Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Pelarut Fosfat Dari Daerah Tambang Kapur Palimanan

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PELARUT
FOSFAT DARI DAERAH TAMBANG KAPUR PALIMANAN

EMIL WAHDI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Pelarut Fosfat dari Daerah Tambang Kapur Palimanan adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Januari 2016
Emil Wahdi
NIM P052120371

RINGKASAN
EMIL WAHDI. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Daerah
Tambang Kapur Palimanan. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK
dan RAHAYU WIDYASTUTI.
Tambang batu kapur (limestone) merupakan suatu usaha untuk mendapatkan
bahan baku yang akan digunakan dalam berbagai kebutuhan industri seperti
pabrik semen, keramik, dan kosmetik. Untuk memenuhi kebutuhan akan bahan
baku kapur maka dilakukan penambangan secara terbuka. Ancaman yang dapat
ditimbulkan dari penambangan ini ialah bahaya erosi, perubahan sifat fisik dan
kimia tanah, serta perubahan kualitas air sungai. Selain itu dampak yang paling
mendasar ialah terjadinya perubahan terhadap ekosistem dari daerah tersebut.
Salah satu langkah untuk mempercepat perbaikan lahan tersebut adalah dengan
cara melakukan revegetasi. Kendala yang sering dihadapi ialah tumbuhan pionir
yang ditanam di daerah tersebut tidak mudah mendapatkan unsur hara terutama
fosfat (P). Akar tumbuhan tidak dapat melarutkan unsur P dari batuan kapur.
Untuk itu perlu diberi perlakuan terlebih dahulu dengan cara pemberian bakteri

yang dapat melarutkan unsur fosfat.
Penelitian ini bertujuan untuk: (1) menganalisis kandungan kimia dan
biologi tanah di tempat dilakukan isolasi bakteri di tambang kapur Palimanan PT
Indocement Tunggal Prakarsa, Tbk., (2) mengisolasi bakteri pelarut fosfat dari
lokasi penambangan batu kapur, dan (3) menguji kemampuan dan karakterisasi
bakteri pelarut fosfat terhadap pelarutan fosfat pada tanah asal tambang kapur.
Pada penelitian ini dilakukan pengambilan sampel tanah di lima titik daerah
tambang kapur PT Indocement Tunggal Prakarsa, Tbk berlokasi di daerah
Palimanan Cirebon, Jawa Barat, kemudian dilakukan analisis kimia bahan tanah
dari daerah kapur tersebut. Untuk mendapatkan bakteri pelarut fosfat dilakukan
isolasi dari contoh tanah menggunakan media agar-agar Pikovskaya. Bakteri yang
menghasilkan zona bening menunjukkan aktivitas pelarutan fosfat kemudian
diukur indek pelarutannya. Karakterisasi dan identifikasi bakteri dilakukan dengan
uji biokimia, kit API serta sekuensing 16S rRNA. Hasil karakterisasi dengan uji
biokimia dan kit API kemudian diverifikasi dengan buku Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. Data hasil sekuensing kemudian dibandingkan
dengan data dari Gen Bank dengan metode BLAST server (Basic Local Alignment
Search Tool) dari National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Hasil analisis kimia terhadap kelima sampel tanah menunjukkan semua
sampel memiliki pH basa antara 8.8 – 9.7. Total fosfat yang terkandung didalam

kelima sampel tanah sebesar 1060 - 2390 ppm. Isolasi bakteri didaerah tambang
kapur Palimanan didapatkan 5 isolat bakteri yang terpilih yang dapat melarutkan
fosfat. Satu isolat bakteri merupakan Gram positif berbentuk kokus, empat isolat
bakteri Gram negatif berbentu batang. Kelima isolat bakteri ini dapat melarutkan
fosfat dari bahan Ca3(PO4)2 dengan membentuk zona bening dalam media
Pikovskaya. Indeks pelarutan fosfat (IP) dari 5 isolat yang terpilih antara 0.23 –
1.00. Identifikasi spesies bakteri dengan gen 16S rRNA menunjukkan hasil yaitu
Staphylococcus sp. (QC1A.1), Pseudomonas mosselii (QC5A.1), Pseudomonas
mosselii (QC5B.1),
Pantoea ananatis (QC5C.1), dan
Pseudomonas
oryzihabitans (QC5B.3).

Uji kemampuan pelarutan fosfat pada kelima tanah uji yang berasal dari
daerah tambang kapur yang berbeda menujukkan indeks peningkatan kelarutan
antara 1.63 sampai 3.54. Kemampuan melarutkan fosfat tergantung kepada
spesies bakteri dan jenis tanah yang digunakan. Spesies bakteri ini dapat tumbuh
dan beradaptasi pada suasana basa dan berkapur sehingga dapat dimanfaatkan
untuk proses revegetasi lahan bekas tambang kapur.
Kata kunci: Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, tambang kapur, 16S rRNA

SUMMARY
EMIL WAHDI. Isolation and Characterization of Phosphate Solubilizing
Bacteria from A Limestone Quarry in Palimanan. Supervised by NISA
RACHMANIA MUBARIK and RAHAYU WIDYASTUTI.
Limestone quarry is an efforts of obtaining raw material that will further be
used in various industries; such as cement factory, ceramic, and cosmetic. In order
to fulfill the demand of limestone raw materials, open mining (quarry) was carried
out. Possible threats caused by this mine are the risk of erosion, physical and
chemical changes in the soil, and the change in river water quality. The most basic
impact is a change of ecosystem in the surrounding area. One of the steps to
hasten land improvement is by doing revegetation. The problems often faced in
the activity is that the pioneer plants which planted in the area had difficulty to
obtain nutrients, especially phosphate (P). The root of the plants cannot dissolve P
particles from limestone. Treatment needed to be done by introducing phosphate
dissolving bacteria.
The aims of this research were to (1) analyze the chemical and biological
composition of the soil in Palimanan limestone quarry of PT Indocement Tunggal
Prakarsa, Tbk. where bacteria isolation was conducted, (2) isolate phosphate
solubilizing bacteria from limestone mining location, and (3) test the ability and

characterization of phosphate solubilizing bacteria towards phosphate dissolution
on soil taken from limestone quarry.
In this research soil sampling was done on five points at limestone quarry
area belong to PT Indocement Tunggal Prakarsa, Tbk located in Palimanan
Cirebon, West Java. Chemical soil analysis was then conducted to the soil sample
obtained from the limestone area. In order to obtain phosphate solubilizing
bacteria, isolation was done on sample soil by using Pikovskaya media agar.
Bacteria that produced clear zones showed phosphate solubilization activity
whose dissolution index would then be measured. Bacterial characterization and
identification was conducted by biochemical test, API kit, and 16S rRNA
sequencing. The isolate identification results from biochemical test and API kit
would then be verified based on Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
Sequencing of molecular identification data would be compared with Gen Bank
by BLAST server method (Basic Local Alignment Search Tool) from National
Center for Biotechnology Information (NCBI).
The results of chemical analysis of the 5 soil samples has an alkaline pH
between 8.8 - 9.7. Total phosphate contained in the five soil samples of 1060 2390 ppm. From bacterial isolation in Palimanan limestone quarry area, 5
bacterial isolates that capable to solubilize Ca3(PO4)2 were obtained. One
bacterial isolate was a coccus positive Gram bacteria, while four isolates were
negative Gram rod bacteria. These five bacterial isolates could dissolve unsoluble

phosphate from Ca3(PO4)2 compound by creating clear zones on Pikovskaya
media. The phosphate dissolution index (IP) from the chosen 5 isolates range
between 0.23 – 1.00. Identification 5 bacterial by using 16S rRNA resulted
Staphylococcus sp. (QC1A.1), Pseudomonas mosselii (QC5A.1), Pseudomonas
mosselii (QC5B.1), Pantoea ananatis (QC5C.1), and Pseudomonas oryzihabitans

