Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro
AKTIVITAS ANTIMIKROB KOMBINASI EKSTRAK DAUN HENNA
(Lawsonia inermis L.) DAN RIFAMPISIN TERHADAP
Mycobacterium tuberculosis SECARA IN VITRO
AMAR MUSLIM
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antimikrob
Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dan Rifampisin terhadap
Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2014
Amar Muslim
NIM G84090019
ABSTRAK
AMAR MUSLIM. Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna
(Lawsonia inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis
secara In Vitro. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan SITI SA’DIAH.
Lawsonia inermis L. yang dikenal dengan nama henna adalah tanaman obat
yang banyak digunakan dalam mengobati berbagai penyakit, termasuk penyakit
tuberkulosis. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis efektivitas kombinasi
ekstrak daun henna dalam membunuh M. tuberculosis dengan menentukan
Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM) ekstrak daun henna terhadap M.
tuberculosis. Serbuk daun kering dimaserasi dengan etanol 96% kemudian
dievaporasi untuk mendapatkan ekstrak pekat. Ekstrak, larutan antibiotik
rifampisin, dan suspensi M. tuberculosis dihomogenkan kemudian diinokulasikan
pada media Ogawa dengan konsentrasi 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm,
80.000 ppm dan diinkubasi pada suhu 37oC. Setelah dua pekan, diamati
konsentrasi terendah ekstrak dan kombinasi ekstrak antibiotik yang dapat
membunuh M. tuberculosis. Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi minimum
ekstrak daun henna yang efektif dalam membunuh M. tuberculosis adalah sebesar
20.000 ppm. Sedangkan konsentrasi minimum kombinasi ekstrak daun henna dan
rifampisin 4.000 ppm adalah kurang dari 10.000 ppm, sehingga kombinasi ekstrak
daun henna dengan rifampisin terbukti lebih efektif dalam membunuh M.
tuberculosis dibandingkan dengan perlakuan ekstrak.
Kata kunci: Tuberkulosis, daun henna, M. tuberculosis, media Ogawa, KHM
ABSTRACT
AMAR MUSLIM. Antimicrobial Activity of Henna’s Leaves Extract (Lawsonia
inermis L.) and Rifampicin Combination against Mycobacterium tuberculosis by
In Vitro. Supervised by SYAMSUL FALAH and SITI SA’DIAH.
Lawsonia inermis L. known as henna in Indonesia is widely used as herbal
medicinal plant to treat various diseases, including tuberculose. The objective of
this research is to analyze combination of henna leaves extract activity against M.
tuberculosis by evaluate the mininum inhibitory concentration (MIC). Dry leaves
were macerated by using ethanol 96%. Then, the leaves went through filtration
and evaporation process to gain concentrated extract. The extract was mixed with
M. tuberculosis suspension and antibiotic solution at concentration of 10.000
ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm, 80.000 ppm and incubated 37oC. After two weeks
the MIC of leaves extract and combination extract and antibiotic that inhibit the
growth of M. tuberculosis was observed. The result showed MIC of henna leaves
extract is 20.000 ppm, while MIC henna leaves extract and rifampicin 4.000 ppm
less than 10.000 ppm. Combination of henna leaves extract and rifampisin
treatment is more effective than extract treatment to kill M.tuberculosis.
Keywords: Henna leaves, M.tuberculose, MIC, Ogawa media, Tuberculosis
AKTIVITAS ANTIMIKROB KOMBINASI EKSTRAK DAUN HENNA
(Lawsonia inermis L.) DAN RIFAMPISIN TERHADAP
Mycobacterium tuberculosis SECARA IN VITRO
AMAR MUSLIM
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia
inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis
secara In Vitro
Nama
: Amar Muslim
NIM
: G84090019
Disetujui oleh
Siti Sa’diah, M.Si, Apt
Pembimbing II
Dr Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Pembimbing I
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi : Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia
inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis
secara In Vitro
: Amar Muslim
Nama
: G84090019
N1M
Disetujui oleh
Dr Syamsui Falah, S.Hu , M.Si
Pembimbing I
Siti Sa diah M.Si A t
Pembimbing IT
.Sc
Ketua Departemen
TanggalLulus:
23 JAN 201 4
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas kesempatan yang
telah diberikan untuk mempelajari sebagian kecil dari ilmu-Nya, atas segala
rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi
ini dengan baik. Penulis memilih judul Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak
Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dan Antibiotik Rifampisin terhadap
Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si.
selaku pembimbing utama dan Siti Sa’diah, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua,
yang telah memberikan ilmu, bimbingan serta kritik kepada penulis. Disamping
itu, penghargaan penulis sampaikan kepada drh. Rahmat Setya Adji, M.Si, Rumah
Sakit Paru Dr. M. Goenawan Partowidigdo Cisarua Bogor yang telah memberikan
isolat Mycobacterium tuberculosis dan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
(Dikti) yang telah mendanai penelitian ini dalam Program Kreativitas Mahasiswa
Penelitian (PKMP) yang berjudul Optimalisasi Aktivitas Tuberkulostatik Ekstrak
Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dengan Variasi Konsentrasi dan Antibiotik
untuk Menghambat Pertumbuhan M. tuberculosis secara In Vitro. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada keluarga, teman satu tim PKMP, Satriaji
Hartamto, star5, dan teman-teman Biokimia angkatan 46 yang telah memberikan
dukungan moril dan materil.
Penulis menyadari bahwa sebagai manusia penulis tidak luput dari
kesalahan dan kekurangan dalam penulisan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini
dapat bermanfaat bagi semua pihak serta berguna untuk kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Januari 2014
Amar Muslim
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL
4
Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Henna
4
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
4
Efektivitas Penghambatan Mycobacterium tuberculosis seluruh Perlakuan
5
PEMBAHASAN
6
Karakteristik Simplisia
6
Rendemen Ekstrak Daun Henna
7
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
8
Aktivitas Penghambatan M. tuberculosis
8
SIMPULAN
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR GAMBAR
1 Daun henna
2 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis. (a). Kontrol positif rifampisin (b).
Kontrol negatif DMSO
3 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada media Ogawa yang
mengandung ekstrak daun henna
4 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada 4 varian konsentrasi ekstrak
yang masing-masing ditambahkan rifampisin 4.000 ppm
4
5
5
6
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji fitokimia ekstrak daun henna (Lawsonia inermis L.)
2 Hasil determinasi tanaman henna
14
15
PENDAHULUAN
Penyakit tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyakit berbahaya di
dunia. Sampai saat ini belum ada satu negara pun yang terbebas dari TB. Insidensi
TB meningkat secara drastis pada dekade terakhir ini di seluruh dunia termasuk di
Indonesia. Badan kesehatan dunia (WHO) pada tahun 2009 menyatakan jumlah
penderita TB di Indonesia sekitar 429 ribu orang. Lima negara dengan jumlah
kasus terbesar pada tahun 2009 adalah India, Cina, Afrika selatan, Nigeria dan
Indonesia (WHO 2010).
Penyakit TB disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. Bakteri
ini berbentuk batang, bersifat tahan asam, non motil, obligat aerob, dan dapat
hidup dalam rongga paru-paru yang kaya akan oksigen. Mycobacterium
tuberculosis tidak tahan panas, akan mati pada suhu 60oC selama 15 – 20 menit.
Biakan M. tuberculosis akan mati jika terkena sinar matahari langsung selama dua
jam. Bakteri ini dapat bertahan di dalam dahak selama 20-30 jam. Basil dalam
percikan bahan dapat bertahan hidup selama 8-10 hari. Biakan basil ini pada suhu
kamar dapat hidup 6-8 bulan dan dapat disimpan dalam lemari pendingin pada
suhu -20oC selama dua tahun (Elgert 1996; Roitt 1991).
Faktor-faktor yang mempengaruhi tingginya kasus TB di Indonesia adalah
waktu pengobatan TB yang relatif lama (6 – 8 bulan) menjadi penyebab penderita
TB sulit sembuh karena pasien TB berhenti berobat (drop) setelah merasa sehat.
Selain itu, masalah TB diperberat dengan munculnya permasalahan TB-MDR
(Multi Drugs Resistant = kebal terhadap bermacam obat). Masalah lain adalah
penggunaan lebih dari satu macam obat menyebabkan penderita malas untuk
memakan obat sehingga memperbesar peluang meningkatnya kasus TB (WHO
2010).
Tuberkulosis dapat diobati secara total menggunakan obat lini pertama
meliputi isoniazid, rifampisin, etambutol, streptomisin, dan pirazinamid selama 68 bulan (Ganiswara et al. 1995). Salah satu sumber obat TB lain yang potensial
adalah tanaman obat tradisional. Tanaman obat yang berkhasiat sebagai obat
antituberkulosis adalah daun henna (Lawsonia inermis L.) (Sharma 1990).
Senyawa metabolit sekunder 2-hydroxy-1:4-napthoquinone (Lawson) pada henna
kemungkinan berkontribusi terhadap aktivitas antituberkulosis tersebut (Habbal et
al. 2007). Selain itu, L. inermis L. memiliki khasiat sebagai antibakteri, antiiritan,
antioksidan, antikarsinogenik, antiinflamasi.
Berdasarkan informasi tersebut, daun henna memiliki potensi yang sangat
besar dalam bidang farmakologi terutama sebagai obat anti tuberkulosis yang
sampai saat ini masih sangat dibutuhkan. Pemilihan kombinasi ekstrak daun
henna dan rifampisin diharapkan dapat mengurangi jumlah antibiotik yang
digunakan untuk pengobatan TB yang terbukti memiliki efek negatif terhadap
fungsi hati dan ginjal.
Penelitian ini bertujuan menganalisis efektivitas kombinasi ekstrak daun
henna (Lawsonia inermis) dalam membunuh M. tuberculosis dengan menentukan
konsentrasi hambatan minimum, sehingga diharapkan dapat mempercepat
penyembuhan penyakit tuberkulosis. Selain itu, penelitian ini diharapkan dapat
dijadikan dasar untuk pengembangan daun henna sebagai produk herbal
fitofarmaka dan memberikan nilai tambah terhadap komoditas tanaman henna.
2
METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun henna (Lawsonia
inermis L.) dalam bentuk sediaan simplisia yang diperoleh dari Balai Penelitian
Tanaman Obat dan Rempah, Bogor, dan telah dideterminasi di Herbarium
Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Bahan lainnya adalah alkohol 96%, akuades, bahan kimia untuk penapisan
fitokimia, parafin, antibiotik rifampisin produksi Armoxindo Farma Cipanas
Cianjur, isolat Mycobacterium tuberculosis sensitif obat anti tuberkulosis (OAT)
yang diperoleh dari Rumah Sakit Paru Dr. M. Goenawan Partowidigdo Cisarua
Bogor, potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), standar McFarland 3, 7H9
broth, monosodium glutamat, gliserol, Malachite Green 2%, NaCl fisiologis, dan
telur ayam.
