Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Pelarut Fosfat Dan Kalium Dari Kawasan Sekitar Tambang Batu Kapur Cirebon

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PELARUT
FOSFAT DAN KALIUM DARI KAWASAN SEKITAR
TAMBANG BATU KAPUR CIREBON

ELIYA MURSYIDA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Pelarut Fosfat dan Kalium dari Kawasan Sekitar Tambang Batu Kapur
Cirebon adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Eliya Mursyida
NIM G351124031

RINGKASAN
ELIYA MURSYIDA. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Pelarut Fosfat dan Kalium
dari Kawasan Sekitar Tambang Batu Kapur Cirebon. Dibimbing oleh NISA
RACHMANIA MUBARIK dan ARIS TJAHJOLEKSONO.
Fosfor (P) dan kalium (K) merupakan unsur utama makronutrien yang
diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Kebutuhan P dan K
untuk tanaman umumnya dipenuhi melalui aplikasi pemupukan. Namun upaya
tersebut menjadi tidak efisien karena P terikat menjadi Fe-P atau Al-P pada tanah
masam atau Ca-P pada tanah basa, dan K mudah tercuci oleh air di dalam tanah,
sehingga P dan K tidak tersedia bagi tanaman. Kurang efisiennya penggunaan
pupuk P dan K dapat diatasi dengan memanfaatkan bakteri pelarut fosfat (BPF)
dan bakteri pelarut kalium (BPK) sebagai pupuk hayati. Tujuan penelitian ini
ialah untuk mengisolasi dan identifikasi bakteri pelarut fosfat dan kalium dari
kawasan sekitar tambang batu kapur Cirebon dalam upaya reklamasi tambang
batu kapur.

Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel tanah secara acak pada
kedalaman tanah 0-15 cm. Bakteri tanah diisolasi menggunakan metode
pengenceran serial dan disebar pada medium Pikovskaya dan Aleksandrov. Isolat
yang membentuk zona bening dimurnikan dengan menggunakan metode gores
kuadran. Isolat yang murni ditumbuhkan kembali pada medium Pikovskaya dan
Aleksandrov untuk mengetahui pelarutan P dan K berdasarkan indeks
pelarutannya. Isolat yang memiliki kemampuan pelarutan P dan K tertinggi,
digunakan dalam pembuatan kurva pertumbuhan dan estimasi secara kuantitatif
untuk mengetahui aktivitas pelarutan P dan K. Identifikasi secara morfologi dan
fisiologi dilakukan dengan menggunakan API Kit 20 NE, sedangkan identifikasi
secara molekuler dilakukan berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa 12 isolat dari 45 isolat bakteri pelarut
P yang diisolasi dari sampel tanah sekitar kawasan tambang batu kapur Cirebon
mampu melarutkan K. Berdasarkan nilai indeks pelarutan diperoleh tiga isolat
terpilih yang mampu melarutkan P dan K tertinggi yaitu isolat QC3.a.1, QC3.a.2
dan QC3.d.5. Hasil estimasi kuantitatif menunjukkan bahwa isolat QC3.a.2
memiliki kemampuan pelarutan P tertinggi pada medium Pikovskaya cair, dan
isolat QC3.a.1 memiliki kemampuan pelarutan K tertinggi pada medium
Aleksandrov cair. Hasil identifikasi secara fisiologi menggunakan API Kit 20 NE
menunjukkan bahwa isolat QC3.d.5 merupakan bakteri Pseudomonas sp. dengan

tingkat kemiripan 99%. Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa
isolat QC3.a.1 berkerabat dekat dengan Burkholderia cepacia, QC3.a.2 berkerabat
dekat dengan Serratia marcescens dan S. nematodiphila, dan QC3.d.5 berkerabat
dekat dengan Pseudomonas putida.
Kata kunci: bakteri pelarut fosfat dan kalium, indeks pelarutan P dan K, gen 16S
rRNA, Cirebon Quarry

SUMMARY
ELIYA MURSYIDA. Isolation and Identification of Phosphate and Potassium
Solubilizing Bacteria from the Area Around the Limestone Mining in Cirebon
Quarry. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Phosphorus (P) and potassium (K) are important macronutrients that
necessary for growth and development of plants. The needs of P and K in plants
are usually obtained through fertilizer application. However, such effort became
inefficient because P is bound to Fe-P or Al-P in acid soil or Ca-P in alkaline soil,
and K is easily leached by water in the soil, so that P and K are unavailable for
plants. The inefficiency problem of P and K fertilizer can be solved by using
phosphate solubilizing bacteria (PSB) and potassium solubilizing bacteria (KSB)
as biological fertilizer. This study aimed to isolate and identify the phosphate and

potassium solubilizing bacteria from the area around limestone Cirebon Quarry in
relation to the effort of limestone mining reclamation.
This study was conducted using soil samples taken randomly from 0-15 cm
soil depth. The bacteria were isolated from soil samples using serial dilutions and
plated on Pikovskaya and Aleksandrov solid medium. Isolates forming clear zone
were purified using quadrant method. Pure isolates were regrown using dot
method on Pikovskaya and Aleksandrov solid medium to determined the ability of
bacteria to solubilize P and K. Isolates having highest ability to solubilize P and K
were used to determine the growth curve and to estimate quantitatively the P and
K solubilization activity. Morphological and physiological identification were
conducted using API 20 NE Kit, while molecular identification was realized based
on 16S rRNA gene sequence.
The result showed that 12 of 45 bacterial isolates obtained from soil sample
area around the limestone mining in Cirebon were capable to solubilize K mineral.
Based on the solubility index, three isolates having the highest ability to solubilize
P and K were selected. The results of quantitative estimation of selected isolates
to solubilize P and K showed that isolate QC3.a.2 has the highest ability to
solubilizing of P in Pikovskaya liquid medium, and the isolate QC3.a.1 has the
highest activity in solubilizing K in Aleksandrov liquid medium. Physiological
identification using API 20 NE Kit showed that isolate QC3.d.5 is Pseudomonas

sp. with similarity level of 99%. Sequence analysis of 16S rRNA gene showed
that the isolate QC3.a.1 was closely related to Burkholderia cepacia, QC3.a.2 was
closely related to Serratia marcescens and S. nematodiphila, and QC3.d.5 was
closely related to Pseudomonas putida.
Keywords: phosphate-potassium solubilizing bacteria, index of P and K
solubilization, 16S rRNA gene, Cirebon Quarry

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PELARUT
FOSFAT DAN KALIUM DARI KAWASAN SEKITAR
TAMBANG BATU KAPUR CIREBON

ELIYA MURSYIDA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Rahayu Widyastuti, MScAgr

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei sampai Desember

2014 ini ialah isolasi dan identifikasi bakteri pelarut fosfat dan kalium dari
kawasan sekitar tambang batu kapur Cirebon.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
sebagai ketua komisi pembimbing dan Bapak Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA
sebagai anggota komisi pembimbing, yang telah banyak memberikan nasehat,
saran, motivasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis
selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Selain itu
penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Dr Rahayu Widyastuti,
MScAgr dan Prof Dr Anja Meryandini, MS selaku Ketua Program Studi
Mikrobiologi IPB yang telah memberikan nasehat dan saran saat ujian tesis. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Staf PT Indocement, Tbk
yang telah memberikan kesempatannya dalam The Quarry Life Award 2014.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu Heni dan Bapak Jaka
selaku teknisi Laboratorium Mikrobiologi IPB, Mba Rike, Mba Eja, Mba Cesa,
Mba Anja, Kak Sipri, Bang Risky, Erni, Dame, Meli, Zizah, Cico, Sukma, Eka,
Mei serta seluruh teman-teman di Laboratorium IPB, atas dukungan, motivasi dan
bantuannya selama penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga dan paling
spesial penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta Mama & Papa, Bang
Edwin, Zeno, serta seluruh keluarga dan sahabat-sahabatku Ellarisya, atas segala
do’a, dukungan, dan kasih sayangnya. Terima kasih untuk teman-teman

seperjuangan di Pascasarjana Mikrobiologi IPB angkatan 2012 dan 2013 serta
seluruh pihak yang telah memberikan do’a dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2015
Eliya Mursyida