(QC5B.3). These bacteria were identified by biochemical characteristic test, API
kit, and 16S rRNA analysis.
Tested of phosphate dissolution on 5 samples soil from different limestone
quarry showed that solubilization index value ranged between 1.63 until 3.54. The
ability to dissolve phosphate depended on the species of the bacteria and the type
of soil used. These species could grow and adapt in calcareous and alkaline soil
and thus can be used in the revegetation of former limestone mined land.
Key words: limestone quarry, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, 16S rRNA

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PELARUT
FOSFAT DARI DAERAH TAMBANG KAPUR PALIMANAN

EMIL WAHDI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Pengelolaan Sumberdaya Alam dan Lingkungan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Ir Syaiful Anwar, MSc

gtAZ N][I
Z l:sntnrtuaEuur

SI0Z roqo]{O SZrwt&t

&l

Sr{'?uurusny dece3 rIJO Jnril

f-{ffi).*

W

Iuelv

eueftesecsed rl€lo

uu8uqEql up

e,(upreqrung uuq0Fft{
rpnlg rue6or6ry;l

qslo rru{u}eTrc

eloEEuy

unlo>I

ffiv
Eurqunqued rsrruo)
qelo rnlnlesrg

ILTOZIZ;O{
Ipqe,4[ IIUII
ueuerurled rndu;1 Eueqruel
rleroe(l rrep lBJSoc lruuled Irepleg rs€srroDleff) uep rs€losl

:
:

I^[IN
etueN

:

srsoJ Inpnf

Judul Tesis : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Daerah
Tambang Kapur Palimanan
Nama
: Emil Wahdi
NIM
: P052120371

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Dra Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Ketua

Dr Dra Rahayu Widyastuti, MScAgr
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Pengelolaan Sumberdaya Alam
dan Lingkungan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Ir Cecep Kusmana, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 28 Oktober 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2014 ini ialah Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Daerah Tambang Kapur Palimanan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Dra Nisa Rachmania Mubarik,
MSi dan Ibu Dr Dra Rahayu Widyastuti, MScAgr selaku pembimbing. Disamping
itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Program Diploma Institut Pertanian
Bogor yang telah memberikan kesempatan dan kepercayaan untuk melanjutkan
studi S2 di Program Pascasarjana IPB serta membantu dalam pembiayaan
pendidikan dan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada
PT Indocement Tunggal Prakarsa, Tbk melalui Quarry Life Award Project dan
Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu, dan Keamanan Hasil
Perikanan (BUSKIPM) Departemen Kelautan dan Perikanan, serta Bapak Dr Ir
Condro Utomo, MSc yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada seluruh keluarga, istri
tercinta Haririyah, serta kedua puteri kami Dhaifina dan Kayyisa yang selalu
memberi semangat, doa, dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2016
Emil Wahdi

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian

1
1
2
3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Keberadaan Fosfat di Daerah Bekas Tambang
Mikrob Pelarut Fosfat di Tanah

3
3
7

3 METODE PENELITIAN
Waktu, Tempat Penelitian, dan Lokasi Pengambilan Sampel Tanah
Analisis Kimia Bahan Tanah dari Daerah Kapur
Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat
Karakterisasi Biokimia Bakteri
Analisis Sekuensing Gen 16S rRNA Isolat Bakteri
Uji Kemampuan Pelarutan Fosfat

9
9
10
10
11
11
12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampling dan Analisis Tanah
Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat
Karakterisasi Biokimia Bakteri Pelarut Fosfat
Hasil Analisis Sekuensing Gen 16S rRNA Isolat Bakteri
Penentuan Kemampuan Bakteri Melarutkan Fosfat

13
10
14
16
19
21

5 SIMPULAN

25

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

32

DAFTAR TABEL
1 Lokasi pengambilan contoh tanah daerah tambang kapur Palimanan
Cirebon
2 Kandungan unsur dari contoh tanah di lima lokasi batuan kapur
Palimanan
3 Hasil indeks pelarutan fosfat (IP) dari 5 isolat bakteri terpilih
4 Uji pewarnaan Gram, KOH 3% dan oksidatif/fermentatif (O/F)
5 Uji karakteristik biokimia isolat bakteri
6 Hasil analisis gen 16S rRNA menggunakan program BLAST NCBI
7 Indeks kemampuan pelarutan fosfat oleh bakteri pada contoh tanah (IPF)
8 Indeks kemampuan melarutkan PO4 (IPF) oleh Staphylococcus sp.
QC1A.1
9 Indeks kemampuan melarutkan PO4 (IPF) oleh Pseudomonas mosselii
QC5A.1
10 Indeks kemampuan melarutkan PO4 (IPF) oleh Pseudomonas mosselii
QC5B.1
11 Indeks kemampuan melarutkan PO4 (IPF) oleh Pantoea ananatis
QC5C.1
12 Indeks kemampuan melarutkan PO4 (IPF) oleh Pseudomonas
oryzihabitans QC5B.3

10
14
16
17
18
19
21
22
23
23
24
25

DAFTAR GAMBAR
1 Aliran fosfor (P) di dalam tanah (Sposito 2008)
2 Isolat yang membentuk zona bening pada media Pikovskaya
3 Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA dari kelima isolat
bakteri pelarut fosfat
4 Pohon filogenetik dari 4 isolat bakteri yang dilakukan sekuensing 16S
rRNA

7
15
19
20

DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram uji kemampuan bakteri melarutkan fosfat (Illmer & Schinner
1995)
2 Bahan analisis molobdat-vanadat dan kurva standar

