khususnya industri minyak dan lemak, dan untuk
referensi yang berhubungan dengan gen penyandi enzim lipase termofilik,
khususnya yang berasal dari Geobacillus stearothermophilus.
TINJAUAN PUSTAKA
Struktur dan Mekanisme Reaksi Enzim Lipolitik
Enzim lipolitik
$%')*)
struktural dikelompokan ke dalam protein
superfamili α/β hidrolase. Anggota kelompok ini memiliki karakteristik yang
:
sama yaitu memiliki kesamaan arsitektur protein berupa pelipatan α/β
h+,*-.)$%/
kesamaan unsur penyusun utama situs katalitik enzim, yaitu katalitik triad yang
umumnya tersusun dari residu serin, aspartat dan histidin, kesamaan motif urutan
pentapeptida terkonservasi pada residu serin situs aktif, yang umumnya tersusun
0 J)%1%*
atas Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (Arpigny
1999). Beberapa enzim yang
memiliki struktur pelipatan dan mekanisme katalitik yang sama, yaitu enzim
lipase (E.C.3.1.1.3), esterase (E.C.3.1.1), asetilkolinesterase (E.C.3.1.1.7),
kutinase
(E.C.3.1.1.74),
karboksil-
esterase
(E.C.3.1.11),
arilesterase
(E.C.3.1.1.2), fosfolipase A1 (E.C.3.1.1.32), kolinesterase (E.C.3.1.1.8) dan
234%5+.% hormone esterase (E.C.3.1.2.14) 67+$'her 0 Pleiss, 2003).
Anggota kelompok protein enzim α/β hidrolase memiliki kesamaan
struktur pelipatan protein yang
$%')*) umum merupakan suatu struktur pelipatan
yang tersusun dari 8 untaian lembaran β (β-sheet) yang hampir seluruhnya pararel,
89;+)1*)? topologi pelipatan umum dan minimal dari struktur pelipatan
protein enzim α/β hidrolase. Warna hitam ?%53523@@)5 pelipatan
minimal, w)*5) abu-abu ?%53523@@)5 pelipatan umum. Katalitik triad
ditandai sebagai N3: Nukleofil, A': Asam, H: Histidin (Heikenheimo
et al. 1999).
6
Struktur pelipatan yang minimal dibutuhkan oleh suatu protein untuk
dapat dikelompokan dalam protein enzim α/β hidrolase adalah memiliki minimal
5 rantai β, dimulai dari rantai β3 (Heikenheimo et al. 1999). Struktur pelipatan
umum α/β hidrolase memiliki untaian lembaran β2 yang antipararel terhadap
untaian lembaran β yang lain, dengan pola untaian α-heliks diikuti lembaran β (α
turn β). Stuktur katalitik pada enzim α/β hidrolase memiliki katalitik triad yang
terdiri atas nukleofil, asam dan histidin. Nukleofil pada struktur katalitik tidak
sama pada tiap enzim α/β hidrolase dan dapat berupa serin, sistein atau asam
aspartat.
Berdasarkan substratnya, enzim lipase dibedakan dari esterase. Substrat
enzim lipase adalah asilgliserida rantai
BCEFCEG yang bersifat tidak larut di dalam
air dan karenanya akan membentuk misel. Asilgliserida rantai pendek yang
bersifat lebih larut dalam air merupakan substrat untuk enzim esterase. Kontak
iIKMOPQRM)
antara lipase dengan antarmuka (
misel yang terbentuk dari substrat
BCEFCEG yang tidak larut dalam air akan menyebabkan
perubahan konformasi enzim STEFCUX konformasi yang aktif, fenomena
pengaktifan ini dikenal sebagai iIKMOPQRiQY activation. ZIKMOPQRiQY activation pada
berupa asilgliserol rantai
lipase melibatkan reorganisasi struktur sekunder dan pembukaan suatu struktur
[CTGT\ et al.
yang dibentuk oleh untaian α heliks yang menutup situs aktif enzim (
1994, Kim et al. 1997).
Enzim lipase memiliki kemampuan untuk mengkatalisis beberapa
FTEX]
reaksi biotransformasi lipid yaitu reaksi hidrolisis pada ikatan ester yang terdapat
pada asilgliserol yang menghasilkan asam lemak dan gliserol, dan reaksi balik
arah, yaitu reaksi esterifikasi atau pembentukan ikatan ester antara asam lemak
dan gliserol untuk membentuk asilgliserol, reaksi asidolisis yaitu reaksi
]TE^C_C ester dengan suatu ]TE^C_C asam,
reaksi alkoholisis yaitu reaksi pertukaran gugus alkil antara suatu ]TE^C_C ester
dengan suatu ]TE^C_C alkohol, reaksi interesterifikasi yaitu reaksi pertukaran
gugus alkil antar ]TE^C_C ester, dan reaksi gliserolisis yaitu reaksi pembentukan
pertukaran gugus alkil antar suatu
ikatan ester antara gugus hidroksil pada gliserol dengan gugus asil yang berasal
dari
]TE^C_C asilgliserol yang lain (Gambar 2).
7
Hidrolisis
Asidolisis
Alkoholisis
Gliserolisis
Transesterifikasi
Gambar 2 Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase (
`acefgl 1994). R ,
n
R’n
adalah residu asam lemak, ROH umumnya adalah metanol.
Mekanisme reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase ini digunakan dalam
aplikasi untuk memproses lemak dan minyak, antara lain hidrolisis lemak atau
minyak untuk membuat sabun, gliserolisis untuk produksi monogliserida yang
dimanfaatkan sebagai pengemulsi pada produk makanan, kosmetik dan farmasi.
Reaksi esterifikasi dimanfaatkan untuk menghasilkan gliserida seperti
monogliserida melalui proses esterifikasi asam lemak ke gliserol, sedangkan
reaksi interesterifikasi digunakan dalam transformasi minyak dengan nilai
ekonomi rendah, seperti fraksi menengah dalam pemrosesan minyak sawit
n
menjadi trigliserida cocoa butter yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Proses
alkoholisis gula alkohol dengan minyak yang berasal dari tanaman maupun hewan
8
Gambar 3 Mekanisme reaksi hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase
(Jaeger et al 1999): (1) Pengikatan lipid (substrat) dan aktivasi
residu nukleofilik serin oleh histidin, diikuti oleh serangan terhadap
atom karbon pada gugus karbonil oleh O- dari serin, (2) Terbentuk
intermediet tetrahedral sementara dengan O- distabilkan oleh
interaksi
dengan
dua
gugus
NH
pada
peptida.
Histidin
mendonasikan satu proton kepada komponen alkohol dari bagian
substrat yang memisah, (3) Terbentuk intermediet kovalen (asilenzim) yaitu komponen asam dari substrat teresterifikasi ke residu
serin dari enzim. Molekul air akan diaktifkan oleh residu histidin
dan menghasilkan ion hidroksil yang kemudian melakukan
serangan nukleofilik ke atom karbon dari gugus karbonil dari
senyawa intermediet kovalen, (4) Residu histidin mendonasikan
sebuah proton ke atom oksigen pada residu serin. Ikatan ester
antaraserin dan komponen asil akan terputus sehingga menghasilkkan produk asil.
9
akan menghasilkan ester asam lemak pada gula (Jaeger et al. 1994). Mekanisme
reaksi katalitik hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase terdiri atas empat tahapan
reaksi
oqrturv 3).
Klasifikasi Enzim Lipolitik Bakteri
xyz{t
lipolitik pada bakteri dikelompokkan ke dalam
|
family
berdasarkan motif urutan asam amino terkonservasi dan karakteristik biologis
enzim
o}v~{y Jaeger 1999). rt{ I merupakan kelompok yang terbesar dan
dikelompokkan lagi ke dalam 6 subfamily. Termasuk ke dalam family ini ialah
enzim lipase yang berasal kelompok bakteri
qram negatif seperti
maupun bakteri qram positif seperti Bacillus maupun
. xyz{t lipase dari kelompok bakteri termofilik aerobik dari genus
Bacillus yang diklasifikasikan ulang sebagai Geobacillus (Nazina et al.
dikelompokkan ke dalam subfamily
rt{ II merupakan kelompok enzim lipolitik dari bakteri yang memiliki
motif urutan pentapeptida q-} ~ -¡¢v-o£¢¤ atau oq¥¡o£ enzim pada residu
dan
serin dari situs aktif, yang membedakannya dari motif pentapeptida dari kelompok
q-§-¡¢v-§-q Termasuk ke dalam
family ini ialah asiltransferase dari ¨ hila dan esterase yang
dihasilkan © ª Salmonella
dan © luminescens. xyz{t lipolitik yang memiliki
kemiripan urutan asam amino terhadap enzim platelet activating «
pada manusia, dikelompokkan ke dalam family III, termasuk
dalam kelompok ini ialah enzim lipase dari ¬«us dan
albus, serta enzim esterase 1 dari ¬ sp. xnzim lipolitik yang
family lain, yang
¢¦rvr
umum adalah
memiliki kemiripan urutan asam amino terhadap enzim hormone sensitive lipase
o®¡£ pada mamalia, di kelompokkan kedalam family ¯° termasuk di dalamnya
ialah enzim lipase yang berasal dari sp ±²° enzim esterase 2 yang
berasal dari bakteri psikrofilik ¬ sp, esterase dari bakteri mesofilik
Escherichia coli dan ¨ª eutrophus, dan bakteri termofilik ¨bacillus acidocaldarius dan Archaeglobus fulgidus.
10
Kelompok enzim lipolitik dari family
³ ´µ¶µ·µ¸¹º oleh kemiripan sekuen
asam amino terhadap beberapa enzim bukan lipolitik yang berasal dari bakteri,
seperti hidrolase
»¼½¾µ´¹¿ dehalogenase dan haloperoksidase. Termasuk ke dalam
family ini ialah enzim esterase dari bakteri psikrofilik Moraxella sp. (esterase 3
dan Psychrobacter immobilis, esterase dari bakteri mesofilik Haemophilus
influenza dan Acetobacter pasteurianus maupun esterase yang dihasilkan bakteri
termofilik Sulfolobus acidocaldarius.