Alat-alat yang digunakan adalah alat–alat gelas, shaker, penguap putar,
neraca analitik, autoklaf, oven, corong pemisah, tabung Eppendorf 1.5 mL, lemari
pendingin, rak miring, glass homogenizer, grinder, mixer, penangas air, laminar
airflow, jarum ose, lampu bunen, sentrifuse, vortex, kapas steril, kertas saring,
cawan porselin, desikator.
Prosedur Analisis Data
Ekstraksi Daun Henna
Daun henna dicuci bersih kemudian ditiriskan lalu dikeringkan dengan
oven suhu 40oC hingga kering selama 48 jam. Setelah kering sampel dihaluskan
dengan saringan ukuran 80 mesh hingga menjadi serbuk halus dan ditentukan
kadar airnya dengan metode gravimetri. Simplisia daun henna kemudian
diekstraksi dengan teknik maserasi menggunakan pelarut etanol 96% selama 3 x
24 jam dengan bantuan shaker kecepatan 150 rpm. Ekstrak etanol daun henna
selanjutnya dikeringkan dengan penguap putar pada suhu 50 oC hingga menjadi
ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh ditentukan rendemennya dan
kandungan fitokimianya secara kualitatif. Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk
tahap selanjutnya.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun henna
yang dibuat 4 konsentrasi yaitu 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm, 80.000
dalam pelarut DMSO 20.000 ppm. Selain itu, dibuat juga 4 perlakuan kombinasi
ekstrak dengan konsentrasi yang sama (10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm,
80.000 ppm) tapi masing-masing ditambahkan rifampisin 4.000 ppm dalam
pelarut DMSO 20.000 ppm dengan perbandingan volume ekstrak dan rifampisin
sebesar 1:1.
Media Ogawa
Pembuatan media Ogawa dibuat mengacu pada metode Aditama dan Erna
(2002) modifikasi. Sebanyak 3 g monosodium glutamat dan 3 g KH2PO4
dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer 500 mL yang berisi 300 mL akuades,
kemudian diaduk hingga homogen lalu dipanaskan di atas penangas air pada suhu
3
100oC selama 30 menit, setelah itu didinginkan. Sebanyak 12-16 butir telur ayam
segar yang telah direndam dalam alkohol 95% selama 10 menit dipecah satu per
satu kemudian dikocok dengan mixer lalu disaring dan dituangkan ke dalam labu
Erlenmeyer. Selanjutnya ditambahkan 18 mL gliserol dan 18 mL Malachite green
2%. Setelah dihomogenkan, bahan ditempatkan ke dalam tabung reaksi masingmasing sebanyak 6 mL, setelah itu tabung reaksi ditempatkan di atas penangas air
(diuapkan dengan suhu 90oC selama 1 jam) dalam posisi miring hingga menjadi
sediaan padat yang siap untuk digunakan.
Larutan Stok Bakteri
Larutan stok bakteri dibuat mengacu pada metode Murray et al. (2007)
modifikasi. Perbanyakan kultur bakteri M. tuberculosis dilakukan dengan cara
penyegaran kultur bakteri sebanyak 1 ose ke dalam media cair 7H9 broth 5 mL,
kemudian diagitasi kuat menggunakan vortex sampai homogen dan diinkubasi
selama 7 hari. Setelah 7 hari, dilakukan pengukuran konsentrasi suspensi bakteri
M. tuberculosis sensitif OAT dengan konsentrasi standar 3 McFarland (setara
dengan 9x108 CFU/mL). Penyetaraan konsentrasi bakteri dilakukan dengan
menambahkan 7H9 broth sedikit demi sedikit pada media yang berisi bakteri M.
tuberculosis sampai tingkat kekeruhan suspensi bakteri sama dengan kekeruhan
standar McFarland 3.
Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Henna dan Antibiotik terhadap Bakteri
M. tuberculosis
Uji efektivitas kombinasi ekstrak dan antibiotik mengacu pada metode
Fatimah (2009) modifikasi. Pengujian ini dilakukan terhadap 10 perlakuan.
Perlakuan 1-4 adalah ekstrak konsentrasi 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm,
80.000 ppm sebanyak 250 µ l, perlakuan 5-8 adalah 250 µ l ekstrak konsentrasi
10.000, 20.000, 40.000, 80.000 yang masing-masing ditambahkan rifampisin
4.000 ppm. Perlakuan 9 adalah kontrol positif rifampisin 4.000 ppm sebanyak 250
µ l, dan perlakuan 10 adalah kontrol negatif DMSO 20.000 ppm sebanyak 250 µ l.
Masing-masing perlakuan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1.5 mL,
lalu diinokulasikan M. tuberculosis yang sudah disetarakan dengan McFarland 3
sebanyak 250 µl pada setiap perlakuan. Campuran diagitasi kuat menggunakan
vortex selama 3 menit, lalu diinkubasi selama 7 hari pada suhu 37 oC. Setelah hari
ke-7 perlakuan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pelet
yang diperoleh dipisahkan dari supernatan lalu dicampurkan dengan NaCl
fisiologis sebanyak 100 µl. Pelet dan NaCl fisiologis kemudian diinokulasikan
dengan teknik penggoresan di atas permukaan media ogawa dan diinkubasi
selama 14 hari pada suhu 37oC. Pada hari ke-14 diamati ada tidaknya
pertumbuhan M. tuberculosis. Pertumbuhan (-) menyatakan perlakuan efektif
sebagai antimikobakteri, pertumbuhan (+) menyatakan perlakuan tidak efektif
sebagai antimikobakteri.
4
HASIL
Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Henna
Karakteristik daun henna segar berwarna hijau tua (Gambar 1a). Setelah
dilakukan pengeringan menggunakan oven suhu 40oC selama 48 jam, daun henna
menjadi berwarna hijau kecoklatan dengan tekstur sangat kering, lebih gelap, dan
tampak keriput (Gambar 1b). Penghalusan dilakukan untuk membuat daun kering
menjadi serbuk simplisia. Serbuk yang didapat berwarna hijau kecoklatan dan
bertekstur halus (Gambar 1c). Simplisia daun henna memiliki rata-rata kadar air
sebesar 3.64%. Ekstrak etanol daun henna kental diperoleh dengan cara maserasi,
lalu dipekatkan dengan penguap putar menghasilkan ekstrak berwarna hijau tua
pekat menyerupai pasta (Gambar 1d). Nilai rendemen ekstrak etanol daun henna
sebesar 18.62%.
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
Hasil penapisan fitokimia secara kualitatif terhadap ekstrak menunjukkan
bahwa ekstrak etanol daun henna mengandung alkaloid, flavonoid, tanin, dan
fenol. Uji triterpenoid dan saponin menunjukkan hasil negatif artinya tanaman
henna tidak mengandung metabolit sekunder golongan terpenoid, seperti tampak
pada Tabel 1.
a
b
c
d
Gambar 1 Daun henna. (a) Daun basah, (b) Daun kering, (c) Serbuk, dan (d)
Ekstrak kental
Tabel 1Analisis fitokimia (kualitatif) ekstrak daun henna
Parameter fitokimia
Saponin
Alkaloid
Polifenol
Triterpenoid
Tanin
Flavonoid
Hasil
+
+
+
+
5
Efektivitas Penghambatan Mycobacterium tuberculosis Seluruh Perlakuan
Bakteri M. tuberculosis tidak tumbuh pada kontrol positif rifampisin. Hal
tersebut ditandai dengan tidak terbentuknya warna kuning pada permukaan media
Ogawa (Gambar 2a). Hal ini membuktikan bahwa isolat M. tuberculosis di dalam
penelitian ini sangat sensitif terhadap rifampisin. Pada kontrol negatif DMSO
terlihat adanya M. tuberculosis melapisi hampir seluruh permukaan media,
ditandai dengan terbentuknya lapisan kuning, bertekstur kasar, dan kering
(Gambar 2b). Pertumbuhan M. tuberculosis pada perlakuan DMSO menandakan
bahwa DMSO sebagai pelarut ekstrak dan antibiotik tidak berpotensi untuk
membunuh M. tuberculosis.
Ekstrak dengan konsentrasi 10.000 ppm tampak adanya lapisan kuning di
atas permukaan media yang menunjukkan adanya aktivitas pertumbuhan M.
tuberculosis (Gambar 3a), sedangkan pada ekstrak konsentrasi 20.000 ppm,
40.000 ppm, dan 80.000 ppm lapisan tidak ditemukan (Gambar 3b, 3c, dan 3d)
sehingga terbukti efektif dalam membunuh M. tuberculosis. Kombinasi ekstrak
daun henna dan rifampisin 4.000 ppm mulai dari konsentrasi 10.000 ppm hingga
80.000 ppm dapat membunuh M. tuberculosis (Gambar 4). Hal ini ditunjukan
dengan tidak adanya lapisan kuning yang terlihat di atas permukaan media. Hal
tersebut membuktikan semua konsentrasi kombinasi ekstrak daun henna dengan
rifampisin terbukti efektif dalam membunuh M. tuberculosis.
a
Gambar 2
b
Pertumbuhan pelet M. tuberculosis. (a). Kontrol positif rifampisin 4.000 ppm
(b). Kontrol negatif DMSO 20.000 ppm
a
b
c
d
Gambar 3 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada media Ogawa yang mengandung
ekstrak daun henna. (a). Konsentrasi 10.000 ppm, (b). Konsentrasi 20.000
ppm, (c). Konsentrasi 40.000 ppm , dan (d). Konsentrasi 80.000 ppm
6
a
Gambar 4
b
c
d
Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada 4 varian konsentrasi ekstrak yang
masing-masing ditambahkan rifampisin 4.000 ppm (a). Konsentrasi 10.000
ppm, (b). Konsentrasi 20.000 ppm, (c). Konsentrasi 40.000 ppm, dan (d).
Konsentrasi 80.000 ppm
PEMBAHASAN
Karakteristik Simplisia
Karakterisasi yang dilakukan terhadap simplisia dan ekstrak etanol daun
tanaman henna (Lawsonia inermis L.) meliputi penetapan kadar air dan penetapan
rendemen. Langkah awal yang harus dilakukan untuk menentukan kadar air
adalah pengeringan sampel. Sampel daun henna dikeringkan untuk mengurangi
kadar air dalam bahan. Kadar air yang rendah (kurang dari 10%) dapat menekan
pertumbuhan mikroorganisme pembusukan. Berbagai metode pengeringan
digunakan untuk berbagai jenis daun yaitu pengeringan dianginkan, pengeringan
oven, serta pengeringan di bawah sinar matahari. Pengeringan dengan sinar
matahari dan oven lebih cepat daripada pengeringan angin. Hal ini disebabkan
suhu pengeringan matahari dan oven lebih tinggi dibandingkan suhu pengeringan
angin (Kadir 1978).