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vii

DAFTAR GAMBAR

vii

DAFTAR LAMPIRAN

vii

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
2
2

TINJAUAN PUSTAKA
Pentingnya Nitrogen, Fosfor dan Kalium untuk Tanaman
Nitrogen
Fosfor
Kalium
Bakteri Pelarut Fosfat

Bakteri Pelarut Kalium
Mekanisme Pelarutan P dan K oleh Mikrob Tanah
Reklamasi Tambang serta Pemanfaatan Mikrob Tanah

2
2
3
3
3
4
4
5
5

METODE
Kerangka Penelitian
Waktu dan Tempat
Bahan
Pengambilan Sampel Tanah
Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dan Kalium dari Tanah

Pengujian Kemampuan Bakteri dalam Melarutkan P dan K
Penentuan Kurva Pertumbuhan Isolat Terpilih
Estimasi Kuantitatif Pelarutan P dan K
Identifikasi Bakteri secara Morfologi dan Fisiologi
Identifikasi Molekuler Isolat Terpilih

6
6
6
7
7
7
7
8
8
8
9

HASIL
Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dan Kalium dari Tanah
Pengujian Kemampuan Bakteri dalam Melarutkan P dan K
Kurva Pertumbuhan Isolat Terpilih
Estimasi Kuantitatif Pelarutan P dan K
Identifikasi Bakteri secara Morfologi dan Fisiologi
Identifikasi Molekuler Isolat Terpilih

10
10
10
10
11
12
13

PEMBAHASAN

14

DAFTAR ISI (Lanjutan)
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

17
17
17

DAFTAR PUSTAKA

18

LAMPIRAN

22

RIWAYAT HIDUP

32

DAFTAR TABEL
1 Hasil pengujian tiga isolat terpilih dalam melarutkan P dan K
2 Karakteristik tiga isolat terpilih berdasarkan pengamatan morfologi

11
13

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8

Diagram alur penelitian
Isolat bakteri QC3.a.1 pada medium Pikovskaya dan Aleksandrov
Pengujian kemampuan tiga isolat terpilih dalam melarutkan P dan K
Kurva pertumbuhan tiga isolat terpilih pada medium Nutrient Broth
selama 39 jam inkubasi
Jumlah sel dan konsentrasi pelarutan P dan K dari tiga isolat terpilih
Hasil pewarnaan Gram diamati pada perbesaran 1000x
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari tiga isolat terpilih
Konstruksi pohon filogenetik dari tiga isolat terpilih berdasarkan
sekuen gen 16S rRNA

6
10
11
11
12
13
14
14

DAFTAR LAMPIRAN
1 Lokasi pengambilan sampel tanah pada kawasan sekitar tambang batu
kapur Cirebon
2 Kurva log jumlah sel terhadap turbiditas dari isolat bakteri QC3.a.1
3 Kurva log jumlah sel terhadap turbiditas dari isolat bakteri QC3.a.2
4 Kurva log jumlah sel terhadap turbiditas dari isolat bakteri QC3.d.5
5 Kurva standar estimasi KH2PO4
6 Tahapan isolasi DNA berdasarkan protokol PrestoTM gDNA Bakteria
Mini Kit (Geneaid)
7 Hasil pengujian 45 isolat bakteri dalam melarutkan P dan K
8 Identifikasi 45 isolat bakteri secara morfologi
9 Hasil identifikasi fisiologi isolat QC3.d.5 menggunakan API Kit 20 NE
10 Kualitas DNA hasil ekstraksi dari tiga isolat terpilih
11 Sekuen isolat bakteri QC3.a.1
12 Sekuen isolat bakteri QC3.a.2
13 Sekuen isolat bakteri QC3.d.5
14 Kesamaan sekuen tiga isolat terpilih dengan spesies pembanding pada
database NCBI
15 Hasil analisis kimia tanah kawasan sekitar tambang batu kapur Cirebon
16 Acceptance Letter

22
22
22
23
23
23
24
25
26
26
27
28
29
30
30
31

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Fosfor (P) dan kalium (K) merupakan unsur utama makronutrien yang
diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Kebutuhan P dan K
untuk tanaman umumnya dipenuhi melalui aplikasi pemupukan. Namun upaya
tersebut menjadi tidak efisien bagi tanaman karena P terikat menjadi Fe-P atau AlP pada tanah masam atau Ca-P pada tanah basa (Lindsay et al. 1989), sedangkan
K mudah tercuci oleh air di dalam tanah. Kurang efisiennya penggunaan pupuk P
dan K dapat diatasi dengan memanfaatkan mikrob pelarut fosfat dan kalium, salah
satunya yaitu bakteri pelarut fosfat (BPF) dan bakteri pelarut kalium (BPK)
sebagai pupuk hayati.
Fosfat dan kalium di dalam tanah terikat dalam bentuk batuan P, mineral K,
atau deposit lainnya (Goldstein 1994) yang tidak dapat diserap oleh tanaman.
Fosfat dan kalium dibuat tersedia bagi tanaman ketika P dan K dikonversi dalam
bentuk terlarut (Bertsch dan Thomas 1985; Kpomblekou dan Tabatabai 1994).
Tanaman menyerap P dalam bentuk ion H2PO4-, HPO42-, dan PO43- , sedangkan K
dalam bentuk ion K+. Fosfat berperan penting dalam merangsang pembungaan,
kematangan buah, dan pembentukan biji (Tucker 2001), sedangkan kalium
berperan penting dalam pertumbuhan dan reproduksi tanaman (Badr 2006).
Bakteri pelarut P diketahui mampu melarutkan P dengan melepaskan
senyawa P melalui mekanisme pembentukan khelat, reaksi pertukaran, dan
produksi asam organik (Chen et al. 2006). Beberapa kelompok bakteri yang
umumnya diketahui mampu melarutkan P antara lain Pseudomonas, Bacillus,
Azotobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Rhizobium, Acinotebacter,
Paenibacillus, Serratia, Burkholderia, Flavobacterium, dan Micrococcus (Chen et
al. 2006; Islam et al. 2007; Walpola dan Yoon 2013; Don dan Diep 2014).
Bakteri pelarut K mampu melarutkan mineral K seperti mika, illit, dan
ortoklas yang terdapat di dalam tanah melalui produksi dan sekresi asam organik
(Friedrich et al. 1991), serta produksi polisakarida kapsuler (Sheng dan He 2006)
yang kemudian dapat diserap oleh tanaman. Beberapa kelompok bakteri pelarut K
diketahui mampu melarutkan K seperti Pseudomonas, Burkholderia, Azotobacter,
Rhizobium, Bacillus, dan Paenibacillus (Hu et al. 2006; Singh et al. 2010; Don
dan Diep 2014) dan dapat digunakan sebagai pupuk hayati.
Sebagian besar pertambangan di Indonesia dilakukan dengan sistem terbuka
(open-pit mining). Salah satu pertambangan sistem terbuka di Indonesia ialah
pertambangan batu kapur (quarry) Palimanan, Cirebon. Mikrob seperti bakteri
pelarut P dan bakteri pelarut K dapat dikembangkan menjadi pupuk hayati yang
bermanfaat bagi kesuburan tanah dan tanaman pada lahan bekas tambang.
Mubarik et al. (2014) telah mengeksplorasi keanekaragaman bakteri dari tambang
batu kapur Cirebon. Meskipun demikian, belum ada laporan mengenai
kemampuan bakteri dalam melarutkan P dan K secara kuantitatif dari tambang
batu kapur Cirebon, oleh karena itu dilakukan penelitian.

