Daya Tahan Pembekuan Semen Empat Genetik Ayam Lokal pada Program Kriopreservasi Plasma Nutfah Indonesia
DAYA TAHAN PEMBEKUAN SEMEN EMPAT GENETIK
AYAM LOKAL PADA PROGRAM KRIOPRESERVASI
PLASMA NUTFAH INDONESIA
JUNAEDI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Daya Tahan Pembekuan
Semen Empat Genetik Ayam Lokal pada Program Kriopreservasi Plasma Nutfah
Indonesia” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Junaedi
NIM D151130051
RINGKASAN
JUNAEDI. Daya Tahan Pembekuan Semen Empat Genetik Ayam Lokal pada
Program Kriopreservasi Plasma Nutfah Indonesia. Dibimbing oleh CECE
SUMANTRI, ASEP GUNAWAN dan RADEN IIS ARIFIANTINI.
Ayam merupakan ternak yang sangat umum dijumpai di Indonesia, serta
telah terbukti mempunyai potensi yang tinggi sebagai penghasil daging dan telur.
Salah satu upaya pelestarian plasma nutfah ayam adalah dengan pembekuan
(kriopreservasi) semen. Pembekuan semen merupakan cara yang digunakan untuk
memperpanjang daya hidup spermatozoa dan salah satu cara untuk melestarikan
plasma nutfah ayam terancam punah. Tujuan dari penelitian ini adalah
membandingkan kualitas spermatozoa berbagai genetik rumpun ayam pejantan
lokal, menentukan jenis krioprotektan (dimethyl sulfoxide/ DMSO), gliserol, dan
dimethyl acetamide/ DMA) yang terbaik pada proses pembekuan semen setiap
galur ayam lokal, dan menentukan konsentrasi krioprotektan yang paling optimum
pada proses pembekuan semen setiap galur ayam lokal Indonesia
Penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahap yaitu; 1) Uji banding kualitas
semen segar antar rumpun ayam lokal, 2) Penentuan konsentrasi krioprotektan
DMSO pada pengencer ringer laktat dan kuning telur, 3) Penentuan konsentrasi
krioprotektan gliserol pada pengencer ringer laktat dan kuning telur, 4) Penentuan
konsentrasi krioprotektan DMA pada pengencer ringer laktat dan kuning telur, 5)
Uji banding freezing capability antara empat rumpun ayam, yaitu ayam pelung,
ayam kampung, ayam sentul, dan ayam persilangan kampung broiler
menggunakan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing
perlakuan. Penelitian tahap 1 sampai 4 dirancang menggunakan rancangan acak
lengkap sedangkan tahap 5 menggunakan rancangan faktorial. Jika terdapat
perbedaan antar perlakuan dilanjutkan menggunakan uji Duncan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara umum kualitas semen segar
ayam pelung lebih baik dari rumpun ayam lainnya. Penggunaan DMSO 7%
merupakan konsentrasi terbaik pada pembekuan semen ayam kampung
dibandingkan dengan konsentrasi DMSO 5% dan DMSO 9%. Penggunaan
gliserol 5% merupakan konsentrasi terbaik pada pembekuan semen ayam sentul
dibandingkan dengan konsentrasi gliserol 7% dan gliserol 9%. Penggunaan DMA
9% merupakan konsentrasi terbaik pada pembekuan semen ayam silangan
kampung broiler dibandingkan dengan konsentrasi DMA 5% dan DMA 7%.
Penggunaan gliserol 5%, DMSO 7%, dan DMA 9% didapatkan gliserol 5%
terbaik pada pembekuan semen ayam kampung, sentul, pelung dan silangan
kampung broiler. Recovery rate (RR) pada ayam sentul lebih tinggi dibanding
rumpun ayam lokal lainnya. Rumpun ayam dan tipe krioprotektan berpengaruh
pada penurunan motilitas semen beku selama proses pembekuan.
Kata kunci: DMA, DMSO, gliserol, semen ayam.
SUMMARY
JUNAEDI. Freezing Capability of Semen Four Genetic Local Chicken on
Cryopreservation Germplasm Program Indonesia. Supervised by CECE
SUMANTRI, ASEP GUNAWAN and RADEN IIS ARIFIANTINI.