29
30

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tambang batu kapur (limestone) merupakan suatu usaha untuk mendapatkan
bahan baku yang akan digunakan dalam berbagai kebutuhan industri seperti
pabrik semen, keramik, dan kosmetik. Tambang ini termasuk ke dalam kelompok
sumber daya alam nonhayati dan tidak dapat diperbaharui. Bahan tambang ini
juga menjadi sumber pendapatan yang menopang pertumbuhan ekonomi dan
pembangunan di Indonesia.
Wilayah Indonesia sangat kaya dengan daerah pertambangan, baik tambang
mineral maupun non mineral. Semuanya merupakan potensi sumberdaya alam
yang dapat meningkatkan pendapatan dan pembangunan baik masyarakat daerah
maupun pusat. Peningkatan pembangunan sejalan dengan tingginya permintaan
terhadap bahan bangunan seperti semen.
Semen merupakan campuran dari berbagai bahan material yang diaduk dan
dibakar pada suhu tinggi (1450 oC) yang terdiri atas bahan kapur, silika, alumina,
dan besi dan dikenal dengan istilah cement clinker. Bahan utama dari semen ialah
kalsium silikat dan sebagian kecil kalsium aluminat yang jika bereaksi dengan air
akan membentuk beton. Untuk pemenuhan tingginya kebutuhan jumlah kalsium
dalam semen, maka dibutuhkan bahan baku yang mengandung kalsium tinggi
seperti calcium limestone, tanah liat, batuan lumpur, dan serpihan batu yang
banyak mengandung silika dan alumina (British Geological Survey 2005).
Untuk memenuhi kebutuhan akan bahan baku kapur maka dilakukan
penambangan secara terbuka. Pembukaan hutan pun tidak bisa dihindari dan akan
menimbulkan hamparan lahan terbuka. Ancaman yang dapat ditimbulkan dari
penambangan ini ialah bahaya erosi, perubahan sifat fisik dan kimia tanah, serta
perubahan kualitas air sungai. Selain itu dampak yang paling mendasar ialah
terjadinya perubahan terhadap ekosistem dari daerah tersebut.
Setelah dilakukan penambangan maka akan terjadi kerusakan pada lahan
tersebut. Lahan akan menjadi miskin hara dan kritis serta sangat sulit untuk
dipulihkan kembali. Sesuai dengan Undang-undang Republik Indonesia nomor 4
tahun 2009 tentang Pertambangan Mineral dan Batu Bara maka lahan pasca
tambang perlu dilakukan reklamasi untuk menata, memulihkan dan untuk
memperbaiki kualitas lingkungan dan ekosistem agar dapat berfungsi kembali
sesuai peruntukannya. Salah satu langkah untuk mempercepat perbaikan lahan
tersebut adalah dengan cara melakukan revegetasi.
Program revegetasi daerah bekas tambang diharapkan terjadinya suksesi
tumbuhan secara alami. Proses ini membutuhkan kondisi lahan dan iklim yang
sesuai dan mendukung untuk pertumbuhan dari organisme dan tumbuhan yang
ada disekitarnya. Akan tetapi, selama aktivitas proses penambangan komponenkomponen dari ekosistem tanah akan menurun dan akan berdampak buruk pada
lahan tersebut. Kondisi ini akan mempengaruhi kualitas lahan dan proses
perbaikan lahan secara alamiah mejadi lambat. Selain itu rendahnya unsur hara
yang tersedia pada lahan bekas tambang akan mempersulit proses perbaikan
kualitas lahan tersebut.

2
Untuk mempercepat terjadinya regenerasi secara alamiah dari lahan bekas
tambang dapat dilakukan penanaman pohon dan herba. Penanaman pohon akan
mempengaruhi komponen fisik, kimia, dan biologi tanah. Setelah proses
penanaman pohon maka akan diharapkan terjadinya pertumbuhan dari jenis
tumbuhan lainnya secara alamiah. Kondisi ini akan membantu terbentuknya
vegetasi-vegetasi herba yang baru, sehingga proses penanaman ini akan
membantu menutupi permukaan lahan terbuka setelah dilakukan penambangan.
(Singh 2011).
Selama berlangsungnya pengembalian ekosistem di lahan tambang yang
rusak akan terjadi akumulasi nutrien-nutrien pada tempat tersebut. Nutrien alami
ini akan dimanfaatkan sendiri oleh ekosistem yang ada di tempat tersebut untuk
perkembangan selanjutnya. Invasi spesies herba alami selama proses tersebut akan
memberikan peranan yang signifikan dalam biodiversitas tanaman. Sekarang ini
telah banyak dilakukan investigasi terhadap suplementasi tanaman dengan
menambahkan inokulasi mikrob untuk melengkapi proses revegetasi alami.
Tanaman yang diinokulasikan dengan beberapa mikroorganisme akan
mempercepat proses pertumbuhan untuk memperbaiki lahan bekas tambang batu
kapur (Singh 2011).
Hal lain yang dapat dilakukan dengan menanam tumbuhan pionir atau
perintis yang dapat dengan cepat beradaptasi terhadap lahan yang kritis dan
miskin hara. Kendala yang sering dihadapi adalah tumbuhan pionir yang ditanam
di daerah tersebut tidak mudah mendapatkan unsur hara terutama fosfor (P). Akar
tumbuhan tidak dapat melarutkan unsur P dari batuan kapur. Untuk itu perlu
diberi perlakuan terlebih dahulu dengan cara pemberian bakteri yang dapat
melarutkan senyawa fosfat. Senyawa asam yang dihasilkan dari bakteri tersebut
dapat melarut senyawa fosfat sehingga unsur ini tersedia dalam bentuk yang
mudah diserap oleh akar tumbuhan. Bakteri-bakteri tersebut dapat diisolasi dari
daerah tersebut dan diharapkan sudah beradaptasi dengan kadar kapur yang sangat
tinggi.
Untuk menunjang keberhasilan proses reklamasi dan revegetasi lahan bekas
tambang kapur perlu dilakukan penelitian dengan cara mengisolasi bakteri-bakteri
yang dapat melarutkan fosfat dari daerah tambang kapur itu sendiri. Setelah itu
dilakukan pemilihan terhadap bakteri tersebut yang dapat tumbuh dengan baik
dengan kondisi kadar kapur yang tinggi, dapat beradaptasi dengan pH tanah
berkapur, serta dapat menghasilkan senyawa asam dalam jumlah yang tinggi
sehingga dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan yang akan ditanam di daerah lahan
bekas tambang tersebut.
Perumusan Masalah
Pemenuhan kebutuhan akan semen untuk pembangunan sejalan dengan
peningkatan penambangan bahan baku kapur. Pembukaan lahan dan hutan untuk
tambang kapur akan membawa dampak kepada kerusakan ekosistem lingkungan
tersebut. Nilai dan fungsi lahan harus dikembalikan dengan cara melakukan
reklamasi. Hal yang dapat dilakukan ialah dengan revegetasi lahan-lahan yang
sudah ditambang.

3
Untuk melakukan revegetasi lahan pasca tambang termasuk sulit. Hal ini
disebabkan rusaknya populasi alami dari mikrob tanah, minimnya bahan organik,
fluktuasi pH yang sangat tinggi dan tidak adanya air yang terinfiltrasi dalam tanah
sehingga sangatlah sulit untuk memulai tumbuhnya tanaman perintis. Selain itu
tanaman yang akan ditanam pada daerah bekas tambang kapur tidak dapat hidup
dengan sempurna karena akar tanaman akan kesulitan dalam mendapatkan unsur
hara. Unsur hara dan bahan mineral yang ada dalam tanah masih dalam bentuk
senyawa-senyawa yang tidak siap untuk diserap oleh akar tanaman. Oleh karena
itu ketersedian unsur hara ini dapat dibantu oleh adanya mikrob pelarut fosfat.
Dari kondisi ini perlu dilakukan penelitian dengan permasalahan pokoknya
antara lain:
1. Bagaimana sifat kimia tanah di tambang kapur Palimanan PT
Indocement Tunggal Prakarsa, Tbk.
2. Bagaimana cara mengisolasi bakteri yang dapat melarutkan fosfat
untuk membantu proses revegetasi lahan pasca tambang.
3. Bagaimana karakteristik bakteri yang telah diisolasi dari daerah
tersebut serta kemampuannya untuk melarutkan fosfat dalam tanah
kapur.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Menganalisis kandungan kimia tanah di tempat dilakukan isolasi
bakteri di tambang kapur Palimanan PT Indocement Tunggal Prakarsa,
Tbk.
2. Mengisolasi bakteri pelarut fosfat dari lokasi penambangan batu kapur.
3. Karakterisasi bakteri pelarut fosfat dan menguji kemampuan pelarutan
fosfat pada tanah asal tambang kapur