2
Perumusan Masalah
Pertambangan yang dilakukan secara terbuka mengakibatkan terjadinya
perubahan sifat fisik, kimia, dan biologi tanah. Revegetasi di daerah
pertambangan biasanya tidak mencapai keberhasilan yang diinginkan karena
tingginya angka kematian suatu spesies atau lambatnya pertumbuhan spesies yang
ditanam. Hal ini disebabkan oleh kurangnya ketersediaan unsur-unsur hara bagi
tanaman. Mikrob yang meliputi BPF dan BPK dinilai dapat digunakan sebagai
salah satu alternatif untuk mengatasi ketersediaan unsur hara terutama P dan K di
lahan reklamasi bekas tambang batu kapur.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini ialah melakukan isolasi dan identifikasi bakteri pelarut
fosfat dan kalium dari kawasan sekitar tambang batu kapur Cirebon, dan
mempelajari kemampuan bakteri dalam melarutkan P dan K.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai spesies
bakteri pelarut fosfat dan kalium yang potensial untuk dimanfaatkan dalam upaya
reklamasi tambang batu kapur serta upaya peningkatan pertumbuhan dan
produktivitas tanaman pada daerah lahan bekas tambang.

Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi pengujian kemampuan bakteri
dalam melarutkan P dan K berdasarkan indeks pelarutan, estimasi kuantitatif
pelarutan P dan K, identifikasi bakteri secara morfologi, fisiologi, serta analisis
gen 16S rRNA isolat terpilih.

TINJAUAN PUSTAKA
Pentingnya Nitrogen, Fosfor, dan Kalium untuk Tanaman
Nutrisi sangat penting bagi tanaman untuk pertumbuhannya. Nitrogen (N),
fosfor (P), dan kalium (K) ialah makronutrien utama yang dibutuhkan dalam
jumlah besar, sedangkan unsur mikro seperti tembaga, boron dan zat besi
umumnya diperlukan dalam jumlah sedikit. Di dalam tanah, nutrisi mineral yang
terlarut dapat diserap oleh tanaman melalui akar. Namun, jumlah nutrisi di dalam
tanah bersifat dinamis dan tidak cukup untuk pertumbuhan tanaman. Akibatnya,
nutrisi utama yaitu N, P, dan K yang dibutuhkan dalam jumlah besar oleh
tanaman, saat ini dipenuhi dari pemupukan.

3
Menurut Wu et al. (2005), penggunaan pupuk hayati tidak hanya
meningkatkan kadar unsur hara pada tanaman seperti N, P dan K, tetapi juga
menjaga kandungan senyawa organik dan N-total dalam tanah. Hal lain yang
menguntungkan ialah bahwa mikrob tanah dapat mendorong peningkatan
pertumbuhan rambut-rambut akar sehingga penyerapan air dan hara menjadi lebih
efisien.

Nitrogen
Nitrogen sangat penting dalam pembentukan protein dan senyawa lainnya.
Pada dasarnya, nitrogen diambil oleh tanaman dalam bentuk nitrat (NO3-) atau
amonium (NH4+). Amonium diproduksi oleh dekomposer dan bakteri nitrogen
tanah melalui proses amonifikasi. Bakteri nitrifikasi akan mengubah amonium
menjadi nitrit sebagai senyawa perantara melalui proses nitrifikasi sebelum diubah
menjadi nitrat yang akan diambil oleh tanaman dalam proses asimilasi.
Pupuk N, bila diaplikasikan pada tanah, akan cepat meningkatkan
konsentrasi ion amonium dalam larutan tanah, tetapi segera hilang melalui
penyerapan oleh tanaman, imobilisasi oleh mikrob, pencucian, dan denitrifikasi
(Houng 1976). Nitrogen yang hilang dapat dikembalikan ke dalam tanah melalui
pelapukan sisa mahluk hidup (bahan organik) melalui bantuan mikrob tanah.

Fosfor
Fosfor merupakan unsur utama yang diperlukan tanaman setelah nitrogen.
Fosfor yang diserap tanaman tidak direduksi, melainkan berada dalam bentuk
teroksidasi seperti senyawa-senyawa organik dan anorganik. Peranan P bagi
tanaman antara lain merupakan komponen membran sitoplasma dan kloroplas,
proses metabolisme tanaman seperti ATP, ADP, dan AMP, pembentukan
nukleotida dalam penyusunan DNA dan RNA (Salisbury dan Ross 1995).
Fosfat di dalam tanah dibedakan menjadi dua bentuk, yaitu P-organik dan Panorganik (Handayanto dan Hairiah 2007). Senyawa P-organik berada dalam
bentuk senyawa organik kompleks yang berasal dari sisa-sisa tanaman, hewan,
mikrob tanah, dan organisme lainnya. Bentuk P-organik terdapat sebagai senyawa
ester dari asam orthofosfat diantaranya inositol fosfat, fosfolipid, asam nukleat,
nukleotida, dan gula-gula fosfat. Kandungan P-organik di dalam tanah sekitar 3050% dari P-total tanah dan kandungannya bervariasi tergantung pada jenis tanah.
Bentuk P-anorganik dapat dibedakan menjadi P aktif yang meliputi Ca-P, Al-P,
Fe-P, dan P tidak aktif yang meliputi occluded-P, reductant-P, dan mineral P
primer.

Kalium
Selain unsur N dan P yang dibutuhkan tanaman, unsur K juga memegang
peranan penting. Peranan K bagi tanaman antara lain aktivasi enzim, berperan
dalam mengatur transpor air dan nutrisi melalui xylem, dan meningkatkan hasil
panen (Doman 1979; Marschner 1995). Menurut Soepardi (1983) kalium penting

4
untuk pembentukan protein dan selulosa. Unsur K dapat meningkatkan respon
tanaman terhadap pemupukan dan meningkatkan efisiensi penggunaan pupuk N
dan P. Kalium dalam jumlah yang cukup akan menjamin ketegaran tanaman dan
merangsang pertumbuhan akar. Kalium memperkuat batang tanaman yang berarti
mempertinggi ketahanan tanaman terhadap serangan cendawan patogen seperti
Pyricularia oryzae dan Helminthosporium.
Sebagian tanah di dunia, kandungan K tersedia sangat rendah untuk
produksi hasil tanaman yang baik. Konsentrasi K tersedia berkisar antara 1-2% di
dalam tanah yang dapat diserap langsung oleh tanaman (Goldstein 1994).
Kelompok mikrob tertentu seperti bakteri, jamur, dan aktinomiset diketahui
mampu melarutkan mineral K menjadi bentuk yang larut yang dapat dimanfaatkan
oleh tanaman. Pemanfaatan mikrob pelarut K dapat memberikan alternatif
potensial untuk membuat K tersedia dan dapat diserap oleh tanaman.