Chicken is a very common animal in Indonesia, and has been shown high
potential as meat and eggs producer. Semen cryopreservation as one way to
preserve endangered local chicken breed. The purpose of this study was to
compare the genetic quality by analyze of sperm quality of various local chicken
breed, determine the best cyoprotectant concentration (dimethyl sulfoxide/
DMSO), glycerol, and dimethyl acetamide/ DMA) in ringer lactate egg yolk
extender in different breed and to compare freezing capability among breed using
the best concentration of cryoprotectant in each breed.
The research was conducted into 5 step; 1) comparison of fresh semen
quality among local chicken breed 2) determination the best DMSO concentration
in Ringer's lactate diluent egg yolk (RLEY) of kampung chicken breed 3)
determination of the best glycerol concentration in RLEY of sentul chicken breed
4) determination of the DMA concentration in RLEY of kampung broiler cross
breed 5) to compare freezing capability among local chicken breed using the best
cryoprotectan concentration of each breed. Step 1 to step 4 were design using
completely randomized and step 5 using factorial design.
The results showed that fresh semen of pelung chicken demonstrated higher
quality compare to other. The use of 7% DMSO was the best concentration of
frozen semen compared to 5% and 9% of kampung chicken breed. Glycerol 5%
using was the best concentration in frozen semen compared with 7% and 9% of
sentul chicken breed. For kampung broiler cross breed, 9% DMA more suitable
compare to 5% and 7%. When compare between 5% glicerol, 7% DMSO, and 9%
DMA for kampung chicken, sentul chicken, pelung chicken, and kampung broiler
cross breed, 5% glicerol demonstrated the best cryoprotectan for all breed
chicken. Recovery rate (RR) of sentul was higher than kampung chicken, sentul
chicken, pelung chicken, and kampung broiler cross breed. Breed and type
cryoprotectan influenced the decrease of spermatozoa motility during freezing
process.
Key words: chicken semen, DMA , DMSO, glycerol.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DAYA TAHAN PEMBEKUAN SEMEN EMPAT GENETIK
AYAM LOKAL PADA PROGRAM KRIOPRESERVASI
PLASMA NUTFAH INDONESIA
JUNAEDI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr drh Iman Supriatna
Judul Tesis : Daya Tahan Pembekuan Semen Empat Genetik Ayam Lokalg
PRAKATA
Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Salawat
kepada junjungan Nabi Muhammad Shalallahu‘alaihiwasallam. Karya ilmiah
ditulis berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan pada bulan Mei – Oktober
2014. Judul yang dipilih dalam penelitian yaitu Daya Tahan Pembekuan Semen
Empat Rumpun Genetik Ayam Lokal pada Program Kriopreservasi Plasma
Nutfah Indonesia.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal Perguruan
Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dana beasiswa pada studi Magister
melalui BPPDN-CD (Beasiswa Program Pascasarjana Dalam Negeri Calon
Dosen). Terima kasih penulis ucapkan kepada segenap pembimbing yaitu, Prof
Dr Ir Cece Sumantri, MSc, Dr Agr Asep Gunawan, SPt MSc dan Prof Dr Dra
Raden Iis Arifiantini, MSi. Disamping itu, kepada semua pihak yang telah
membantu penelitian ini, penulis sampaikan ucapan terima kasih kepada Saudara
Khaerudin, Nu’man Hidayat, Muktakim, Pak Dadang dan Pak Bondang beserta
staf Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi IPB.
Ucapan terima kasih kepada Keluarga tercinta Bani Sulaiman (Bapak
Sulaiman, Ibunda Jumiati, Adinda Junardi, Adinda Rumailah, dan Adinda Abu
Abdillah Muhammad Sholih Al Jenepontoji) atas semua kebaikan, do’a, kasih
sayang dan motivasinya. Kepada teman-teman mahasiswa Prodi IPTP 2013
terima kasih atas segenap bantuan dan kerjasamanya. Staf IPB dan jajarannya
serta ikhwan Ahlu Sunnah Wal Jama’ah (As Salafiyyun) di Bogor penulis
mengucapkan terima kasih atas bantuannya.
Meskipun karya ilmiah ini dibuat sedemikian teliti dan kehati-hatian dari
kesalahan akan tetapi karena keterbatasan Penulis sebagai manusia yang tak luput
dari kesalahan. Penulis memohon maaf atas kekurangan yang ada pada karya
ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat menjadi referensi yang bermanfaat bagi
pembaca dan menambah khasanah keilmuan.