Sampel daun henna dalam penelitian ini dikeringkan menggunakan oven
suhu 40oC. Pengeringan pada suhu 40oC merupakan pengeringan paling optimum
untuk mendapatkan rendemen dan senyawa fenolat tertinggi dibandingkan oven
suhu 60oC, cahaya matahari, dan kering angin suhu kamar (Rivai 2011). Suhu
50oC tidak akan membuat kandungan fitokimia yang terdapat pada daun henna
rusak akibat pemanasan. Kadir (1978) juga menyatakan pengeringan suhu diatas
70oC akan menyebabkan kehilangan kandungan kimia penyusun bahan tersebut.
Pengeringan yang dilakukan selama 48 jam secara terus menerus akan
menghasilkan daun berwarna hijau kecoklatan, lebih kecil, dan tampak keriput
dibandingkan dengan sebelumnya. Hal ini diakibatkan oleh perbedaan kandungan
klorofil antara daun basah dan daun kering setelah pemanasan. Klorofil dalam
daun basah berikatan dengan protein. Setelah pemanasan, protein yang terdapat
pada daun kering terdenaturasi lalu berubah menjadi pheophitin yang
menyebabkan hilangnya warna hijau (Fennema 1985).
Sampel yang telah kering kemudian dihaluskan dan disaring dengan
saringan berukuran 80 mesh. Tujuan dari penghalusan ini untuk meningkatkan
luas permukaan sampel sehingga kontak dengan pelarut pengekstraksi
7
menjadilebih besar dan ekstraksi bisa berlangsung lebih optimal. Sampel daun
henna yang siap untuk diesktraksi memilliki kadar air sebesar 3.64%. Hal ini
sudah sesuai dengan kriteria Badan Pengawas Obat Makanan (POM) (2002).
Rendemen Ekstrak Daun Henna
Hasil perhitungan rendemen ekstrak daun henna dengan teknik maserasi
didapat sebesar 18.62%. Hasil ini lebih tinggi dibandingkan rendemen yang
dihasilkan oleh Jain et al. (2010), ekstrak etanol 70% daun henna dengan teknik
soxhletasi memiliki rendemen sebesar 12.34%. Hal ini membuktikan rendemen
yang didapat dengan metode maserasi sudah cukup baik karena menghasilkan
rendemen yang lebih tinggi. Faktor-faktor yang menyebabkan perbedaan jumlah
rendemen adalah lama waktu ekstraksi, jumlah pelarut, temperatur pada proses
ekstraksi, dan ukuran simplisia (Retno 2000). Rendemen ekstrak dihitung dengan
cara membandingkan jumlah ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal yang
digunakan.
Penetapan rendemen diawali dengan ekstraksi simplisia daun henna.
Metode ekstraksi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah maserasi. Maserasi
merupakan perendaman sampel menggunakan pelarut organik pada temperatur
ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam
karena dengan perendaman akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel
akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel. Metabolit sekunder yang
ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa
akan sempurna. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan
efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam
dalam pelarut tersebut (Ansel 1989).
Pelarut organik yang digunakan di dalam penelitian ini adalah etanol 96%,
pemilihan pelarut etanol 96% karena pelarut tersebut bersifat polar, sebab
umumnya senyawa aktif di dalam tanaman daun henna bersifat polar, selain itu
etanol juga dapat menghambat pertumbuhan kapang, absorbsinya baik,
memerlukan panas yang lebih sedikit untuk pemekatan (penguapan pelarut).
Proses maserasi suatu bahan dipengaruhi oleh lamanya perendaman.
Semakin lama waktu perendaman maka kesempatan untuk penarikan kandungan
fitokimia makin besar sehingga hasilnya juga bertambah sampai titik jenuh larutan.
Adapun lama waktu perendaman sampel yang dipilih dalam penelitian ini adalah
3x24 jam. Kontak antara sampel dan pelarut dapat ditingkatkan apabila dibantu
dengan pengadukan. Pada penelitian ini dilakukan pengadukan dengan
menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm agar kontak antara sampel dan
pelarut semakin sering terjadi, sehingga proses ekstraksi lebih sempurna.
Maserat yang sudah didapat disaring untuk memisahkan residu dan filtrat.
Filtrat yang diperoleh dipisahkan pelarutnya dengan menggunakan penguap putar
(vacum rotary evaporator) pada suhu 50°C. Pemilihan suhu 50oC diharapkan agar
kandungan metabolit sekunder pada daun henna tidak terdenaturasi dengan
perlakuan panas yang terlalu tinggi. Ekstrak etanol daun henna yang didapat
berwarna hijau tua seperti daun basah dan simplisia. Hal tersebut menunjukkan
masih adanya klorofil dalam ekstrak daun henna. Konsentrasi klorofil yang tinggi
diakibatkan oleh pelarut etanol 96% menarik kandungan klorofil dalam daun
(Shadmani et al. 2004). Ekstrak etanol 96% daun henna kemudian dilarutkan
dalam DMSO 20.000 ppm. DMSO merupakan komponen organosulfur yang
8
berfungsi sebagai pelarut senyawa polar dan non polar. Pemilihan DMSO 20.000
ppm sebagai pelarut ekstrak karena DMSO tidak akan membunuh M. tuberculosis
(Grange dan Snell 1996).
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
Penapisan fitokimia dilakukan pada ekstrak daun henna mengandung
senyawa alkaloid, polifenol, flavonoid, dan tanin. Senyawa tannin, flavonoid dan
fenolik merupakan golongan senyawa polifenol bersifat antibakteri yang
diharapkan bisa membunuh bakteri M. tuberculosis. Pada penelitian yang
dilakukan Zubardiah (2006), ekstrak etanol 30% daun henna yang berasal dari
Depok memiliki kandungan fitokimia berupa tanin, alkaloid, dan saponin.
Perbedaan kandungan fitokimia diduga karena perbedaan pemilihan konsentrasi
pelarut dan lokasi asal daun henna. Etanol 96% terbukti lebih banyak menarik
kandungan fitokimia pada daun henna dibandingkan dengan etanol 30%.
Faktor-faktor yang menyebabkan perbedaan kandungan metabolit
sekunder ekstrak daun henna dipengaruhi oleh kesuburan tanah tempat tumbuh
(kandungan zat hara), ketinggian tanah, faktor fisik lingkungan (iklim, cahaya,
kelembaban), waktu panen, faktor stress lingkungan (logam berat, sinar uv,
elicitor), umur tanaman, dan gen (Heldt 2005).
Uji fitokimia merupakan pemeriksaan kimia secara kualitatif terhadap
senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak. Metabolit sekunder
adalah senyawa metabolit yang tidak esensial bagi pertumbuhan organisme dan
ditemukan dalam bentuk yang unik atau berbeda-beda antara spesies yang satu
dan lainnya. Metabolit sekunder berfungsi untuk mempertahankan diri dari
kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, misalnya untuk mengatasi hama
dan penyakit, menarik polinator, dan sebagai molekul sinyal. Senyawa ini
diklasifikasikan menjadi 3 kelompok utama, yaitu terpenoid (sebagian besar
senyawa ini mengandung karbon dan hidrogen), fenilpropanoid (senyawa ini
terbuat dari gula sederhana dan memiliki cincin benzen), dan alkaloid (senyawa
yang mengandung nitrogen) (Hanson 2011).
Aktivitas Penghambatan M. tuberculosis
Kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin dapat menghambat
pertumbuhan M. tuberculosis pada konsentrasi 10.000 ppm, sedangkan ekstrak
daun henna sebesar 20.000 ppm. Hal tersebut menunjukkan daya hambat
perlakuan kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin lebih tinggi dibandingkan
dengan perlakuan ekstrak saja. Namun jika mengacu uji efektivitas pada kontrol
positif rifampisin, KHM kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin belum bisa
ditentukan. Hal tersebut karena rifampisin masih bisa membunuh M. tuberculosis
sehingga khasiat dari ekstraknya sendiri tidak terlihat. Proses penghambatan M.
tuberculosis oleh rifampisin mengindikasikan isolat M. tuberculosis di dalam
penelitian ini sangat sensitif terhadap rifampisin. Oleh sebab itu perlu dilakukan
pengujian lebih lanjut dengan konsentrasi rifampisin yang paling rendah yang
dapat menumbuhkan M. tuberculosis atau pengujian dilakukan pada konsentrasi
yang sama pada bakteri yang resistan OAT.
Pada penelitian Shari (2008), ekstrak n-heksan daun ketepeng cina (Senna
alata) memiliki nilai KHM lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol daun
henna, yakni sebesar 30.000 ppm. Dengan demikian, ekstrak etanol daun henna
9
terbukti lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan M. tuberculosis. Ekstrak
daun henna dapat membunuh M. tuberculosis diduga karena adanya pengaruh
metabolit sekunder berupa 2-hydroxy-1,4-napthoquinone (Lawson). Efek
fitofarmaka dari Lawson telah dideskripsikan sebagai anti inflamasi, bakterisidal,
fungisidal, virusidal, tripanosidal, anti Plasmodium falciparum, anti malaria, anti
Schistosoma mansoni, anti kanker, dan anti M. tuberculosis (Habbal et al. 2007).
ekstrak etanol dan air pada daun henna menunjukkan efek analgesik, antipiretik,
dan efek anti inflamasi pada tikus percobaan (Ali et al. 1995).
Mekanisme kerja Lawson dalam membunuh M. tuberculosis dengan cara
menghambat girase DNA bakteri. Enzim girase merupakan enzim yang mutlak
diperlukan dalam proses replikasi bakteri M. tuberculosis. Enzim ini bekerja pada
perubahan struktur DNA dari bakteri, yaitu perubahan dari struktur double helix
menjadi super coil. Pada proses tersebut enzim girase berikatan dengan DNA dan
memotong salah satu rantai DNA dan kemudian menyambung kembali. Lawson
memiliki kemampuan untuk berikatan dengan komplek girase DNA. Hal tersebut
mengakibatkan bakteri akan mati (Shantanu et al. 2012).
Pemilihan media pertumbuhan merupakan salah satu kriteria yang sangat
penting untuk uji efektivitas antibakteri. Media pertumbuhan M. tuberculosis yang
digunakan dalam penelitian ini adalah media Ogawa. Media Ogawa adalah media
berbasis telur yang saat ini banyak digunakan di beberapa laboratorium negara
berkembang untuk pemeriksaan spesimen dari pasien TB dengan efikasi setara
dengan media standar Lowenstein Jensen (Ang et al. 2001; Hasegawa et al. 2002).