Bakteri Pelarut Fosfat
Bakteri pelarut fosfat (BPF) merupakan kelompok bakteri tanah yang
memiliki kemampuan melarutkan P yang terfiksasi dalam tanah dan mengubahnya
menjadi bentuk yang tersedia. Bakteri pelarut P ini dapat berupa bakteri
Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus, dan Streptomyces. Menurut Rodriguez dan
Fraga (1999), dari beberapa kelompok bakteri, ternyata genus Pseudomonas dan
Bacillus mempunyai kemampuan yang tinggi dalam melarutkan P.
Keefektifan bakteri pelarut P yang hidup dalam permukaan akar seperti
Pseudomonas fluorescens, P. putida, dan P. striata tidak hanya disebabkan oleh
kemampuannya dalam meningkatkan ketersediaan unsur P, tetapi juga
kemampuannya dalam menghasilkan zat pengatur tumbuh. Mikrob-mikrob
tersebut dapat menghasilkan zat pengatur tumbuh seperti asam indol asetat (IAA)
dan asam giberellin (GA3) (Arshad dan Frankenberger 1993; Patten dan Glick
1996), serta memiliki kemampuan sebagai agens biokontrol dan menurunkan
endosulfan seperti pestisida organoklorin (Kukreja et al. 2010).

Bakteri Pelarut Kalium
Bakteri pelarut kalium (BPK) merupakan kelompok bakteri tanah yang
memiliki kemampuan melarutkan mineral K seperti mika, illit, dan ortoklas.
Bakteri pelarut K dapat melarutkan mineral K menjadi bentuk terlarut melalui
produksi dan sekresi asam organik. Bakteri pelarut K ini dapat berupa
Pseudomonas, Bacillus, Erwinia, dan Streptomyces. Menurut Raj (2004), ternyata
genus Bacillus mempunyai kemampuan yang lebih efisien dalam melarutkan
mineral K atau silikat pada kondisi in vitro.
Penggunaan bakteri pelarut K pada tanaman dilaporkan dapat memberikan
efek yang menguntungkan pada pertumbuhan kapas dan lobak (Sheng 2005),
merica dan mentimun (Han et al. 2006), tomat (Badr 2006), gandum (Sheng dan
He 2006), dan rumput sudan (Basak dan Biswas 2008). Menurut Singh et al.
(2010), inokulasi tanaman jagung dan gandum dengan Bacillus maciloginosus,
Azotobacter chroococcum, dan Rhizobium dapat mengakibatkan mobilisasi K

5
yang lebih tinggi dari limbah mika, sehingga dapat dimanfaatkan untuk
pertumbuhan tanaman. Dengan demikian, penerapan bakteri pelarut K sebagai
pupuk hayati untuk perbaikan pertanian dapat mengurangi penggunaan pupuk
kimia dan mendukung produksi tanaman yang ramah lingkungan.

Mekanisme Pelarutan P dan K oleh Mikrob Tanah
Pelarutan senyawa P oleh mikrob pelarut P dapat berlangsung secara kimia
dan biologi. Mekanisme pelarutan P secara kimia merupakan mekanisme
pelarutan P utama yang dilakukan oleh mikrob pelarut P. Mikrob pelarut P
mensekresikan sejumlah asam organik berbobot molekul rendah seperti oksalat,
suksinat, tartat, sitrat, laktat, alfa ketoglutarat, asetat, formiat, propionat, glikolat,
glutamat, glioksilat, malat, fumarat. Asam-asam organik ini dapat membentuk
khelat (kompleks stabil) dengan kation Al, Fe atau Ca yang mengikat P, sehingga
ion H2PO4- menjadi bebas dari ikatannya dan tersedia bagi tanaman untuk diserap
(Illmer dan Schinner 1992; Hasanudin 2006).
Mekanisme pelarutan P secara biologi oleh mikrob pelarut P dilakukan
dengan cara menghasilkan enzim antara lain enzim fosfatase. Fosfatase
merupakan enzim yang akan dihasilkan apabila ketersediaan P rendah. Fosfatase
disekresikan oleh akar tanaman dan lebih dominan oleh mikrob di dalam tanah
(Joner et al. 2000). Dalam proses mineralisasi bahan organik, senyawa P organik
diuraikan menjadi bentuk P anorganik yang tersedia bagi tanaman dengan bantuan
enzim fosfatase. Enzim fosfatase dapat melepaskan P yang terikat pada senyawasenyawa organik menjadi bentuk yang tersedia.
Mekanisme pelarutan K dari mineral K tidak larut seperti mika, illit dan
ortoklas ialah dengan mensekresikan asam organik oleh bakteri pelarut K yang
secara langsung melarutkan batuan K atau mengkhelat ion silikat untuk membawa
K ke dalam bentuk terlarut (Aleksandrov et al. 1967; Bennett et al. 1998). Selain
itu, Styriakova et al. (2003) mengatakan bahwa pelarutan K terjadi karena adanya
pembentukan kompleks antara asam organik yang disekresikan bakteri dan ion
logam yang berikatan dengan mineral K seperti Fe2+, Al3+, dan Ca2+.

Reklamasi Tambang serta Pemanfaatan Mikrob Tanah
Reklamasi adalah usaha untuk memperbaiki atau memulihkan kembali lahan
yang rusak sebagai akibat kegiatan usaha pertambangan agar dapat berfungsi dan
berdaya guna sesuai dengan kemampuannya. Reklamasi lahan bekas tambang
merupakan upaya untuk memperbaiki kondisi lingkungan pasca tambang, juga
untuk menghasilkan lingkungan ekosistem yang lebih baik dibandingkan rona
awalnya. Proses reklamasi pada lahan bekas tambang dilakukan dengan
mempertimbangkan potensi bahan galian yang masih tertinggal. Namun, upaya
perbaikan dengan cara ini masih dirasakan kurang efektif, hal ini karena tanaman
secara umum kurang dapat beradaptasi dengan lingkungan ekstrim, termasuk
bekas lahan tambang.
Keberadaan mikrob tanah potensial dapat memainkan peranan sangat
penting bagi perkembangan dan kelangsungan hidup tanaman. Aktivitasnya tidak

6
saja terbatas pada penyediaan unsur hara, tetapi juga aktif dalam dekomposisi
serasah dan bahkan dapat memperbaiki struktur tanah. Dengan demikian, untuk
memperbaiki lahan bekas tambang perlu dilakukan pemanfaatan mikrob terutama
bakteri pelarut P dan bakteri pelarut K yang diharapkan dapat menjadi biofertilizer
yang mampu memberikan unsur P dan K yang tersedia bagi tanaman, sehingga
tanaman dapat memanfaatkannya (Mursyidin 2009).

METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian ini (Gambar 1) meliputi isolasi bakteri pelarut P dan K,
uji pelarutan P dan K berdasarkan indeks pelarutan, estimasi kuantitatif pelarutan
P dan K, dan analisis gen 16S rRNA isolat terpilih.
Isolasi bakteri pelarut
fosfat dan kalium

Pengujian pelarutan P dan K
berdasarkan indeks pelarutan

Penentuan kurva
pertumbuhan isolat terpilih

Identifikasi isolat terpilih

Morfologi dan fisiologi

Amplifikasi gen 16S rRNA

Estimasi kuantitatif
pelarutan P dan K
Gambar 1 Diagram alur penelitian

Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Mei 2014 sampai Desember 2014.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, Institut Pertanian Bogor (IPB).

7
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini ialah sampel tanah yang berasal
dari kawasan sekitar tambang batu kapur PT Indocement Tbk, Palimanan, Cirebon
(Lampiran 1).