Bogor, Agustus 2015
Junaedi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
3
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Materi Penelitian
Metode Penelitian
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
3
3
4
4
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Banding Kualitas Semen Segar
Kualitas Semen Beku Ayam Kampung dengan Konsentrasi DMSO
Kualitas Semen Beku Ayam Sentul dengan Konsentrasi Gliserol
Kualitas Semen Beku Ayam KB dengan Konsentrasi DMA
Uji Banding Freezing Capability antar Rumpun Genetik Ayam
Recovery Rate Semen Beku
Penurunan Motilitas Spermatozoa Semen Beku Ayam
9
9
11
13
14
15
17
18
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
20
20
20
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
24
DAFTAR TABEL
1 Kandungan zat gizi pakan dari perusahaan pt. Gold coin indonesia
2 Komposisi bahan pengencer semen beku ayam kampung
menggunakan kadar dmso yang berbeda
3 Komposisi bahan pengencer semen beku ayam sentul menggunakan
kadar gliserol yang berbeda
4 Komposisi bahan pengencer semen beku silangan KB menggunakan
kriprotektan dma dengan kadar yang berbeda.
5 Jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing
perlakuan pada tahap II, III, dan IV.
6 Karakteristik semen segar ayam kampung, ayam silangan KB, sentul,
dan pelung.
7 Kualitas semen beku ayam kampung pada berbagai tahapan
pembekuan dalam pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai
dosis DMSO
8 Kualitas semen beku ayam sentul pada berbagai tahapan pembekuan
dalam pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai dosis
gliserol
9 Kualitas semen beku ayam silangan KB pada berbagai tahapan
pembekuan pada pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai
dosis DMA
10 Karakteristik semen beku berbagai rumpun ayam lokal dalam
pengencer ringer laktat kuning telur pada jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
11 Recovery rate semen beku berbagai rumpun ayam lokal dalam
pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai jenis
krioprotektan
3
6
7
8
8
10
12
13
14
16
18
DAFTAR GAMBAR
1 Skema alur penelitian
2 Penurunan motilitas semen beku berbagai rumpun ayam lokal pada
setiap tahap pebekuan
3 Penurunan motilitas semen beku ayam lokal pada setiap tahap
pembekuan dengan penggunaan jenis krioprotektan yang berbeda
4
19
20
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
Proses pembuatan pengencer
Proses koleksi semen ayam
Proses pengemasan dan ekuilibrasi semen ayam
Prosedur pembekuan dan penyimpana semen beku
Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan abnormalitas total
semen segar empat rumpun ayam lokal Indonesia
24
24
25
25
26
6 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan abnormalitas primer
semen segar empat rumpun ayam lokal indonesia
7 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan abnormalitas sekunder
semen segar empat rumpun ayam lokal indonesia
8 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas semen segar
empat rumpun ayam lokal indonesia
9 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas semen segar
empat rumpun ayam lokal indonesia
10 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan konsentrasi semen
segar empat rumpun ayam lokal indonesia
11 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan volume semen segar
empat rumpun ayam lokal indonesia
12 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
13 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
14 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
15 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan recovery rate semen
ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
16 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
17 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
18 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
19 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
20 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan recovery rate semen
ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
21 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
22 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
23 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dma yang berbeda
24 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dma yang berbeda
25 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan rr semen ayam
dengan konsentrasi dma yang berbeda
26 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dma yang berbeda
27 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas semen
segar pada tahap terakhir
28 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas semen
segar pada tahap penelitian
26
27
27
28
28
29
29
30
30
31
31
32
32
32
32
33
33
33
34
34
35
35
36
29 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
30 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
31 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
32 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
33 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan recovery rate semen
beku ayam dengan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari
perlakuan
34 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan penurunan kualitas
semen segar- ekuilibrasi dari berbagai rumpun ayam lokal dengan
jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari perlakuan
35 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan penurunan kualitas
semen dari ekuilibrasi - setelah thawing dari berbagai rumpun ayam
lokal dengan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari
perlakuan
36 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan penurunan kualitas
semen segar- thawing dari berbagai rumpun ayam lokal dengan jenis
dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari perlakuan
37
37
38
39
40
41
41
42
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ayam merupakan ternak yang sangat umum dijumpai di Indonesia, dan
telah terbukti mempunyai potensi yang tinggi sebagai penghasil daging dan telur.
keanekaragaman hayati dari ternak ayam cukup besar, terbuka peluang untuk
melakukan pemuliabiakan jenis ternak tersebut sehingga dapat dihasilkan ras atau
bangsa ayam baru (proven breed) yang produktivitasnya lebih baik. Program
pemuliaan pengujian kualitas sperma jantan berbagai genetik pejantan perlu
dilakukan untuk mendapatkan produktivitas yang tinggi. Semen yang mempunyai
kualitas jelek menyebabkan fertilitas telur rendah dan sebaliknya untuk semen
kualitas baik akan menghasilkan persentase telur fertil yang lebih baik. Hal ini
tergantung dari pejantan, khususnya kualitas semen yang dihasilkan pejantan.
