Rekayasa Genetik Nicotiana Tabacum Sr1 Dengan Gen Glutathione S-Transferase 12 (Gst12)

REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum SR1 DENGAN GEN
glutathione S-transferase 12 (GST12)

PURWANTI PRATIWI PURBOSARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Rekayasa Genetik
Nicotiana tabacum SR1 dengan Gen glutathione S-transferase 12 (GST12) adalah
benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, November 2015
Purwanti Pratiwi Purbosari
NIM G353120131

RINGKASAN
PURWANTI PRATIWI PURBOSARI. Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum
SR1 dengan Gen glutathione S-transferase 12 (GST12). Dibimbing oleh UTUT
WIDYASTUTI dan SUHARSONO.
Glutathione S-transferase (GST) merupakan enzim antioksidan yang
berperan dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman biotik dan abiotik. Gen
GST12 adalah salah satu anggota dari gen GST. Gen GST12 terlibat dalam
pertahanan tanaman terhadap cekaman aluminium dan pH rendah. cDNA gen
GST12 dari kedelai kultivar Slamet telah berhasil diisolasi dengan ukuran 722 pb.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan vektor ekspresi gen
glutathione S-transferase 12 (GST12) dan tanaman Nicotiana tabacum SR1
transgenik.
Vektor ekspresi gen GST12 telah berhasil dikonstruksi menggunakan
metode gateway cloning. cDNA GST12 telah berhasil diisolasi dari plasmid
pGEM-GST12. Hasil isolasi cDNA GST12 telah berhasil disisipkan ke dalam
vektor pENTRTM/D-TOPO® menggunakan teknik directional TOPO cloning.

Vektor rekombinan pENTR-GST12 telah berhasil direkombinasikan dengan
vektor ekspresi pGWB502 sehingga gen GST12 tersisip ke dalam vektor ekspresi
pGWB502 menjadi vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12. Verifikasi
vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 dengan PCR menggunakan primer
GST12-F dan NosT-R, serta pemotongan dengan enzim restriksi HindIII dan
EcoR1 mengkonfirmasi bahwa plasmid pGWB502-GST12 yang dihasilkan telah
mengandung gen GST12. Vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 di
dalam bakteri E. coli DH5α telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A.
tumefaciens LBA4404 menggunakan metode triparental mating. A. tumefaciens
LBA4404 yang mengandung pGWB502-GST12 telah dikonfirmasi dengan PCR
koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R. Transformasi genetik
tanaman Nicotiana tabacum SR1 melalui perantara A. tumefaciens LBA4404
rekombinan yang dilakukan dengan metode ko-kultivasi menggunakan potongan
daun sebagai eksplan telah menghasilkan beberapa tanaman Nicotiana tabacum
SR1 transgenik. Analisis molekuler dengan PCR menggunakan primer hpt-F and
hpt-R telah mengkonfirmasi bahwa tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik
mengandung gen hpt. Gen hpt terpaut dekat dengan gen GST12. Oleh karena itu,
tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik yang mengandung gen hpt juga
mengandung gen GST12. Analisis PCR menunjukkan bahwa gen GST12 yang
terintegrasi di dalam genom tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik

mengalami delesi.
Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, gen glutathione S-transferase 12
(GST12), Nicotiana tabacum (tembakau) SR1, pGWB502,
transformasi genetik

SUMMARY
PURWANTI PRATIWI PURBOSARI. Genetic Engineering of Nicotiana
tabacum SR1 with glutathione S-transferase 12 (GST12) Gene. Supervised by
UTUT WIDYASTUTI and SUHARSONO.
Glutathione-S-transferase (GST) is an enzyme that involves in plant
tolerance to oxidative stress caused by biotic and abiotic factors. GST12 gene is a
member of GST gene. GST12 gene involves in plant tolerance to aluminum and
low pH stresses. The cDNA of GST12 containing 722 bp nucleotides from
soybean cv Slamet has been isolated. The objectives of this research were to
construct the expression vector of GST12 gene and the Nicotiana tabacum
(tobacco) SR1 transgenic.
Expression vector of GST12 gene was constructed using gateway cloning
system. The cDNA of GST12 was successfully isolated from pGEM-GST12
plasmid by PCR. The GST12 was successfully inserted into the pENTRTM/DTOPO® vector using directional TOPO cloning technique producing recombinant
plasmid pENTR-GST12. By recombination between pENTR-GST12 and

pGWB502, GST12 was successfully inserted into pGWB502 producing
recombinant pGWB502-GST12 expression vector. Verification by PCR using
GST12-F and NosT-R primers and digestion using restriction enzymes HindIII
and EcoRI confirmed that pGWB502-GST12 contains GST12 gene. The
recombinant pGWB502-GST12 in E. coli DH5α was successfully introduced into
the A. tumefaciens LBA4404 using triparental mating method. A. tumefaciens
LBA4404 containing recombinant pGWB502-GST12 was confirmed by colony
PCR using GST12-F and NosT-R primer. The genetic transformation of Nicotiana
tabacum SR1 intermediated by this recombinant A. tumefaciens by co-cultivation
method using leaf disc as explants resulted transgenic Nicotiana tabacum SR1
plants. Molecular analysis by PCR using hpt-F and hpt-R primers confirmed that
transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants contain hpt gene. Since hpt gene is
close linked to GST12 gene, so the transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants
contain also GST12 gene. PCR analysis showed that there is a deletion of GST12
gene integrated into the genome of transgenic Nicotiana tabacum SR1 plants.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, genetic transformation, glutathione Stransferase 12 (GST12) gene, Nicotiana tabacum (tobacco) SR1,
pGWB502

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum SR1 DENGAN GEN
glutathione S-transferase 12 (GST12)

PURWANTI PRATIWI PURBOSARI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014 sampai Juli
2015 ini ialah transformasi genetik dengan judul Rekayasa Genetik Nicotiana
tabacum SR1 dengan Gen glutathione S-transferase 12 (GST12). Penelitian ini
merupakan bagian dari kegiatan Hibah Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi
DIKTI 2014 atas nama Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dengan judul Perbaikan
Genetik Tumbuhan Kedelai terhadap Cekaman Asam melalui Teknik DNA
Rekombinan Gen Antioksidan glutathione S-transferase 12 (GST12) dan
peroksidase (per) dengan nomor kontrak: 79/IT3.41. 2/L1/SPK/2014 tanggal 24
Mei 2014.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dan Prof
Dr Ir Suharsono, DEA selaku pembimbing atas arahan dan bimbingannya selama

ini. Terima kasih kepada Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA selaku penguji atas saran
yang diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih kepada Dr Ir
Miftahudin, MSi selaku ketua program studi Biologi Tumbuhan atas masukan dan
arahannya. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Ibu Pepi Elvavina,
Ibu Nia Dahniar dan Bapak Abdul Mulya selaku laboran dan teknisi di
Laboratorium Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) IPB yang telah membantu penyediaan bahan dalam penelitian ini.
Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak, Ibu, Iko, Risang dan
segenap keluarga atas doa, semangat dan kasih sayangnya. Terima kasih penulis
ucapkan kepada sahabat seperjuangan Plant Biology 2012: Mba Destik, Mba
Fajri, Mba Efa, Bang Rudi dan Baso, serta segenap keluarga Laboratorium
Biotechnology Research Indonesia-The Nedherlands (BIORIN) dan Laboratorium
Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) atas kebersamaan dan
semangatnya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada sahabat dan
keluarga besar Rumah Qur’an IPB (RQ IPB), keluarga besar Himpunan
Mahasiswa Muslim Pascasarjana (HIMMPAS) dan Forum Mahasiswa
Pascasarjana (FORUM WACANA) atas doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2015