ÀºÁµÂ
lipolitik yang dimasukkan ke dalam kelompok family
³Ã ialah
enzim karboksilesterase, dan memiliki kemiripan urutan asam amino dengan
lysophospholipase pada eukariot, termasuk ke dalam kelompok ini ialah enzim
karboksilesterase yang dihasilkan oleh Pseudomonas fluorescens.
family
³ÃÃ
dari enzim lipolitik asal bakteri memiliki kemiripan sekuen asam
amino dengan enzim asetilkolin esterase dan
eukariot.
ĻŽ¼½¸
µºÆ»ÇƵº»Èŵɻ· karboksilesterase pada
Ê»Ëerapa enzim lipolitik dari anggota kelompok ini memiliki manfaat
untuk aplikasi dalam industri, seperti karbamat hidrolase yang dihasilkan
Arthrobacter oxydans yang bersifat aktif terhadap herbisida
¼Ì»ºÍŶ¹·Ë¹Â¹Æ» dan
p-nitrobenzil yang dihasilkan Bacillus subtilis dan dimanfaatkan untuk sintesis
antibiotik
β-lactam.
Family
VIII
merupakan
family
terakhir
dalam
pengelompokan enzim lipolitik yang berasal dari bakteri, dan memiliki kemiripan
dengan kelompok C dari enzim β-laktamase, termasuk ke dalam kelompok ini
ialah esterase yang dihasilkan oleh Arthrobacter geobiformis dan Streptomyces
chrysomalis.
EnzimTermostabil dari Mikroorganisme Termofilik
Suhu merupakan salah satu faktor lingkungan yang sangat mempengaruhi
pertumbuhan dan kemampuan organisme untuk bertahan hidup. Beberapa jenis
mikroorganisme diketahui dapat hidup dan tumbuh pada lingkungan yang
memiliki kisaran suhu yang tinggi dan digolongkan sebagai mikroorganisme
termofilik (kisaran suhu 45 hingga 80ºC) dan hipertermofilik (kisaran suhu di atas
80ºC, hingga suhu tertinggi yang diketahui masih dapat mendukung pertumbuhan
yaitu 113ºC) (Stetter 1999, Dehouck
et al 2008 ). Secara umum dengan
peningkatan suhu akan menyebabkan kenaikan laju reaksi kimia dan enzimatik
yang terjadi di dalam sel, dan akan mempercepat pertumbuhan hingga pada suatu
11
suhu tertentu, komponen sel seperti protein dan asam nukleat akan mengalami
denaturasi dan menyebabkan sel berhenti berfungsi. Enzim yang berasal dari
mikroorganisme termofilik pada umumnya memiliki aktivitas yang optimum
pada suhu antara 60 hingga 80ºC dan tidak berfungsi dengan baik pada suhu di
bawah 40ºC (Vieille & Zeikus 2001). Agar dapat mempertahankan suatu keadaan
fungsional pada kondisi yang ekstrem seperti pada suhu yang tinggi, dibutuhkan
kestabilan protein (Jaenicke & Bohm 1998).
Mekanisme mempertahankan kestabilan protein pada suhu yang tinggi
ditunjang oleh beberapa faktor, baik yang bersifat intrinsik maupun ekstrinsik
(Vielle & Zeikus 2001). Faktor penstabil yang bersifat intrinsik antara lain:
komposisi asam amino, ikatan disulfide, interaksi hidrofobik, interaksi aromatik
dan ikatan hidrogen. Faktor ekstrinsik merupakan faktor penstabil yang berasal
dari lingkungan dalam sel yaitu garam, substrat maupun tekanan.
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen 16S rRNA
Sebelum perangkat untuk analisis biologi molekuler berkembang, ahli
taxonomi hanya bertumpu kepada karakteristik fenotip, yaitu penampakan secara
fisik
untuk
menarik
kesimpulan
tentang
genotip,
yaitu gen-gen
yang
menyebabkan penampakan fenotip tersebut. Meskipun demikian, terdapat
keterbatasan karena kemiripan fenotip tidak selalu merefleksikan kemiripan
genotip. Metode identifikasi mikroorganisme secara tradisional yang bertumpu
pada karakterisasi fenotip dari organisme juga memberikan hasil identifikasi
yang cenderung bervariasi yang disebabkan oleh pengaruh kondisi pertumbuhan,
fase pertumbuhan dan terjadinya mutasi spontan (Tenover et al. 1997). Dengan
berkembangnya biologi molekuler, data molekuler digunakan untuk menentukan
hubungan filogenetik antara semua mahluk hidup dengan didasarkan pada
hipotesis jam molekuler yang diajukan oleh Emile Zuckerkandl dan Linus Pauling
(Woese et al. 1990). Hipotesis jam molekuler menyatakan bahwa laju subtitusi
sangat konstan di antara protein-protein yang homolog selama masa jutaan tahun
sehingga akumulasi perubahan asam amino berlaku seperti gerakan jam
molekuler. Secara sederhana organisme - organisme dengan tingkat kemiripan
12
molekuler yang tinggi diharapkan mempunyai hubungan yang lebih dekat
dibandingkan dengan organisme yang tingkat kemiripan molekulernya rendah.
Ribosom merupakan molekul yang secara luas digunakan untuk
menentukan hubungan evolusi di antara mahluk hidup (Madigan et al. 2009).
Ribosom merupakan molekul yang berperan penting dalam proses sintesis protein,
telah ada sejak lama sebagai komponen penting di dalam sel, memiliki fungsi
yang konstan, terdistribusi secara universal dan secara moderat memiliki sekuen
yang terkonservasi. 16S rRNA merupakan salah satu dari 3 molekul RNA
ribosomal yang terdapat pada prokaryot dengan ukuran panjang ±1550 bp dan
terdiri atas sekuen daerah variabel dan daerah terkonservasi (Clarridge 2004).
Daerah variabel pada 16S rRNA bakteri menunjukkan keragaman di antara
spesies bakteri yang berbeda dan dapat digunakan untuk identifikasi genus
maupun spesies (Chakravorty et al. 2007).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Research and Development PT.
Wilmar Benih Indonesia, Bekasi, yang dimulai dari bulan September 2010 sampai
bulan Desember 2011.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen),
plasmid pGEM-T Easy (Promega), Agarose (Gibco), PCR GoTaq®Green Master
Mix (Promega), enzim T4 DNA ligase (New England Biolabs), marker molekuler
100 bp DNA ladder (Vivantis), Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega),
QIAquick PCR Purification kit (Qiagen).
Alat utama yang digunakan ialah sentrifuge (Sorval Biofuge Primo R),
mesin PCR (BIO RAD Thermal Cycler C1000), sequencer (AB Applied
Biosystems Hitachi 3130 Genetic Analyzer), perangkat elektroforesis (BIO RAD),
shaker waterbath (Yih Der).
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase. Isolasi dilakukan dengan
menginokulasikan sebanyak satu lup air dan tanah yang diambil dari mata air
panas ke dalam media Basal Salt Solution (BSM) (0,8 g/l K2 HPO4 ; 0,6 g/l
KH2 PO4 ; 1 g/l (NH4 )2 SO4; 0,2 g/l MgSO4 ·7H2 O; 0,05 g/l CaCl2 ·2H2 O; 3 g/l NaCl
dan 0,001 g FeCl3 ) yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 1% minyak zaitun,
kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan penggoyangan 175 rpm selama
48 jam. Setelah inkubasi, kultur disebar pada media Rhodamin B (0,01 g/l
(NH4 )2 SO4 ; 0,01 g/l K2 HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05 g/l MgSO4 ·7H2 O; 0,01 g/l
FeSO4 ·7H2 O; 0,05 g/l ekstrak khamir, 0,05 g/l tripton, 0,01% Rhodamin B
(Kouker & Jaeger 1987) dan 2% Polyvinil alkohol (PVA)/minyak zaitun (3:1).
dan diinkubasikan pada suhu 60°C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh diamati di
bawah lampu UV dengan panjang gelombang 350 nm.
14
Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Inokulum untuk produksi enzim dibuat
dengan mengambil 1 lup biakan bakteri dan diinokulasikan pada 10 ml media
produksi yang mengandung 0,5% ekstrak khamir, 0,5% tripton dan 2% minyak
zaitun kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan digoyang 175 rpm selama
12 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan inokulum ke dalam
50 ml media produksi: 0,01 g/l (NH4 )2 SO4 ; 0,01 g/l K2 HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05
g/l MgSO4 . 7H2 O; 0,01 g/l FeSO4 .7H2 O yang diberi 0,5% ekstrak khamir, 0,5%
tripton dan 2% minyak zaitun, kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan
digoyang 175 rpm selama 48 jam. Kultur hasil inkubasi disentrifugasi pada 4000
rpm (nomor rotor 7591) selama 40 menit. Supernatan yang mengandung enzim
ekstrak kasar dipisahkan dan digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim.
Pengukuran Aktivitas Enzim. Aktivitas enzim lipase diukur dengan
menggunakan metode Xu et al. (2002) yang telah dimodifikasi; 4 ml campuran
2% Polivinyl alcohol (PVA)/ minyak zaitun (3:1) dicampurkan dengan 2 ml 0,2
M bufer natrium fosfat pH 7, 2,5 ml dH2 O dan 0,5 m 0,1 M CaCl2 . Supernatan
yang mengandung enzim ekstrak kasar ditambahkan sebanyak 1 ml dan
diinkubasikan selama 15 menit pada 60°C dengan digoyang pada 175 rpm. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 10 ml etanol 95%. Campuran reaksi diberi 25 μl
phenolphtalein dan dititrasi dengan 0,05 M NaOH. Tiga ulangan dilakukan untuk
tiap pengukuran aktivitas enzim. Satu unit aktivitas enzim lipase didefinisikan
sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol asam lemak per menit pada
kondisi dilakukannya pengukuran aktivitas. Aktivitas enzim relatif adalah
persentase aktivitas enzim pada tiap hasil pengukuran, dibandingkan terhadap
nilai tertinggi dari hasil pengukuran aktivitas enzim.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar. Suhu optimum untuk aktivitas
enzim ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas pada suhu yang
berbeda, yaitu 50°C, 60°C, 70°C, 80°C dan 90°C pada 0,2 M bufer natrium fosfat
pH 7. Penentuan pH optimum untuk aktivitas enzim dilakukan pada suhu
optimum dengan melakukan pengukuran aktivitas enzim pada kisaran pH 5
hingga pH 9 dengan menggunakan bufer natrium asetat 0,2 M untuk pH 5 hingga
pH 6, bufer natrium fosfat 0,2 M untuk pH 6,5 hingga 7,5 dan bufer Tris-HCl
0,2 M untuk pH 8 hingga pH 9.