Salah satu upaya pelestarian plasma nutfah ayam adalah dengan
kriopreservasi semen. Pembekuan semen merupakan upaya yang digunakan untuk
memperpanjang daya hidup spermatozoa. Teknik kriopreservasi akan menjadi alat
yang sangat berharga bagi industri unggas (Fulton 2006) dan untuk keberhasilan
pelestarian sumber daya genetik unggas yang masih ada. Namun dalam proses
pembekuan yang sering dihadapi adalah cold shock dan kerusakan sel akibat
terbentuknya kristal es. Pengolahan semen beku perlu memperhatikan beberapa
faktor diantaranya pengencer dan krioprotektan yang tepat sehingga dapat
melindungi spermatozoa dari efek pembekuan. Pengencer semen harus
mengandung sumber nutrisi, larutan penyangga, bahan anti cold shock,
krioprotektan, dan antibiotika.
Pembekuan semen perlu ditambahkan zat pelindung yang biasa disebut
sebagai krioprotektan yang dapat mencegah terbentuknya kristal es dan
menstabilkan membran plasma spermatozoa selama proses pembekuan.
Krioprotektan yang digunakan harus mudah larut dalam air dan harus mempunyai
bobot molekul yang kecil agar lebih cepat penetrasi ke dalam sel dan mengurangi
toksisitas akibat osmolaritas yang tinggi. Jenis dan konsentrasi krioprotektan
yang tepat dalam bahan pengencer sangat penting untuk melindungi spermatozoa
selama pembekuan (Suidzinska dan Lukaszewicz 2008).
Krioprotektan berperan dalam mengurangi pengaruh mematikan selama
pembekuan, baik berupa pengaruh larutan maupun adanya pembentukan kristal es
sehingga viabilitas sel dapat dipertahankan. Krioprotektan dikelompokkan
menjadi krioprotektan yang bekerja di dalam dan di luar sel (Chen et al. 2005;
Luz et al. 2009). Sementara itu, berdasarkan bahan krioprotektan dikelompokkan
menjadi dua golongan, yaitu kelompok alkohol seperti etilen glikol, dan gliserol
serta kelompok amida seperti dimetilformamid, asetamid, dan metilformamid
(Alvarenga et al. 2005).
Dimethyl sulfoxide (DMSO) adalah campuran organosulfur dengan rumus
kimia (CH3)2SO dan mempunyai berat molekul sebesar 78.13 g/mol dengan titik
beku yang tinggi. Gerzilov (2010) melaporkan DMSO bisa digunakan pada
pembekuan semen unggas. Konsentrasi DMSO dalam pengencer semen bervariasi,
pada semen itik terbaik adalah 10% (Han et al. 2005) sedangkan pada ayam
2
white leghorn, ovambo, dan potchefstrom koekoek terbaik adalah 5% (Makhafola
et al. 2009).
Dimethyl acetamide (DMA) merupakan senyawa dengan berat molekul
87.12 g/mol dan berat jenis 0.94 g/cm3 merupakan larutan yang mudah larut
dalam air, alkohol, ether, aseton, benzena dan larutan lain. Krioprotektan DMA
mempunyai kemampuan penetrasi yang baik pada sel-sel dengan kandungan lipid
membran yang banyak. Dosis optimum DMA dalam pengencer semen itik sebesar
10% (Han et al. 2005), dan ayam arab sebesar 7% (Iskandar et al. 2006).
Gliserol (C3H8O3) merupakan senyawa golongan alkohol polihidrat dengan
tiga buah gugus hidroksil dalam satu molekul, bersifat polar, berat molekul 92.09
g/mol, dan berat jenis 1.26 g/cm3. Gliserol merupakan krioprotektan intraseluler
yang paling banyak digunakan untuk pembekuan semen. Gliserol dapat masuk ke
dalam sel spermatozoa untuk mengikat sebagian air bebas, sehingga kristal-kristal
es yang terbentuk di dalam medium pengencer pada waktu pembekuan dapat
dicegah. Konsentrasi gliserol yang digunakan berbeda bergantung jenis semen
serta pengencer yang digunakan (Azizah dan Arifiantini 2009).