Purwanti Pratiwi Purbosari

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA

2

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Metode

10
10
10
10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Vektor Ekspresi Gen GST12
Introduksi Vektor Ekspresi Rekombinan pGWB502-GST12 ke dalam
Agrobacterium tumefaciens LBA4404
Transformasi Genetik tanaman Nicotiana tabacum SR1

14
14
17
18

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

20
20
20

DAFTAR PUSTAKA

20

RIWAYAT HIDUP

23

DAFTAR TABEL
1

Tipe gen GST pada tanaman kedelai

3

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
13
14
15

Fungsi seluler Glutathione S-Transferase (GST)
Integrasi dan disintegrasi fage ke dalam kromosom E. coli
Skema umum kloning gateway
Proses masuknya T-DNA dari A. tumefaciens ke dalam sel tanaman
Peta fisik dan situs pengklonan vektor pENTRTM/D-TOPO®
Peta fisik plasmid pGWB502
Hasil PCR cDNA gen GST12 dari plasmid pGEM-GST12
menggunakan primer GST12pENTER-F dan GST12-R
Hasil PCR koloni menggunakan primer M13-F dan GST12-R terhadap
koloni bakteri E. coli Top10 transforman
Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R terhadap
koloni bakteri E. coli DH5α transforman yang mengandung vektor
ekspresi rekombinan pGWB502-GST12
Hasil pemotongan vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12
dengan enzim restriksi Hind111 dan EcoR1
Peta konstruksi vektor ekspresi pGWB502-GST12
Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R terhadap
koloni bakteri A. tumefaciens LBA4404 transforman
Kultur jaringan dari eksplan potongan daun N. tabacum SR1 selama
transformasi genetik dengan gen GST12
Analisis PCR DNA genom tanaman N. tabacum SR1 menggunakan
primer hpt-F dan hpt-R
Analisis PCR DNA genom tanaman N. tabacum SR1 menggunakan
primer aktin-F dan aktin-R, serta primer spesifik 35S-F dan NosT-R

5
6
8
9
11
12
14
15

16
16
17
17
18
19
20

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Glutathione S-transferase (GST) merupakan salah satu enzim antioksidan
yang berperan dalam pertahanan tanaman terhadap cekaman biotik dan abiotik.
GST mampu mengkatalis konjugasi antara Glutathione (GSH) dengan berbagai
substrat elektrofilik. Hal ini berhubungan dengan sisi katalitik yang dimiliki GST.
Pada tumbuhan, GST dapat berupa homodimer maupun heterodimer dengan
masing-masing sub unit memiliki dua sisi aktif yang berdekatan, yaitu sisi
pengikatan glutathione (G-site) dan sisi pengikatan substrat (H-site) (Dixon et al.
2002).
Cekaman biotik dan abiotik dapat menginduksi peningkatan konsentrasi
reactive oxygen species (ROS) seperti radikal superoksida (O2-) dan hidrogen
peroksida (H2O2) (Apel dan Hirt 2002). Meskipun produksi ROS merupakan salah
satu bentuk mekanisme pertahanan tanaman terhadap cekaman, akan tetapi
tingginya konsentrasi ROS dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada lipid
bilayer, DNA dan protein pada tanaman (Gill dan Tuteja 2010).
Peningkatan ekspresi gen GST pada tanaman berhubungan dengan
peningkatan ROS yang disebabkan oleh adanya cekaman (McGonigle et al.
2000). GST memiliki dua jalur dalam menangani cekaman oksidatif. Pertama,
GST mampu mengkatalis reaksi antara GSH dengan senyawa-senyawa toksik
yang terbentuk akibat tingginya konsentrasi ROS, seperti 4-hidroksialkenal dan
basa propenal. Molekul-molekul yang telah berkonjugasi dengan GSH kemudian
ditransfer ke dalam vakuola oleh protein pembawa untuk diproses lebih lanjut.
Hal ini bertujuan untuk membatasi efek dari penghambatan produk akhir GST dan
melindungi sel dari bahaya lebih lanjut akibat senyawa-senyawa yang
berkonjugasi dengan GSH (Dixon et al. 1998). GST juga mampu melakukan
fungsi Glutathione Peroksidase (GPX) untuk bereaksi dengan senyawa-senyawa
hasil dari peroksidasi lipid secara langsung, serta mampu melindungi membran sel
dari kerusakan dengan cara mereduksi H2O2 (Marss 1996). Peranan GST dalam
menangani cekaman H2O2 dapat terlihat dari beberapa penelitian. Desikan et al.
(1998) melaporkan bahwa pada kultur suspensi Arabidopsis, H2O2 mampu
menginduksi ekspresi gen GST. Selain itu, Polidoros et al. (1999) juga
menemukan bahwa pemberian H2O2 eksogenus mampu menginduksi ekspresi gen
GST1 pada tanaman jagung.
Pada Arabidopsis thaliana, ekspresi dari gen GST terinduksi karena adanya
peningkatan konsentrasi ROS yang disebabkan oleh cekaman aluminium
(Richards et al. 1998). GST juga dilaporkan terlibat dalam mekanisme
detoksifikasi xenobiotik, serta perlindungan tanaman terhadap patogen dan
herbisida. Pada kondisi tanpa cekaman, GST berperan dalam detoksifikasi toksin
dari proses metabolisme sekunder dan transfer flavonoid dari sitosol ke vakuola
dengan membentuk kompleks GST-flavonoid (Dixon et al. 2002).
Analisis ekspresi gen GST12 pada tanaman kedelai kultivar Slamet yang
toleran terhadap cekaman aluminium dan pH rendah menunjukkan bahwa ekspresi
gen GST12 terinduksi pada 8 jam setelah perlakuan cekaman (1,6 mM Al dan pH
4,0) dengan peningkatan ekspresi sebesar 44.4%. Pada perlakuan yang sama, gen

2
GST8 menunjukkan hasil yang berbeda, yaitu terinduksi pada 8 jam setelah
perlakuan dengan peningkatan ekspresi sebesar 4.4% dan pada 24 jam setelah
perlakuan dengan peningkatan ekspresi sebesar 14.4%. Akan tetapi, pada kurun
waktu 48 jam setelah perlakuan tersebut, gen GST8 tidak lagi terekspresi
(Mashuda 2007). Berlainan dengan kultivar Slamet, pada tanaman kedelai kultivar
Lumut yang peka terhadap cekaman aluminium dan pH rendah, gen GST12 tidak
terinduksi oleh perlakuan cekaman 1,6 mM Al dan pH 4,0 (Sawitri 2007). Hasil
analisis ini mengindikasikan adanya keterlibatan gen GST12 dalam pertahanan
tanaman terhadap cekaman aluminium dan pH rendah.
cDNA GST12 dari akar tanaman kedelai kultivar Slamet telah berhasil
diisolasi dan diklon ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Dari hasil pengurutan
nukleotida cDNA GST12 diketahui bahwa ukuran cDNA GST12 adalah sebesar
722 pb dan menyandikan 237 asam amino. Hasil penelusuran daerah asam amino
terkonservasi menunjukkan bahwa cDNA GST12 memiliki daerah domain asam
amino terkonservasi GST_N_Tau dan GST_C_Tau. cDNA GST12 dari kedelai
kultivar Slamet ini juga memiliki kekerabatan yang dekat dengan GST12 Glycine
max (AF243367) (Jaya 2010).
Ekspresi berlebih dari gen GST12 dibutuhkan sebagai langkah awal dalam
analisis terhadap fungsi gen GST12. Oleh karena itu, perlu adanya suatu vektor
ekspresi yang menggabungkan gen GST12 dengan promotor kuat. Daerah T-DNA
dari vektor ekspresi rekombinan yang telah membawa gen GST12 selanjutnya
dapat diintroduksikan ke dalam tanaman model untuk melihat ekspresi dari gen
GST12 tersebut.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan vektor ekspresi gen
glutathione S-transferase (GST12) dan tanaman Nicotiana tabacum (tembakau)
SR1 transgenik.