Metode lain untuk uji efektivitas antibakteri adalah dengan mengukur masa sel
bakteri menggunakan spektrofotometer (turbidimetri). Keuntungan menggunakan
spektrofotometer adalah kepekaan lebih tinggi dan tidak membutuhkan waktu
yang lama. Namun karena bakteri yang digunakan sangat patogen, uji efektivitas
menggunakan spektrofotometer tidak bisa digunakan karena faktor keamanan
laboratorium.
Masa inkubasi M. tuberculosis pada media Ogawa relatif lebih lama
dibandingkan dengan masa inkubasi bakteri lainnya, yakni selama 14 hari. Hal
tersebut karena aktivitas metabolik M. tuberculosis sangat rendah apabila
dibandingkan dengan bakteri lainnya. Menurut Jindal (2011) Mycobacterium
tuberculosis membelah diri setiap 15 sampai 20 jam, berbeda dengan bakteri lain
seperti Escherichia coli membelah setiap 20 menit.
Penggunaan kombinasi OAT rifampisin dengan obat lini pertama lainnya
seperti etambutol, isoniazid, pirazinamid, dan streptomisin (lini pertama) biasa
digunakan untuk pengobatan penyakit TB yang disebabkan oleh bakteri M.
tuberculosis. Antibiotik yang digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian
ini adalah OAT dosis tunggal rifampisin. Mekanisme kerja dari rifampisin dalam
membunuh M.tuberculosis adalah dengan cara memblok sintesis mRNA dan
menghambat RNA polymerase dari M. tuberculosis sehingga bakteri akan mati
(Zhang dan Yew 2009).
Pemilihan dosis tunggal OAT yang dikombinasikan dengan ekstrak daun
henna diharapkan dapat mengurangi jumlah OAT yang digunakan untuk
pengobatan TB yang terbukti memiliki efek negatif terhadap fungsi hati dan ginjal.
Selain itu rifampisin dan ekstrak daun henna mempunyai penghambatan yang
berbeda terhadap M. tuberculosis, diharapkan akan lebih ampuh dalam membunuh
M. tuberculosis (Zhang dan Yew 2009; Shantanu et al. 2012).
10
SIMPULAN
Konsentrasi minimum ekstrak daun henna yang efektif dalam membunuh
kuman M. tuberculosis adalah sebesar 20.000 ppm. Sedangkan konsentrasi
minimum kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin 4.000 ppm adalah kurang
dari 10.000 ppm, sehingga kombinasi ekstrak daun henna dengan rifampisin
terbukti lebih efektif dalam membunuh M. tuberculosis dibandingkan dengan
perlakuan ekstrak saja.
DAFTAR PUSTAKA
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2002. Petunjuk Operasional
Cara Pengolahan Obat yang Baik. Jakarta (ID): Badan POM.
[WHO] World Health Organization. 2010. Global tuberculosis control 2010.
Geneva (CH) : WHO.
Aditama TY, Erna L. 2002. Buku Petunjuk Teknik Pemeriksaan Laboratorium
Tuberkulosis ed ke-3. Jakarta (ID) : Laboratorium Bakteriologi RS.
Persahabatan.
Ali BH, Bashir, Taniram, 1995. Anti-inflammatory, antipyretic and analgesic
effects of Lawsonia inermis L. (henna) in rats. J. Pharmacology. 51: 356363.
Ang CF et al. 2001. Isolation rates of Mycobacterium tuberculosis from smear
negative and smear positive sputum specimen using the Ogawa culture
technique and the standar Löwenstein-Jensen culture technique. Phil J
Microbiol Infect Disc. 30:37-39.
Ansel. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta (ID) : UI press.
Davidson PM, Hover. 1993. Antimicrobial Component from Lactic Acid Bacteria.
New York (US): Marcel Dekker Inc.
Elgert KD. 1996. Immunology: Understanding the immune system. New York
(US): Wiley Liss Inc.
Fatimah. 2009. Uji aktivitas antituberkulosis ekstrak daun picisan (Drymoglossum
piloselloides .L) dibandingkan dengan rifampisin dan etambutol terhadap
bakteri Mycobacterium tuberculosis. J Kultura. 10:1.
Fennema OR. 1985. Principles of Food Science. New York (US): Marcel Dekker
Ganiswara et al. 1995. Farmakologi dan Terapi. Jakarta (ID): FK UI.
Grange JM, Snell NJC. 1996. Activity of bromohexine and ambroxol semi
synthetic development of vacisine from the indian shurb Adhatoda vasica
against Mycobacterium Tuberculosis in Vitro. J Ethnopharmacol. 50:4953
Habbal OA, Jabri AA, Hag. 2007. Antimicrobial properties of Lawsonia inermis
L. (Henna) (review). J Medical Herbalism. 19:3.
Hanson JR. 2011. Natural Products: The Secondary Metabolites. London (GB):
University of Sussex.
Hasegawa N, Miura T, Ishizaka A, Yamaguchi K, Ishii K. 2002. Detection of
mycobacteria in patients with pulmonary tuberculosis undergoing
chemoteraphy using MGIT and egg-based solid medium culture systems. J
Tuberc Lung Dis. 6:447-453.
11
Heldt H. 2005. Plant Biochemistry Third Edition. San Diego (US): Elsevier
Academic Press Inc.
Jain et al. 2010. Antioxidant and antimicrobial acvtivities of Bryophyllum
Calycinum leaf. J Pharmacology. 1: 393-405
Jindal. 2011. Textbook of pulmonary and critical care medicine. New Delhi (IN):
Jaypee Brothers Medical Publishers.
Kadir K. 1978. Pengeringan Alami Beberapa Jenis Kayu Indonesia. Bogor (ID):
Lembaga Penelitian Hasil Hutan.
Murray, Baron, Jorgensen, Pfaller, Yolken. 2007. Manual of Clinical
Microbiology 8th Ed. Washington (US) : American Society of Clinical
Microbiology.
Retno U. 2000. Pengaruh jumlah pelarut, suhu, dan waktu ekstraksi terhadap
rendemen dan mutu cairan kulit biji mete [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Rivai H. 2011. Asas Pemeriksaan Kimia. Depok (ID): UI Press.
Roitt IM. 1991. Essential Imnnunology. Oxford (GB) : Blackwell Scientific
Publications.
Shadmani, Azhar I, Mazhar F, Hassan MM, Ahmed SW, Ahmad I, Usmanghani K,
Shamin S. 2004. Kinetic studies on Zingiber Officinale. Pakistan Juounal
Pharm Sciences. 17:47-54.
Shari R. 2008. Efek ekstrak daun ketepeng cina (Senna alata) dan bunga tahi
ayam (Lantana camara) terhadap pertumbuhan Mycobacterium
tuberculosis [tesis]. Makasar (ID): Universitas Hasanuddin.
Shantanu K, Terence THC, Frederic C, Lesley A, Mitchennall, Adam RM, Sandra
JG, Jacobus JMM, Namrita L, Anthony M. 2012. The napthoquinone
diospyrin is an inhibitor of DNA gyrase with a novel mechanism of action.
J Biol Chem. 288(7):5149-5156.
Sharma VK. 1990. Tuberculostatic activity of henna (Lawsonia inermis L.).
Tubercle. 71(4):293-5.
Zhang Y, Yew WW. 2009. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium
tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13(11):1320-1330
Zubardiah L. 2006. Efek antibakteri daun Lawsonia inermis L. terhadap
Actinobacillus actinomycetemcomitans secara in vitro. J Kedokteran Gigi.
21(2): 47-53.
Zubardiah, Nurul DM, Auerkari EI. 2008. Khasiat Daun Lawsonia inermis L..
Sebagai Obat Tradisional Antibakteri. Surabaya (ID): Perhimpunan Dokter
Gigi Indonesia.
12
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil uji fitokimia ekstrak daun henna (Lawsonia inermis L.)
Hasil
Uji Fitokimia
Gambar
+
Flavonoid
Saponin
-
Alkaloid
+
Polifenol dan Tanin
-
Triterpenoid
+
13
Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman henna
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 16 Februari 1991 dari ayah Asep
Saepudin dan ibu Sariningsih. Penulis merupakan putra bungsu dari tiga
bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Cianjur dan pada tahun
yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB. Penulis diterima di Program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti program S1 di IPB
penulis pernah bergabung dengan organisasi Paduan Suara Mahasiswa IPB Agria
Swara, Forum for Scientific Studies (FORCES) dan Paguyuban Mojang Jajaka
Kota Bogor. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah
Biokimia Klinis di Departemen Biologi FMIPA IPB. Pada tahun 2012 penulis
melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Biokimia Balai Besar Biogen
Penulis merupakan penerima beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa pada
tahun 2010-2013. Memenangkan hibah dana bersaing dari DIKTI dalam Program
Kreativitas Mahasiswa Penelitian (PKMP) dengan judul Ameliorasi Sel Hati
Akibat Sindrom Metabolik melalui Terapi Herbal pada Tikus (Rattus novergicus)
dengan Pemanfaatan Limbah Kulit Kayu Mahoni (Swietenia macrophylla King
(2012), Optimalisasi Aktivitas Tuberkulostatik Ekstrak Daun Henna (Lawsonia
inermis L.) dengan Variasi Konsentrasi dan Antibiotik untuk Menghambat
Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro (2013) dan Program
Kreatifitas Mahasiswa Kewirausahaan (PKMK) dengan judul Diferensiasi dan
Komersialisasi Produk Pewarna dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia
mangostana L) (2010), 10 besar ON Biologi regional IPB, penulis juga mendapat
undangan untuk acara Konferensi Internasional Pelajar Indonesia di Brisbane
Australia (2012) dan “The First Annual International Scholars Conference” di
Taiwan (2013), Prestasi penulis dalam dunia tarik suara adalah Juara 2 Lomba
Paduan Suara Nasional Lagu Perjuangan ke-4 Universitas Tarumanegara (2011)
dan finalis region Jakarta Suara Indonesia Trans TV (2010). Selain itu, penulis
pernah menjadi ketua konser angkatan konser angkatan PSM IPB Agria Swara,
ketua pembinaan PSM IPB Agria Swara, ketua panitia lapang konser tahunan
PSM IPB Agria swara, dan pernah mengikuti konser tahunan PSM IPB Agria
Swara di kedutaan besar Belanda Erasmus Huis. Di dalam dunia pageant penulis
mendapat prestasi top 6 Mojang Jajaka Kota Bogor (2013).