Selain jenis krioprotektan yang digunakan, konsentrasi krioprotektan pun
akan memengaruhi kualitas semen beku. Adanya keragaman kualitas spermatozoa
unggas serta efektivitas optimum dari krioprotektan pada proses kriopreservasi
yang berbeda dari hasil setiap peneliti. Penelitian terdahulu didapatkan kinerja
optimum dari DMA, DMSO, maupun gliserol yaitu 5-10%. Penelitian ini
dilaksanakan untuk menentukan efektifitas setiap jenis dan konsentrasi
krioprotektan (5%, 7% dan 9%) dalam pengencer ringer laktat kuning telur pada
pembekuan semen ayam dan untuk menguji kualitas spermatozoa berbagai
rumpun genetik ayam pejantan, menguji daya tahan terhadap pembekuan (freezing
capability) dari berbagai rumpun genetik ayam lokal.
Rumusan Masalah
Uraian di atas dapat diambil rumusan masalah;
1. Apakah kualitas semen segar dari berbagai rumpun ayam lokal berbeda?
2. Bagaimanakah daya tahan spermatozoa terhadap pembekuan (freezing
capability) dari berbagai rumpun genetik ayam pejantan?
3. Jenis dan konsentrasi krioprotektan manakah yang memberikan kinerja
optimum terhadap kemampuan daya tahan spermatozoa selama proses
pembekuan (freezing capability) dari berbagai rumpun genetik ayam
pejantan?
Tujuan Penelitian
1.
2.
3.
Membandingkan kualitas spermatozoa berbagai genetik rumpun ayam
pejantan local.
Menentukan konsentrasi krioprotektan yang terbaik pada proses
pembekuan semen setiap galur ayam lokal.
Menentukan jenis krioprotektan yang paling optimum pada proses
pembekuan semen setiap galur ayam lokal.
3
Manfaat Penelitian
1. Mendapatkan satu paket teknologi untuk meningkatkan populasi ayam.
2. Menghasilkan peluang usaha baru di bidang pembenihan unggas
khususnya ayam.
3. Merintis pembentukan bank genetik khusus dalam bentuk semen ayam
dalam rangka pelestarian satwa aves lokal Indonesia.
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di kandang Pemuliaan Ternak Unggas, Fakultas
Peternakan IPB dan di Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Bagian
Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran Hewan IPB pada bulan MeiOktober 2014.
Materi Penelitian
Sumber Semen
Ayam jantan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari empat genetik
ayam jantan yang berbeda, masing-masing 3 ekor ayam jantan pelung, 3 ekor
ayam jantan kampung, 3 ekor ayam jantan sentul, dan 3 ekor ayam jantan
persilangan kampung broiler. Ayam jantan yang digunakan telah dewasa kelamin
dan berumur 1 tahun. Ayam jantan dikandangkan secara individual. Ayam jantan
yang digunakan diadaptasikan terhadap kolektor semen maupun pada lingkungan
kandang. Adaptasi memerlukan waktu dua bulan. Setelah terbiasa dengan
lingkungan kandang dan kolektor, baru ayam tersebut bisa dipakai dalam
penelitian untuk ditampung semennya.
Pakan yang diberikan berupa pakan jadi (pakan komersial) berbentuk pellet
dari perusahaan PT. Gold Coin Indonesia. Pakan diberikan dengan takaran 150
gram/hari dan pemberian air minum secara adlibitum. Kandungan zat gizi pakan
dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Kandungan zat gizi pakan dari perusahaan PT. Gold Coin Indonesia.
Komposisi
Protein kasar (%)
Abu (%)
Serat kasar (%)
Lemak kasar(%)
Kalsium (%)
Fosfor (%)
Kandungan Gizi
17.00
14.00
6.00
3.00
4.20
0.60
Bahan dan Peralatan
Bahan-bahan yang dipakai untuk penelitian diantaranya NaCl fisiologis,
kuning telur ayam, ringer laktat, antibiotik (penisilin dan streptomisin), pewarna
eosin negrosin, alkohol, kertas tissue, dan nitrogen cair. Krioprotektan gliserol,
dimethyl sulfoxide (DMSO), dan dimethyl acetamide (DMA).