Manfaat Penelitian
Vektor ekspresi gen glutathione S-transferase (GST12) dan tanaman
Nicotiana tabacum (tembakau) SR1 transgenik yang dihasilkan dapat
dimanfaatkan dalam analisis fungsi gen GST12 serta perbaikan genetik tanaman
pertanian terhadap cekaman aluminium dan pH rendah.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Gen glutathione S-transferase (GST)
Gen glutathione S-transferase (GST) merupakan kelompok besar gen yang
menyandikan protein Glutathione S-Transferase (GST) yang aktivitas katalitiknya
bergantung pada Glutathione (GSH). Dixon et al. (2002) mengelompokkan gen
GST berdasarkan identitas sekuen penyusunnya menjadi lima kelompok, yaitu

3
kelas phi, tau, theta, zeta dan lamda. Kelas theta dan zeta selain terdapat pada
tanaman juga terdapat pada hewan, akan tetapi kelas lainnya adalah spesifik pada
tanaman. Berdasarkan analisis expressed sequenced tag (EST), terdapat
keanekaragaman gen GST pada beberapa tanaman pertanian. Pada jagung
dilaporkan terdapat 12 sekuen gen GST dari kelas phi, 28 sekuen dari kelas tau
dan 2 sekuen dari kelas zeta. Pada kedelai teridentifikasi 4 sekuen dari kelas phi, 1
sekuen dari kelas zeta dan 20 sekuen dari kelas tau.
Droog et al. (1995); Board et al. (1997); McGonigle et al. (2000) membagi
gen GST pada tanaman ke dalam tiga kelompok, yaitu tipe 1, II dan III.
Pengelompokan ini didasarkan pada identitas urutan asam amino dan konservasi
penempatan intron-ekson, namun tidak didasarkan pada penerimaan substrat dan
reaksi silang antibodi. GST tipe I mengandung 3 ekson dan 2 intron, GST tipe II
mengandung 10 ekson dan 9 intron, sedangkan GST tipe III mengandung 2 ekson
dan 1 intron. GST tipe I dan III memiliki kemiripan dengan kelas zeta pada
mamalia, sedangkan GST tipe II mirip dengan kelas theta pada mamalia (Marrs
1996).
Tabel 1 Tipe gen GST pada tanaman kedelaia
Tipe

Nama

GST tipe I

GmGST 21
GmGST 22
GmGST 23
GmGST 24
GmGST 25
GH2/4 (Gmhsp26-A or GmGST 1)
GmGST 2
GmGST 3
GST a (GmGST 4)
GmGST 5
GmGST 6
GmGST 7
GmGST 8
GmGST 9
GmGST 10
GmGST 11
GmGST 12
GmGST 13
GmGST 14
GmGST 15
GmGST 16
GmGST 17
GmGST 18
GmGST 19
GmGST 20

GST tipe II
GST tipe III

a

Sumber: McGonigle et al. (2000).

No. Aksesi
NCBI
AF243376
AF243377
AF243378
AF243379
AF243380
J03197, M20363
Y10820
X68819
AF048978
AF243360
AF243361
AF243362
AF243363
AF243364
AF243365
AF243366
AF243367
AF243368
AF243369
AF243370
AF243371
AF243372
AF243373
AF243374
AF243375

4
McGonigle et al. (2000) telah melakukan pensejajaran dan klasifikasi
sekuen lengkap GST pada jagung dan kedelai. Pada jagung ditemukan 42 jenis
GST, yaitu 12 GST tipe I, 2 GST tipe II dan 28 GST tipe III. Pada kedelai
ditemukan 25 jenis GST yang terdiri dari 4 GST tipe I, 1 GST tipe II dan 20 GST
tipe III. Tabel 1 menyajikan jenis GST yang ditemukan pada tanaman kedelai.
Namun fungsi gen GST tidak berhubungan dengan klasifikasi yang didasarkan
pada kemiripan sekuen dan tidak bisa diprediksi dari struktur dasarnya, melainkan
ditetapkan berdasarkan eksperimen (McGonigle et al. 2000).

Karakteristik dan Fungsi Seluler Protein Glutathione S-Transferase (GST)
Glutathione S-Transferase (GST) merupakan protein dimer dengan masa
molekul dari masing-masing sub-unit berkisar antara 25-26 kDa. Titik isoelektrik
dari protein ini yaitu pada pH 4-5. Subunit dari kelas GST yang sama dapat
mengalami dimerisasi meskipun sekuen asam amino yang dimiliki sangat berbeda.
Akan tetapi, sub-unit dari kelas GST yang berbeda tidak dapat mengalami
dimerisasi karena faktor inkompatibilitas residu interfasial.
Dari penelitian yang dilakukan pada jagung diketahui bahwa isoenzim GST
diekspresikan pada jaringan yang berbeda (Goria et al. 1993). Namun, GST
terdapat pada setiap tahapan perkembangan tanaman (mulai dari embriogenesis
sampai senesens) dan pada setiap jaringan tanaman yang diuji (McGonigle et al.
2000). Pada sebagian besar tanaman pertanian sereal, GST dapat diekspresikan
sangat tinggi, yaitu mencapai 2% dari total protein pada dedaunan (Dixon et al.
2002).
GST mampu mengkatalis konjugasi antara Glutathione (GSH) dengan
berbagai substrat elektrofilik (Marrs 1996) dengan reaksi umum sebagai berikut:
GSH
(Glutathione)

+

R-X
(Molekul
elektrofilik)

GS-R
+
HX
(Molekul
(Produk samping)
terkonjugasi)
(Dixon et al. 1998)

Beberapa fungsi seluler yang sudah diketahui dari GST di antaranya pada
metabolisme sekunder GST mampu mendetoksifikasi toksin dengan mengkatalis
konjugasi antara toksin dengan GSH. Beberapa GST dari kelas phi dan tau
berperan dalam transport pigmen flavonoid dari sitosol ke vakuola. GST juga
mampu mereduksi DNA sitotoksik dan hidroperoksida lipid seperti yang
dilakukan oleh Glutathione peroksidase. Selain itu, GST juga berperan dalam
perlindungan lebih lanjut tanaman dari kematian sel yang diinduksi oleh bax. Pada
sinyal tanaman terhadap cekaman, GST berfungsi dalam menginduksi kalkon
sintase setelah tanaman terpapar sinar ultraviolet. Sedangkan pada metabolisme
primer, GST bertindak dalam isomerasi maleilasetoasetat (Gambar 1) (Dixon et al.
2002).