(Lawsonia inermis L.) DAN RIFAMPISIN TERHADAP
Mycobacterium tuberculosis SECARA IN VITRO
AMAR MUSLIM
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antimikrob
Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dan Rifampisin terhadap
Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2014
Amar Muslim
NIM G84090019
ABSTRAK
AMAR MUSLIM. Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna
(Lawsonia inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis
secara In Vitro. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan SITI SA’DIAH.
Lawsonia inermis L. yang dikenal dengan nama henna adalah tanaman obat
yang banyak digunakan dalam mengobati berbagai penyakit, termasuk penyakit
tuberkulosis. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis efektivitas kombinasi
ekstrak daun henna dalam membunuh M. tuberculosis dengan menentukan
Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM) ekstrak daun henna terhadap M.
tuberculosis. Serbuk daun kering dimaserasi dengan etanol 96% kemudian
dievaporasi untuk mendapatkan ekstrak pekat. Ekstrak, larutan antibiotik
rifampisin, dan suspensi M. tuberculosis dihomogenkan kemudian diinokulasikan
pada media Ogawa dengan konsentrasi 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm,
80.000 ppm dan diinkubasi pada suhu 37oC. Setelah dua pekan, diamati
konsentrasi terendah ekstrak dan kombinasi ekstrak antibiotik yang dapat
membunuh M. tuberculosis. Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi minimum
ekstrak daun henna yang efektif dalam membunuh M. tuberculosis adalah sebesar
20.000 ppm. Sedangkan konsentrasi minimum kombinasi ekstrak daun henna dan
rifampisin 4.000 ppm adalah kurang dari 10.000 ppm, sehingga kombinasi ekstrak
daun henna dengan rifampisin terbukti lebih efektif dalam membunuh M.
tuberculosis dibandingkan dengan perlakuan ekstrak.
Kata kunci: Tuberkulosis, daun henna, M. tuberculosis, media Ogawa, KHM
ABSTRACT
AMAR MUSLIM. Antimicrobial Activity of Henna’s Leaves Extract (Lawsonia
inermis L.) and Rifampicin Combination against Mycobacterium tuberculosis by
In Vitro. Supervised by SYAMSUL FALAH and SITI SA’DIAH.
Lawsonia inermis L. known as henna in Indonesia is widely used as herbal
medicinal plant to treat various diseases, including tuberculose. The objective of
this research is to analyze combination of henna leaves extract activity against M.
tuberculosis by evaluate the mininum inhibitory concentration (MIC). Dry leaves
were macerated by using ethanol 96%. Then, the leaves went through filtration
and evaporation process to gain concentrated extract. The extract was mixed with
M. tuberculosis suspension and antibiotic solution at concentration of 10.000
ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm, 80.000 ppm and incubated 37oC. After two weeks
the MIC of leaves extract and combination extract and antibiotic that inhibit the
growth of M. tuberculosis was observed. The result showed MIC of henna leaves
extract is 20.000 ppm, while MIC henna leaves extract and rifampicin 4.000 ppm
less than 10.000 ppm. Combination of henna leaves extract and rifampisin
treatment is more effective than extract treatment to kill M.tuberculosis.
Keywords: Henna leaves, M.tuberculose, MIC, Ogawa media, Tuberculosis
AKTIVITAS ANTIMIKROB KOMBINASI EKSTRAK DAUN HENNA
(Lawsonia inermis L.) DAN RIFAMPISIN TERHADAP
Mycobacterium tuberculosis SECARA IN VITRO
AMAR MUSLIM
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia
inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis
secara In Vitro
Nama
: Amar Muslim
NIM
: G84090019
Disetujui oleh
Siti Sa’diah, M.Si, Apt
Pembimbing II
Dr Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Pembimbing I
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi : Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak Daun Henna (Lawsonia
inermis L.) dan Rifampisin terhadap Mycobacterium tuberculosis
secara In Vitro
: Amar Muslim
Nama
: G84090019
N1M
Disetujui oleh
Dr Syamsui Falah, S.Hu , M.Si
Pembimbing I
Siti Sa diah M.Si A t
Pembimbing IT
.Sc
Ketua Departemen
TanggalLulus:
23 JAN 201 4
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas kesempatan yang
telah diberikan untuk mempelajari sebagian kecil dari ilmu-Nya, atas segala
rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi
ini dengan baik. Penulis memilih judul Aktivitas Antimikrob Kombinasi Ekstrak
Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dan Antibiotik Rifampisin terhadap
Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si.
selaku pembimbing utama dan Siti Sa’diah, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua,
yang telah memberikan ilmu, bimbingan serta kritik kepada penulis. Disamping
itu, penghargaan penulis sampaikan kepada drh. Rahmat Setya Adji, M.Si, Rumah
Sakit Paru Dr. M. Goenawan Partowidigdo Cisarua Bogor yang telah memberikan
isolat Mycobacterium tuberculosis dan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
(Dikti) yang telah mendanai penelitian ini dalam Program Kreativitas Mahasiswa
Penelitian (PKMP) yang berjudul Optimalisasi Aktivitas Tuberkulostatik Ekstrak
Daun Henna (Lawsonia inermis L.) dengan Variasi Konsentrasi dan Antibiotik
untuk Menghambat Pertumbuhan M. tuberculosis secara In Vitro. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada keluarga, teman satu tim PKMP, Satriaji
Hartamto, star5, dan teman-teman Biokimia angkatan 46 yang telah memberikan
dukungan moril dan materil.
Penulis menyadari bahwa sebagai manusia penulis tidak luput dari
kesalahan dan kekurangan dalam penulisan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini
dapat bermanfaat bagi semua pihak serta berguna untuk kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Januari 2014
Amar Muslim
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL
4
Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Henna
4
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
4
Efektivitas Penghambatan Mycobacterium tuberculosis seluruh Perlakuan
5
PEMBAHASAN
6
Karakteristik Simplisia
6
Rendemen Ekstrak Daun Henna
7
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
8
Aktivitas Penghambatan M. tuberculosis
8
SIMPULAN
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR GAMBAR
1 Daun henna
2 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis. (a). Kontrol positif rifampisin (b).
Kontrol negatif DMSO
3 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada media Ogawa yang
mengandung ekstrak daun henna
4 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada 4 varian konsentrasi ekstrak
yang masing-masing ditambahkan rifampisin 4.000 ppm
4
5
5
6
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji fitokimia ekstrak daun henna (Lawsonia inermis L.)
2 Hasil determinasi tanaman henna
14
15
PENDAHULUAN
Penyakit tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyakit berbahaya di
dunia. Sampai saat ini belum ada satu negara pun yang terbebas dari TB. Insidensi
TB meningkat secara drastis pada dekade terakhir ini di seluruh dunia termasuk di
Indonesia. Badan kesehatan dunia (WHO) pada tahun 2009 menyatakan jumlah
penderita TB di Indonesia sekitar 429 ribu orang. Lima negara dengan jumlah
kasus terbesar pada tahun 2009 adalah India, Cina, Afrika selatan, Nigeria dan
Indonesia (WHO 2010).
Penyakit TB disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. Bakteri
ini berbentuk batang, bersifat tahan asam, non motil, obligat aerob, dan dapat
hidup dalam rongga paru-paru yang kaya akan oksigen. Mycobacterium
tuberculosis tidak tahan panas, akan mati pada suhu 60oC selama 15 – 20 menit.
Biakan M. tuberculosis akan mati jika terkena sinar matahari langsung selama dua
jam. Bakteri ini dapat bertahan di dalam dahak selama 20-30 jam. Basil dalam
percikan bahan dapat bertahan hidup selama 8-10 hari. Biakan basil ini pada suhu
kamar dapat hidup 6-8 bulan dan dapat disimpan dalam lemari pendingin pada
suhu -20oC selama dua tahun (Elgert 1996; Roitt 1991).
Faktor-faktor yang mempengaruhi tingginya kasus TB di Indonesia adalah
waktu pengobatan TB yang relatif lama (6 – 8 bulan) menjadi penyebab penderita
TB sulit sembuh karena pasien TB berhenti berobat (drop) setelah merasa sehat.
Selain itu, masalah TB diperberat dengan munculnya permasalahan TB-MDR
(Multi Drugs Resistant = kebal terhadap bermacam obat). Masalah lain adalah
penggunaan lebih dari satu macam obat menyebabkan penderita malas untuk
memakan obat sehingga memperbesar peluang meningkatnya kasus TB (WHO
2010).
Tuberkulosis dapat diobati secara total menggunakan obat lini pertama
meliputi isoniazid, rifampisin, etambutol, streptomisin, dan pirazinamid selama 68 bulan (Ganiswara et al. 1995). Salah satu sumber obat TB lain yang potensial
adalah tanaman obat tradisional. Tanaman obat yang berkhasiat sebagai obat
antituberkulosis adalah daun henna (Lawsonia inermis L.) (Sharma 1990).
Senyawa metabolit sekunder 2-hydroxy-1:4-napthoquinone (Lawson) pada henna
kemungkinan berkontribusi terhadap aktivitas antituberkulosis tersebut (Habbal et
al. 2007). Selain itu, L. inermis L. memiliki khasiat sebagai antibakteri, antiiritan,
antioksidan, antikarsinogenik, antiinflamasi.
Berdasarkan informasi tersebut, daun henna memiliki potensi yang sangat
besar dalam bidang farmakologi terutama sebagai obat anti tuberkulosis yang
sampai saat ini masih sangat dibutuhkan. Pemilihan kombinasi ekstrak daun
henna dan rifampisin diharapkan dapat mengurangi jumlah antibiotik yang
digunakan untuk pengobatan TB yang terbukti memiliki efek negatif terhadap
fungsi hati dan ginjal.
Penelitian ini bertujuan menganalisis efektivitas kombinasi ekstrak daun
henna (Lawsonia inermis) dalam membunuh M. tuberculosis dengan menentukan
konsentrasi hambatan minimum, sehingga diharapkan dapat mempercepat
penyembuhan penyakit tuberkulosis. Selain itu, penelitian ini diharapkan dapat
dijadikan dasar untuk pengembangan daun henna sebagai produk herbal
fitofarmaka dan memberikan nilai tambah terhadap komoditas tanaman henna.
2
METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun henna (Lawsonia
inermis L.) dalam bentuk sediaan simplisia yang diperoleh dari Balai Penelitian
Tanaman Obat dan Rempah, Bogor, dan telah dideterminasi di Herbarium
Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Bahan lainnya adalah alkohol 96%, akuades, bahan kimia untuk penapisan
fitokimia, parafin, antibiotik rifampisin produksi Armoxindo Farma Cipanas
Cianjur, isolat Mycobacterium tuberculosis sensitif obat anti tuberkulosis (OAT)
yang diperoleh dari Rumah Sakit Paru Dr. M. Goenawan Partowidigdo Cisarua
Bogor, potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), standar McFarland 3, 7H9
broth, monosodium glutamat, gliserol, Malachite Green 2%, NaCl fisiologis, dan
telur ayam.