2 TINJAUAN PUSTAKA
Keberadaan Fosfat di Daerah Bekas Tambang
Lahan setelah dilakukan penambangan akan mengalami perubahan bentuk
topografi dan sistem aliran air (hidrologi). Hal ini tergantung kepada cara
penambangan yang dilakukan maupun jenis bahan tambang yang akan diambil.
Umumnya penambangan yang ada di Indonesia dilakukan secara terbuka dan
tambang bawah tanah. Perbedaan cara penambangan dan jenis bahan tambang ini
membawa konsekuensi kepada berbagai permasalahan yang dihadapi dalam
melakukan reklamasi lahan-lahan bekas tambang. Permasalahan yang sering
terjadi menyangkut teknis reklamasi yaitu: kesuburan tanah yang sangat rendah,
erosi, sedimentasi yang tinggi, tanah pucuk kurang atau tidak tersedia, munculnya
air asam tambang, lereng-lereng yang curam, air untuk menyiram kurang atau
tidak tersedia, iklim mikro belum sesuai, pemilihan jenis tanaman, dan lain-lain.
Penyelesaian masalah-masalah ini sangat menentukan keberhasilan dari proses
reklamasi tambang (Iskandar et al. 2013).

4
Berdasarkan Peraturan Pemerintah RI nomor 27 tahun 1980 bahwa bahanbahan galian tambang terbagi atas tiga golongan:
a. Golongan bahan galian yang strategis adalah: minyak bumi, bitumen
cair, lilin bumi, gas alam, bitumen padat, aspal, antrasit, batubara, batubara muda,
uranium, radium, thorium dan bahan-bahan galian radioaktip lainnya, nikel, kobalt
dan timah.
b. Golongan bahan galian yang vital adalah: besi, mangan, molibden,
khrom, wolfram, vanadium, titan, bauksit, tembaga, timbal, seng, emas, platina,
perak, air raksa, intan, arsin, antimon, bismut, yttrium, hutenium, cerium dan
logam-logam langka lainnya, berillium, korundum, zirkon, kristal kwarsa, kriolit,
fluorpar, barit, yodium, brom, khlor, belerang.
c. Golongan bahan galian yang tidak termasuk golongan a atau b adalah:
nitrat-nitrat, fospat-fospat, garam batu (halite), asbes, talk, mika, grafit, magnesit,
yarosit, leusit, tawas (alum), oker, batu permata, batu setengah permata, pasir
kwarsa, kaolin, feldspar, gips, bentonit, batu apung, tras, obsidian, perlit, tanah
diatome, tanah serap (fullers earth), marmer, batu tulis, batu kapur, dolomit, kalsit.
Menurut Asir (2013) bahwa dalam proses revegetasi lahan kendala yang
sering dihadapi ialah kondisi lahan yang tidak mendukung untuk pertumbuhan
tanaman. Kondisi fisik, kimia dan biologi tanah menjadi kritis akibat adanya
perubahan lahan akibat penambangan. Karakteristik lahan kritis pasca tambang
dapat dilihat sebagai berikut:
1. Kondisi Fisik Tanah
Penambangan secara terbuka menyebabkan terjadinya kerusakan pada
struktur, tekstur, porositas dan bulk desity. Kondisi ini berkaitan dengan sistem
tata air (water infiltration and percolation) dan aerasi tanah. Perubahan pada
kondisi fisik tanah akan membuat tanah menjadi padat sehingga akar tanaman
tidak dapat berkembang dan menyerap hara dengan baik. Akibatnya pertumbuhan
tanaman akan terganggu, kerdil dan merana. Selain itu pemadatan tanah juga
dapat menyebabkan sulitnya penyerapan air hujan ke dalam tanah. Tanah tidak
mampu menampung air hujan dan kemudian terjadi aliran permukaan (run off).
Sedangkan pada musim kemarau tanah akan menjadi lebih keras dan padat
sehingga akan sulit bagi tanaman untuk tumbuh normal.
2. Kondisi kimia tanah
Lapisan tanah paling atas (top soil) akan ikut terbawa pada saat dilakukan
penggalian tambang. Lapisan tanah ini merupakan lapisan utama yang
menyediakan unsur hara makro dan mikro esensial bagi tumbuhan, serta bahan
organik untuk pertumbuhan mikroorganisme. Proses pembentukan lapisan tanah
bagian atas memakan waktu yang lama. Hilangnya lapisan tanah bagian atas ini
mengakibatkan tanah menjadi tidak subur. Masalah utama yang terjadi pada
daerah bekas tambang kapur yaitu rendahnya ketersediaan unsur hara nitrogen,
kalium, fosfat, serta pH tanah yang tidak normal. Tingginya variasi pH tanah dan
unsur hara disebabkan karena terjadinya campuran dari bahan galian dari
beberapa lokasi tambang. Kondisi ini berakibat sulitnya didapatkan takaran soil
amandement atau soil ameliorant dalam proses reklamasi lahan tambang ini.
3. Kondisi biologi tanah
Pengurukan lapisan tanah permukaan (top soil) dan serasah (litter layer)
pada saat pembukaan lahan tambang menjadi penyebab turunnya populasi