5

Gambar 1 Fungsi seluler Glutathione S-Transferase (GST) (Dixon
et al. 2002)

Reactive Oxygen Species (ROS) dan Penanganannya oleh Glutathione STransferase (GST)
Organisme aerobik akan selalu memproduksi molekul-molekul reactive
oxygen species (ROS) seperti radikal superoksida, radikal hidroksil dan hidrogen
peroksida (H2O2) selama proses konsumsi oksigen. Pada keadaan normal,
pertahanan dari antioksidan seperti dismutase superoksida (SOD), katalase,
peroksidase dan asam askorbat mampu mengimbangi produksi senyawa-senyawa
ROS. Namun selama terjadi cekaman oksidatif, keseimbangan antara produksi
ROS dengan peredaman dari antioksidan tidak lagi seimbang. Salah satu efek
berbahaya dari tingginya produksi ROS adalah terjadinya peroksidasi lipid
membran yang merubah asam lemak menjadi fragmen hidrokarbon seperti 4hidroksialkenal yang sangat toksik. Senyawa ini dapat menjadi inhibitor yang kuat
bagi enzim seperti adenilat siklase dalam sintesis DNA dan protein. Akibat lain
dari adanya produksi senyawa ROS adalah terbentuknya basa propenal, produk
dari kerusakan oksidatif DNA yang sangat toksik (Marrs 1996).
GST mampu mengkatalis reaksi antara GSH dengan senyawa-senyawa
toksik yang terbentuk akibat tingginya konsentrasi ROS, seperti 4-hidroksialkenal
dan basa propenal. Selain itu, GST juga dilaporkan mampu melakukan fungsi

6
Glutathione Peroksidase (GPX) untuk bereaksi dengan senyawa-senyawa hasil
dari peroksidasi lipid secara langsung dan untuk mereduksi H2O2 (Marss 1996).
Pada kultur suspensi Arabidopsis, H2O2 diketahui menginduksi ekspresi gen GST
(Desikan et al. 1998). H2O2 eksogenus juga mampu menginduksi ekspresi gen
GST1 pada tanaman jagung hasil persemaian (Polidoros et al. 2005).

Metode Kloning Gateway
Pada era 1990-an, sangat berkembang teknik konstruksi vektor biner
menggunakan bantuan enzim restriksi dan ligase. Pada teknik ini, vektor dan
DNA yang akan diklon harus dipotong pada tempat-tempat tertentu menggunakan
enzim restriksi, selanjutnya vektor dan insert linier digabungkan dengan bantuan
enzim ligase. Namun kenyataannya teknik tersebut membutuhkan waktu yang
lama dan pekerjaan laboratorium yang panjang. Untuk mengkonstruksi gen yang
dimodifikasi di dalam vektor biner harus dicari situs restriksi yang sesuai antara
vektor dengan DNA. Situs restriksi yang sesuai tersebut sering kali terdapat dalam
jumlah yang terbatas. Kekurangan tersebut membuat teknik ini sulit menghasilkan
keluaran yang tinggi. Namun saat ini telah berkembang suatu teknik yang dapat
digunakan untuk mengkonstruksi dan memodifikasi vektor biner dengan lebih
efisien, yaitu metode kloning gateway yang dikeluarkan oleh Invitrogen (USA)
(Nakagawa et al. 2009).
Teknologi kloning gateway merupakan bentuk aplikasi dari reaksi
rekombinasi situs spesifik yang terjadi selama intergrasi fage ke dalam maupun
keluar dari DNA E. coli (Gambar 2). Saat proses integrasi, situs attP (242 pb) dari

Gambar 2

Integrasi dan disintegrasi fage
(Nakagawa et al. 2009)

ke dalam kromosom E. coli

7
fage dan situs attB (25 pb) dari E. coli berekombinasi menyebabkan genom fage
terintegrasi ke dalam genom E. coli. Sebagai hasil, genom fage terapit oleh
situs attL (100 pb) dan attR (168 pb) (BP reaction). Pada reaksi kebalikannya,
DNA fage keluar dari genom E. coli dengan jalan rekombinasi antara situs attL
dan attR (LR reaction). Proses BP reaction membutuhkan dua protein, yaitu
protein integrase fage (Int) dan protein E. coli integration host factor (IHF). Pada
sistem gateway, campuran dari kedua protein ini disebut BP clonase. Sedangkan
pada LR reaction, dibutuhkan protein Int, IHF dan satu jenis protein lainnya, yaitu
protein excisionase (Xis). Campuran dari ketiga jenis protein ini disebut LR
clonase. Metode gateway cloning memanfaatkan situs att dan clonase ini untuk
dapat mengkonstruksi plasmid rekombinan secara in vitro (Hartley et al. 2000;
Walhout et al. 2000).
Terdapat empat pasang situs att yang dapat dimodifikasi untuk tujuan
kloning secara langsung dari sistem gateway. Keempat situs att tersebut adalah
attB1 dan attB2, attP1 dan attP2, attL1 dan attL2, serta attR1 dan attR2. Reaksi
rekombinasi hanya dapat terjadi antara situs attB1 dengan attP1, attB2 dengan
attP2, attL1 dengan attR1 dan antara situs attL2 dengan attR2 (Hartley et al.
2000; Walhout et al. 2000). Pada situs att ini juga terdapat gen ccdB sebagai
penanda seleksi dan pemelihara vektor gateway karena protein ccdB mampu
menghambat DNA girase. Situs att1 biasanya berlokasi pada ujung 5’ dari daerah
opening reading frame (ORF), sedangkan situs att2 pada ujung 3’. Orientasi ini
tetap dipertahankan pada semua tahapan reaksi gateway.
Pada kloning gateway secara umum, sekuen attB1 dan attB2 ditambahkan
pada ujung 5’ dan 3’ dari daerah ORF menggunakan adapter PCR sebagai langkah
pertama. Produk dari langkah tersebut (attB1-ORF-attB2) digunakan dalam BP
reaction bersama dengan vektor donor yang memiliki kaset attP1-ccdB-attP2.
Karena keberadaan marker seleksi negatif ccdB yang semula terletak diantara
attP1 dan attP2 maka hanya bakteri transforman yang mengandung vektor
rekombinan dengan kaset attL1-ORF-attL2 (entry clone) yang dapat tumbuh pada
media seleksi. Bakteri yang mengandung gen ccdB akan segera mati karena
protein CcdB bersifat letal untuk kebanyakan strain bakteri E. coli. Selanjutnya
ORF dalam entry clone dapat segera ditransfer ke dalam destination vector
melalui reaksi LR. Destination vector ini membawa kaset attR1-ccdB-attR2.
Setelah rekombinasi, hanya bakteri yang membawa destination vector rekombinan
dengan kaset attB1-ORF-attB2 (expression clone) yang mampu bertahan dari
seleksi. Sedangkan bakteri yang membawa gen ccdB akan mati. Di dalam
gateway cloning, situs attB (25 pb) yang merupakan situs att terpendek didesain
agar terdapat pada produk akhir yang berupa expression clone. Hal ini bertujuan
untuk meminimalisasi panjangnya sambungan kloning setelah reaksi klonase
(Gambar 3). Banyak pengembangan yang telah dilakukan pada destination vector
untuk memenuhi beberapa tujuan yang berbeda, misalnya vektor untuk ekspresi
pada tumbuhan, hewan, bakteria dan mamalia, maupun vektor untuk RNAi
(Nakagawa et al. 2009).