Pengambilan Sampel Tanah
Pengambilan sampel tanah dilakukan dengan menggunakan metode
purposive random sampling. Sampel tanah diambil secara acak dari 10 titik pada
lapisan permukaan antara 0-15 cm.

Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dan Kalium dari Tanah
Sebanyak 3 gram sampel tanah dimasukkan ke dalam 27 ml larutan garam
fisiologis 0.85%, dan diinkubasi dalam inkubator goyang pada kecepatan 120 rpm
selama 4 jam pada suhu ruang, kemudian dibuat pengenceran serial sampai 10-4.
Sebanyak 0.1 ml dari pengenceran 10-2 sampai 10-4 disebar di atas permukaan
medium agar-agar Pikovskaya yang terdiri atas 10 g C6H12O6, 5 g Ca3(PO4)2, 0.5
g (NH4)2SO4, 0.2 g KCl, 0.1 g MgSO4.7H2O, 0.002 g MnSO4.7H2O, 0.002 g
FeSO4.7H2O, 0.1 g NaCl, 0.5 g ekstrak khamir, 20 g agar-agar dalam 1000 ml
dengan pH 7 (Nautiyal 1999), dan medium agar-agar Aleksandrov yang terdiri
atas 5 g C6H12O6, 0.5 g MgSO4.7H2O, 0.1 g CaCO3, 0.006 g FeCl3, 2 g Ca3(PO4)2,
3 g KAlSi3O8 (feldspar), 20 g agar-agar dalam 1000 ml dengan pH 7 (Prajapati
dan Modi 2012), dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Pertumbuhan
koloni bakteri pelarut P dan K ditandai dengan pembentukan zona bening di
sekitar koloni. Koloni-koloni yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dengan
metode gores kuadran pada medium Pikovskaya dan Aleksandrov untuk
mendapatkan koloni tunggal. Isolat yang diperoleh disimpan sebagai stok untuk
uji selanjutnya.

Pengujian Kemampuan Bakteri dalam Melarutkan P dan K
Isolat bakteri pelarut P yang telah murni, ditumbuhkan kembali pada
medium Pikovskaya padat untuk pelarutan P dan medium Aleksandrov padat
untuk pelarutan K dengan cara dititik, dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu
ruang. Setelah inkubasi, zona bening yang terbentuk di sekitar koloni diukur dan
dihitung indeks pelarutan (IP) P dan K pada masing-masing koloni untuk
mengetahui daya degradasi bakteri terhadap P dan K dengan persamaan berikut.

8
Penentuan Kurva Pertumbuhan Isolat Terpilih
Sebanyak 1 lup kultur isolat bakteri terpilih diinokulasikan ke dalam 50 ml
medium Nutrient Broth (NB) dan diinkubasi dengan inkubator goyang hingga sel
bakteri mencapai 107 CFU/ml. Sebanyak 1 ml kultur 107 CFU/ml diinokulasikan
ke dalam 100 ml medium NB, lalu diinkubasi dengan inkubator goyang
berkecepatan agitasi 100 rpm pada suhu 37 oC selama 24-48 jam. Setiap 3 jam
dilakukan pengambilan kultur sel untuk pengukuran densitas selnya menggunakan
spektrofotometer Genesys 20 pada panjang gelombang 620 nm. Jumlah sel
dihitung dengan menggunakan kurva log jumlah sel terhadap turbiditas dari tiga
isolat terpilih yang dibuat sebelumnya (Lampiran 2, 3 dan 4).

Estimasi Kuantitatif Pelarutan P dan K
Estimasi kuantitatif P yang dilarutkan oleh isolat bakteri terpilih dilakukan
berdasarkan metode Lynn et al. (2013). Sebanyak 1 lup kultur bakteri
diinokulasikan ke dalam 50 ml medium Pikovskaya cair, kemudian diinkubasi
dalam inkubator goyang selama 48 jam. Setelah inkubasi, sebanyak 1 ml kultur
diinokulasikan ke dalam 100 ml medium Pikovskaya cair, dan diinkubasi dalam
inkubator goyang selama 7 hari pada suhu 37 oC. Setiap 24 jam, sebanyak 1.5 ml
kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10.600 g selama 10 menit untuk
memisahkan sel bakteri dari supernatan. Supernatan hasil sentrifugasi diambil
sebanyak 1 ml dan direaksikan dengan pereaksi pembentuk warna (2.5 ml natrium
molibdat 2.5% dan 1 ml hidrazin sulfat 0.3%), kemudian dipanaskan selama 10
menit dan didinginkan. Setelah terbentuk warna biru, aktivitas pelarutan P diukur
dengan spektrofotometer Genesys 20 pada panjang gelombang 830 nm. Kurva
standar dibuat dengan menggunakan konsentrasi KH2PO4 untuk standar 0, 20, 40,
60, 80, dan 100 ppm (Lampiran 5).
Estimasi kuantitatif K yang dilarutkan oleh isolat bakteri terpilih dilakukan
berdasarkan metode Parmar dan Sindhu (2013). Sebanyak 1 lup kultur bakteri
diinokulasikan ke dalam 50 ml medium Aleksandrov cair, dan diinkubasi dalam
inkubator goyang selama 48 jam. Setelah inkubasi, sebanyak 0.5 ml kultur
diinokulasikan ke dalam 50 ml medium Aleksandrov cair, dan diinkubasi dalam
inkubator goyang selama 25 hari pada suhu 28 oC. Setiap 5 hari, sebanyak 3 ml
kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10.600 g selama 10 menit untuk
memisahkan koloni bakteri dari supernatan. Jumlah kalium terlarut dalam
supernatan diukur dengan spektrofotometer serapan atom Shimadzu AA-7000
dengan flame air-C2H2 pada panjang gelombang 766.5 nm. Kurva standar dibuat
dengan menggunakan konsentrasi KCl untuk standar 0, 0.5, 1, 1.5, dan 2 ppm.

Identifikasi Bakteri secara Morfologi dan Fisiologi
Identifikasi secara morfologi dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat
bakteri pada medium Nutrient Agar (NA) secara gores kuadran, dan diinkubasi
selama 48 jam. Morfologi koloni yang diamati meliputi bentuk, tepian, elevasi,
dan warna koloni. Pewarnaan Gram dilakukan untuk melihat jenis dan bentuk sel
bakteri (Hadioetomo 1993). Identifikasi secara fisiologi dengan menggunakan

9
metode Analytical Profile Index (API) 20 NE biochemical test kit (bioMerieux,
Inc. Durham, USA). Isolat ditumbuhkan pada medium NA dan diinkubasi pada
suhu 37 oC selama 24 jam. Sebanyak 1 lup isolat dilarutkan dalam 2 ml garam
fisiologi 0.85%, dan dihomogenkan. Selanjutnya, sebanyak 200 μl suspensi isolat
bakteri diteteskan ke dalam sumur tanpa garis, dan 200 μl suspensi isolat bakteri
ditambahkan ke medium API Kit lalu diteteskan ke dalam sumur bergaris.
Pembacaan hasil test didasarkan pada tabel baca API 20 NE, kemudian digunakan
program (software) API 20 NE untuk mengetahui spesies bakteri dari isolat yang
diuji.