5
mikroorganisme tanah. Pada lapisan ini terdapat bahan-bahan karbon untuk
pertumbuhan mikrob tersebut. Keberadaan mikrob pada lapisan tanah berperan
dalam peningkatan penyedian unsur hara, dekomposisi serasah dan memperbaiki
struktur tanah. Beberapa jenis bakteri juga berperan dalam penambat nitrogen dan
pelarut fosfat.
Menurut Syekhfani (2015) bahwa sifat dan ciri lahan tambang golongan C
pada penambangan batu kapur adalah umumnya penambangan dilakukan pada
lokasi perbukitan di mana deposit kapur, dolomit atau fosfat dijumpai. Deposit
kapur dan dolomit umumnya dijumpai dalam suatu perbukitan utuh, sedang batu
fosfat alam berupa kantong-kantong pada perbukitan. Kawasan tambang ini
dicirikan oleh kondisi iklim kering atau setengah kering, kalkareus dengan nilai
pH tinggi, kedalaman air tanah sangat dalam, dan topografi berombak hingga
berbukit. Dengan demikian kendala yang dihadapi bila lahan akan dijadikan
pertanian adalah kekurangan air, kadar bahan organik rendah, dan pH tinggi yang
menyebabkan unsur-unsur tertentu bermasalah (N, K, Fe, Mn, Cu, Zn, dan fiksasi
P).
Isolasi mikrob yang dilakukan pada daerah yang ada di sekeililing tambang
bertujuan untuk mendapatkan mikrob yang telah teradaptasi dengan kondisi kapur
yang tinggi serta dapat bertahan hidup pada pH yang basa. Sesuai dengan
pernyataan Sposito (2008) bahwa dalam siklus unsur hara dalam tanah terutama
unsur P dipengaruhi oleh keberadaan mikrob tanah. Jika kebedaraan mikrob
dalam tanah tidak ada maka unsur hara tanah akan sulit diserap oleh tumbuhan
sehingga siklus tidak berjalan dengan baik. Mikrob tanah akan mengeluarkan
beberapa enzim ke lingkungan sehingga makro molekul tanah akan terdegradasi
menjadi mikro molekul. Kemudian mikro molekul ini juga akan dimanfaatkan
oleh makhluk hidup lainnya sehingga terbentuklah suatu ekosistem lingkungan
yang baik.
Menurut Iskandar et al. (2013) bahwa aspek kesuburan media tanam
dapat dikelompokkan menjadi kesuburan fisik, kimia, dan biologi. Ketiga
aspek kesuburan tersebut secara bersama-sama berperan dalam
mempengaruhi kualitas media tanam. Seperti diketahui bahwa lokasi-lokasi
tambang di Indonesia umumnya berada pada tanah-tanah yang tidak subur.
Oleh karena itu, perbaikan kualitas media tanam khususnya pada tanah
lapisan atas perlu dilakukan untuk meningkatkan keberhasilan revegetasi.
Pemberian bahan organik merupakan kunci pokok perbaikan lapisan atas.
Selain itu adanya aktivitas mikroorganisme dalam tanah sangat menentukan dari
kesuburan biologi tanah.
Bachar et al. (2010) telah melakukan eksplorasi terhadap kelimpahan dan
keragaman mikrob tanah pada daerah dengan curah hujan yang rendah.
Penyebaran mikrob di alam mempengaruhi keragaman, penyebaran, kepunahan,
dan interaksi antar spesies di lingkungan. Komposisi dari komunitas ini akan
menjadi keunikan dari setiap ekosistem. Selain itu keragaman dan kelimpahan
bakteri di alam akan memainkan peranan yang penting dalan proses ekologi dan
fungsi dari suatu ekosistem.
Beberapa penelitian sebelumnya sudah banyak ditemukan bakteri pelarut
fosfat. Akan tetapi pada aplikasi di lapangan ternyata tidak semua bakteri dapat
tumbuh dan membantu proses revegetasi tanaman. Hal ini disebabkan perbedaan
unsur-unsur dan ikatan senyawa pada setiap lahan tambang. Seperti adanya

6
ikatan metal-fosfat yang ada pada lahan pH asam: Fe-P dan Al-P. Untuk tanah
yang bersifat basa maka fosfat akan berikatan dalam senyawa kalsium fosfat (CaP). Selain itu banyak senyawa fosfat yang memiliki kestabilan yang tinggi dan
kelarutan yang rendah dalam tanah diakibatkan bentuk ikatannya, seperti:
kalsium fosfat dihidrat (brushite) CaHPO4·2H2O > anhidrous dikalsium fosfat
(monetite) CaHPO4 > oktakalsium fosfat Ca8H2(PO4)6·5H2O > trikalsium fosfat
Ca(PO4)2 > hydroksiapatit Ca5(PO4)3OH > flurapatite Ca5(PO4)3F. Bentuk yang
stabil dari fosfat organik adalah fitat (dodekasodium inositol heksafosfat,
Na12C6H6P6O24). Karena kestabilan fosfat dalam tanah tinggi maka tumbuhan
tidak akan bisa menyerap unsur fosfat. Walaupun dalam analisis kandungan
fosfat di labaoratorium tinggi tetapi pada kenyataannya unsur ini tidak dapat
membantu pertumbuhan dari tanaman (Bashan et al. 2013).
Fosfor (P) merupakan unsur makronutrien utama yang sangat esensial untuk
pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Akan tetapi konsentrasi P yang
terlarut di dalam tanah sangatlah kecil. Konsentrasi P di dalam tanah biasanya
berbentuk senyawa yang tidak mudah larut seperti terdapat pada batuan, mineral
dan deposit. Proses pelapukan batuan menjadi tanah liat, lumpur, pasir dan
komponen mineral tanah merupakan faktor lingkungan yang penting di bumi.
Pada kondisi tertentu unsur P dapat terlarut sebagian sehingga bisa dimanfaatkan
oleh tumbuhan.
Konsentrasi terlarut dari P-anorganik sangat rendah pada sebagian besar
tanah. Ion fosfat akan cendrung berikatan dengan mineral-mineral yang
bermuatan positif seperti Fe dan Al. Selain itu ion fosfat juga dapat berbentuk
kombinasi dari beberapa logam, seperti Ca, Fe, dan Al. Dibandingkan dengan
unsur makro yang lainnya untuk nutrisi tumbuhan, unsur P termasuk sangat
lambat mobilitasnya. Hal ini sangat dipengaruhi oleh kondisi tanah tersebut.
Proses adsorbsi/desorpsi dan presipitasi/pelarutan P di dalam tanah sangat
mempengaruhi keseimbangan mobilitas dan ketersediaan P di dalam tanah. Faktor
utama yang mempengaruhi keseimbangan konsentrasi P dalam tanah yaitu a) pH
tanah, b) konsentrasi anion yang berkompetisi dengan ion P untuk membentuk
reaksi pertukaran ligan dan c) konsentrasi logam yang dapat berikatan dengan ion
P seperti Ca, Fe dan Al (Hinsinger 2001).
Siklus P di alam sangat dinamis, terjadinya perpindahan P dipengaruhi oleh
pH dari tanah dan dipergunakannya unsur ini oleh makhluk hidup (Gambar 1)
(Sposito 2008). Unsur fosfor (P) merupakan salah satu unsur makro nutrien yang
sangat penting untuk pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Terdapat
sekitar 440-1200 mg/kg unsur P di dalam tanah, akan tetapi konsentrasi P yang
terlarut di dalam tanah sangat rendah normalnya pada level 1 ppm. Sebagian besar
unsur P terdapat pada batuan dan deposit lainnya seperti apatit. Mikroorganisme
memiliki peranan penting dalam siklus P di alam. Siklus ini terjadi karena adanya
reaksi oksidasi dan reduksi komponen fosfor, dengan terjadi reaksi transfer
elektron antara fosfin (-3) ke fosfat (+5) (Rodriguez dan Fraga 1999).
Mikroorganisme memiliki peranan penting dalam siklus alamiah dari unsur
P. Ada beberapa bakteri yang terdapat dalam tanah dan pada akar tanaman dapat
melarutkan P serta memiliki peranan yang penting dalam melarutkan komponen
fosfat an-organik. Bakteri silikat yang ditemukan juga dapat melarutkan kalium,
silikon, dan aluminium dari mineral an-organik yang tidak mudah larut (Diep dan
Hieu 2013). Penelitian yang dilakukan oleh Mursyida et al. (2015) ditemukan

7
bakteri Burkholderia, Serratia, dan Pseudomonas yang mampu melarutkan fosfat.
Bakteri ini diisolasi dari daerah penyangga dan area reklamasi dari tambang kapur
Palimanan Cirebon.