Alat-alat yang digunakan adalah alat–alat gelas, shaker, penguap putar,
neraca analitik, autoklaf, oven, corong pemisah, tabung Eppendorf 1.5 mL, lemari
pendingin, rak miring, glass homogenizer, grinder, mixer, penangas air, laminar
airflow, jarum ose, lampu bunen, sentrifuse, vortex, kapas steril, kertas saring,
cawan porselin, desikator.
Prosedur Analisis Data
Ekstraksi Daun Henna
Daun henna dicuci bersih kemudian ditiriskan lalu dikeringkan dengan
oven suhu 40oC hingga kering selama 48 jam. Setelah kering sampel dihaluskan
dengan saringan ukuran 80 mesh hingga menjadi serbuk halus dan ditentukan
kadar airnya dengan metode gravimetri. Simplisia daun henna kemudian
diekstraksi dengan teknik maserasi menggunakan pelarut etanol 96% selama 3 x
24 jam dengan bantuan shaker kecepatan 150 rpm. Ekstrak etanol daun henna
selanjutnya dikeringkan dengan penguap putar pada suhu 50 oC hingga menjadi
ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh ditentukan rendemennya dan
kandungan fitokimianya secara kualitatif. Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk
tahap selanjutnya.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun henna
yang dibuat 4 konsentrasi yaitu 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm, 80.000
dalam pelarut DMSO 20.000 ppm. Selain itu, dibuat juga 4 perlakuan kombinasi
ekstrak dengan konsentrasi yang sama (10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm,
80.000 ppm) tapi masing-masing ditambahkan rifampisin 4.000 ppm dalam
pelarut DMSO 20.000 ppm dengan perbandingan volume ekstrak dan rifampisin
sebesar 1:1.
Media Ogawa
Pembuatan media Ogawa dibuat mengacu pada metode Aditama dan Erna
(2002) modifikasi. Sebanyak 3 g monosodium glutamat dan 3 g KH2PO4
dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer 500 mL yang berisi 300 mL akuades,
kemudian diaduk hingga homogen lalu dipanaskan di atas penangas air pada suhu
3
100oC selama 30 menit, setelah itu didinginkan. Sebanyak 12-16 butir telur ayam
segar yang telah direndam dalam alkohol 95% selama 10 menit dipecah satu per
satu kemudian dikocok dengan mixer lalu disaring dan dituangkan ke dalam labu
Erlenmeyer. Selanjutnya ditambahkan 18 mL gliserol dan 18 mL Malachite green
2%. Setelah dihomogenkan, bahan ditempatkan ke dalam tabung reaksi masingmasing sebanyak 6 mL, setelah itu tabung reaksi ditempatkan di atas penangas air
(diuapkan dengan suhu 90oC selama 1 jam) dalam posisi miring hingga menjadi
sediaan padat yang siap untuk digunakan.
Larutan Stok Bakteri
Larutan stok bakteri dibuat mengacu pada metode Murray et al. (2007)
modifikasi. Perbanyakan kultur bakteri M. tuberculosis dilakukan dengan cara
penyegaran kultur bakteri sebanyak 1 ose ke dalam media cair 7H9 broth 5 mL,
kemudian diagitasi kuat menggunakan vortex sampai homogen dan diinkubasi
selama 7 hari. Setelah 7 hari, dilakukan pengukuran konsentrasi suspensi bakteri
M. tuberculosis sensitif OAT dengan konsentrasi standar 3 McFarland (setara
dengan 9x108 CFU/mL). Penyetaraan konsentrasi bakteri dilakukan dengan
menambahkan 7H9 broth sedikit demi sedikit pada media yang berisi bakteri M.
tuberculosis sampai tingkat kekeruhan suspensi bakteri sama dengan kekeruhan
standar McFarland 3.
Pengujian Efektivitas Ekstrak Daun Henna dan Antibiotik terhadap Bakteri
M. tuberculosis
Uji efektivitas kombinasi ekstrak dan antibiotik mengacu pada metode
Fatimah (2009) modifikasi. Pengujian ini dilakukan terhadap 10 perlakuan.
Perlakuan 1-4 adalah ekstrak konsentrasi 10.000 ppm, 20.000 ppm, 40.000 ppm,
80.000 ppm sebanyak 250 µ l, perlakuan 5-8 adalah 250 µ l ekstrak konsentrasi
10.000, 20.000, 40.000, 80.000 yang masing-masing ditambahkan rifampisin
4.000 ppm. Perlakuan 9 adalah kontrol positif rifampisin 4.000 ppm sebanyak 250
µ l, dan perlakuan 10 adalah kontrol negatif DMSO 20.000 ppm sebanyak 250 µ l.
Masing-masing perlakuan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1.5 mL,
lalu diinokulasikan M. tuberculosis yang sudah disetarakan dengan McFarland 3
sebanyak 250 µl pada setiap perlakuan. Campuran diagitasi kuat menggunakan
vortex selama 3 menit, lalu diinkubasi selama 7 hari pada suhu 37 oC. Setelah hari
ke-7 perlakuan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pelet
yang diperoleh dipisahkan dari supernatan lalu dicampurkan dengan NaCl
fisiologis sebanyak 100 µl. Pelet dan NaCl fisiologis kemudian diinokulasikan
dengan teknik penggoresan di atas permukaan media ogawa dan diinkubasi
selama 14 hari pada suhu 37oC. Pada hari ke-14 diamati ada tidaknya
pertumbuhan M. tuberculosis. Pertumbuhan (-) menyatakan perlakuan efektif
sebagai antimikobakteri, pertumbuhan (+) menyatakan perlakuan tidak efektif
sebagai antimikobakteri.
4
HASIL
Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Henna
Karakteristik daun henna segar berwarna hijau tua (Gambar 1a). Setelah
dilakukan pengeringan menggunakan oven suhu 40oC selama 48 jam, daun henna
menjadi berwarna hijau kecoklatan dengan tekstur sangat kering, lebih gelap, dan
tampak keriput (Gambar 1b). Penghalusan dilakukan untuk membuat daun kering
menjadi serbuk simplisia. Serbuk yang didapat berwarna hijau kecoklatan dan
bertekstur halus (Gambar 1c). Simplisia daun henna memiliki rata-rata kadar air
sebesar 3.64%. Ekstrak etanol daun henna kental diperoleh dengan cara maserasi,
lalu dipekatkan dengan penguap putar menghasilkan ekstrak berwarna hijau tua
pekat menyerupai pasta (Gambar 1d). Nilai rendemen ekstrak etanol daun henna
sebesar 18.62%.
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
Hasil penapisan fitokimia secara kualitatif terhadap ekstrak menunjukkan
bahwa ekstrak etanol daun henna mengandung alkaloid, flavonoid, tanin, dan
fenol. Uji triterpenoid dan saponin menunjukkan hasil negatif artinya tanaman
henna tidak mengandung metabolit sekunder golongan terpenoid, seperti tampak
pada Tabel 1.
a
b
c
d
Gambar 1 Daun henna. (a) Daun basah, (b) Daun kering, (c) Serbuk, dan (d)
Ekstrak kental
Tabel 1Analisis fitokimia (kualitatif) ekstrak daun henna
Parameter fitokimia
Saponin
Alkaloid
Polifenol
Triterpenoid
Tanin
Flavonoid
Hasil
+
+
+
+
5
Efektivitas Penghambatan Mycobacterium tuberculosis Seluruh Perlakuan
Bakteri M. tuberculosis tidak tumbuh pada kontrol positif rifampisin. Hal
tersebut ditandai dengan tidak terbentuknya warna kuning pada permukaan media
Ogawa (Gambar 2a). Hal ini membuktikan bahwa isolat M. tuberculosis di dalam
penelitian ini sangat sensitif terhadap rifampisin. Pada kontrol negatif DMSO
terlihat adanya M. tuberculosis melapisi hampir seluruh permukaan media,
ditandai dengan terbentuknya lapisan kuning, bertekstur kasar, dan kering
(Gambar 2b). Pertumbuhan M. tuberculosis pada perlakuan DMSO menandakan
bahwa DMSO sebagai pelarut ekstrak dan antibiotik tidak berpotensi untuk
membunuh M. tuberculosis.
Ekstrak dengan konsentrasi 10.000 ppm tampak adanya lapisan kuning di
atas permukaan media yang menunjukkan adanya aktivitas pertumbuhan M.
tuberculosis (Gambar 3a), sedangkan pada ekstrak konsentrasi 20.000 ppm,
40.000 ppm, dan 80.000 ppm lapisan tidak ditemukan (Gambar 3b, 3c, dan 3d)
sehingga terbukti efektif dalam membunuh M. tuberculosis. Kombinasi ekstrak
daun henna dan rifampisin 4.000 ppm mulai dari konsentrasi 10.000 ppm hingga
80.000 ppm dapat membunuh M. tuberculosis (Gambar 4). Hal ini ditunjukan
dengan tidak adanya lapisan kuning yang terlihat di atas permukaan media. Hal
tersebut membuktikan semua konsentrasi kombinasi ekstrak daun henna dengan
rifampisin terbukti efektif dalam membunuh M. tuberculosis.
a
Gambar 2
b
Pertumbuhan pelet M. tuberculosis. (a). Kontrol positif rifampisin 4.000 ppm
(b). Kontrol negatif DMSO 20.000 ppm
a
b
c
d
Gambar 3 Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada media Ogawa yang mengandung
ekstrak daun henna. (a). Konsentrasi 10.000 ppm, (b). Konsentrasi 20.000
ppm, (c). Konsentrasi 40.000 ppm , dan (d). Konsentrasi 80.000 ppm
6
a
Gambar 4
b
c
d
Pertumbuhan pelet M. tuberculosis pada 4 varian konsentrasi ekstrak yang
masing-masing ditambahkan rifampisin 4.000 ppm (a). Konsentrasi 10.000
ppm, (b). Konsentrasi 20.000 ppm, (c). Konsentrasi 40.000 ppm, dan (d).
Konsentrasi 80.000 ppm
PEMBAHASAN
Karakteristik Simplisia
Karakterisasi yang dilakukan terhadap simplisia dan ekstrak etanol daun
tanaman henna (Lawsonia inermis L.) meliputi penetapan kadar air dan penetapan
rendemen. Langkah awal yang harus dilakukan untuk menentukan kadar air
adalah pengeringan sampel. Sampel daun henna dikeringkan untuk mengurangi
kadar air dalam bahan. Kadar air yang rendah (kurang dari 10%) dapat menekan
pertumbuhan mikroorganisme pembusukan. Berbagai metode pengeringan
digunakan untuk berbagai jenis daun yaitu pengeringan dianginkan, pengeringan
oven, serta pengeringan di bawah sinar matahari. Pengeringan dengan sinar
matahari dan oven lebih cepat daripada pengeringan angin. Hal ini disebabkan
suhu pengeringan matahari dan oven lebih tinggi dibandingkan suhu pengeringan
angin (Kadir 1978).