4
Peralatan yang dipakai untuk penampungan dan evaluasi adalah spoit 1 mL,
microtube 2 mL, mikroskop, obyek gelas, gelas penutup, rak tabung semen,
counting chamber, pipet plastik, gunting atau straw cutter, dan lemari es.
Sedangkan peralatan yang dilibatkan untuk kriopresevasi semen temasuk
pembekuan dan pencairan semen beku yaitu meliputi tabung koleksi semen 2 mL,
tabung reaksi 5 mL, mikropipet, tip mikropipet, kotak styrofoam, seperangkat
penyimpanan semen beku (storage container) atau kontainer nitrogen cair (196oC), pipet, jerami plastik (straw) berukuran 0.25 mL, spoit 1 mL dilengkapi
dengan konektor straw, rak tabung, semen dalam kotak plastik, bunsen,
thermometer, dan lemari es.
Metode Penelitian
Penelitian dibagi menjadi beberapa tahap dan dijelaskan secara detail dalam
skema alur penelitian yang disajikan pada Gambar 1.
Penampungan Semen Empat Rumpun Ayam
Uji KualitasSemen Segar
Tahap I
Pembuatan Pengencer Semen
Tahap II
Tahap III
Tahap IV
DMSO
5%, 7%, 9%
Gliserol
5%, 7%, 9%
DMA
5%, 7%, 9%
Ayam Kampung
Ayam Sentul
Ayam KB
Didapatkan
Jenis dan Level KrioprotektanTerbaik
Uji Freezing Capability
Ayam Kampung
Ayam Sentul
Ayam KB
Gambar 1 Skema alur penelitian
Tahap V
Ayam Pelung
5
Tahap 1: Uji Banding Kualitas Semen Segar Empat Rumpun Ayam Lokal
Koleksi Semen Segar
Koleksi semen dari tiap perlakuan dilakukan tiga kali seminggu. Adapun
teknik penampungan semen yang digunakan adalah dengan pengurutan (masase)
pada bagian punggung ayam. Penampungan semen dilakukan oleh dua orang.
Seorang memegang ayam pada kedua pahanya dengan tangan kiri sambil
mengurut bagian punggung ayam untuk merangsang keluarnya semen, dan
seorang lagi menyiapkan tabung penampung semen berskala dan tissue pembersih
kotoran ayam. Pengurutan dilakukan beberapa kali sampai terjadinya rangsangan
pada ayam yang ditandai dengan peregangan tubuh ayam dan keluarnya papillae
dari proktodaeum kloaka. Ketika ereksi mencapai maksimal, tangan kanan dan
kiri orang yang melakukan pengurutan bekerjasama memerah semen. Pada saat
yang sama, orang kedua bersiap-siap menampung semen dengan tabung
penampung berskala.
Evaluasi Semen Segar
Setelah koleksi semen dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis.
Evaluasi secara makroskopis dilakukan terhadap volume, warna, konsistensi, dan
derajat keasamaan (pH). Volume semen diukur dengan menggunakan pipet ukur,
pH semen diukur menggunakan pH special indicator paper, konsistensi semen
dibedakan antara kental dan sedang, dan warna dibedakan menjadi krem dan putih
susu dilihat secara visual. Evaluasi secara mikroskopis meliputi gerakan massa,
motilitas spermatozoa, konsentrasi spermatozoa per ml, spermatozoa hidup, dan
morfologi spermatozoa.
Gerakan massa spermatozoa dinilai dengan cara meneteskan semen segar
pada objek glass lalu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 X 10
(100X). Penilaian dilakukan berdasarkan tebal tipisnya gelombang massa serta
kecepatan gelombang massa berpindah tempat, dengan kriteria penilaian sangat
baik (+++/3), baik (++/2), lumayan (+/1), dan buruk (tidak ada gelombang).
Motilitas spermatozoa adalah persentase spermatozoa yang maju ke depan
(progresif), dinilai dengan cara meneteskan 1 tetes semen ditambah 8-10 tetes
NaCl fisiologis, dihomogenkan dan dipindahkan 1 tetes di atas obyek gelas yang
lain dan ditutup dengan gelas penutup. Motilitas spermatozoa dinilai secara
estimasi dari lima lapangan pandang dengan cara membandingkan jumlah
spermatozoa yang bergerak maju ke depan dengan gerakan spermatozoa yang lain
dinyatakan dalam persentase (Arifiantini 2012).