8

Gambar 3 Skema umum kloning gateway (Nakagawa et al. 2009)

Transformasi Genetik Diperantarai Agrobacterium tumefaciens
Transformasi yang diperantarai A. tumefaciens merupakan teknik yang
umum digunakan untuk menyisipkan gen yang diinginkan ke dalam genom
tanaman. Di alam, A. tumefaciens merupakan agen penyebab penyakit tumor
(crown gall) pada banyak spesies tanaman. Penyakit tumor ini menggambarkan
sebuah manifestasi dari transfer dan ekspresi DNA bakteri di dalam sel tanaman
(Dandekar dan Fisk 2004). Pemindahan DNA (T-DNA) pada A. tumefaciens di
alam membawa gen oncogene dan opine-catabolism yang ketika diekspresikan di
dalam sel tanaman akan menyebabkan pertumbuhan neoplastik dari jaringan
tanaman transforman, serta menyebabkan produksi opin yang merupakan turunan
asam amino yang digunakan oleh bakteri sebagai sumber nitrogen. Strain
Agrobacterium rekombinan di mana T-DNA yang dimiliki telah diganti dengan
gen yang diinginkan merupakan sarana yang paling efisien saat ini untuk
mengintroduksikan gen asing ke dalam genom tanaman dan untuk memproduksi
spesies tanaman transgenik (Tzfira dan Citovsky 2006).
Perlengkapan molekuler yang dibutuhkan dalam penyisipan T-DNA ke
dalam sel tanaman terdiri dari beberapa protein yang disandi oleh seperangkat
kromosomal bakteri (chv) dan gen Ti-plasmid virulence (vir). Selain itu, berbagai
protein yang dimiliki oleh sel host juga dilaporkan ikut berperan dalam proses

9
transformasi genetik tersebut. Daerah vir yang terdapat pada plasmid Ti menyandi
sebagian besar protein Vir yang digunakan oleh bakteri untuk menyiapkan TDNA dan memindahkannya ke dalam sel tanaman. Pada Agrobacterium yang
sudah tidak berbahaya, di mana daerah T-DNA asli yang dimiliki telah
dihilangkan dari plasmid Ti, daerah T-DNA rekombinannya biasanya berada pada
plasmid biner yang terpisah dari Ti plasmid (Tzfira dan Citovsky 2006).
Gambar 4 menunjukkan tahapan yang terjadi ketika proses transformasi.
Proses transformasi tersebut dimulai dengan penempelan bakteri pada tanaman
(Gambar 4, tahap 1), diikuti induksi dari ekspresi daerah gen vir oleh sinyal
spesifik dari sel tanaman (Gambar 4, tahap 2 dan 3). Molekul T-DNA utas tunggal
(T-strand) (Gambar 4, tahap 4) kemudian dihasilkan dari aksi kombinasi protein
VirD1 dan VirD2. Di dalam sel bakteri, satu molekul VirD2 berikatan kovalen
dengan utas tunggal T-DNA pada bagian ujung 5’ membentuk kompleks proteinssDNA. Kompleks ini bersama protein Vir yang lain ditransfer ke dalam sel
tanaman (Gambar 4, tahap 5) oleh sistem sekresi VirB/D4 tipe IV. Tahapan ini
membutuhkan interaksi T-pilus bakteri dengan sedikitnya satu protein spesifik
dari sel tanaman. Di dalam sitoplasma sel tanaman, T-DNA diproses lebih lanjut
menjadi komplek T matang (T-complex) di mana seluruh bagian molekul T-strand
diliputi oleh banyak molekul VirE2. Molekul VirE2 ini memberikan struktur dan
proteksi yang dibutuhkan T-DNA saat ditransfer ke dalam nukleus sel tanaman.
Tahapan selanjutnya adalah pengangkutan di dalam sitoplasma (Gambar 4, tahap
6), pengangkutan melewati membran nukleus (Gambar 4, tahap 7), pengangkutan
di dalam nukleus (Gambar 4, tahap 8), pelepasan mantel berupa molekul VirE2
dari T-DNA (Gambar 4, tahap 9) dan integrasi (Gambar 4, tahap 10) (Tzfira dan
Citovsky 2006).

sitoplasma

Sinyal
tanaman

nukleus

Daerah
vir
Reseptor
bakteri
dan
tanaman

Kompleks-T
Immature
belum
matang
T-complex

Agrobacterium
k

Saluran VirB/D4T4SS

Kompleks-T
matang

T-DNA
terintegrasi

Sel tanaman

Gambar 4 Proses masuknya T-DNA dari A. tumefaciens ke dalam sel tanaman
(Tzfira dan Citovsky 2006)

10

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Maret 2014 hingga Juli 2015 di
Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-the Netherland (BIORIN) dan
Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor.

Bahan
cDNA GST12 diperoleh dari plasmid pGEM-GST12 dalam bakteri E. coli
DH5α (Jaya 2010). Plasmid pENTRTM/D-TOPO® dan pGWB502 (Invitrogen,
USA) masing-masing berfungsi sebagai entry vector dan destination vector dalam
metode gateway. Bakteri E. coli Top10 dan E. coli DH5α digunakan untuk
memperbanyak vektor rekombinan. Plasmid helper pRK2013 dalam bakteri E.
coli DH1 berperan dalam introduksi vektor rekombinan pGWB502-GST12 dari
bakteri E. coli DH5α ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404. Bakteri A.
tumefaciens LBA4404 digunakan dalam proses introduksi gen GST12 ke dalam
genom tanaman N. tabacum (tembakau) SR1. Potongan daun N. tabacum SR1
yang diambil dari kultur jaringan digunakan sebagai sumber eksplan.

Metode
Amplifikasi cDNA gen GST12
cDNA gen GST12 diperoleh dengan cara mengamplifikasi plasmid pGEMGST12 (Jaya 2010) dengan PCR menggunakan pasangan primer GST12pENTERF
(5’-CACCATGGTGAAGGCTGTGGT-3’)
dan
GST12-R
(5’ACTAGTATATATCATTCTGTGGCAGAAG-3’).
Primer
forward
GST12pENTER-F didesain dengan menambahkan sekuen CACC pada ujung 5’.
Komposisi reaksi PCR yang digunakan adalah 40 ng template plasmid pGEMGST12, 10 pmol primer forward pENTR-GST12F, 10 pmol primer reverse
GST12R, 2 mM dNTP mix, 5X High Fidelity PCR Buffer (Invitrogen, USA), 1 U
Taq DNA High Fidelity Polymerase (Invitrogen, USA) dan ddH2O hingga volume
reaksi mencapai 50 µL. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi praPCR 94⁰C, 5 menit; denaturasi 94⁰C, 1 menit; penempelan primer 55⁰C, 30 detik;
pemanjangan 72⁰C, 1 menit; pasca PCR 72⁰C, 7 menit dan pendinginan 25⁰C, 10
menit. Produk hasil PCR dielektroforesis untuk mengetahui konsentrasinya.
Purifikasi terhadap produk hasil PCR dilakukan dengan cara elusi dari gel agarosa
mengikuti prosedur kit elusi dari Geneaid.
Penyisipan cDNA gen GST12 ke dalam vektor pENTRTM/D-TOPO®
Hasil purifikasi cDNA gen GST12 diligasikan dengan vektor pENTRTM/DTOPO® (Invitrogen, USA) pada daerah situs pengklonan vektor tersebut (Gambar
5). Proses ligasi dilakukan dengan teknik Directional TOPO Cloning sesuai
protokol manual dari Invitrogen. Komposisi dari reaksi tersebut adalah 1 L (15