Sampel daun henna dalam penelitian ini dikeringkan menggunakan oven
suhu 40oC. Pengeringan pada suhu 40oC merupakan pengeringan paling optimum
untuk mendapatkan rendemen dan senyawa fenolat tertinggi dibandingkan oven
suhu 60oC, cahaya matahari, dan kering angin suhu kamar (Rivai 2011). Suhu
50oC tidak akan membuat kandungan fitokimia yang terdapat pada daun henna
rusak akibat pemanasan. Kadir (1978) juga menyatakan pengeringan suhu diatas
70oC akan menyebabkan kehilangan kandungan kimia penyusun bahan tersebut.
Pengeringan yang dilakukan selama 48 jam secara terus menerus akan
menghasilkan daun berwarna hijau kecoklatan, lebih kecil, dan tampak keriput
dibandingkan dengan sebelumnya. Hal ini diakibatkan oleh perbedaan kandungan
klorofil antara daun basah dan daun kering setelah pemanasan. Klorofil dalam
daun basah berikatan dengan protein. Setelah pemanasan, protein yang terdapat
pada daun kering terdenaturasi lalu berubah menjadi pheophitin yang
menyebabkan hilangnya warna hijau (Fennema 1985).
Sampel yang telah kering kemudian dihaluskan dan disaring dengan
saringan berukuran 80 mesh. Tujuan dari penghalusan ini untuk meningkatkan
luas permukaan sampel sehingga kontak dengan pelarut pengekstraksi
7
menjadilebih besar dan ekstraksi bisa berlangsung lebih optimal. Sampel daun
henna yang siap untuk diesktraksi memilliki kadar air sebesar 3.64%. Hal ini
sudah sesuai dengan kriteria Badan Pengawas Obat Makanan (POM) (2002).
Rendemen Ekstrak Daun Henna
Hasil perhitungan rendemen ekstrak daun henna dengan teknik maserasi
didapat sebesar 18.62%. Hasil ini lebih tinggi dibandingkan rendemen yang
dihasilkan oleh Jain et al. (2010), ekstrak etanol 70% daun henna dengan teknik
soxhletasi memiliki rendemen sebesar 12.34%. Hal ini membuktikan rendemen
yang didapat dengan metode maserasi sudah cukup baik karena menghasilkan
rendemen yang lebih tinggi. Faktor-faktor yang menyebabkan perbedaan jumlah
rendemen adalah lama waktu ekstraksi, jumlah pelarut, temperatur pada proses
ekstraksi, dan ukuran simplisia (Retno 2000). Rendemen ekstrak dihitung dengan
cara membandingkan jumlah ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal yang
digunakan.
Penetapan rendemen diawali dengan ekstraksi simplisia daun henna.
Metode ekstraksi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah maserasi. Maserasi
merupakan perendaman sampel menggunakan pelarut organik pada temperatur
ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam
karena dengan perendaman akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel
akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel. Metabolit sekunder yang
ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa
akan sempurna. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan
efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam
dalam pelarut tersebut (Ansel 1989).
Pelarut organik yang digunakan di dalam penelitian ini adalah etanol 96%,
pemilihan pelarut etanol 96% karena pelarut tersebut bersifat polar, sebab
umumnya senyawa aktif di dalam tanaman daun henna bersifat polar, selain itu
etanol juga dapat menghambat pertumbuhan kapang, absorbsinya baik,
memerlukan panas yang lebih sedikit untuk pemekatan (penguapan pelarut).
Proses maserasi suatu bahan dipengaruhi oleh lamanya perendaman.
Semakin lama waktu perendaman maka kesempatan untuk penarikan kandungan
fitokimia makin besar sehingga hasilnya juga bertambah sampai titik jenuh larutan.
Adapun lama waktu perendaman sampel yang dipilih dalam penelitian ini adalah
3x24 jam. Kontak antara sampel dan pelarut dapat ditingkatkan apabila dibantu
dengan pengadukan. Pada penelitian ini dilakukan pengadukan dengan
menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm agar kontak antara sampel dan
pelarut semakin sering terjadi, sehingga proses ekstraksi lebih sempurna.
Maserat yang sudah didapat disaring untuk memisahkan residu dan filtrat.
Filtrat yang diperoleh dipisahkan pelarutnya dengan menggunakan penguap putar
(vacum rotary evaporator) pada suhu 50°C. Pemilihan suhu 50oC diharapkan agar
kandungan metabolit sekunder pada daun henna tidak terdenaturasi dengan
perlakuan panas yang terlalu tinggi. Ekstrak etanol daun henna yang didapat
berwarna hijau tua seperti daun basah dan simplisia. Hal tersebut menunjukkan
masih adanya klorofil dalam ekstrak daun henna. Konsentrasi klorofil yang tinggi
diakibatkan oleh pelarut etanol 96% menarik kandungan klorofil dalam daun
(Shadmani et al. 2004). Ekstrak etanol 96% daun henna kemudian dilarutkan
dalam DMSO 20.000 ppm. DMSO merupakan komponen organosulfur yang
8
berfungsi sebagai pelarut senyawa polar dan non polar. Pemilihan DMSO 20.000
ppm sebagai pelarut ekstrak karena DMSO tidak akan membunuh M. tuberculosis
(Grange dan Snell 1996).
Fitokimia Ekstrak Daun Henna
Penapisan fitokimia dilakukan pada ekstrak daun henna mengandung
senyawa alkaloid, polifenol, flavonoid, dan tanin. Senyawa tannin, flavonoid dan
fenolik merupakan golongan senyawa polifenol bersifat antibakteri yang
diharapkan bisa membunuh bakteri M. tuberculosis. Pada penelitian yang
dilakukan Zubardiah (2006), ekstrak etanol 30% daun henna yang berasal dari
Depok memiliki kandungan fitokimia berupa tanin, alkaloid, dan saponin.
Perbedaan kandungan fitokimia diduga karena perbedaan pemilihan konsentrasi
pelarut dan lokasi asal daun henna. Etanol 96% terbukti lebih banyak menarik
kandungan fitokimia pada daun henna dibandingkan dengan etanol 30%.
Faktor-faktor yang menyebabkan perbedaan kandungan metabolit
sekunder ekstrak daun henna dipengaruhi oleh kesuburan tanah tempat tumbuh
(kandungan zat hara), ketinggian tanah, faktor fisik lingkungan (iklim, cahaya,
kelembaban), waktu panen, faktor stress lingkungan (logam berat, sinar uv,
elicitor), umur tanaman, dan gen (Heldt 2005).
Uji fitokimia merupakan pemeriksaan kimia secara kualitatif terhadap
senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak. Metabolit sekunder
adalah senyawa metabolit yang tidak esensial bagi pertumbuhan organisme dan
ditemukan dalam bentuk yang unik atau berbeda-beda antara spesies yang satu
dan lainnya. Metabolit sekunder berfungsi untuk mempertahankan diri dari
kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, misalnya untuk mengatasi hama
dan penyakit, menarik polinator, dan sebagai molekul sinyal. Senyawa ini
diklasifikasikan menjadi 3 kelompok utama, yaitu terpenoid (sebagian besar
senyawa ini mengandung karbon dan hidrogen), fenilpropanoid (senyawa ini
terbuat dari gula sederhana dan memiliki cincin benzen), dan alkaloid (senyawa
yang mengandung nitrogen) (Hanson 2011).
Aktivitas Penghambatan M. tuberculosis
Kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin dapat menghambat
pertumbuhan M. tuberculosis pada konsentrasi 10.000 ppm, sedangkan ekstrak
daun henna sebesar 20.000 ppm. Hal tersebut menunjukkan daya hambat
perlakuan kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin lebih tinggi dibandingkan
dengan perlakuan ekstrak saja. Namun jika mengacu uji efektivitas pada kontrol
positif rifampisin, KHM kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin belum bisa
ditentukan. Hal tersebut karena rifampisin masih bisa membunuh M. tuberculosis
sehingga khasiat dari ekstraknya sendiri tidak terlihat. Proses penghambatan M.
tuberculosis oleh rifampisin mengindikasikan isolat M. tuberculosis di dalam
penelitian ini sangat sensitif terhadap rifampisin. Oleh sebab itu perlu dilakukan
pengujian lebih lanjut dengan konsentrasi rifampisin yang paling rendah yang
dapat menumbuhkan M. tuberculosis atau pengujian dilakukan pada konsentrasi
yang sama pada bakteri yang resistan OAT.
Pada penelitian Shari (2008), ekstrak n-heksan daun ketepeng cina (Senna
alata) memiliki nilai KHM lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol daun
henna, yakni sebesar 30.000 ppm. Dengan demikian, ekstrak etanol daun henna
9
terbukti lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan M. tuberculosis. Ekstrak
daun henna dapat membunuh M. tuberculosis diduga karena adanya pengaruh
metabolit sekunder berupa 2-hydroxy-1,4-napthoquinone (Lawson). Efek
fitofarmaka dari Lawson telah dideskripsikan sebagai anti inflamasi, bakterisidal,
fungisidal, virusidal, tripanosidal, anti Plasmodium falciparum, anti malaria, anti
Schistosoma mansoni, anti kanker, dan anti M. tuberculosis (Habbal et al. 2007).
ekstrak etanol dan air pada daun henna menunjukkan efek analgesik, antipiretik,
dan efek anti inflamasi pada tikus percobaan (Ali et al. 1995).
Mekanisme kerja Lawson dalam membunuh M. tuberculosis dengan cara
menghambat girase DNA bakteri. Enzim girase merupakan enzim yang mutlak
diperlukan dalam proses replikasi bakteri M. tuberculosis. Enzim ini bekerja pada
perubahan struktur DNA dari bakteri, yaitu perubahan dari struktur double helix
menjadi super coil. Pada proses tersebut enzim girase berikatan dengan DNA dan
memotong salah satu rantai DNA dan kemudian menyambung kembali. Lawson
memiliki kemampuan untuk berikatan dengan komplek girase DNA. Hal tersebut
mengakibatkan bakteri akan mati (Shantanu et al. 2012).
Pemilihan media pertumbuhan merupakan salah satu kriteria yang sangat
penting untuk uji efektivitas antibakteri. Media pertumbuhan M. tuberculosis yang
digunakan dalam penelitian ini adalah media Ogawa. Media Ogawa adalah media
berbasis telur yang saat ini banyak digunakan di beberapa laboratorium negara
berkembang untuk pemeriksaan spesimen dari pasien TB dengan efikasi setara
dengan media standar Lowenstein Jensen (Ang et al. 2001; Hasegawa et al. 2002).