15
Identifikasi Bakteri. Identifikasi bakteri dilakukan dengan metode PCR
koloni, untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA; 1 koloni tunggal diambil dan
dicampurkan ke dalam 25 μl campuran reaksi PCR GoTaq® Green Master Mix
(Promega). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah
primer universal yang spesifik terhadap domain bakteri (Marchesi et al. 1998)
yaitu primer 63f (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan 1387r (5’GGGCGGAWGTGTACAAGGC-3’). Kondisi PCR adalah pre PCR (94°C, 7
menit), denaturasi (94°C, 30 detik), penempelan (56°C, 30 detik), pemanjangan
(72°C, 1 menit dan 30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7
menit). Hasil PCR diimigrasikan pada gel elektroforesis dengan konsentrasi 1,5 %
pada 80 volt selama 50 menit. Gel direndam dalam larutan 0,5 mg/l larutan
etidium bromida selama 15 menit dan kemudian dalam air selama 10 menit. Gel
kemudian divisualisasi di atas UV transiluminator. Untuk sekuensing, hasil PCR
dimurnikan dengan QIAquick PCR Purification Kit dan selanjutnya disekuensing
dan dibandingkan dengan data sekuen gen 16S rRNA yang terdapat pada
GenBank menggunakan BLASTn (Basic Local Alignment Search Tools for
nucleotida).
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri
dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit
(Promega). Identifikasi keberadaan gen lipase dilakukan berdasarkan metode Bell
et al. (2002), dengan menggunakan primer OXF1 (5’-CCYGTKGTSYTNG
TNCAYGG-3’), OXF2 (5’-CCRATMRTWYTNGTNCAYGG-3’), OXF3 (5’-CC
KYTWGTKYTNATHCAYGG-3’), ACR1 (5’-AGGCCNCCCAKNGARTGNS
C-3’), ACR2 (5’-AGRCCNCCCAKRCTRTGNSC-3’), ACR3 (5’-AGGCCRCC
NTGNGARTGNSC-3’), ACR4 (5’-AGGCCNCCNTGRCTRTGNSC-3’). Kondi si PCR yang digunakan ialah: segmen 1 (94ºC, 1 detik), segmen 2 (94ºC, 1 menit),
segmen 3 (37ºC, 1 detik), segmen 4 (37ºC, 30 detik), segmen 5 (72ºC, 2 menit dan
20 detik), segmen 6 (72ºC, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari: segmen 1 (95ºC, 1
menit), segmen 2 (50ºC, 1 menit) dan segmen 3 (72ºC, 1 menit).
Isolasi Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri dilakukan dengan
menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Gen lipase
diisolasi dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi oleh Jiang et al
16
(2010), yaitu pasangan primer degenerate (5’-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG3’ dan 5’-TTAAGGSHSSAARCTYGCCA-3’), primer F1 (5’-GGAATTCCATA
TGATGAAATGCTGCCGGGTGATG-3’), primer F2 (5’-GGAATTCCATATGG
CAGCTTCACGCGCCAAT-3’) dan primer R1 (5’-CGCGGATCCTTAAGGG
TCCAAGCTCGCCAAC-3’).
Kondisi
PCR
untuk
amplifikasi
dengan
menggunakan primer degenerate ialah: segmen 1 (94°C, 1 detik), segmen 2 (94°C,
1 menit), segmen 3 (37°C, 1 detik), segmen 4 (37°C, 30 detik), segmen 5 (72°C, 2
menit dan 20 detik), segmen 6 (72°C, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari segmen
1 (95°C, 1 menit), segmen 2 (50°C, 1 menit) dan segmen 3 (72°C, 1 menit).
Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer degenerate
digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan
primer F1-R1 dan F2-R1. Kondisi PCR untuk amplifikasi dengan menggunakan
pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ialah pre PCR (94°C, 7 menit), denaturasi
(94°C, 30 detik), penempelan (60°C, 30 detik), pemanjangan (72°C, 1 menit dan
30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7 menit). Hasil PCR
kemudian diimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan etidium
bromida dan kemudian divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga
disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada
GenBank.
Kloning Gen Lipase. Gen lipase hasil pemurnian diligasikan ke plasmid
pGEM-T Easy (Promega) dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase (New
England Biolab), pada suhu 4°C selama 12 jam, kemudian ditransformasikan ke
E. coli TOP 10 dengan menggunakan metode Sambrook et al. (2001). Seleksi
untuk transforman menggunakan metode seleksi biru/ putih pada media Luria agar
yang diberi antibiotik Ampisilin (100 μg /ml), 0,1 mM IPTG, 80 μg/ml X-Gal
dan diinkubasikan selama 12 jam pada suhu 37°C. Transforman yang membawa
plasmid rekombinan yang tersisipi oleh gen lipase akan membentuk koloni
berwarna putih. Transforman kemudian diverifikasi dengan PCR koloni,
menggunakan primer M13f (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’) dan
M13r (5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’) (Moffett et al. 2000), Hasil
PCR kemudian dimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan
etidium bromida dan divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga
17
disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada
GenBank menggunakan BLASTp (Basic Local Alignment Search Tools for
protein). Aktivitas enzim lipase yang dihasilkan oleh E. coli TOP 10 transforman
diukur pada suhu 80°C dan pH 8,5.
Analisis Filogenetik. Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan
program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Analisis filogenetik untuk 16S rRNA
menggunakan
metode
Neighbour
Joining,
jarak
diperkirakan
dengan
menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates.
Analisis filogenetik sekuen asam amino hasil deduksi gen lipase menggunakan
metode Neighbour Joining, jarak diperkirakan dengan metode Poisson dengan
100 bootstrap replicates.
ÎÏÐÑÒ ÓÏÔ ÕÖ×ØÏÎÏÐÏÔ
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase
Sampel berupa air dan tanah diambil dari mata air panas di pulau Seram,
Maluku (Gambar 4), yang memiliki suhu 89 °C dan pH 6,3. Suhu pertumbuhan
mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu lebih dari 80°C berada pada
kisaran pertumbuhan mikroorganisme yang bersifat hipertermofilik (Stetter 1995).
Gambar 4 Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku.
Tanah yang terdapat pada lokasi mata air tersebut berwarna hitam, tercium
bau belerang dan terdapat daun-daun kering maupun ranting pohon yang gugur
dari pepohonan yang tumbuh di sekitar aliran air dari mata air panas tersebut
(Gambar 5). Lokasi mata air panas terdapat di daerah dataran rendah dan bukan
pada daerah gunung berapi. Menurut Kristjansson dan Hreggvidsson
(1995)
sumber mata air panas yang terdapat di luar zona aktif vulkanik biasanya memiliki
pH yang berkisar pada netral hingga alkalin, air dipanaskan oleh aliran lava yang
20
telah padam atau oleh ruang magma yang telah padam. Suhu air pada kedalaman
500 hingga 3000 meter seringkali di bawah 150°C, air tanah yang dipanaskan
kemudian akan kembali ke permukaan dengan membawa mineral terlarut seperti
silika dan gas terlarut seperti karbondioksida, dan gas H2 S dalam jumlah yang
kecil sehingga oksidasi pada permukaan tidak terlalu mempengaruhi pH.
Gambar 5 Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas.
Bakteri termofilik penghasil lipase diisolasi dengan menginokulasikan air
dan tanah yang diambil dari sumber mata air panas ke media Basal Salt Solution
(BSM), yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 0,1% minyak zaitun sebagai
sumber karbon satu-satunya untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase.
Pencawanan sampel secara langsung pada media seleksi yang kaya dan
mengandung sumber karbon dalam jumlah banyak akan menyebabkan tumbuhnya
mikroorganisme termofilik nonlipolitik dalam jumlah banyak dan dalam waktu
yang relatif cepat. Bakteri penghasil lipase akan membentuk koloni berwarna
merah jika ditumbuhkan pada media yang mengandung rhodamin B (Gambar 6).
21
Gambar 6 Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung
rhodamin B.
Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan pembandingan sekuen gen 16S
S
M
rRNA isolat T I.2 terhadap basis data gen 16S rRNA pada GenBank. Amplifikasi
gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r
yang dikonstruksi oleh Marchesi et al. (1998) dan diharapkan menghasilkan
fragmen DNA dengan ukuran sekitar 1324 bp. Amplifikasi gen 16S rRNA dari
isolat T I.2 dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r menghasilkan
fragmen dengan ukuran yang berada pada kisaran 1200 bp hingga 1500 bp
(Gambar 7), yang menunjukkan bahwa gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dapat
teramplifikasi dengan baik. Fragmen gen 16S rRNA hasil amplifikasi kemudian
disekuensing dan diperoleh hasil berupa sekuen fragmen DNA berukuran 540 bp
yang selanjutnya digunakan untuk analisis filogenetik (Lampiran 2). Sekuen
fragmen tersebut dimulai dari basa ke-72 yang terdapat pada ujung
ÙÚ dari sekuen
utuh gen 16S rRNA. Sekuen 500 bp awal dari 16S rRNA diketahui memberikan
cukup perbedaan untuk tujuan identifikasi antar galur karena
memiliki
keragaman yang lebih tinggi untuk tiap kilobasa dari sekuen (Clarridge 2004).
22
S
M
1324 bp
1500 bp
1200 bp
Gambar 7 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan
primer 63f dan 1387r (S : fragmen gen 16S rRNA Isolat T I.2, M :
Marker 100 bp Vivantis).
Hasil
BLASTn
untuk
pembandingan
terhadap
sekuen
GenBank
menunjukkan homologi hingga 99% terhadap Geobacillus stearothermophilus
Tapo3
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kloning Gen Penyandi Lipase
Termofilik dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku adalah
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini.