11
ng) cDNA GST12, 1 L (1.2 M NaCl dan 0.06 M MgCl2) salt solution, 1 L (1520 ng) TOPO® vector dan 3 L ddH2O. Setelah inkubasi selama 5 menit pada
suhu ruang, hasil ligasi diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli Top10 kompeten
menggunakan metode heat shock (Sambrook et al. 1989). Bakteri E. coli
transforman ditumbuhkan pada media seleksi Luria Bertani (LB) padat yang
mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L. Verifikasi terhadap koloni yang
tumbuh dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer M13-F (5’GTAAAACGACGGCCAG-3’) dan GST12-R (5’-ACTAGTATATATCATTC
TGTGGCAGAAG-3’). Kondisi PCR yang digunakan sama dengan kondisi PCR
saat amplifikasi cDNA gen GST12. Koloni yang positif membawa plasmid
pENTR-GST12 disubkultur selama 16-18 jam dalam media LB cair yang
mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L. Plasmid dari bakteri tersebut diisolasi
menggunakan Geneaid Plasmid Minipreps Kit.

Peta fisik dan situs pengklonan vektor pENTRTM/D-TOPO®
(Invitrogen, USA)
Penyisipan cDNA gen GST12 ke dalam vektor ekspresi pGWB502
Penyisipan cDNA gen GST12 ke dalam vektor ekspresi pGWB502 (Gambar
6) dilakukan dengan bantuan enzim LR clonase. Vektor rekombinan pENTRGST12 direaksikan dengan vektor ekspresi pGWB502 sesuai protokol gateway
cloning (Invitrogen, USA). Komposisi dari reaksi tersebut adalah 2 L (300 ng)
vektor pGWB502, 2 L (300 ng) vektor rekombinan pENTR-GST12, 1 L 5X LR
Clonase™ reaction buffer dan 1 µL TE Buffer. Hasil reaksi diintroduksikan ke
Gambar 5

12
dalam E. coli DH5α kompeten kemudian bakteri tersebut ditumbuhkan pada
media LB padat yang mengandung spektinomisin 50 mg/L. Koloni yang tumbuh
diverifikasi
menggunakan
PCR
koloni
dengan
primer
GST12-F
(TCTAGACCATAGCAATGGCAGAGCAAG-3’)
dan
NosT-R
(5’CTCATAAATAACGTCATGCATTAC-3’). Komposisi reaksi PCR tersebut
adalah 3 L DNA template, 5 L Dream Taq Green Master Mix PCR (Thermo
scientific), 10 pmol primer forward GST12-F, 10 pmol primer reverse NosT-R
dan ddH2O sampai volume reaksi mencapai 10 L. Sebagai langkah verifikasi
berikutnya, plasmid pGWB502-GST12 dari koloni E. coli DH5α transforman
diisolasi menggunakan Geneid Plasmid Minipreps Kit. Plasmid tersebut kemudian
dipotong menggunakan enzim restriksi HindIII dan EcoRI.

Gambar 6 Peta fisik plasmid pGWB502
Introduksi vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 ke dalam bakteri
Agrobacterium tumefaciens LBA4404
Introduksi vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 dari bakteri E.
coli DH5α ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 dilakukan menggunakan
metode triparental mating (Anggraito 2012) dengan bantuan plasmid helper
pRK2013. Koloni bakteri E. coli DH5α yang positif membawa pGWB502-GST12
ditumbuhkan pada 5 mL media LB cair yang mengandung 50 mg/L spektinomisin
selama 16-18 jam pada suhu 37⁰C dengan penggoyangan 220 rpm. Bakteri E. coli
DH1 yang membawa plasmid pRK2013 ditumbuhkan pada 5 mL media LB cair
yang mengandung 50 mg/L kanamisin selama 16-18 jam pada suhu 37⁰C dengan
penggoyangan 220 rpm. Bakteri A. tumefaciens LBA4404 ditumbuhkan pada 5
mL media LB cair yang mengandung 50 mg/L spektinomisin selama dua hari
dalam ruangan gelap pada suhu 28⁰C dengan penggoyangan pada kecepatan 220
rpm. Dari ketiga kultur bakteri di atas, masing-masing diambil 20 L dan
dicampurkan di atas media LB padat tanpa antibiotik untuk selanjutnya diinkubasi
selama dua hari dalam kondisi gelap, suhu 28⁰C. Koloni bakteri yang tumbuh
diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dilarutkan ke dalam 500 L LB cair.
Dari larutan bakteri tersebut, diambil sebanyak 5 L dan ditambahkan ke dalam
495 L LB cair. 80 L hasil pengenceran bakteri disebar di atas media LB padat
yang mengandung 50 mg/L spektinomisin dan 50 mg/L streptomisin. PCR koloni
menggunakan primer GST12-F dan NosT-R dilakukan untuk verifikasi bakteri A.
tumefaciens LBA4404 yang membawa pGWB502-GST12.
Persiapan eksplan tanaman Nicotiana tabacum SR1
Sterilisasi permukaan biji N. tabacum SR1 dilakukan dengan mencelupkan
biji di dalam larutan alkohol 70%, disertai penggoyangan menggunakan tangan
selama 5 menit. Biji dicuci menggunakan air steril kemudian direndam di dalam