Metode lain untuk uji efektivitas antibakteri adalah dengan mengukur masa sel
bakteri menggunakan spektrofotometer (turbidimetri). Keuntungan menggunakan
spektrofotometer adalah kepekaan lebih tinggi dan tidak membutuhkan waktu
yang lama. Namun karena bakteri yang digunakan sangat patogen, uji efektivitas
menggunakan spektrofotometer tidak bisa digunakan karena faktor keamanan
laboratorium.
Masa inkubasi M. tuberculosis pada media Ogawa relatif lebih lama
dibandingkan dengan masa inkubasi bakteri lainnya, yakni selama 14 hari. Hal
tersebut karena aktivitas metabolik M. tuberculosis sangat rendah apabila
dibandingkan dengan bakteri lainnya. Menurut Jindal (2011) Mycobacterium
tuberculosis membelah diri setiap 15 sampai 20 jam, berbeda dengan bakteri lain
seperti Escherichia coli membelah setiap 20 menit.
Penggunaan kombinasi OAT rifampisin dengan obat lini pertama lainnya
seperti etambutol, isoniazid, pirazinamid, dan streptomisin (lini pertama) biasa
digunakan untuk pengobatan penyakit TB yang disebabkan oleh bakteri M.
tuberculosis. Antibiotik yang digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian
ini adalah OAT dosis tunggal rifampisin. Mekanisme kerja dari rifampisin dalam
membunuh M.tuberculosis adalah dengan cara memblok sintesis mRNA dan
menghambat RNA polymerase dari M. tuberculosis sehingga bakteri akan mati
(Zhang dan Yew 2009).
Pemilihan dosis tunggal OAT yang dikombinasikan dengan ekstrak daun
henna diharapkan dapat mengurangi jumlah OAT yang digunakan untuk
pengobatan TB yang terbukti memiliki efek negatif terhadap fungsi hati dan ginjal.
Selain itu rifampisin dan ekstrak daun henna mempunyai penghambatan yang
berbeda terhadap M. tuberculosis, diharapkan akan lebih ampuh dalam membunuh
M. tuberculosis (Zhang dan Yew 2009; Shantanu et al. 2012).
10
SIMPULAN
Konsentrasi minimum ekstrak daun henna yang efektif dalam membunuh
kuman M. tuberculosis adalah sebesar 20.000 ppm. Sedangkan konsentrasi
minimum kombinasi ekstrak daun henna dan rifampisin 4.000 ppm adalah kurang
dari 10.000 ppm, sehingga kombinasi ekstrak daun henna dengan rifampisin
terbukti lebih efektif dalam membunuh M. tuberculosis dibandingkan dengan
perlakuan ekstrak saja.
DAFTAR PUSTAKA
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2002. Petunjuk Operasional
Cara Pengolahan Obat yang Baik. Jakarta (ID): Badan POM.
[WHO] World Health Organization. 2010. Global tuberculosis control 2010.
Geneva (CH) : WHO.
Aditama TY, Erna L. 2002. Buku Petunjuk Teknik Pemeriksaan Laboratorium
Tuberkulosis ed ke-3. Jakarta (ID) : Laboratorium Bakteriologi RS.
Persahabatan.
Ali BH, Bashir, Taniram, 1995. Anti-inflammatory, antipyretic and analgesic
effects of Lawsonia inermis L. (henna) in rats. J. Pharmacology. 51: 356363.
Ang CF et al. 2001. Isolation rates of Mycobacterium tuberculosis from smear
negative and smear positive sputum specimen using the Ogawa culture
technique and the standar Löwenstein-Jensen culture technique. Phil J
Microbiol Infect Disc. 30:37-39.
Ansel. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta (ID) : UI press.
Davidson PM, Hover. 1993. Antimicrobial Component from Lactic Acid Bacteria.
New York (US): Marcel Dekker Inc.
Elgert KD. 1996. Immunology: Understanding the immune system. New York
(US): Wiley Liss Inc.
Fatimah. 2009. Uji aktivitas antituberkulosis ekstrak daun picisan (Drymoglossum
piloselloides .L) dibandingkan dengan rifampisin dan etambutol terhadap
bakteri Mycobacterium tuberculosis. J Kultura. 10:1.
Fennema OR. 1985. Principles of Food Science. New York (US): Marcel Dekker
Ganiswara et al. 1995. Farmakologi dan Terapi. Jakarta (ID): FK UI.
Grange JM, Snell NJC. 1996. Activity of bromohexine and ambroxol semi
synthetic development of vacisine from the indian shurb Adhatoda vasica
against Mycobacterium Tuberculosis in Vitro. J Ethnopharmacol. 50:4953
Habbal OA, Jabri AA, Hag. 2007. Antimicrobial properties of Lawsonia inermis
L. (Henna) (review). J Medical Herbalism. 19:3.
Hanson JR. 2011. Natural Products: The Secondary Metabolites. London (GB):
University of Sussex.
Hasegawa N, Miura T, Ishizaka A, Yamaguchi K, Ishii K. 2002. Detection of
mycobacteria in patients with pulmonary tuberculosis undergoing
chemoteraphy using MGIT and egg-based solid medium culture systems. J
Tuberc Lung Dis. 6:447-453.
11
Heldt H. 2005. Plant Biochemistry Third Edition. San Diego (US): Elsevier
Academic Press Inc.
Jain et al. 2010. Antioxidant and antimicrobial acvtivities of Bryophyllum
Calycinum leaf. J Pharmacology. 1: 393-405
Jindal. 2011. Textbook of pulmonary and critical care medicine. New Delhi (IN):
Jaypee Brothers Medical Publishers.
Kadir K. 1978. Pengeringan Alami Beberapa Jenis Kayu Indonesia. Bogor (ID):
Lembaga Penelitian Hasil Hutan.
Murray, Baron, Jorgensen, Pfaller, Yolken. 2007. Manual of Clinical
Microbiology 8th Ed. Washington (US) : American Society of Clinical
Microbiology.
Retno U. 2000. Pengaruh jumlah pelarut, suhu, dan waktu ekstraksi terhadap
rendemen dan mutu cairan kulit biji mete [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Rivai H. 2011. Asas Pemeriksaan Kimia. Depok (ID): UI Press.
Roitt IM. 1991. Essential Imnnunology. Oxford (GB) : Blackwell Scientific
Publications.
Shadmani, Azhar I, Mazhar F, Hassan MM, Ahmed SW, Ahmad I, Usmanghani K,
Shamin S. 2004. Kinetic studies on Zingiber Officinale. Pakistan Juounal
Pharm Sciences. 17:47-54.
Shari R. 2008. Efek ekstrak daun ketepeng cina (Senna alata) dan bunga tahi
ayam (Lantana camara) terhadap pertumbuhan Mycobacterium
tuberculosis [tesis]. Makasar (ID): Universitas Hasanuddin.
Shantanu K, Terence THC, Frederic C, Lesley A, Mitchennall, Adam RM, Sandra
JG, Jacobus JMM, Namrita L, Anthony M. 2012. The napthoquinone
diospyrin is an inhibitor of DNA gyrase with a novel mechanism of action.
J Biol Chem. 288(7):5149-5156.
Sharma VK. 1990. Tuberculostatic activity of henna (Lawsonia inermis L.).
Tubercle. 71(4):293-5.
Zhang Y, Yew WW. 2009. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium
tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13(11):1320-1330
Zubardiah L. 2006. Efek antibakteri daun Lawsonia inermis L. terhadap
Actinobacillus actinomycetemcomitans secara in vitro. J Kedokteran Gigi.
21(2): 47-53.
Zubardiah, Nurul DM, Auerkari EI. 2008. Khasiat Daun Lawsonia inermis L..
Sebagai Obat Tradisional Antibakteri. Surabaya (ID): Perhimpunan Dokter
Gigi Indonesia.
12
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil uji fitokimia ekstrak daun henna (Lawsonia inermis L.)
Hasil
Uji Fitokimia
Gambar
+
Flavonoid
Saponin
-
Alkaloid
+
Polifenol dan Tanin
-
Triterpenoid
+
13
Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman henna
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 16 Februari 1991 dari ayah Asep
Saepudin dan ibu Sariningsih. Penulis merupakan putra bungsu dari tiga
bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Cianjur dan pada tahun
yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB. Penulis diterima di Program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti program S1 di IPB
penulis pernah bergabung dengan organisasi Paduan Suara Mahasiswa IPB Agria
Swara, Forum for Scientific Studies (FORCES) dan Paguyuban Mojang Jajaka
Kota Bogor. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah
Biokimia Klinis di Departemen Biologi FMIPA IPB. Pada tahun 2012 penulis
melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Biokimia Balai Besar Biogen
Penulis merupakan penerima beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa pada
tahun 2010-2013. Memenangkan hibah dana bersaing dari DIKTI dalam Program
Kreativitas Mahasiswa Penelitian (PKMP) dengan judul Ameliorasi Sel Hati
Akibat Sindrom Metabolik melalui Terapi Herbal pada Tikus (Rattus novergicus)
dengan Pemanfaatan Limbah Kulit Kayu Mahoni (Swietenia macrophylla King
(2012), Optimalisasi Aktivitas Tuberkulostatik Ekstrak Daun Henna (Lawsonia
inermis L.) dengan Variasi Konsentrasi dan Antibiotik untuk Menghambat
Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis secara In Vitro (2013) dan Program
Kreatifitas Mahasiswa Kewirausahaan (PKMK) dengan judul Diferensiasi dan
Komersialisasi Produk Pewarna dari Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia
mangostana L) (2010), 10 besar ON Biologi regional IPB, penulis juga mendapat
undangan untuk acara Konferensi Internasional Pelajar Indonesia di Brisbane
Australia (2012) dan “The First Annual International Scholars Conference” di
Taiwan (2013), Prestasi penulis dalam dunia tarik suara adalah Juara 2 Lomba
Paduan Suara Nasional Lagu Perjuangan ke-4 Universitas Tarumanegara (2011)
dan finalis region Jakarta Suara Indonesia Trans TV (2010). Selain itu, penulis
pernah menjadi ketua konser angkatan konser angkatan PSM IPB Agria Swara,
ketua pembinaan PSM IPB Agria Swara, ketua panitia lapang konser tahunan
PSM IPB Agria swara, dan pernah mengikuti konser tahunan PSM IPB Agria
Swara di kedutaan besar Belanda Erasmus Huis. Di dalam dunia pageant penulis
mendapat prestasi top 6 Mojang Jajaka Kota Bogor (2013).