Bogor, Mei 2012
Edwin Thomas Apituley
P051090161
ABSTRACT
EDWIN THOMAS APITULEY. Cloning of Termophilic Lipase Gene from a
Bacterium Isolated from Hot Spring at Seram Island, Molluccas. Under direction
of ANTONIUS SUWANTO, and NISA RACHMANIA MUBARIK
Thermophilic bacteria often possess enzymes that are stable and active at
high temperature which are valuable for some biotechnological and industrial
applications such as lipase enzyme for lipid hydrolysis and esterification
reactions. The objectives of this research were to isolate and characterize lipase
produced by the thermophilic bacterium, and to isolate and cloned its lipase
encoding gene. Isolat T I.2 was thermophilic bacterium isolated from hot spring at
Seram island, which had temperature 89°C and pH 6,3. Comparison of 16SrDNA
sequence to GenBank database using Basic Local Alignment Search Tools for
nucleotides (BLASTn) showed that isolat T I.2 was cosely related to Geobacillus
stearothermophilus with 99% homology. The phylogenetic tree for 16S rRNA
which was constructed using Neighbour Joining Method and distance was
estimated using Kimura’s two parameter method with one hundred bootstrap
replicates showed that the thermophile isolat T I.2 is clustered to other members
of Geobacillus and closely related to Geobacillus stearothermophilus. Titrimetric
method was used to measure activity of crude lipase preparation of isolat T I.2 at
various temperature and pH with the result showed that optimum temperature and
pH of lipase activity were 80°C and 6,5. Isolation of lipase gene was conducted
using degenerate primers pair, primers pairs F1-R1 and primers pair F2-R1.
Primer pair F1-R1 could amplified only 600 bp of DNA fragment however 1180
bp of isolat T I.2 lipase gene amplified by primer pair F2-R1 was successfully
cloned to pGEM-T Easy and transformed to E.coli TOP 10. Crude lipase
preparation of E. coli TOP 10 transforman which carry recombinan plasmid, and
measured under optimal temperature 80°C and optimal pH 8,5, was 3,11 Unit/ml.
Sequence of 390 amino acids deduced from lipase gene of isolat T I.2 was
compared to GeneBank database using Basic Local Alignment Search Tools for
protein (BLASTp) and the result showed that it was closely related to lipase of
Geobacillus stearothermophilus L1 with 90% homology.
Keywords:
bacteria.
cloning,
Geobacillus
stearothermophilus,
lipase,
thermophilic
RINGKASAN
EDWIN THOMAS APITULEY. Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik dari
Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku. Dibimbing oleh
ANTONIUS SUWANTO, and NISA RACHMANIA MUBARIK
Bakteri termofilik seringkali memiliki enzim yang stabil dan aktif pada
suhu tinggi yang bermanfaat untuk diaplikasikan dalam bidang bioteknologi dan
industri, seperti enzim lipase yang digunakan dalam reaksi hidrolisis dan
esterifikasi. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi bakteri termofilik
penghasil lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengisolasi
serta mengklon gen penyandi lipase.
Isolat T I.2 adalah bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber mata air
panas yang terdapat di pulau Seram yang memiliki suhu 89°C dan pH 6,3. Isolasi
dilakukan menggunakan media Basal Salt Medium dengan minyak zaitun sebagai
sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase. Pembandingan
sekuen 16S rDNA terhadap basis data pada GenBank menggunakan Basic Local
Alignment Search Tools for nucleotides (BLASTn) menunjukkan bahwa isolat T
I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus stearothermophilus
dengan homologi 99%. Primer yang digunakan dikonstruksi oleh Marchesi et al
untuk amplifikasi gen 16S rRNA dan merupakan primer universal yang spesifik
terhadap domain bakteri,. Analisis filogenetik untuk 16S rRNA dilakukan dengan
menggunakan metode Neighbour Joining, dengan jarak diperkirakan
menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates.
Pohon filogenetik yang dikonstruksi menunjukkan bahwa isolat T I.2
mengelompok di antara anggota dari genus Geobacillus dan memiliki kemiripan
yang lebih dekat terhadap Geobacillus stearothermophilus.
Metode titrimetri digunakan untuk mengukur aktivitas lipase ekstrak kasar
dari isolat T I.2 pada berbagai suhu dan pH. Hasil yang diperoleh menunjukkan
aktivitas lipase optimal suhu 80°C dan pH 6,5. Prakiraan adanya gen lipase
dilakukan dengan mengamplifikasi fragmen gen lipase menggunakan primer yang
dikonstruksi oleh Bell et al. Primer tersebut tidak dapat mendeteksi adanya gen
lipase, untuk prakiraan keberadaan gen lipase pada isolat T I.2. Isolasi gen lipase
kemudian dilakukan dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi
oleh Jiang et al. Primer degenerate digunakan untuk menghasilkan beberapa
fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda, dan fragmen yang berukuran kurang
lebih 1200 bp digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan
menggunakan pasangan primer F1-R1 yang dikonstruksi untuk amplifikasi gen
lipase beserta sekuen signalnya, dan primer F2-R1 untuk mengamplifikasi gen
lipase tanpa menyertakan signal sekuen. Pasangan primer F1-R1 hanya dapat
mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 600 bp. Gen lipase isolat T I.2
berukuran 1180 bp berhasil diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer
F2-R1, dan diklon ke pGEM-T Easy sehingga diperoleh plasmid rekombinan
pGEM-TGeolipFull dengan ukuran 4204 bp. Plasmid rekombinan kemudian
ditransformasikan ke Escherichia coli TOP 10. Aktivitas enzim lipase ekstrak
kasar yang dihasilkan E.coli TOP 10 transforman yang membawa plasmid
rekombinan ialah sebesar 3,11 U/ml pada kondisi optimal yaitu suhu 80°C dan pH
8,5, hal ini menunjukkan bahwa gen lipase pada plasmid rekombinan dapat
terekspresi dengan baik.
Sekuen yang terdiri dari 390 asam amino hasil deduksi gene lipase isolat T
I.2 dibandingkan terhadap basis data GenBank menggunakan Basic Local
Alignment Search Tools for protein (BLASTp) menunjukkan bahwa gen lipase
isolat T I.2 memiliki kekerabatan yang lebih dekat kepada Geobacillus
stearothermophilus L1 dengan tingkat keidentikan mencapai 90%. Berdasarkan
hasil pembandingan BLASTp tingkat keidentikan maksimal antara sekuen asam
amino protein lipase T I.2 terhadap sekuen asam amino protein lipase Geobacillus
yang lain adalah sebesar 93%, meskipun demikian berdasarkan skor maksimal
pada hasil pembandingan dengan BLASTp, dapat disimpulkan bahwa isolat T I.2
memiliki kedekatan secara evolusi terhadap Geobacillus stearothermophilus L1
meskipun hanya memiliki tingkat keidentikan 90%. Analisis filogenetik sekuen
asam amino hasil deduksi gen lipase dilakukan dengan menggunakan metode
Neighbour Joining, dimana jarak diperkirakan dengan metode Poisson dan
menggunakan 100 bootstrap replicates. Hasil analisis pohon filogenetik
menunjukkan bahwa lipase yang berasal dari isolat T I.2 memiliki kemiripan yang
lebih dekat kepada lipase dari genus Geobacillus dan dikelompokkan ke dalam
Family I.5 dari enzim lipolitik. Analisis filogenetik protein lipase T I.2 terhadap
beberapa proein enzim lipase yang berasal dari beberapa spesies Geobacillus
dengan menggunakan Neighbour Joining Method menunjukkan bahwa enzim
lipase isolat T I.2 terletak pada percabangan awal dari pohon filogenetik bersama
dengan sumber awal lipase dari beberapa Geobacillus yang lain dalam pohon
filogenetik.
Pemadanan sekuen lipase T I.2 terhadap sekuen dan elemen struktur
sekunder lipase L1 dari G. stearothermophilus L1 menunjukkan bahwa daerah
pentapeptida terkonservasi, triad katalitik dan daerah pengikatan ion Ca2+ dan
Zn2+ bersifat identik pada kedua lipase tersebut. Kedua sekuen tersebut
menunjukkan perbedaan hingga 43 asam amino, dan memiliki 346 asam amino
yang identik. Hasil pemadanan sekuen asam amino lipase T I.2 terhadap lipase L1
juga menunjukkan bahwa terdapat subtitusi asam amino ke 190 pada daerah heliks
α6, yaitu asam glutamat (G) yang bersifat polar negatif pada lipase L1, menjadi
lisin (K) yang bersifat polar positif. Heliks α6 akan berfungsi sebagai tudung (lid)
yang dapat membuka selama aktivasi enzim lipase Geobacillus
stearothermophilus. Subtitusi juga terjadi pada Histidin (H) 87 yang bersifat polar
netral pada daerah domain ekstra pada lipase L1, menjadi asam aspartat (D) yang
bersifat polar negatif pada lipase dari isolat T I.2. Protein enzim lipase dari
Geobacillus memiliki suatu domain ekstra, yang memiliki situs pengikatan Zn2+,
yang membentuk ikatan koordinasi dengan domain ekstra (Histidin 81 dan
Histidin 87) dan domain inti dari protein (Aspartat 61 dan Aspartat 238). Adanya
ikatan koordinasi ini berperan untuk meningkatkan termostabilitas enzim.
Kata kunci: kloning, Geobacillus stearothermophilus, lipase, bakteri termofilik.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KLONING GEN PENYANDI LIPASE TERMOFILIK DARI
ISOLAT BAKTERI ASAL MATA AIR PANAS DI PULAU
SERAM, MALUKU
EDWIN THOMAS APITULEY
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas
berkat dan anugerahnya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema
yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2010
adalah kloning gen lipase, dengan judul Kloning Gen Penyandi Lipase Termofilik
dari Isolat Bakteri Asal Mata Air Panas di Pulau Seram, Maluku.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius
Suwanto, M.Sc dan Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku pembimbing,
bapak Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA yang telah banyak memberikan saran dan
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi. Penulis
juga ingin mengucapkan terima kasih kepada PT. Wilmar Benih Indonesia atas
bantuan dana dan kesempatan untuk memanfaatkan fasilitas penelitian, kepada
Ibu Esti Puspitasari, M.S, Bapak Cahya Priatna, M.Sc, Bapak Yeppi Hardi
Rustam, S.Si, Griselda Herman S.Si beserta seluruh staf Departemen Research
and Development, PT Wilmar Benih Indonesia yang telah membantu selama
dilakukannya penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan staf Jurusan
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Universitas Pattimura,
dan kepada rekan-rekan angkatan 2009 pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah
Pascasarjana IPB. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada ibu dan
kakak-kakak, serta seluruh keluarga atas segala doa, kasih sayang dan dukungan
yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2012
Edwin Thomas Apituley
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ambon pada tanggal 1 Mei 1974 dari ayah Jacob J.