13
larutan pemutih-disinfektan bayclin (NaClO 5, 25%) 20% dengan penggoyangan
selama 10 menit. Pembilasan dilakukan menggunakan air steril sebanyak enam
kali. Biji kemudian ditanam pada media Murashige dan Skoog (MS0) yang
mengandung garam MS, vitamin MS, 30 g/L sukrosa dan 3 g/L agar di dalam
ruangan bersuhu 26-27⁰C. Tanaman yang tumbuh yang telah berumur 1 bulan
disubkultur ke media yang baru.
Transformasi genetik tanaman Nicotiana tabacum SR1
Daun N. tabacum SR1 hasil perbanyakan in vitro yang berumur 8 minggu
dipotong dengan ukuran 1 x 1 cm. Potongan daun tersebut direndam dalam
suspensi A. tumefaciens yang membawa vektor rekombinan pGWB502-GST12
(OD600 0.5–0.8) selama 15 menit untuk proses ko-kultivasi dengan penggoyangan
100 rpm pada suhu ruang. Eksplan dikeringkan menggunakan kertas tissue steril
dan ditanam pada media kokultivasi padat (MS 4.33 g/L + vitamin MS + sukrosa
30 g/L + BA 0.5 mg/L + IAA 0.1 mg/L + agar gelrite 2.8 g/L + 40 mg/L
asetosiringon) selama 3 hari di ruang gelap. Setelah proses kokultivasi, eksplan
dicuci menggunakan air steril sebanyak tiga kali kemudian dilanjutkan dengan air
steril yang sudah ditambah antibiotik cefotaxime 200 mg/L selama 10 menit.
Eksplan kembali dikeringkan menggunakan kertas tissue steril kemudian ditanam
dalam media induksi tunas (MS 4.33 g/L + vitamin MS + BA 2 mg/L + IAA 0.5
mg/L + cefotaksim 100 mg/L + sukrosa 30 g/L+ agar gelrite 2.8 g/L) selama 1012 hari. Kalus transgenik selanjutnya diseleksi dengan cara dipindahkan ke media
regenerasi tunas yang sekaligus berfungsi sebagai media seleksi yang
mengandung 30 mg/L antibiotik higromisin. Setelah 10-12 hari, tunas yang kuat
dipindahkan ke media MS0 (MS 4.33 g/L + vitamin MS + sukrosa 30 g/L + agar
gelrite 2.8 g/L) hingga terbentuk akar.
Identifikasi tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik
Identifikasi tanaman N. tabacum SR1 transgenik dilakukan dengan PCR
terhadap DNA genom yang diisolasi dari daun N. tabacum SR1. Isolasi DNA
genom dilakukan dengan metode CTAB (Sambrook et al. 1989). 0.1 g sampel
daun N. tabacum SR1 digerus menggunakan 300 L buffer CTAB 2% (20 g/L
CTAB, 100 ml 1 M Tris pH 7.5, 20 ml 0.5 M EDTA pH 8, 140 ml 5 M NaCl).
Sebanyak 1,2 L -mercapto etanol 0.2% ditambahkan ke dalam hasil gerusan
dan diinkubasi pada suhu 65⁰C selama 30 menit. Hasil inkubasi ditambahkan
dengan 300 L larutan CI (chloroform:isopropanol; 24:1) dan disentrifugasi
selama 10 menit pada suhu ruang dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan yang
dihasilkan
ditambahkan
dengan
600
L
larutan
PCI
(phenol:chloroform:isopropanol; 25:24:1) dan disentrifugasi dengan kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 25⁰C. Supernatan diambil dan ditambah
dengan etanol absolut sebanyak 2 kali volume dan sodium asetat pH 5.4 sebanyak
0.1 kali volume. Larutan tersebut diinkubasi selama 12 jam pada suhu -20⁰C.
Hasil pengendapan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 1.000 rpm
pada suhu 4⁰C. Pelet ditambahkan dengan etanol 70% sebanyak 500 L dan
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C. Pelet
yang terbentuk dikeringkan dengan vacuum dryer selama 15-20 menit kemudian
dilarutkan dalam 20 L ddH2O steril dan ditambah dengan 4 L RNAse 1 mg/L.
Inkubasi untuk aktivasi RNAse dilakukan pada suhu 37⁰C selama 10 menit,

14
dilanjutkan inaktivasi RNAse dengan cara inkubasi pada suhu 70⁰C selama 10
menit. PCR dilakukan terhadap hasil isolasi genom tersebut. Primer yang
digunakan adalah aktin-F (5’-CCTCTTAACCCGAAGGCTAA) dan aktin-R (5’GAAGGTTGGAAAAGGACTTC)-3’, hpt-F (5’-GATGGTTGGCGACCTCGTA
TT-3’) dan hpt-R (5’-ACTATCGGCGACTACTTCTACA-3’), serta 35SF (5’AAACCTCCTCGGATTCCATT-3’) dan NostR.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Vektor Ekspresi Gen GST12
Tahapan dalam mengkonstruksi vektor ekspresi gen GST12 meliputi tiga
langkah utama yang saling berurutan, yaitu isolasi cDNA GST12, penyisipan
cDNA GST12 ke dalam entry vector pENTRTM/D-TOPO®, dilanjutkan dengan
penyisipan cDNA GST12 ke dalam destination vector pGWB502. Proses
penyisipan cDNA gen GST12 ke dalam entry vector dan destination vector
dilakukan menggunakan metode gateway.
cDNA gen GST12 diisolasi dari plasmid pGEM-GST12 (Jaya 2010) melalui
PCR menggunakan pasangan primer spesifik GST12pENTER-F dan GST12-R.
Ujung 5’ dari primer forward GST12pENTER-F didesain dengan menambahkan
sekuen CACC dengan tujuan agar cDNA gen GST12 dapat tersisip pada situs
pengklonan vektor pENTRTM/D-TOPO® dengan orientasi yang benar. Fragmen
hasil PCR ini berujung tumpul (blunt end). Ukuran fragmen yang dihasilkan dari
proses PCR tersebut adalah sekitar 722 pb (Gambar 7). Ukuran ini sesuai dengan
ukuran cDNA gen GST12. Purifikasi dilakukan terhadap fragmen hasil PCR
dengan cara elusi dari gel agarosa.
M

750pb
pb
750

Gambar 7

1

GST12
GST12 (722 pb)

Hasil PCR cDNA gen GST12 dari plasmid pGEM-GST12
menggunakan primer GST12pENTER-F dan GST12-R. M:
marka 1 kb, 1: GST12

Hasil purifikasi cDNA gen GST12 telah disisipkan ke dalam vektor
pENTRTM/D-TOPO® menggunakan prosedur directional TOPO cloning
(Invitrogen, USA). Bagian overhang berupa sekuen GTGG dari vektor
pENTRTM/D-TOPO® menginvasi dan berpasangan dengan sekuen CACC pada
ujung 5’ dari cDNA gen GST12. Proses ini melibatkan enzim topoisomerase I
yang memutus ikatan fosfodiester pada salah satu utas DNA (bagian GTGG) dari
cDNA gen GST12. Akibatnya, sekuen GTGG dari cDNA gen GST12 dapat

15
dihilangkan dan posisinya digantikan oleh sekuen GTGG dari vektor
pENTRTM/D-TOPO®. Adanya penempelan yang spesifik ini meminimalisasi
kemungkinan terjadinya kesalahan orientasi dalam penyisipan fragmen cDNA gen
GST12 ke dalam vektor pENTRTM/D-TOPO®. Efisiensi penyisipan insert ke
dalam vektor dengan orientasi yang benar melalui metode ini dapat mencapai 90%
atau lebih (Invitrogen, USA).
Vektor rekombinan yang dihasilkan (pENTR-GST12) juga telah
diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli Top10 kompeten. Vektor pENTRTM/DTOPO® memiliki gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin. Bakteri yang
tumbuh pada media seleksi yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L
diduga merupakan bakteri E. coli Top10 yang membawa vektor rekombinan
pENTR-GST12. Verifikasi lebih lanjut dilakukan terhadap koloni yang tumbuh
menggunakan PCR koloni dengan pasangan primer M13-F dan GST12-R. Produk
PCR berukuran sekitar 856 pb (Gambar 8). Hasil tersebut menunjukkan bahwa
cDNA gen GST12 telah tersisip secara tepat ke dalam vektor pENTRTM/DTOPO®. Fragmen cDNA gen GST12 tersebut diapit oleh situs attL1 dan attL2 di
dalam vektor pENTRTM/D-TOPO®.
M

750 pb

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12 13

GST12
(856 pb)