Identifikasi Molekuler Isolat Terpilih
Identifikasi molekuler terhadap isolat terpilih dari lokasi pengambilan
sampel dilakukan dalam beberapa tahapan, yaitu isolasi DNA genom bakteri,
amplifikasi gen 16S rRNA dan sekuening DNA hasil amplifikasi.
Isolasi DNA Genom Bakteri
Koloni bakteri tunggal dari isolat terpilih pada medium NA diinokulasikan
ke dalam 50 ml medium Luria Broth (LB), dan diinkubasi pada inkubator goyang
berkecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel
bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10.600 g selama 10 menit. DNA genom
bakteri diisolasi (diekstraksi) menggunakan protokol dari PrestoTM gDNA
Bakteria Mini Kit (Geneaid) (Lampiran 6). Kualitas dan kuantitas DNA genom
diukur menggunakan spektrofotometer NanoDrop 2000 (Thermo Scientific,
Wilmington, DE, USA).
Amplifikasi Gen 16S rRNA
Reaksi PCR mix dibuat sebanyak 50 μl dengan komposisi yaitu: masingmasing 3 μl primer 63f (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan primer
1387r (5’-GGGCGGCGTGTACAAGGC-3’) (Marchesi et al. 1998) konsentrasi
10 pmol, 25 μl GoTaq Green Master Mix 2x (Promega, Madison, W1, USA), 12
µl ddH2O, dan 7 µl template DNA. PCR dilakukan dengan kondisi sebagai
berikut: predenaturasi 95 oC selama 5 menit, 30 siklus yang terdiri dari denaturasi
95 oC selama 1 menit, annealing 55 oC selama 1 menit, dan elongasi 72 oC selama
1.5 menit. Setelah siklus terakhir, reaksi dilanjutkan dengan pasca elongasi pada
suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis menggunakan gel
agarosa 1% pada tegangan 75 volt selama 46 menit, kemudian diwarnai dengan
etidium bromida dan didokumentasikan (dipotret) di bawah sinar UV.
Sekuening DNA dan Analisis Filogenetik
DNA hasil amplifikasi dikirimkan ke perusahaan jasa sekuensing untuk
mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil sekuen DNA yang diperoleh kemudian
dibandingkan dengan sekuen pada database menggunakan program BLAST-N
yang tersedia pada website NCBI (National Center for Biotechnology
Information):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Analisis
filogenetik
dilakukan dengan menggunakan program MEGA 5.05 dengan metode Neighbour
Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.

10

HASIL
Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dan Kalium dari Tanah
Isolasi dari 10 sampel tanah dari kawasan sekitar tambang batu kapur
Cirebon menghasilkan 45 isolat yang mampu melarutkan P pada medium
Pikovskaya, sedangkan isolasi dari 10 sampel tanah tidak menghasilkan isolat
yang mampu melarutkan K pada medium Aleksandrov. Isolat dimurnikan pada
cawan dengan metode gores kuadran (Gambar 2), kemudian disimpan pada agaragar miring Pikovskaya sebagai stok.

Gambar 2 Isolat bakteri QC3.a.1 pada medium Pikovskaya (a) dan Aleksandrov
(b)

Pengujian Kemampuan Bakteri dalam Melarutkan P dan K
Isolat bakteri pelarut P yang telah murni, diuji kemampuannya dalam
melarutkan P dan K secara kualitatif melalui pembentukan zona bening di sekitar
koloni dengan cara menghitung indeks pelarutannya (IP). Di antara 45 isolat
pelarut P yang diperoleh, terdapat 12 isolat yang mampu melarutkan K (Lampiran
7). Berdasarkan nilai indeks pelarutan, dipilih tiga isolat yang mampu melarutkan
P dan K tertinggi (Tabel 1; Gambar 3) untuk analisis selanjutnya.

Kurva Pertumbuhan Isolat Terpilih
Pertumbuhan bakteri dapat diamati melalui peningkatan jumlah sel terhadap
waktu. Isolat QC3.a.1 mengalami fase akhir eksponensial pada jam ke-9 dengan
jumlah bakteri rata-rata 8.2x107 CFU/ml, setelah itu diikuti dengan fase stasioner
hingga jam ke-24. Isolat QC3.a.2 pada jam ke-0 hingga jam ke-27 mengalami
peningkatan jumlah bakteri berkisar antara 7.3x108 CFU/ml - 9.0x108 CFU/ml,
setelah itu masuk fase stasioner pada jam ke-30. Isolat QC3.d.5 mengalami fase
akhir eksponensial pada jam ke-9 dengan jumlah bakteri rata-rata 8.1x107 CFU/ml
dan mengalami peningkatan jumlah bakteri secara perlahan hingga jam ke-39
(Gambar 4). Data kurva pertumbuhan selanjutnya digunakan untuk menentukan
umur bakteri yang akan diuji pada tahap identifikasi isolat bakteri secara
morfologi, fisiologi, dan analisis gen 16S rRNA isolat terpilih.

11
Tabel 1 Hasil pengujian tiga isolat terpilih dalam melarutkan P dan K
No
1
2
3

Kode Isolat
QC3.a.1
QC3.a.2
QC3.d.5

Indeks Pelarutan P
1.00
0.34
0.81

Indeks Pelarutan K
1.29
3.73
0.31

Log jumlah sel (cfu/ml)

Gambar 3 Pengujian kemampuan tiga isolat terpilih dalam melarutkan P dan K.
(1) QC3.a.1, (2) QC3.a.2, dan (5) QC3.d.5 pada medium Pikovskaya
(a) dan Aleksandrov (b)
9,4
9,0
8,6
8,2
7,8
7,4
7,0
6,6
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39

Waktu (jam)
-◊- QC3.a.1, -□- QC3.a.2, -∆- QC3.d.5
Gambar 4 Kurva pertumbuhan tiga isolat terpilih pada medium Nutrient Broth
selama 39 jam inkubasi

Estimasi Kuantitatif Pelarutan P dan K
Hasil estimasi kuantitatif pelarutan P dan K dari isolat terpilih menunjukkan
bahwa masing-masing isolat memiliki waktu (hari) optimum yang berbeda dalam
melarutkan P dan K. Hasil estimasi kuantitatif pelarutan P menunjukkan bahwa
isolat QC3.a.1 melarutkan P tertinggi pada hari ke-5, yaitu 50.83 mg/L, isolat
QC3.a.2 melarutkan P tertinggi pada hari ke-7, yaitu 80.61 mg/L, dan isolat
QC3.d.5 melarutkan P tertinggi pada hari ke-4, yaitu 43.22 mg/L (Gambar 5A-C).
Kontrol tanpa kultur pada estimasi pelarutan P yaitu 0.56 mg/L. Hasil estimasi
kuantitatif pelarutan K menunjukkan isolat QC3.a.1 melarutkan K tertinggi pada

12

100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0

8,0
6,0
4,0
0

1

2

3

4

5

6

7

Log jumlah sel (cfu/ml)

10,0

D. isolat QC3.a.1
10,0

2,0
1,5

8,0

1,0
6,0

0,5

4,0

0,0
0

5

10,0
8,0
6,0
4,0
4 5

6 7

Log jumlah sel (cfu/ml)

100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
2 3

E. isolat QC3.a.2
2,0
1,5

8,0

1,0
6,0

0,5

4,0

0,0
0

5

80,0
60,0
40,0

6,0

20,0
0,0

4,0
0 1 2 3 4 5 6 7

Log jumlah sel (cfu/ml)

100,0

8,0

15

20

25

F. isolat QC3.d.5
10,0

2,0
1,5

8,0

1,0
6,0

0,5

4,0

0,0
0

5

10

15

20

25

Konsentrasi K (mg/L)

C. isolat QC3.d.5
10,0

10

Waktu (hari)

Konsentrasi P (mg/L)

Log jumlah sel (cfu/ml)

25

10,0

Waktu (hari)

Waktu (hari)

20

Konsentrasi K (mg/L)

B. isolat QC3.a.2

0 1

15

Waktu (hari)

Konsentrasi P (mg/L)

Log jumlah sel (cfu/ml)

Waktu (hari)

10

Konsentrasi K (mg/L)

A. isolat QC3.a.1

Konsentrasi P (mg/L)

Log jumlah sel (cfu/ml)

hari ke-25, yaitu 1.7 mg/L, isolat QC3.a.2 melarutkan K tertinggi pada hari ke-25,
yaitu 1.1 mg/L, dan isolat QC3.d.5 melarutkan K tertinggi pada hari ke-20, yaitu
1.1 mg/L (Gambar 5D-F). Kontrol tanpa kultur pada estimasi pelarutan K yaitu
0.4 mg/L.