H. Apituley (Alm) dan ibu Merry Z. Apituley. Penulis merupakan putra bungsu
dari lima bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, lulus pada tahun 2000. Pada tahun
2002, penulis melanjutkan pendidikan pada program Magister Manajemen,
Universitas 17 Agustus, Surabaya dan menyelesaikannya pada tahun 2004. Pada
tahun 2009, penulis memperoleh kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke
Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana IPB.
Sejak tahun 2004, penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Jurusan
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pattimura,
Ambon
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ……………………………………………………..
xiv
DAFTAR GAMBAR …………………………………………………..
xv
DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………..
xvi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ………………………………………………...
1
Tujuan Penelitian ……………………………………………….
3
Manfaat Penelitian …………………………………………….
3
TINJAUAN PUSTAKA
Struktur dan Mekanisme Reaksi Enzim Lipolitik ……………..
5
Klasifikasi Enzim Lipolitik Bakteri …………………………..
9
EnzimTermostabil dari Mikroorganisme Termofilik ...………...
10
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen 16S rRNA ………….
11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian …………………………………..
13
Bahan dan Alat ………………………………………………...
13
Metode Penelitian ..…………………………………………….
13
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase …………………..
19
Identifikasi Bakteri …………………………………………….
21
Analisis Filogenetik 16S rRNA ………………………………..
24
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar ……………………………
25
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase …………………………….
28
Isolasi Gen Lipase ……………………………………………..
29
Kloning Gen Lipase ……………………………………………
31
Analisis Filogenetik Protein Lipase ...…………………………
37
SIMPULAN …………………………………………………………...
45
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………
47
LAMPIRAN ……………………………………………………………
53
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil BLASTn sekuen 16S rRNA isolat T I.2 ………………………
23
2 Hasil BLASTp sekuen lipase isolat T I.2 pada GenBank …………...
36
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Diagram topologi pelipatan umum dan minimal dari struktur
pelipatan protein enzim α/β hidrolase ……………………………...
5
2
Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase …………………………...
7
3
Mekanisme reaksi hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase …………
8
4
Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku ………………...
19
5
Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas …………...
20
6
Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung
rhodamin B ………………………………………………………….
7
21
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan
primer 63f dan 1387r ……………………………………………….....
22
8
Posisi filogenetik dari isolat T I.2 di antara spesies Geobacillus …….
24
9
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar ……………...
26
10 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ekstrak kasar ………………..
27
11 Hasil amplifikasi genom isolat termofilik T I.2 dengan menggunakan
primer OXF-ACR …………………………………………………..
28
12 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dengan menggunakan primer
degenerate …………………………………………………………...
30
13 Hasil amplifikasi PCR gen lipase dari isolat T I.2 dengan
menggunakan pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ………………….
30
14 Hasil amplifikasi PCR untuk verifikasi transforman dengan
menggunakan pasangan primer M13f dan M13r …………………...
32
15 Peta plasmid rekombinan pGEM-T Geolip-Full …………………….
32
16 Peta plasmid pGEM-T Easy …………………………………………
33
17 Sekuen promotor dan situs multiple cloning dari plasmid
pGEM-TEasy ..………………………………………………………
33
18 Koloni E. coli TOP 10 transforman ditumbuhkan pada media
rhodamin B yang diberi Ampisilin (100 µg/ml), X-Gal 80µg/ml
dan IPTG (0,1 mM) …………………………………………………
34
19 Posisi filogenetik protein lipase T I.2 di antara protein enzim
lipolitik ........................................................................
38
Halaman
20 Posisi filogenetik protein lipase T I.2 di antara protein enzim lipase
dari beberapa spesies Geobacillus …………………………………..
39
21 Sekuen konsensus lipase dari beberapa spesies Geobacillus ………..
42
22 Pembandingan sekuen asam amino protein lipase T I.2 terhadap
sekuen asam amino protein lipase L1 ……………………………….
43
D L
Halaman
1
Matriks subtitusi BLOSUM62 …………………………………........
55
2
Sekuen 16S rRNA isolat T I.2 ………………………………………
56
3
Hasil pengukuran aktivitas enzim lipase isolat T I.2 pada kisaran
suhu 50°C hingga 90°C dan pH 7 …………………………………..
4
57
Hasil pengukuran aktivitas enzim lipase pada kisaran pH 5 hingga 9
dan suhu 80°C ………………………………………………………
58
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Minyak dan lemak berperan penting dalam diet manusia, dengan
menyediakan kalori dan asam lemak yang esensial. Asam lemak yang
teresterifikasi ke gliserol merupakan komponen utama penyusun minyak dan
lemak (Shahidi 2005). Minyak dan lemak digolongkan sebagai lipid sederhana
dan digunakan dalam industri untuk menghasilkan produk berupa makanan
maupun produk oleokimia. Berdasarkan karakteristik minyak dan lemak sebagai
bahan baku yang sesuai dengan kebutuhan perakitan suatu produk berbasis
minyak dan lemak dan perubahan persepsi tentang kandungan nutrisinya
mendorong dilakukannya modifikasi terhadap minyak dan lemak untuk memenuhi
kebutuhan tersebut.
Enzim lipase (EC 3.1.1.3, triasilgliserol asilhidrolase) menghidrolisis
lemak dan minyak
m
asam lemak dan gliserol. Enzim lipase
j dapat
mensintesis ester dan reaksi interesterifikasi. Oleh karena kemampuan katalisis
terhadap reaksi-reaksi tersebut, enzim lipase digunakan
s luas dalam industri
d
proses pengolahan makanan, sintesis kimia dan
farmasi, sintesis surfaktan, industri oleokimia, dan agrokimia (Vjs 1994).
untuk menghasilkan
Proses katalisis menggunakan enzim lipase memiliki beberapa keuntungan
dibandingkan proses katalisis
s k
m
seperti tingkat kespesifikan yang
tinggi terhadap substrat maupun situs target yang dikatalisis, proses pemurnian
yang lebih sederhana dan murah, aktivitas katalitik yang relatif lebih tinggi, proses
yang lebih bersahabat dengan lingkungan, dan bersifat biodegradable
(
et al.
2008).
Beberapa lipid terutama yang mengandung asam lemak rantai
p
j bersifat padat pada suhu ruang sehingga harus diubah ke dalam
bentuk
pada suhu di atas 50°C untuk dapat diproses lebih lanjut, karenanya
tidak
dibutuhkan enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi (Cho et al. 2000). Enzim
lipase yang stabil pada suhu tinggi dimanfaatkan untuk proses pengolahan limbah
yang mengandung lipid dalam jumlah yang tinggi, yang dihasilkan oleh proses
industri, seperti pengilangan minyak, pembuatan sabun, dan pemrosesan kulit.
2
Kandungan lipid yang tinggi pada limbah sering menimbulkan masalah seperti
bau tidak sedap yang dihasilkan, penyumbatan pipa saluran pembuangan, dan
menghambat proses pengolahan limbah
biologis karena lipid akan
membentuk lapisan pada permukaan air sehingga menurunkan transfer oksigen
pada proses aerobik (Lemus
& Lau 2002). Aplikasi mikroorganisme termofilik
dan enzim lipase untuk pengolahan limbah dengan kandungan lipid tinggi
memiliki keuntungan karena pada suhu di atas 50°C, lipid yang membentuk
agregat akan mencair dan akan terbentuk emulsi substrat yang stabil dengan luas
permukaan yang meningkat selama proses agitasi sehingga ketersediaan substrat
untuk dimanfaatkan oleh enzim maupun mikroorganisme menjadi meningkat.
Pada suhu tinggi laju difusi dan transfer massa akan meningkat dan mengurangi
jumlah patogen (Markossian et al. 2000).
Enzim lipase yang stabil pada suhu tinggi (termostabil) seringkali dapat
diperoleh dari mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu menengah
(mesofilik), maupun dari mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu tinggi
(termofilik). Meskipun demikian, enzim dari mikroorganisme yang bersifat
termofilik bersifat lebih stabil pada kisaran pH yang lebar dalam pelarut organik
dan menunjukkan aktivitas yang relatif lebih tinggi pada suhu tinggi dibandingkan
mikroorganisme nontermofilik (Jiang et al. 2010).
Meskipun memiliki stabilitas yang tinggi pada kisaran pH yang luas dan
suhu yang tinggi, lipase yang berasal dari bakteri termofilik secara normal
dihasilkan dalam jumlah yang rendah sehingga dibutuhkan rekayasa secara
genetik untuk mengisolasi, mengubah regulasi gen dan untuk meningkatkan
produksi protein enzim. Informasi mengenai sekuen nukleotida suatu gen
memungkinkan untuk menentukan sekuen asam amino dari protein suatu enzim.
Berdasarkan sekuen asam amino akan dapat diperkirakan pelipatan tiga dimensi
polipeptida untuk menciptakan struktur tersier yang stabil. Salah satu metode
yang dapat digunakan untuk melakukan isolasi gen lipase ialah dengan
menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR telah berhasil
digunakan untuk melakukan isolasi gen lipase dari beberapa bakteri termofilik
antara lain dari genus Bacillus subtilis (Ma et al. 2006), maupun dari genus
Geobacillus (Jiang et al. 2010; Kim et al. 2000; Leow et al. 2007).
3
Lingkungan dengan kondisi suhu tinggi sering ditemukan pada berasosiasi
dengan fenomena vulkanik, seperti sumber air panas, fumarol maupun geothermal
vents (Madigan et al. 2009). Indonesia merupakan negara yang memiliki banyak
lokasi hidrotermal yang merupakan habitat bagi beragam mikroorganisme
termofilik sehingga merupakan salah satu sumber bagi enzim yang stabil pada
suhu tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini
b !"!#n
untuk mengisolasi bakteri termofilik penghasil
lipase, mengkarakterisasi lipase yang dihasilkan, dan untuk mengklon gen
penyandi lipase.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diperoleh yaitu mendapatkan isolat bakteri potensial
untuk bioteknologi pertanian, khususnya industri minyak dan lemak, dan untuk
referensi yang berhubungan dengan gen penyandi enzim lipase termofilik,
khususnya yang berasal dari Geobacillus stearothermophilus.