MIKROB

KOMPLEK
ANORGANIK

PARTIKEL
PERMUKAAN
TANAH

KATION ATAU
ANION BEBAS

KOMPLEK
ORGANIK
FASE PADAT

AKAR

Gambar 1 Aliran fosfor (P) di dalam tanah (Sposito 2008)
Distribusi P dalam berbagai jenis larutan tanah sangat ditentukan oleh pH
larutan tersebut. Pada domain pH yang relevan dengan sebagian besar tanah, ion
ortofosfat dominan berbentuk H2PO4- dan HPO4-2. Bentuk ion HPO4-2 merupakan
bentuk utama yang terjadi pada pH di atas 7.2. Reaksi protonasi dan deprotonisai
yang terjadi akibat perubahan pH tanah dapat mempengaruhi spesiasi ion P. Ion P
ini sangat penting dalam pembentukan ligan anorganik dalam larutan tanah dan
memiliki kecendrungan yang kuat membentuk pasangan ion atau ikatan kompleks
dengan kation logam di antaranya sebagian besar dengan Ca, Mg, dan beberapa
logam lainnya seperti Fe dan Al. Pada tanah yang bersifat asam, karena tingginya
kelarutan dari Fe dan oksida Al maka akan terbentuk Fe dan Al valensi 3 dengan
konsentrasi yang tinggi dalam larutan tanah. Akan tetapi kondisi ini dapat
diabaikan atau tidak berpengaruh pada tanah yang bersifat netral atau basa
(Hinsinger 2001).

Mikrob Pelarut Fosfat di Tanah

Staphylococcus sp.
Staphylococcus sp. merupakan bakteri alami yang banyak dijumpai pada
tanah di Indonesia. Hasil penelitian Marista et al. (2013) bahwa bakteri Gram
positif ini juga ditemukan pada rhizosper tanaman pisang di tanah gambut dan

8
dapat menghasilkan zona bening pada media Pikovskaya. Bakteri ini bersifat
anaerob fakultatif dan dapat menghasilkan enzim fosfatase, protease dan lipase.
Spesies bakteri yang terisolasi dan positif menghasilkan fosfatase yang dilakukan
pada tanah aluvial, gambut, dan podsolik merah kuning (PMK) bervariasi dan
sangat tergantung kepada pH tanah.
Staphylococcus sp. merupakan bakteri Gram positif yang berbentuk kokus
dengan ciri yang spesifik yaitu dapat hidup dalam kondisi aerob fakultatif. Hal ini
menjadi pembeda dari spesies lainnya seperti Micrococcus dan Streptococcus.
Menurut Bera et al. (2005) bahwa kelompok spesies Staphylococcus merupakan
kelompok yang resisten terhadap enzim lisozim. Kondisi ini digunakan oleh
bakteri ini untuk dapat bertahan hidup pada area kulit dan mukosa manusia dan
hewan.
Menurut Atilano et al. (2010) bahwa bakteri gram positif terutama
kelompok Staphylococcus memiliki dinding sel dengan jaringan yang sangat
komplek. Jaringan ini terdiri dari peptidoglikan dan asam teikoik yang keduanya
komponen yang sangat esensial untuk mempertahankan struktur dan bentuk dari
sel bakteri. Peptidoglikan merupakan polimer heterogenus dari ikatan silang
glikan yang terdiri dari peptida rantai pendek dengan variasi asam amino sebagai
penyusunnya. Selain peptidoglikan juga ditemukan adanya asam teikoik (teichoic
acid) yang merupakan senyawa glikopolimer yang kaya akan fosfat dan akan
berikatan dengan peptidoglikan yang berujung pada membran sitoplasma. Mereka
juga menduga bahwa pembentukan ikatan antara peptidoglikan dan asam teikoik
pada kelompok Staphylococcus mengakibatkan dinding sel bakteri ini tidak bisa
dilisis oleh enzim lisozim. Hal ini juga berbeda dengan bakteri kokus gram positif
lainnya yang masih bisa dilisis oleh lisozim.
Pseudomonas sp.
Pesudomonas sp. merupakan kelompok dari genus bakteri yang banyak
terdapat di alam yang dapat memanfaatkan bahan-bahan organik dan anorganik
pada lingkungan yang beragam. Kelompok bakteri ini dapat dijumpai pada
ekosistem tanah dan air, serta beberapa dari spesies ini menjadi patogen pada
tumbuhan, hewan, dan manusia. Genus Pseudomonas terkenal dengan
kemampuan metabolisme yang fleksibel dan memiliki genetik plasticity. Spesies
dari genus Pseudomonas dapat tumbuh dengan cepat dan terkenal dengan
kemampuannya melakukan metabolisme yang sangat ekstensif terhadap sejumlah
substrat termasuk bahan kimia yang bersifat toksik seperti senyawa alifatik dan
hidrokarbon aromatik. Beberapa strain dari spesies ini juga sering menggalami
resisten antibiotik, desinfektan, detergen, logam berat dan pelarut organik.
Beberapa spesies juga dilaporkan dapat menghasilkan metabolit yang dapat
memacu pertumbuhan tanaman dan dapat menghambat perkembangan dari hama
tanaman (Moore et al. 2006).
Genus Pseudomonas termasuk ke dalam famili Pseudomonadaceae yang
didalamnya terdapat 5 genera antara lain: Pseudomonas, Azotobacter, Azomonas,
Azorhizophilus, dan Cellvibrio. Secara umum famili ini memiliki ciri fisiologi
yang bersifat aerobik, metabolisme kemoorganotropik, tidak dapat melakukan
fermentasi, tidak dapat melakukan fotosintesis dan hidup dalam variasi bahan
makanan bahan organik. Umumnya spesies dalam genus Pseudomonas berbentuk

9
batang, Gram negatif, berespirasi aerob, beberapa ada yang bersifat motil dan
memiliki endospora. Memiliki kemampuan hidup pada suhu 4 – 42 oC dan
rentang pH antara 4 sampai 8 (Moore et al. 2006).
Pantoea sp.
Pantoea sp. merupakan spesies yang termasuk kelompok famili
Enterobacteriaceae. Spesies ini dapat ditemukan di lingkungan perairan, kotoran,
sayur-sayuran dan tanah. Sebelumnya meluasnya penggunaan antibiotik,
kelompok Enterobacter banyak diteliti karena bersifat patogen baik pada manusia
maupun pada tanaman. Akan tetapi di Amerika Serikat mencatat tidak semua
kelompok ini bersifat patogen pada manusia maupun tumbuhan.
Pada penelitian sebelumnya penamaan terhadap infeksi yang disebabkan
oleh kelompok ini terdapat perbedaan, beberapa laboratorium secara taksonomi
sering menggunakan nama Enterobacter atau Klebsiella. Bakteri yang ditemukan
pada urine dinamai dengan Enterobacter dan jika ditemukan pada Sputum
dinamai dengan Klebsiella. Enterobacter agglomerans tersebar di alam dengan
berbagai kondisi lingkungan terutama terdapat pada tumbuhan. Sebelumnya
terjadi penggunaan nomenklatur penamaan yang berbeda untuk spesies ini seperti
Enterobacter agglomerans sama penamaannya dengan Erwinia herbicola. Akan
tetapi penamaan Enterobacter dari spesies ini selanjutnya digunakan Pantoea sp.
Spesies Pantoea sp. ini memiliki ciri Gram negatif, bersifat anaerob fakultatif atau
bersifat fermentatif. Beberapa spesies ada yang bersifat motil dan ada yang tidak
(Grimont dan Grimont 2006).