Konsentrasi spermatozoa adalah jumlah spermatozoa per ml dihitung
dengan menggunakan kamar hitung neubauer, dengan pengenceran 500 kali (998
µl formolsalin dengan 2 µL semen). Jumlah spermatozoa dari lima kotak hitung
dikalikan 25 X 106 (faktor pengenceran, faktor koreksi menghitung 5 kotak
hitung dan konversi dari mm3 ke mL). Persentase spermatozoa hidup dievaluasi
dengan menggunakan zat warna eosin negrosin. Satu tetes semen ditambah 8-10
tetes eosin negrosin, dihomogenkan dan dibuat preparat ulas dan dikeringkan pada
suhu 37 oC. Penghitungan dilakukan di bawah mikroskop pembesaran 40 x 10
(400 X) pada 10 lapangan pandang. Spermatozoa yang hidup tidak menyerap
warna dan yang mati berwarna merah ungu pada bagian kepala. Jumlah
6
spermatozoa hidup adalah jumlah spermatozoa yang hidup dibagi jumlah
spermatozoa terhitung dikali 100%.
Morfologi spermatozoa dilakukan menggunakan pewarnaan yang sama
dengan spermatozoa hidup. Morfologi dibedakan berdasarkan morfologi yang
normal dan morfologi yang abnormal. Abnormalitas spermatozoa dihitung
minimal 200 sel berdasarkan perhitungan 10 lapang pandang (Arifiantini et al.
2005). Persentase spermatozoa yang abnormal dibedakan berdasarkan
abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder (Alkan et al. 2002).
Pengukuran Tekanan Osmotik Semen Segar dan Bahan Pengencer
Dilakukan pengukuran tekanan osmotik semen segar semua jenis ayam
dan tekanan osmotik bahan pengencer yang digunakan.
Tahap II: Penentuan Konsentrasi Krioprotektan DMSO pada Pengencer
Ringer Laktat dan Kuning Telur
Koleksi Semen dan Evaluasi Semen
Koleksi semen dari tiap perlakuan dilakukan tiga kali seminggu. Adapun
teknik penampungan semen yang digunakan adalah dengan pengurutan (masase).
Semen yang diperoleh dievaluasi seperti yang dilakukan pada tahap I.
Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer yang digunakan larutan ringer laktat dengan tiga
konsentrasi DMSO (Tabel 2).
Tabel 2 Komposisi bahan pengencer semen beku menggunakan kadar DMSO
yang berbeda
Komposisi
Ringer laktat (mL)
Kuning telur (mL)
DMSO (mL)
Penisilin (IU mL-1)
Streptomisin (mg mL-1)
Total (mL)
Tekanan osmotik (mOsmol kg -1)a
pHb
5%
8.5
1
0.5
1 000
1
10
738
7
DMSO
7%
8.3
1
0.7
1 000
1
10
1 010
7
9%
8.1
1
0.9
1 000
1
10
1 042
7
a
Tekanan osmotik pengencer diukur menggunakan osmometer. bpH pengencer di-ajust (dipaskan)
dengan Tris hydroxymethyl aminomethan.
Pengenceran dan Pengemasan Semen
Semen yang menunjukkan motilitas spermatozoa lebih dari 75% dengan
konsentrasi spermatozoa lebih dari 2500 x 106 per mL, dibagi ke dalam tiga
tabung, masing-masing diencerkan dengan pengencer ringer laktat kuning telur
(RLKT) dengan DMSO 5% (RLKT5), RLKT DMSO 7% (RLKT7) dan RLKT
DMSO 9% (RLKT9) dengan dosis 50x106 per 0.25 mL. Semen yang diencerkan
dikemas ke dalam mini straw (Minitub, Germany) 0.25 mL dan disusun dalam
rak pembekuan.
7
Ekuilibrasi dan Pembekuan Semen
Straw selanjutnya diekuilibrasi pada suhu 5 oC selama 2 jam (Bearden et
al. 2004), dibekukan pada uap nitrogen cair selama 10 menit (Han et al. 2005),
kemudian disimpan pada kontainer nitrogen cair (-196 oC) untuk pengujian
berikutnya.
Penyimpanan
Semen beku disimpan dalam nitrogen cair selama 24 jam untuk pengujian
lebih lanjut.