TINJAUAN PUSTAKA
Struktur dan Mekanisme Reaksi Enzim Lipolitik
Enzim lipolitik
$%')*)
struktural dikelompokan ke dalam protein
superfamili α/β hidrolase. Anggota kelompok ini memiliki karakteristik yang
:
sama yaitu memiliki kesamaan arsitektur protein berupa pelipatan α/β
h+,*-.)$%/
kesamaan unsur penyusun utama situs katalitik enzim, yaitu katalitik triad yang
umumnya tersusun dari residu serin, aspartat dan histidin, kesamaan motif urutan
pentapeptida terkonservasi pada residu serin situs aktif, yang umumnya tersusun
0 J)%1%*
atas Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (Arpigny
1999). Beberapa enzim yang
memiliki struktur pelipatan dan mekanisme katalitik yang sama, yaitu enzim
lipase (E.C.3.1.1.3), esterase (E.C.3.1.1), asetilkolinesterase (E.C.3.1.1.7),
kutinase
(E.C.3.1.1.74),
karboksil-
esterase
(E.C.3.1.11),
arilesterase
(E.C.3.1.1.2), fosfolipase A1 (E.C.3.1.1.32), kolinesterase (E.C.3.1.1.8) dan
234%5+.% hormone esterase (E.C.3.1.2.14) 67+$'her 0 Pleiss, 2003).
Anggota kelompok protein enzim α/β hidrolase memiliki kesamaan
struktur pelipatan protein yang
$%')*) umum merupakan suatu struktur pelipatan
yang tersusun dari 8 untaian lembaran β (β-sheet) yang hampir seluruhnya pararel,
89;+)1*)? topologi pelipatan umum dan minimal dari struktur pelipatan
protein enzim α/β hidrolase. Warna hitam ?%53523@@)5 pelipatan
minimal, w)*5) abu-abu ?%53523@@)5 pelipatan umum. Katalitik triad
ditandai sebagai N3: Nukleofil, A': Asam, H: Histidin (Heikenheimo
et al. 1999).
6
Struktur pelipatan yang minimal dibutuhkan oleh suatu protein untuk
dapat dikelompokan dalam protein enzim α/β hidrolase adalah memiliki minimal
5 rantai β, dimulai dari rantai β3 (Heikenheimo et al. 1999). Struktur pelipatan
umum α/β hidrolase memiliki untaian lembaran β2 yang antipararel terhadap
untaian lembaran β yang lain, dengan pola untaian α-heliks diikuti lembaran β (α
turn β). Stuktur katalitik pada enzim α/β hidrolase memiliki katalitik triad yang
terdiri atas nukleofil, asam dan histidin. Nukleofil pada struktur katalitik tidak
sama pada tiap enzim α/β hidrolase dan dapat berupa serin, sistein atau asam
aspartat.
Berdasarkan substratnya, enzim lipase dibedakan dari esterase. Substrat
enzim lipase adalah asilgliserida rantai
BCEFCEG yang bersifat tidak larut di dalam
air dan karenanya akan membentuk misel. Asilgliserida rantai pendek yang
bersifat lebih larut dalam air merupakan substrat untuk enzim esterase. Kontak
iIKMOPQRM)
antara lipase dengan antarmuka (
misel yang terbentuk dari substrat
BCEFCEG yang tidak larut dalam air akan menyebabkan
perubahan konformasi enzim STEFCUX konformasi yang aktif, fenomena
pengaktifan ini dikenal sebagai iIKMOPQRiQY activation. ZIKMOPQRiQY activation pada
berupa asilgliserol rantai
lipase melibatkan reorganisasi struktur sekunder dan pembukaan suatu struktur
[CTGT\ et al.
yang dibentuk oleh untaian α heliks yang menutup situs aktif enzim (
1994, Kim et al. 1997).
Enzim lipase memiliki kemampuan untuk mengkatalisis beberapa
FTEX]
reaksi biotransformasi lipid yaitu reaksi hidrolisis pada ikatan ester yang terdapat
pada asilgliserol yang menghasilkan asam lemak dan gliserol, dan reaksi balik
arah, yaitu reaksi esterifikasi atau pembentukan ikatan ester antara asam lemak
dan gliserol untuk membentuk asilgliserol, reaksi asidolisis yaitu reaksi
]TE^C_C ester dengan suatu ]TE^C_C asam,
reaksi alkoholisis yaitu reaksi pertukaran gugus alkil antara suatu ]TE^C_C ester
dengan suatu ]TE^C_C alkohol, reaksi interesterifikasi yaitu reaksi pertukaran
gugus alkil antar ]TE^C_C ester, dan reaksi gliserolisis yaitu reaksi pembentukan
pertukaran gugus alkil antar suatu
ikatan ester antara gugus hidroksil pada gliserol dengan gugus asil yang berasal
dari
]TE^C_C asilgliserol yang lain (Gambar 2).
7
Hidrolisis
Asidolisis
Alkoholisis
Gliserolisis
Transesterifikasi
Gambar 2 Reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase (
`acefgl 1994). R ,
n
R’n
adalah residu asam lemak, ROH umumnya adalah metanol.
Mekanisme reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase ini digunakan dalam
aplikasi untuk memproses lemak dan minyak, antara lain hidrolisis lemak atau
minyak untuk membuat sabun, gliserolisis untuk produksi monogliserida yang
dimanfaatkan sebagai pengemulsi pada produk makanan, kosmetik dan farmasi.
Reaksi esterifikasi dimanfaatkan untuk menghasilkan gliserida seperti
monogliserida melalui proses esterifikasi asam lemak ke gliserol, sedangkan
reaksi interesterifikasi digunakan dalam transformasi minyak dengan nilai
ekonomi rendah, seperti fraksi menengah dalam pemrosesan minyak sawit
n
menjadi trigliserida cocoa butter yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Proses
alkoholisis gula alkohol dengan minyak yang berasal dari tanaman maupun hewan
8
Gambar 3 Mekanisme reaksi hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase
(Jaeger et al 1999): (1) Pengikatan lipid (substrat) dan aktivasi
residu nukleofilik serin oleh histidin, diikuti oleh serangan terhadap
atom karbon pada gugus karbonil oleh O- dari serin, (2) Terbentuk
intermediet tetrahedral sementara dengan O- distabilkan oleh
interaksi
dengan
dua
gugus
NH
pada
peptida.
Histidin
mendonasikan satu proton kepada komponen alkohol dari bagian
substrat yang memisah, (3) Terbentuk intermediet kovalen (asilenzim) yaitu komponen asam dari substrat teresterifikasi ke residu
serin dari enzim. Molekul air akan diaktifkan oleh residu histidin
dan menghasilkan ion hidroksil yang kemudian melakukan
serangan nukleofilik ke atom karbon dari gugus karbonil dari
senyawa intermediet kovalen, (4) Residu histidin mendonasikan
sebuah proton ke atom oksigen pada residu serin. Ikatan ester
antaraserin dan komponen asil akan terputus sehingga menghasilkkan produk asil.
9
akan menghasilkan ester asam lemak pada gula (Jaeger et al. 1994). Mekanisme
reaksi katalitik hidrolisis ikatan ester oleh enzim lipase terdiri atas empat tahapan
reaksi
oqrturv 3).
Klasifikasi Enzim Lipolitik Bakteri
xyz{t
lipolitik pada bakteri dikelompokkan ke dalam
|
family
berdasarkan motif urutan asam amino terkonservasi dan karakteristik biologis
enzim
o}v~{y Jaeger 1999). rt{ I merupakan kelompok yang terbesar dan
dikelompokkan lagi ke dalam 6 subfamily. Termasuk ke dalam family ini ialah
enzim lipase yang berasal kelompok bakteri
qram negatif seperti
maupun bakteri qram positif seperti Bacillus maupun
. xyz{t lipase dari kelompok bakteri termofilik aerobik dari genus
Bacillus yang diklasifikasikan ulang sebagai Geobacillus (Nazina et al.
dikelompokkan ke dalam subfamily
rt{ II merupakan kelompok enzim lipolitik dari bakteri yang memiliki
motif urutan pentapeptida q-} ~ -¡¢v-o£¢¤ atau oq¥¡o£ enzim pada residu
dan
serin dari situs aktif, yang membedakannya dari motif pentapeptida dari kelompok
q-§-¡¢v-§-q Termasuk ke dalam
family ini ialah asiltransferase dari ¨ hila dan esterase yang
dihasilkan © ª Salmonella
dan © luminescens. xyz{t lipolitik yang memiliki
kemiripan urutan asam amino terhadap enzim platelet activating «
pada manusia, dikelompokkan ke dalam family III, termasuk
dalam kelompok ini ialah enzim lipase dari ¬«us dan
albus, serta enzim esterase 1 dari ¬ sp. xnzim lipolitik yang
family lain, yang
¢¦rvr
umum adalah
memiliki kemiripan urutan asam amino terhadap enzim hormone sensitive lipase
o®¡£ pada mamalia, di kelompokkan kedalam family ¯° termasuk di dalamnya
ialah enzim lipase yang berasal dari sp ±²° enzim esterase 2 yang
berasal dari bakteri psikrofilik ¬ sp, esterase dari bakteri mesofilik
Escherichia coli dan ¨ª eutrophus, dan bakteri termofilik ¨bacillus acidocaldarius dan Archaeglobus fulgidus.
10
Kelompok enzim lipolitik dari family
³ ´µ¶µ·µ¸¹º oleh kemiripan sekuen
asam amino terhadap beberapa enzim bukan lipolitik yang berasal dari bakteri,
seperti hidrolase
»¼½¾µ´¹¿ dehalogenase dan haloperoksidase. Termasuk ke dalam
family ini ialah enzim esterase dari bakteri psikrofilik Moraxella sp. (esterase 3
dan Psychrobacter immobilis, esterase dari bakteri mesofilik Haemophilus
influenza dan Acetobacter pasteurianus maupun esterase yang dihasilkan bakteri
termofilik Sulfolobus acidocaldarius.
ÀºÁµÂ
lipolitik yang dimasukkan ke dalam kelompok family
³Ã ialah
enzim karboksilesterase, dan memiliki kemiripan urutan asam amino dengan
lysophospholipase pada eukariot, termasuk ke dalam kelompok ini ialah enzim
karboksilesterase yang dihasilkan oleh Pseudomonas fluorescens.
family
³ÃÃ
dari enzim lipolitik asal bakteri memiliki kemiripan sekuen asam
amino dengan enzim asetilkolin esterase dan
eukariot.