Gambar 8 Hasil PCR koloni menggunakan primer M13-F dan GST12-R terhadap
koloni bakteri E. coli Top10 transforman. M: marka 1 kb, 1-13: koloni
E. coli Top10 yang tumbuh pada media seleksi
cDNA GST12 yang dibawa oleh vektor pENTRTM/D-TOPO® selanjutnya
disisipkan ke dalam vektor ekspresi pGWB502. Proses ini melibatkan enzim LR
clonase mix (Invitrogen, USA) yang membantu terjadinya rekombinasi situs
spesifik antara kedua vektor tersebut. Situs attL1 dari vektor rekombinan pENTRGST12 berekombinasi dengan situs attR1 dari vektor ekspresi pGWB502,
sedangkan situs attL2 dari vektor rekombinan pENTR-GST12 berekombinasi
dengan situs attR2 dari vektor ekspresi pGWB502. Reaksi rekombinasi tersebut
menyebabkan cDNA gen GST12 dapat berpindah dari vektor pENTRTM/DTOPO® ke dalam vektor ekspresi pGWB502. Sementara itu, gen ccdB yang
dibawa oleh pGWB502 akan berpindah menggantikan posisi cDNA gen GST12
pada pENTRTM/D-TOPO®. Gen ccdB berfungsi sebagai penanda seleksi negatif
yang memproduksi protein toksin yang akan bersifat letal pada kebanyakan strain
E. coli seperti TOP10 dan DH5 (Traore dan Zhao 2011). Protein CcdB akan
menghambat kerja DNA girase pada E. coli (Bernard dan Couturier 1992)
sehingga DNA girase tidak akan mampu menghilangkan ketegangan pada struktur
superheliks positif akibat kerja helikase (Yusuf 2001). Sistem ini memudahkan
proses seleksi bakteri bukan target karena sel bakteri yang terintroduksi dengan
unreacted vector pGWB502 (pGWB502 yang tidak mengalami rekombinasi)
tidak akan mampu melakukan replikasi DNA, begitu pula dengan sel bakteri yang

16
membawa molekul produk samping berupa vektor pENTRTM/D-TOPO® yang
telah mengandung gen ccdB. Sedangkan sel E. coli yang membawa vektor
ekspresi rekombinan akan mampu melakukan replikasi DNA dan memperbanyak
diri. Vektor ekspresi rekombinan yang dihasilkan disebut vektor ekspresi
rekombinan pGWB502-GST12.
Vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 juga telah diintroduksikan
ke dalam bakteri E. coli DH5α kompeten. Koloni bakteri yang tumbuh pada media
seleksi LB padat yang mengandung antibiotik spektinomisin 50 mg/L diverifikasi
menggunakan PCR koloni dengan primer GST12-F dan NosT-R. Pita DNA yang
dihasilkan dari PCR koloni tersebut berukuran sekitar 972 pb (Gambar 9). Hal ini
menunjukkan bahwa cDNA gen GST12 telah tersisip secara tepat ke dalam vektor
ekspresi pGWB502. Verifikasi lebih lanjut juga telah berhasil dilakukan, yaitu
dengan cara memotong vektor ekspresi pGWB502-GST12 hasil isolasi dari E. coli
DH5α transforman menggunakan enzim restriksi HindIII dan EcoRI sehingga
menghasilkan dua fragmen dengan ukuran 10.941 pb dan 1.065 pb (Gambar 10).
M

1

2

1000 pb

Gambar 9

GST12 (972 pb)

Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R
terhadap koloni bakteri E. coli DH5α transforman yang mengandung
vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12. M: marka 1 kb, 1-2:
koloni E. coli transforman
M
10.000 pb

1000 pb

1

2
pGWB502

GST12 (1.065 pb)

Gambar 10 Hasil pemotongan vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12
dengan enzim restriksi Hind111 dan EcoR1. M: marka 1 kb, 1:
kontrol pGWB502-GST12 tidak dipotong, 2: pGWB502-GST12
dipotong dengan enzim HindIII dan EcoRI
Gambar 11 menampilkan peta konstruksi vektor ekspresi gen GST12 pada
daerah T-DNA. Gen GST12 berada di bawah kendali promoter kuat 35S CaMV,
sedangkan gen hygromycin phosphotransferase (hpt) yang bertanggungjawab atas
ketahanan terhadap antibiotik higromisin berperan sebagai penanda seleksi.

17

1.065 pb
Gambar 11 Peta konstruksi vektor ekspresi pGWB502-GST12. RB: right border,
P35S CaMV: promotor 35S CaMV, GST12: gen GST12, TNos:
terminator
nopaline
synthase,
hpt:
gen
hygromycin
phosphotransferase, PNos: promotor nopaline synthase, LB: left
border
Metode gateway cloning ini telah banyak digunakan dalam pembuatan
vektor ekspresi. Tidak hanya untuk tanaman, beberapa penelitian telah berhasil
mengaplikasikannya untuk jenis organisme lain. Toews et al. (2004) mendesain
vektor ekspresi untuk fungi dan mengintroduksikannya pada Aspergillus nidulans.
Deplancke et al. (2004) mendesain vektor ekspresi untuk yeast, sedangkan Nyabi
et al. (2009) berhasil membuat vektor ekpsresi dan mengintroduksikannya pada
kultur sel stem embrionik tikus.

Introduksi Vektor Ekspresi Rekombinan pGWB502-GST12 ke dalam
Agrobacterium tumefaciens LBA4404
Vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12 dalam bakteri E. coli DH5α
telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404 melalui
metode triparental mating (TPM). Metode ini memungkinkan terjadinya proses
konjugasi antara kedua strain bakteri tersebut dengan bantuan plasmid helper
pRK2013 yang dibawa oleh bakteri E. coli DH1. Koloni bakteri yang tumbuh
pada media seleksi LB padat yang mengandung 50 mg/L antibiotik spektinomisin
dan 50 mg/L streptomisin diduga merupakan bakteri A. tumefaciens LBA4404
yang membawa vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12. Verifikasi
terhadap koloni yang tumbuh dilakukan menggunakan PCR koloni dengan primer
GST12-F dan NosT-R. Pita DNA hasil PCR koloni dengan ukuran sekitar 972 pb
(Gambar 12) menunjukkan bahwa vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12
telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404.
M

1000 pb

K+

1

2

3

GST12 (972 pb)

Gambar 12 Hasil PCR koloni menggunakan primer GST12-F dan NosT-R
terhadap koloni bakteri A. tumefaciens LBA4404 transforman.
M: marka 1 kb, K+: kontrol positif (plasmid pGWB-GST12), 1-3:
koloni A. tumefaciens transforman

18
Transformasi Genetik Tanaman Nicotiana tabacum SR1
Transformasi genetik tanaman N. tabacum SR1 dengan gen GST12
dilakukan dengan bantuan bakteri A. tumefaciens LBA4404 yang membawa
vektor ekspresi rekombinan pGWB502-GST12. Potongan daun N. tabacum SR1
direndam dalam suspensi A. tumefaciens LBA4404 rekombinan sebagai langkah
kokultivasi. Seleksi tanaman transgenik dilakukan dengan menumbuhkan eksplan
pada media regenerasi tunas yang mengandung 30 mg/L higromisin. Pada selang
waktu tiga sampai empat minggu setelah transformasi, eksplan yang dikokultivasi
mulai menghasilkan tunas yang tumbuh di sekitar daerah bekas pelukaan. Daerah
bekas pelukaan tersebut sebelumnya terlihat menebal. Eksplan kontrol berupa
potongan daun N. tabacum SR1 yang tidak dikokultivasi dalam suspensi A.
tumefaciens LBA4404 rekombinan terlihat mulai berwarna kecoklatan kemudian
memucat setelah tiga sampai empat minggu ditanam di media seleksi. Tunas dari
eksplan transforman yang sudah beregenerasi dan terlihat kuat disubkultur ke
media baru untuk pengakaran (Gambar 13).
Pada vektor ekspresi pGWB502-GST12 yang digunakan dalam transformasi
genetik N. tabacum SR1 ini, posisi gen