Waktu (hari)

Gambar 5 Jumlah sel dan konsentrasi pelarutan P (A-C) dan K (D-F) dari tiga
isolat terpilih. (-♦-) = log jumlah sel, (-□-) = konsentrasi P, dan (-∆-)
konsentrasi K.

Identifikasi Bakteri secara Morfologi dan Fisiologi
Identifikasi bakteri secara morfologi dari 45 isolat bakteri menunjukkan
karakter yang berbeda (Lampiran 8). Tiga isolat terpilih memiliki perbedaan
karakter elevasi dan warna koloni (Tabel 2). Berdasarkan hasil pewarnaan Gram,
diketahui bahwa ketiga isolat merupakan bakteri Gram negatif. Isolat QC3.a.1 dan
QC3.d.5 berbentuk basil, sedangkan isolat QC3.a.2 berbentuk kokus (Gambar 6).

13
Hasil identifikasi bakteri secara fisiologi menggunakan API Kit 20 NE (Lampiran
9) menunjukkan bahwa isolat QC3.d.5 merupakan bakteri Pseudomonas sp.
dengan tingkat kemiripan 99% dengan hasil positif terhadap uji L-arginin, urea,
gelatin, D-glukosa, D-mannosa, D-mannitol, N asetil glukosamin, kalium
glukonat, asam kaprat, asam malat, trisodium sitrat dan asam fenilasetat. Isolat
QC3.a.1 dan QC3.a.2 telah diidentifikasi sebelumnya menggunakan API Kit 20
NE/E dan masing-masing merupakan bakteri Burkholderia cepacia dan
Burkholderia sp. (Mubarik et al. 2014).
Tabel 2 Karakteristik tiga isolat terpilih berdasarkan pengamatan morfologi
Kode isolat
QC3.a.1
QC3.a.2
QC3.d.5

Bentuk
Bundar
Bundar
Bundar

Karakteristik Morfologi
Tepian
Elevasi
Warna
Licin
Cembung
Kuning
Licin
Datar
Putih kekuningan
Licin
Datar
Kuning

Gambar 6 Hasil pewarnaan Gram diamati pada perbesaran 1000x. (a) QC3.a.1,
(b) QC3.a.2, dan (c) QC3.d.5.

Identifikasi Molekuler Isolat Terpilih
Isolasi genom DNA dari tiga isolat terpilih menggunakan PrestoTM gDNA
Bakteria Mini Kit menghasilkan kualitas DNA sekitar 1.9 pada rasio A260/A280
(Lampiran 10). Amplifikasi gen 16S rRNA dari tiga isolat terpilih menggunakan
primer 63f dan 1387r (Marchesi et al. 1998) menghasilkan satu amplikon
berukuran sekitar 1300 bp (Gambar 7) yang memiliki sekuen nukleotida seperti
tercantum pada lampiran 11, 12 dan 13. Analisis pohon filogenetik menunjukkan
bahwa isolat QC3.a.1 berkerabat dekat dengan Burkholderia cepacia dengan
tingkat kemiripan 99%, isolat QC3.a.2 berkerabat dekat dengan Serratia
marcescens dan S. nematodiphila dengan tingkat kemiripan 98%, dan isolat
QC3.d.5 berkerabat dekat dengan Pseudomonas putida dengan tingkat kemiripan
99-100% (Gambar 8; Lampiran 14).

14

Gambar 7 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari tiga isolat terpilih. M=1kb,
Sumur 1-3=QC3.d.5, QC3.a.1, dan QC3.a.2
Serratia marcescens galur By2Root2
Serratia marcescens galur S4
100
Serratia nematodiphila galur MUGA215
Isolat QC3.a.2
Pseudomonas putida galur GG65
Pseudomonas putida galur IBFC2012-17
100
Isolat QC3.d.5
69
Pseudomonas putida galur ACO-140
Isolat QC3.a.1
72
Burkholderia cepacia galur K1
Burkholderia
cepacia galur SE-1
100
Burkholderia sp. TCP10
100 Pediococcus pentosaceus galur E24-160
Pediococcus pentosaceus galur V3-86
Bacillus subtilis galur L7
100 Bacillus amyloliquefaciens galur KAVK1
98

93

100

0.02

Gambar 8 Konstruksi pohon filogenetik dari tiga isolat terpilih berdasarkan
sekuen gen 16S rRNA

PEMBAHASAN
Hasil analisis kimia tanah (Lampiran 15), menunjukkan bahwa kawasan
sekitar tambang batu kapur Cirebon memiliki pH tanah bersifat basa (agak
alkalis), C-organik tergolong rendah, P-Bray I atau tersedia tergolong sangat
rendah, serta basa-basa kation seperti K, dan kapasitas tukar kation tergolong