ĻŽ¼½¸
µºÆ»ÇƵº»Èŵɻ· karboksilesterase pada
Ê»Ëerapa enzim lipolitik dari anggota kelompok ini memiliki manfaat
untuk aplikasi dalam industri, seperti karbamat hidrolase yang dihasilkan
Arthrobacter oxydans yang bersifat aktif terhadap herbisida
¼Ì»ºÍŶ¹·Ë¹Â¹Æ» dan
p-nitrobenzil yang dihasilkan Bacillus subtilis dan dimanfaatkan untuk sintesis
antibiotik
β-lactam.
Family
VIII
merupakan
family
terakhir
dalam
pengelompokan enzim lipolitik yang berasal dari bakteri, dan memiliki kemiripan
dengan kelompok C dari enzim β-laktamase, termasuk ke dalam kelompok ini
ialah esterase yang dihasilkan oleh Arthrobacter geobiformis dan Streptomyces
chrysomalis.
EnzimTermostabil dari Mikroorganisme Termofilik
Suhu merupakan salah satu faktor lingkungan yang sangat mempengaruhi
pertumbuhan dan kemampuan organisme untuk bertahan hidup. Beberapa jenis
mikroorganisme diketahui dapat hidup dan tumbuh pada lingkungan yang
memiliki kisaran suhu yang tinggi dan digolongkan sebagai mikroorganisme
termofilik (kisaran suhu 45 hingga 80ºC) dan hipertermofilik (kisaran suhu di atas
80ºC, hingga suhu tertinggi yang diketahui masih dapat mendukung pertumbuhan
yaitu 113ºC) (Stetter 1999, Dehouck
et al 2008 ). Secara umum dengan
peningkatan suhu akan menyebabkan kenaikan laju reaksi kimia dan enzimatik
yang terjadi di dalam sel, dan akan mempercepat pertumbuhan hingga pada suatu
11
suhu tertentu, komponen sel seperti protein dan asam nukleat akan mengalami
denaturasi dan menyebabkan sel berhenti berfungsi. Enzim yang berasal dari
mikroorganisme termofilik pada umumnya memiliki aktivitas yang optimum
pada suhu antara 60 hingga 80ºC dan tidak berfungsi dengan baik pada suhu di
bawah 40ºC (Vieille & Zeikus 2001). Agar dapat mempertahankan suatu keadaan
fungsional pada kondisi yang ekstrem seperti pada suhu yang tinggi, dibutuhkan
kestabilan protein (Jaenicke & Bohm 1998).
Mekanisme mempertahankan kestabilan protein pada suhu yang tinggi
ditunjang oleh beberapa faktor, baik yang bersifat intrinsik maupun ekstrinsik
(Vielle & Zeikus 2001). Faktor penstabil yang bersifat intrinsik antara lain:
komposisi asam amino, ikatan disulfide, interaksi hidrofobik, interaksi aromatik
dan ikatan hidrogen. Faktor ekstrinsik merupakan faktor penstabil yang berasal
dari lingkungan dalam sel yaitu garam, substrat maupun tekanan.
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen 16S rRNA
Sebelum perangkat untuk analisis biologi molekuler berkembang, ahli
taxonomi hanya bertumpu kepada karakteristik fenotip, yaitu penampakan secara
fisik
untuk
menarik
kesimpulan
tentang
genotip,
yaitu gen-gen
yang
menyebabkan penampakan fenotip tersebut. Meskipun demikian, terdapat
keterbatasan karena kemiripan fenotip tidak selalu merefleksikan kemiripan
genotip. Metode identifikasi mikroorganisme secara tradisional yang bertumpu
pada karakterisasi fenotip dari organisme juga memberikan hasil identifikasi
yang cenderung bervariasi yang disebabkan oleh pengaruh kondisi pertumbuhan,
fase pertumbuhan dan terjadinya mutasi spontan (Tenover et al. 1997). Dengan
berkembangnya biologi molekuler, data molekuler digunakan untuk menentukan
hubungan filogenetik antara semua mahluk hidup dengan didasarkan pada
hipotesis jam molekuler yang diajukan oleh Emile Zuckerkandl dan Linus Pauling
(Woese et al. 1990). Hipotesis jam molekuler menyatakan bahwa laju subtitusi
sangat konstan di antara protein-protein yang homolog selama masa jutaan tahun
sehingga akumulasi perubahan asam amino berlaku seperti gerakan jam
molekuler. Secara sederhana organisme - organisme dengan tingkat kemiripan
12
molekuler yang tinggi diharapkan mempunyai hubungan yang lebih dekat
dibandingkan dengan organisme yang tingkat kemiripan molekulernya rendah.
Ribosom merupakan molekul yang secara luas digunakan untuk
menentukan hubungan evolusi di antara mahluk hidup (Madigan et al. 2009).
Ribosom merupakan molekul yang berperan penting dalam proses sintesis protein,
telah ada sejak lama sebagai komponen penting di dalam sel, memiliki fungsi
yang konstan, terdistribusi secara universal dan secara moderat memiliki sekuen
yang terkonservasi. 16S rRNA merupakan salah satu dari 3 molekul RNA
ribosomal yang terdapat pada prokaryot dengan ukuran panjang ±1550 bp dan
terdiri atas sekuen daerah variabel dan daerah terkonservasi (Clarridge 2004).
Daerah variabel pada 16S rRNA bakteri menunjukkan keragaman di antara
spesies bakteri yang berbeda dan dapat digunakan untuk identifikasi genus
maupun spesies (Chakravorty et al. 2007).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Research and Development PT.
Wilmar Benih Indonesia, Bekasi, yang dimulai dari bulan September 2010 sampai
bulan Desember 2011.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen),
plasmid pGEM-T Easy (Promega), Agarose (Gibco), PCR GoTaq®Green Master
Mix (Promega), enzim T4 DNA ligase (New England Biolabs), marker molekuler
100 bp DNA ladder (Vivantis), Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega),
QIAquick PCR Purification kit (Qiagen).
Alat utama yang digunakan ialah sentrifuge (Sorval Biofuge Primo R),
mesin PCR (BIO RAD Thermal Cycler C1000), sequencer (AB Applied
Biosystems Hitachi 3130 Genetic Analyzer), perangkat elektroforesis (BIO RAD),
shaker waterbath (Yih Der).
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase. Isolasi dilakukan dengan
menginokulasikan sebanyak satu lup air dan tanah yang diambil dari mata air
panas ke dalam media Basal Salt Solution (BSM) (0,8 g/l K2 HPO4 ; 0,6 g/l
KH2 PO4 ; 1 g/l (NH4 )2 SO4; 0,2 g/l MgSO4 ·7H2 O; 0,05 g/l CaCl2 ·2H2 O; 3 g/l NaCl
dan 0,001 g FeCl3 ) yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 1% minyak zaitun,
kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan penggoyangan 175 rpm selama
48 jam. Setelah inkubasi, kultur disebar pada media Rhodamin B (0,01 g/l
(NH4 )2 SO4 ; 0,01 g/l K2 HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05 g/l MgSO4 ·7H2 O; 0,01 g/l
FeSO4 ·7H2 O; 0,05 g/l ekstrak khamir, 0,05 g/l tripton, 0,01% Rhodamin B
(Kouker & Jaeger 1987) dan 2% Polyvinil alkohol (PVA)/minyak zaitun (3:1).
dan diinkubasikan pada suhu 60°C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh diamati di
bawah lampu UV dengan panjang gelombang 350 nm.
14
Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Inokulum untuk produksi enzim dibuat
dengan mengambil 1 lup biakan bakteri dan diinokulasikan pada 10 ml media
produksi yang mengandung 0,5% ekstrak khamir, 0,5% tripton dan 2% minyak
zaitun kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan digoyang 175 rpm selama
12 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan inokulum ke dalam
50 ml media produksi: 0,01 g/l (NH4 )2 SO4 ; 0,01 g/l K2 HPO4; 0,05 g/l KCl; 0,05
g/l MgSO4 . 7H2 O; 0,01 g/l FeSO4 .7H2 O yang diberi 0,5% ekstrak khamir, 0,5%
tripton dan 2% minyak zaitun, kemudian diinkubasikan pada suhu 60°C dengan
digoyang 175 rpm selama 48 jam. Kultur hasil inkubasi disentrifugasi pada 4000
rpm (nomor rotor 7591) selama 40 menit. Supernatan yang mengandung enzim
ekstrak kasar dipisahkan dan digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim.
Pengukuran Aktivitas Enzim. Aktivitas enzim lipase diukur dengan
menggunakan metode Xu et al. (2002) yang telah dimodifikasi; 4 ml campuran
2% Polivinyl alcohol (PVA)/ minyak zaitun (3:1) dicampurkan dengan 2 ml 0,2
M bufer natrium fosfat pH 7, 2,5 ml dH2 O dan 0,5 m 0,1 M CaCl2 . Supernatan
yang mengandung enzim ekstrak kasar ditambahkan sebanyak 1 ml dan
diinkubasikan selama 15 menit pada 60°C dengan digoyang pada 175 rpm. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 10 ml etanol 95%. Campuran reaksi diberi 25 μl
phenolphtalein dan dititrasi dengan 0,05 M NaOH. Tiga ulangan dilakukan untuk
tiap pengukuran aktivitas enzim. Satu unit aktivitas enzim lipase didefinisikan
sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol asam lemak per menit pada
kondisi dilakukannya pengukuran aktivitas. Aktivitas enzim relatif adalah
persentase aktivitas enzim pada tiap hasil pengukuran, dibandingkan terhadap
nilai tertinggi dari hasil pengukuran aktivitas enzim.
Karakterisasi Enzim Ekstrak Kasar. Suhu optimum untuk aktivitas
enzim ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas pada suhu yang
berbeda, yaitu 50°C, 60°C, 70°C, 80°C dan 90°C pada 0,2 M bufer natrium fosfat
pH 7. Penentuan pH optimum untuk aktivitas enzim dilakukan pada suhu
optimum dengan melakukan pengukuran aktivitas enzim pada kisaran pH 5
hingga pH 9 dengan menggunakan bufer natrium asetat 0,2 M untuk pH 5 hingga
pH 6, bufer natrium fosfat 0,2 M untuk pH 6,5 hingga 7,5 dan bufer Tris-HCl
0,2 M untuk pH 8 hingga pH 9.