3 METODE PENELITIAN
Waktu, Tempat Penelitian, dan Lokasi Pengambilan Sampel Tanah
Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2014 sampai Februari 2015 di
Laboratorium Mikrobiologi Program Diploma, Institut Pertanian Bogor.
Pengambilan sampel tanah dilakukan di daerah tambang kapur PT Indocement
Tunggal Prakarsa, Tbk berlokasi di daerah Palimanan Cirebon, Jawa Barat.
Sampel diambil pada lima lokasi yaitu dua lokasi pada lahan tambang batu kapur
yang masih dilakukan tambang terbuka, satu lokasi pada lahan bekas tambang
yang belum dilakukan reklamasi, dan dua lokasi pada lahan reklamasi. Sampel
tanah diambil lebih kurang 1 Kg pada setiap titik pengambilan dari lima lokasi
tersebut. Lokasi dan karakterisassi lahan di daerah tambang kapur Palimanan
Cirebon disajikan pada Tabel 1.

10
Tabel 1 Lokasi pengambilan contoh tanah daerah tambang kapur Palimanan
Cirebon

No.

Kode
contoh
tanah

1.

QC 1A,
QC 1B,
QC 1C

2.

QC 4A
QC 4B
QC 4C

3.

QC 5A
QC 5B
QC 5C

Lokasi pengambilan
contoh tanah (GPS)

Lokasi

Ketinggian Suhu lingkungan
(mdpl)
(oC)

S 06° 35’ 24.11”
E 106° 48’ 21.2”

Lahan bekas
tambang (belum
reklamasi)

123

31

S 06° 43’ 08.2”
E 108° 23’ 08.38”

Area tambang
aktif

162

31

S 06° 43’ 09.5”
E 108° 24’ 01.5”

Area reklamasi

136

31

4.

QC 6A
QC 6B

S 06° 43’ 19.5”
E 108° 24’ 04.,6”

Area tambang
aktif

138

31

5.

QC 7A
QC 7B

S 06° 43’ 18.6”
E 108° 24’ 06.2”

Area reklamasi

138

31

Analisis Kimia Bahan Tanah dari Daerah Kapur
Pengukuran kandungan kimia tanah kapur yang dianalisis ialah kandungan
total fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), aluminium (Al), besi (Fe), mangan
(Mn), magnesium (Mg), natrium (Na), klorida (Cl), pH tanah dan kadar air.
Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat
Isolasi bakteri dilakukan dengan menimbang 10 g tanah sampel kemudian
dimasukkan ke dalam 90 ml akuades steril dalam erlenmeyer 250 ml. Larutan
yang dibuat setara perbandingan 1:10 (w:v) kemudian dikocok dan dibiarkan
selama 30 menit. Setelah itu dilakukan serial pengenceran sampai 10-5 dengan cara
memipet 1 ml sampel ke dalam 9 ml akuades steril. Sebanyak 0.1 ml dari serial
pengenceran tersebut kemudian disebar di media agar-agar Pikovskaya.
Kandungan media Pikovskaya per liter ialah: 10 g glukosa, 5 g Ca3(PO4)2, 0.5 g
(NH4)2SO4, 0.1 g MgSO4·7H2O, 0.5 g ekstrak khamir, 0.2 g KCl, 0.2 g NaCl,
0.002 g FeSO4·7H2O, 0.002 g MnSO4·7H2O, dan 1.5 % bacto agar, kemudian pH
larutan dijadikan 7.5. Koloni bakteri yang membentuk zona bening pada media
agar-agar Pikovskaya menunjukkan adanya pelarutan fosfat (Nautiyal 1999).

11
Setelah dilakukan pemurnian kemudian dilakukan uji pembentukan zona
bening pada media Pikovskaya. Uji dilakukan dengan cara sebanyak satu ujung
jarum ose biakan bakteri ditusukan ke bagian tengah media agar-agar Pikovskaya
kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Uji positif menunjukkan
adanya zona bening di sekeliling koloni dan indeks pelarutan fosfat (IP) pada
media agar-agar Pikovskaya dihitung setelah 48 jam inkubasi.

IP =

diameter zona bening cm – diameter koloni cm
diameter koloni cm
Karakterisasi Biokimia Bakteri

Isolat bakteri yang telah dimurnikan kemudian dilakukan pewarnaan Gram.
Satu loop sampel bakteri dioleskan di gelas objek dan difiksasi. Setelah itu
dilakukan 4 tahap pewarnaan yaitu penambahan kristal ungu, iodium 1%, etanol
95% dan pewarna safranin. Isolat bakteri yang bewarna ungu menunjukkan Gram
positif (+) dan warna merah muda menunjukkan Gram negatif (-). Untuk
menguatkan hasil uji Gram juga dilakukan uji KOH 3%. Karakterisasi biokimia
dari mikrob pelarut fosfat menggunakan kit API (BiomerieuxTM, USA). Untuk
melengkapi uji dengan kit API sebelumnya juga dilakukan uji
oksidatif/fermentatif (uji O/F), uji katalase, uji oksidase, dan uji motilitas. Hasil
dari kit API ini kemudian diverifikasi dengan buku Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology (Holt et al. 1994).

Analisis Sekuensing Gen 16S rRNA Isolat Bakteri
Ekstraksi DNA
Isolat bakteri terlebih dahulu ditumbuhkan pada media Luria-Bertani broth
(LB) pada suhu ruang selama 18 jam (Victoria et al. 2009). Setelah itu sebanyak 1
ml biakan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml dan disentrifugasi dengan
kecepatan 7500 rpm (5000 xg) selama 10 menit. Supernatan kemudian dibuang
dan pelet diambil untuk digunakan pada tahap berikutnya. Tahap ekstraksi DNA
dilakukan dengan cara menggunakan kit DNeasy® QIAGEN.
Hasil ekstraksi DNA dari setiap isolat bakteri kemudian dilakukan
amplifikasi dengan menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Primer yang
digunakan adalah 27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan 1492r (5’GGCTACCTTGTTACGACTT-3’) (Devereux dan Wilkinson 2004). Sebanyak
12.5 µl bahan dNTP Go Taq® Green Master Mix (Promega) ditambah dengan 1
µl Primer 27f 10 µM dan 1 µl Primer 1492r 10 µM. Kemudian ditambahkan
ekstrak DNA sebanyak 2 µl dan Nuclease free water (NFW) sebanyak 8.5 µl
(untuk mencapai total volume sebanyak 25 µl).
Tahap amplifikasi dilakukan pada alat Applied Biosystem® GeneAmp®
PCR System 9700. Parameter siklus termal yang dilakukan mengikuti metode
Galkiewicz dan Kellogg (2008) yang telah dimodifikasi. Tahapannya meliputi:

12
denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 15 menit (1 kali), denaturasi pada suhu
94 oC selama 1 menit (30 kali), annealing pada suhu 54 oC selama 1 menit (30
kali), ekstensi pada suhu 72 oC selama 2 menit (30 kali), ekstensi akhir 72 oC
selama 10 menit (1 kali) dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 oC. Sebanyak 5
µl hasil amplifikasi selanjutnya dilakukan analisis elektroforesis pada gel agarose
1%, SBYR® Safe 4 µl dan buffer pH 7 TAE 1x. Pada sumur dimasukan sebanyak
5 µl marker 100 bp, kontrol negatif (tanpa ekstrak DNA) dan ekstrak DNA dari
masing-masing isolat. Kemudian dilihat pada alat UV transiluminator. Purifikasi
dari hasil amplifikasi dilakukan menggunakan metode etanol. Selanjutnya
ditambahkan 20 µl HiDi formamide® dan dilakukan analisis sekuensing dengan
alat Applied Biosystem® 3130 Genetic Analyzer. Data hasil sekuensing kemudian
dibandingkan dengan data dari Gen Bank dengan metode BLAST server (Basic
Local Alignment Search Tool) dari National Center for Biotechnology
Information (NCBI).
Uji Kemampuan Pelarutan Fosfat
Isolat yang menghasilkan zona bening pada media Pikovskaya kemudian
diukur kemampuan melarutkan fosfat terhadap masing-masing contoh tanah.
Masing-masing contoh tanah terlebih dahulu dikering anginkan kemudian digerus
dengan mortar dan dilakukan pengayakan dengan ayakan (screen mesh) no 20
(Lampiran 1). Kemudian tanah ditimbang sebanyak 20 g dan dimasukan ke dalam
erlenmeyer atau sesuai jumlah isolat yang diisolasi (1 isolat dibuat duplo).
Masing-masing erlenmeyer ditambahkan 200 ml larutan nutrien yang berisi 400
mg glukosa, 400 mg sukrosa dan 75 mg NH4NO3 dan disterilisasi dengan suhu
121 oC, 1 atm selama 15 menit. Setiap erlenmeyer ditambahkan 1 ml isolat bakteri
dan diinkubasikan selama 2 minggu pada suhu ruang (Illmer dan Schinner 1995).
Larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm (Hettich®
Zentrifugen Mikro 200R) pada suhu ruang. Supernatan diambil dan kemudian
dilakukan pengukuran dengan metode molibdat-vanadat (International
Organisation of Vine and Wine, 2015). Kemudian absorbansi diukur dengan
spektrofotometer cahaya tampak (Thermo Scientific® Genesys 20) dengan
panjang gelombang 400 nm (Lampiran 2). Kemampuan melarutkan fosfat oleh
isolat bakteri terhadap tanah sampel (IPF) dapat dihitung dengan:

[PO4]akhir – [PO4]awal
Indeks kemampuan melarutkan PO4 tanah (IPF) =
HASIL DAN PEMBAHASAN

[PO4]awal

13

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampling dan Analisis Tanah
Pabrik semen PT Indocement Tunggal Prakarsa, Tbk wilayah Cirebon
terletak di daerah Palimanan Cirebon yang berbatasan dengan sebelah utara
dengan Desa Kedung Bunder Kecamatan gempol, sebelah selatan berbatasan
dengan Desa Cikeusal Kecamatan Gempol. Wilayah barat berbatasan dengan
Desa Cupang Kecamatan Gempol dan Desa Ciwaringin Kecamatan Ciwaringin,
sedangkan untuk daerah timur berbatasan dengan Desa Palimanan Barat dan Desa
Gempol Kecamatan Gempol. Pabrik yang mempunyai kapasitas produksi semen
sekitar 4 juta ton per tahun ini memiliki luas 580 hektar, terdiri atas 346 hektar
merupakan wilayah tambang dan 234 hektar digunakan untuk area pabrik.
Wilayah tambang mimiliki 169 hektar tambang yang masih aktif, 156 hektar
tambang yang tidak aktif serta sekitar 21 hektar dijadikan sebagai wilayah
penyangga.
Contoh tanah diambil dari 5 lokasi, untuk lokasi QC 1, QC4, QC 5 diambil
sebanyak 3 contoh tanah dan untuk lokasi QC 6, QC 7 diambil 2 contoh tanah
(Tabel 1). Lokasi QC 1 merupakan lahan bekas tambang yang belum dilakukan
penutupan kembali dengan tanah pucuk sehingga lokasi ini masih banyak terdapat
bebatuan dan belum ada proses reklamasi pada lokasi ini. Lokasi QC 4 dan QC 6
merupakan lahan yang masih aktif dilakukan penambangan. Lokasi QC 5 dan QC
7 merupakan lahan yang sedang dilakukan reklamasi dengan sudah ditanami oleh
beberapa tanaman seperti legum (trembesi) dan akasia. Pada daerah reklamasi ini
sudah terbentuk lapisan permukaan tanah yang terdiri atas pelapukan daun dan
batang tumbuhan yang ditanam.
Semua sampel tanah yang diambil merupakan tanah alkali (basa) antara pH
8.8 sampai 9.7 (Tabel 2). Tanah QC 4 yang merupakan lahan yang masih aktif
ditambang untuk mendapatkan kalsium untuk pembuatan semen, memiliki pH
yang basa yaitu 9.7 dengan kadar kalsium mencapai 10858.84 ppm. Tanah yang
bersifat alkali akan memiliki kandungan fosfat yang berikatan dengan kalsium
sehingga berbentuk endapan yang tidak mudah diadsorpsi oleh tumbuhan.
Menurut Jianbo et al. (2011) bahwa pada saat terjadinya peningkatan pH
pada tanah maka kelarutan Fe Fosfat dan Al fosfat menjadi meningkat akan tetapi
Ca fosfat kelarutannya menjadi menurun (diendapkan). Fosfat biasanya
diendapkan oleh Ca, awalnya berbentuk dikalsium fosfat yang bisa diserap oleh
tumbuhan. Setelah itu dikalsium fosfat akan berubah bentuk menjadi yang lebih
stabil seperti oktokalsium fosfat dan hidroksiapatit (HAP) kemudian menjadi sulit
diserap oleh tumbuhan. Pada tanah berkapur terdapat lebih 50 % HAP dari total P
anorganik. HAP akan mudah terlarut kembali jika terjadi penurunan pH tanah.
Tanah merupakan media yang berpori yang terdapat dipermukaan lahan
yang terjadi akibat proses pelapukan karena fenomena akitivitas biologi, geologi,
dan hidrologi. Pada dasarnya tanah berbeda dengan pelapukan batuan karena jika
dilihat secara vertikal (horizon tanah) maka semakin ke atas terlihat adanya
aktivitas peresapan air dan aktivitas kehidupan makhluk hidup. Jika dilihat dari
komposisi kimia, tanah merupakan bagian dari sistem terbuka yang terdiri atas
multi komponen dan sistem biogeokimia yang berisi padatan, cairan dan gas.

14
Sistem terbuka pada tanah merupakan adanya pertukaran material dan energi
antara atmosfer, biosfer dan hidrosper (Sposito 2008).
Sampel yang diambil dari lahan tambang kapur tetap disebut dengan
“tanah”. Sesuai konsep yang dinyatakan Sposito (2008) bahwa tanah merupakan
suatu proses pelapukan dari batuan akan tetapi dalam hal ini sangat sulit
membedakan batasan antara batasan tanah dan batuan. Selain itu dalam penelitian
ini tidak dilakukan pengamatan terhadap horizon tanah dan sampel yang diambil
bagian permukaan lahan yang terdiri atas batuan bekas tambang dan tanah
reklamasi.
Tabel 2 Kandungan unsur dari contoh tanah di lima lokasi batuan kapur
Palimanan
Analisis
tanah

Lokasi
Satuan

Total fosfat mg/kg

QC 1

QC 4

QC 5

QC 6

QC 7

2390

1190

1270

1060

1230

143.71

225.94

146.61