15
sedang. Berdasarkan kriteria (PPT 1983), tingkat kesuburan tanah pada kawasan
sekitar tambang tersebut tergolong rendah. Tingkat kesuburan tanah ialah
kemampuan tanah dalam menyediakan unsur-unsur hara dalam jumlah yang
cukup dan seimbang bagi pertumbuhan suatu tanaman.
Sebanyak 45 isolat bakteri pelarut P berhasil diisolasi dari tanah sekitar
tambang batu kapur Cirebon, dan 12 diantaranya mampu melarutkan K. Suliasih
dan Rahmat (2007) mengatakan bahwa bakteri yang tumbuh pada medium
Pikovskaya akan melarutkan P yang ditandai dengan zona bening di sekitar koloni
akibat adanya pelarutan Ca3(PO4)2. Bashan et al. (2013) menegaskan bahwa
pelarutan P terjadi karena adanya pelepasan proton seperti H+ dengan mekanisme
pelarutan P sama dengan trikalsium fosfat Ca3(PO4)2, yang dideskripsikan sebagai
berikut: Ca3(PO4)2 + 2H+  2CaHPO4 + Ca2+. Isolasi dari tanah tidak didapatkan
bakteri yang mampu melarutkan K, diduga populasi bakteri pelarut K pada tanah
daerah sekitar tambang batu kapur rendah jika dibandingkan populasi bakteri
pelarut P dan juga kemampuan bakteri itu sendiri dalam merebutkan sumber
energi yang sama dihabitatnya.
Pengujian dalam melarutkan P dan K berdasarkan indeks pelarutan
menghasilkan dua isolat yang berpotensi dalam melarutkan P tertinggi pada
medium Pikovskaya padat yaitu QC3.a.1 dan QC3.d.5, serta dua isolat yang
berpotensi dalam melarutkan K tertinggi pada medium Aleksandrov padat yaitu
QC3.a.1 dan QC3.a.2 (Tabel 1). Variasi nilai indeks pelarutan tersebut karena
adanya perbedaan kemampuan bakteri dalam mensekresikan asam organik
ekstraselulernya atau jenis asam organik yang dihasilkan. Mekanisme utama
pelarutan P dan K yang tidak larut ialah melalui produksi dan sekresi asam
organik (Archana 2007; Song et al. 2008).
Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni pada medium tidak selalu
disebabkan oleh besar atau tidaknya ukuran suatu koloni. Hal ini ditunjukkan dari
penelitian bahwa diameter koloni yang besar tidak selalu menghasilkan zona
bening yang besar pula (Gambar 3). Selain itu, zona bening yang terbentuk pada
medium Pikovskaya dan Aleksandrov padat tidak dapat menunjukkan jumlah
(konsentrasi) P dan K yang dilarutkan oleh bakteri. Meskipun luas zona bening
dapat menunjukkan kemampuan relatif bakteri dalam melarutkan P dan K, tetapi
tidak dapat menunjukkan jumlah (konsentrasi) P dan K yang terlarut di dalam
medium (Tatiek 1991; Lynn et al. 2013). Oleh karena itu, dilakukan pengujian
pelarutan P dan K secara kuantitatif untuk mengetahui berapa jumlah
(konsentrasi) P dan K yang dilarutkan oleh bakteri.
Pertumbuhan bakteri dapat diamati melalui peningkatan jumlah sel terhadap
waktu. Isolat QC3.a.1 dan QC3.d.5 memiliki waktu untuk mencapai fase
logaritmik yang sama, sedangkan isolat QC3.a.2 tidak terlihat jelas fase
logaritmiknya (Gambar 4). Fase logaritmik ialah fase ketika bakteri mampu
tumbuh lebih cepat sehingga mempunyai waktu penggandaan yang lebih singkat.
Menurut Pelczar dan Chan (1986) perbedaan waktu ini dapat dipengaruhi oleh
beberapa faktor, yaitu sumber energi, sumber karbon, pH, suhu lingkungan, O2
dan masa inkubasi atau sifat organisme tersebut.
Hasil estimasi pelarutan P dan K dari tiga isolat terpilih (Gambar 5A-F),
menunjukkan bahwa aktivitas pelarutan P dan K mulai terjadi ketika jumlah sel
bakteri mulai meningkat. Chen et al. (2006) melaporkan bahwa pelarutan P dalam
medium kultur dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor meliputi komposisi

16
medium bakteri, perubahan pH medium kultur, kehadiran galur bakteri pelarut P.
Pelarutan P oleh bakteri berkisar antara 0.56 mg/L - 898 mg/L (Chen et al. 2006;
Park et al. 2010; Aarab et al. 2013; Karpagam dan Nagalakshmi 2014). Song et al.
(2008) melaporkan bahwa Burkholderia cepacia DA23 yang diisolasi dari tanah
daerah Gimhae, Korea, mampu melarutkan P sebesar 345.9 mg/L. Perez et al.
(2007) melaporkan bahwa Serratia marcescens yang diisolasi dari permukaan besi
yang terletak dekat Ciudad Piar, Bolivar, Venezuela memiliki kemampuan
melarutkan P antara 78.6 mg/L – 82.7 mg/L. Nautiyal (1999) melaporkan bahwa
konsentrasi P sebesar 35 µg/ml dihasilkan oleh Pseudomonas sp. yang diisolasi
dari tanah dan akar tanaman Banthra, Lucknow, India.
Pelarutan K seperti illit dan feldspar oleh mikrob karena adanya produksi
asam organik seperti asam oksalat dan asam tartat, serta produksi polisakarida
kapsuler yang membantu dalam pelarutan mineral K untuk melepaskan K (Sheng
dan He 2006). Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa mikrob tanah dapat
melepaskan K dari mineral K seperti K feldspar, mika, dan illit. Pelarutan K oleh
bakteri berkisar antara 0.59 mg/L - 48 mg/L (Archana 2007; Sugumaran dan
Janarthanam 2007; Parmar dan Sindhu 2013; Lynn et al. 2013; Zhang dan Kong
2014). Burkholderia cepacia GL13 yang diisolasi dari tanah rizosfer sekitar
tanaman tembakau Provinsi Sichuan, Shandong dan Hubei menghasilkan K
terlarut sebesar 0.59 mg/L (Zhang dan Kong 2014), sedangkan Pseudomonas sp.
yang diisolasi dari tanah rhizosfer tanaman berbeda sekitar Dharwad, Belgaum
menghasilkan K terlarut sekitar 8.72 µg/ml - 20.50 µg/ml (Archana 2007).
Penurunan konsentrasi P dan K terlarut (Gambar 5A-F) diduga disebabkan
adanya pemakaian kembali P dan K terlarut oleh kultur sebagai sumber nutrisi
untuk aktivitas metabolismenya dan adanya penurunan jumlah populasi sel bakteri
yang akan mempengaruhi aktivitas bakteri dalam melarutkan P dan K.
Krishnawamy et al. (2009) melaporkan bahwa fosfat diperlukan oleh mikrob
untuk sintesis asam nukleat, membangun membran sel (seperti fosfolipid) dan
transfer energi kimia ke dalam sel (seperti molekul ATP). Gries et al. (2013)
melaporkan bahwa ion kalium (K+) berperan penting dalam fisiologi bakteri,
termasuk regulasi pH sitoplasma, tekanan turgor, aktivitas enzim intraseluler, dan
potensial listrik trans-membran.
Pada uji kualitatif (Gambar 3) menunjukkan isolat QC3.a.1 mampu
melarutkan P tertinggi dan isolat QC3.a.2 mampu melarutkan K tertinggi, tetapi
pada uji kuantitatif (Gambar 5) menunjukkan isolat QC3.a.2 mampu melarutkan P
tertinggi dan isolat QC3.a.1 mampu melarutkan K tertinggi. Hal ini diduga
disebabkan adanya variasi tingkat difusi dari asam organik yang berbeda yang
dihasilkan oleh mikrob yang berbeda. Hasil serupa juga telah dilaporkan oleh
Lynn et al. (2013) dan Nautiyal (1999), mikrob yang melarutkan P dan K pada
medium padat belum tentu mampu melarutkan P dan K tertinggi pada medium
cair. Oleh karena itu, pengukuran secara langsung menggunakan spektrofotometer
lebih akurat dibanding metode cawan.
Ketiga isolat yang diidentifikasi pada penelitian ini (QC3.a.1, QC3.a.2, dan
QC3.d.5), masing-masing berkerabat dekat dengan Burkholderia cepacia, Serratia
marcescens dan S. nematodiphila, dan Pseudomonas putida. Burkholderia,
Serratia, dan Pseudomonas merupakan kelompok bakteri yang mampu
melarutkan P dan K dengan cara memproduksi asam organik (Rodriguez dan
Fraga 1999; Archana 2007), dan umumnya dilaporkan sebagai PGPR (plant

17
growth promoting rhizobacteria) yang mampu menghasilkan zat tumbuh seperti
IAA (Patten dan Glick 2002). Burkholderia diketahui sebagai bakteri fiksasi N
dan memiliki kemampuan sebagai antifungi (Stephen dan Jisha 2011; Mubarik et
al. 2014). Selain itu, Burkholderia cepacia dapat digunakan sebagai agens
fitoremediasi dan promotor tanaman toleran terhadap toluene (Barac et al. 2004).
Serratia diketahui berpotensi menghambat pertumbuhan Aspergillus parasitic dan
produksi senyawa aflatoksin (Wang et al. 2013), serta produksi IAA dan
metabolit sekunder yait