15
Identifikasi Bakteri. Identifikasi bakteri dilakukan dengan metode PCR
koloni, untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA; 1 koloni tunggal diambil dan
dicampurkan ke dalam 25 μl campuran reaksi PCR GoTaq® Green Master Mix
(Promega). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah
primer universal yang spesifik terhadap domain bakteri (Marchesi et al. 1998)
yaitu primer 63f (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan 1387r (5’GGGCGGAWGTGTACAAGGC-3’). Kondisi PCR adalah pre PCR (94°C, 7
menit), denaturasi (94°C, 30 detik), penempelan (56°C, 30 detik), pemanjangan
(72°C, 1 menit dan 30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7
menit). Hasil PCR diimigrasikan pada gel elektroforesis dengan konsentrasi 1,5 %
pada 80 volt selama 50 menit. Gel direndam dalam larutan 0,5 mg/l larutan
etidium bromida selama 15 menit dan kemudian dalam air selama 10 menit. Gel
kemudian divisualisasi di atas UV transiluminator. Untuk sekuensing, hasil PCR
dimurnikan dengan QIAquick PCR Purification Kit dan selanjutnya disekuensing
dan dibandingkan dengan data sekuen gen 16S rRNA yang terdapat pada
GenBank menggunakan BLASTn (Basic Local Alignment Search Tools for
nucleotida).
Prakiraan Keberadaan Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri
dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit
(Promega). Identifikasi keberadaan gen lipase dilakukan berdasarkan metode Bell
et al. (2002), dengan menggunakan primer OXF1 (5’-CCYGTKGTSYTNG
TNCAYGG-3’), OXF2 (5’-CCRATMRTWYTNGTNCAYGG-3’), OXF3 (5’-CC
KYTWGTKYTNATHCAYGG-3’), ACR1 (5’-AGGCCNCCCAKNGARTGNS
C-3’), ACR2 (5’-AGRCCNCCCAKRCTRTGNSC-3’), ACR3 (5’-AGGCCRCC
NTGNGARTGNSC-3’), ACR4 (5’-AGGCCNCCNTGRCTRTGNSC-3’). Kondi si PCR yang digunakan ialah: segmen 1 (94ºC, 1 detik), segmen 2 (94ºC, 1 menit),
segmen 3 (37ºC, 1 detik), segmen 4 (37ºC, 30 detik), segmen 5 (72ºC, 2 menit dan
20 detik), segmen 6 (72ºC, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari: segmen 1 (95ºC, 1
menit), segmen 2 (50ºC, 1 menit) dan segmen 3 (72ºC, 1 menit).
Isolasi Gen Lipase. Isolasi genom total bakteri dilakukan dengan
menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Gen lipase
diisolasi dengan menggunakan pasangan primer yang dikonstruksi oleh Jiang et al
16
(2010), yaitu pasangan primer degenerate (5’-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG3’ dan 5’-TTAAGGSHSSAARCTYGCCA-3’), primer F1 (5’-GGAATTCCATA
TGATGAAATGCTGCCGGGTGATG-3’), primer F2 (5’-GGAATTCCATATGG
CAGCTTCACGCGCCAAT-3’) dan primer R1 (5’-CGCGGATCCTTAAGGG
TCCAAGCTCGCCAAC-3’).
Kondisi
PCR
untuk
amplifikasi
dengan
menggunakan primer degenerate ialah: segmen 1 (94°C, 1 detik), segmen 2 (94°C,
1 menit), segmen 3 (37°C, 1 detik), segmen 4 (37°C, 30 detik), segmen 5 (72°C, 2
menit dan 20 detik), segmen 6 (72°C, 1 menit), diikuti oleh 35 siklus dari segmen
1 (95°C, 1 menit), segmen 2 (50°C, 1 menit) dan segmen 3 (72°C, 1 menit).
Fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan primer degenerate
digunakan sebagai template untuk amplifikasi dengan menggunakan pasangan
primer F1-R1 dan F2-R1. Kondisi PCR untuk amplifikasi dengan menggunakan
pasangan primer F1-R1 dan F2-R1 ialah pre PCR (94°C, 7 menit), denaturasi
(94°C, 30 detik), penempelan (60°C, 30 detik), pemanjangan (72°C, 1 menit dan
30 detik) sebanyak 34 siklus, diikuti pasca PCR (72°C, 7 menit). Hasil PCR
kemudian diimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan etidium
bromida dan kemudian divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga
disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada
GenBank.
Kloning Gen Lipase. Gen lipase hasil pemurnian diligasikan ke plasmid
pGEM-T Easy (Promega) dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase (New
England Biolab), pada suhu 4°C selama 12 jam, kemudian ditransformasikan ke
E. coli TOP 10 dengan menggunakan metode Sambrook et al. (2001). Seleksi
untuk transforman menggunakan metode seleksi biru/ putih pada media Luria agar
yang diberi antibiotik Ampisilin (100 μg /ml), 0,1 mM IPTG, 80 μg/ml X-Gal
dan diinkubasikan selama 12 jam pada suhu 37°C. Transforman yang membawa
plasmid rekombinan yang tersisipi oleh gen lipase akan membentuk koloni
berwarna putih. Transforman kemudian diverifikasi dengan PCR koloni,
menggunakan primer M13f (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’) dan
M13r (5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’) (Moffett et al. 2000), Hasil
PCR kemudian dimigrasikan pada gel elektroforesis, diberi perlakuan dengan
etidium bromida dan divisualisasi pada UV transiluminator. Hasil PCR juga
17
disekuensing dan dibandingkan dengan data sekuen gen lipase yang terdapat pada
GenBank menggunakan BLASTp (Basic Local Alignment Search Tools for
protein). Aktivitas enzim lipase yang dihasilkan oleh E. coli TOP 10 transforman
diukur pada suhu 80°C dan pH 8,5.
Analisis Filogenetik. Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan
program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Analisis filogenetik untuk 16S rRNA
menggunakan
metode
Neighbour
Joining,
jarak
diperkirakan
dengan
menggunakan metode Kimura two parameters dengan 100 bootstrap replicates.
Analisis filogenetik sekuen asam amino hasil deduksi gen lipase menggunakan
metode Neighbour Joining, jarak diperkirakan dengan metode Poisson dengan
100 bootstrap replicates.
ÎÏÐÑÒ ÓÏÔ ÕÖ×ØÏÎÏÐÏÔ
Isolasi Bakteri Termofilik Penghasil Lipase
Sampel berupa air dan tanah diambil dari mata air panas di pulau Seram,
Maluku (Gambar 4), yang memiliki suhu 89 °C dan pH 6,3. Suhu pertumbuhan
mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu lebih dari 80°C berada pada
kisaran pertumbuhan mikroorganisme yang bersifat hipertermofilik (Stetter 1995).
Gambar 4 Peta pulau Seram yang terletak di Provinsi Maluku.
Tanah yang terdapat pada lokasi mata air tersebut berwarna hitam, tercium
bau belerang dan terdapat daun-daun kering maupun ranting pohon yang gugur
dari pepohonan yang tumbuh di sekitar aliran air dari mata air panas tersebut
(Gambar 5). Lokasi mata air panas terdapat di daerah dataran rendah dan bukan
pada daerah gunung berapi. Menurut Kristjansson dan Hreggvidsson
(1995)
sumber mata air panas yang terdapat di luar zona aktif vulkanik biasanya memiliki
pH yang berkisar pada netral hingga alkalin, air dipanaskan oleh aliran lava yang
20
telah padam atau oleh ruang magma yang telah padam. Suhu air pada kedalaman
500 hingga 3000 meter seringkali di bawah 150°C, air tanah yang dipanaskan
kemudian akan kembali ke permukaan dengan membawa mineral terlarut seperti
silika dan gas terlarut seperti karbondioksida, dan gas H2 S dalam jumlah yang
kecil sehingga oksidasi pada permukaan tidak terlalu mempengaruhi pH.
Gambar 5 Tempat pengambilan sampel dari sumber mata air panas.
Bakteri termofilik penghasil lipase diisolasi dengan menginokulasikan air
dan tanah yang diambil dari sumber mata air panas ke media Basal Salt Solution
(BSM), yang diberi 0,01% ekstrak khamir dan 0,1% minyak zaitun sebagai
sumber karbon satu-satunya untuk pertumbuhan bakteri penghasil enzim lipase.
Pencawanan sampel secara langsung pada media seleksi yang kaya dan
mengandung sumber karbon dalam jumlah banyak akan menyebabkan tumbuhnya
mikroorganisme termofilik nonlipolitik dalam jumlah banyak dan dalam waktu
yang relatif cepat. Bakteri penghasil lipase akan membentuk koloni berwarna
merah jika ditumbuhkan pada media yang mengandung rhodamin B (Gambar 6).
21
Gambar 6 Koloni isolat T I.2 yang ditumbuhkan pada media yang mengandung
rhodamin B.
Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan pembandingan sekuen gen 16S
S
M
rRNA isolat T I.2 terhadap basis data gen 16S rRNA pada GenBank. Amplifikasi
gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r
yang dikonstruksi oleh Marchesi et al. (1998) dan diharapkan menghasilkan
fragmen DNA dengan ukuran sekitar 1324 bp. Amplifikasi gen 16S rRNA dari
isolat T I.2 dengan menggunakan primer universal 63f dan 1387r menghasilkan
fragmen dengan ukuran yang berada pada kisaran 1200 bp hingga 1500 bp
(Gambar 7), yang menunjukkan bahwa gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dapat
teramplifikasi dengan baik. Fragmen gen 16S rRNA hasil amplifikasi kemudian
disekuensing dan diperoleh hasil berupa sekuen fragmen DNA berukuran 540 bp
yang selanjutnya digunakan untuk analisis filogenetik (Lampiran 2). Sekuen
fragmen tersebut dimulai dari basa ke-72 yang terdapat pada ujung
ÙÚ dari sekuen
utuh gen 16S rRNA. Sekuen 500 bp awal dari 16S rRNA diketahui memberikan
cukup perbedaan untuk tujuan identifikasi antar galur karena
memiliki
keragaman yang lebih tinggi untuk tiap kilobasa dari sekuen (Clarridge 2004).
22
S
M
1324 bp
1500 bp
1200 bp
Gambar 7 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari isolat T I.2 dengan menggunakan
primer 63f dan 1387r (S : fragmen gen 16S rRNA Isolat T I.2, M :
Marker 100 bp Vivantis).
Hasil
BLASTn
untuk
pembandingan
terhadap
sekuen
GenBank
menunjukkan homologi hingga 99% terhadap Geobacillus stearothermophilus
Tapo3