Pengujian Kualitas Semen Beku
Pengujian kualitas semen beku dilakukan 24 jam setelah penyimpanan,
dengan cara melakukan thawing semen beku dalam air hangat (37 oC) selama 30
detik. Pengujian dilakukan terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa seperti
yang dilakukan pada semen segar. Keberhasilan pembekuan juga dinilai dengan
Recovery rate yaitu persentase spermatozoa yang berhasil pulih dari proses
pembekuan yang dihitung dengan membandingkan persentase spermatozoa motil
pada semen segar dan setelah thawing
.
Tahap III: Penentuan Konsentrasi Krioprotektan Gliserol pada Pengencer
Ringer Laktat dan Kuning Telur
Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer yang digunakan pada tahap III sama dengan tahap yang
ke II, perbedaannya adalah pada jenis dan konsentrasi krioprotektan yang
digunakan, dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi bahan pengencer semen beku menggunakan kadar gliserol
yang berbeda
Komposisi
Ringer laktat (mL)
Kuning telur (mL)
Gliserol (mL)
Penisilin (IU mL-1)
Streptomisin (mg mL-1)
Total (mL)
Tekanan osmotik (mOsmol kg -1)a
pHb
5%
8.5
1
0.5
1 000
1
10
1 230
7
Gliserol
7%
8.3
1
0.7
1 000
1
10
1 800
7
9%
8.1
1
0.9
1 000
1
10
2 298
7
a
Tekanan osmotik pengencer diukur menggunakan osmometer. bpH pengencer di-ajust (dipaskan)
dengan Tris hydroxymethyl aminomethan.
Prosedur selanjutnya adalah koleksi, evaluasi, dan pengolahan semen sama
seperti yang dilakukan pada tahap II.
8
Tahap IV: Penentuan Konsentrasi Krioprotektan DMA pada Pengencer
Ringer Laktat dan Kuning Telur
Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer yang digunakan pada tahap III sama dengan tahap yang
ke II, perbedaannya adalah pada jenis dan konsentrasi krioprotektan yang
digunakan, dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Komposisi bahan pengencer semen beku menggunakan kriprotektan
DMA dengan kadar yang berbeda.
Komposisi
Ringer laktat (mL)
Kuning telur (mL)
DMA (mL)
Penisilin (IU mL-1)
Streptomisin (mg mL-1)
Total (mL)
Tekanan osmotik mOsmol kg -1)a
pHb
5%
8.5
1
0.5
1 000
1
10
889
7
DMA
7%
8.3
1
0.7
1 000
1
10
1 104
7
9%
8.1
1
0.9
1 000
1
10
1 294
7
a
Tekanan osmotik pengencer diukur menggunakan osmometer. bpH pengencer di-ajust (dipaskan)
dengan Tris hydroxymethyl aminometha
Prosedur selanjutnya adalah koleksi, evaluasi, dan pengolahan semen sama
seperti yang dilakukan pada tahap II dan III.
Tahap V: Uji Banding Freezing Capability Empat Genetik Rumpun Ayam
Uji banding freezing capability antar empat genetik rumpun ayam yaitu
ayam pelung, ayam kampung, ayam sentul dan ayam persilangan kampung broiler
menggunakan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing
perlakuan (Tabel 5). Parameter yang diukur dalam pemeriksaan semen adalah
persentase motilitas dan viabilitas.
Tabel 5 Jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing perlakuan
pada tahap II, III, dan IV
Jenis ayam
Pelung
Kampung
Sentul
Kampung broiler
Pengencera
RL Gliserol (%) RL DMSO (%) RL DMA (%)
5
7
9
5
7
9
5
7
9
5
7
9
a
RL DMSO (konsentrasi terbaik Tahap II), RL Gliserol (Konsentrasi terbaik Tahap III), dan RL
DMA ( terbaik Tahap IV)
Proses koleksi, evaluasi, pengolahan semen beku dan pengujian kualitas
dilakukan sesuai dengan tahap II, III dan IV.
9
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Pelaksanaan proses penelitian pada tahap I menggunakan rancangan acak
lengkap (RAL) dengan empat perlakuan (ayam kampung, sentul, silangan KB,
dan pelung). Sedangkan mulai dari tahap II - IV dianalisa dengan menggunakan
RAL tiga perlakuan dengan model matematika sebagai berikut:
Yij = µ + αi+ εij
Keterangan:
Yij
: Respon yang diperoleh dari pengaruh perlakuan (DMSO/Gliserol/DMA)
ke-i (5%, 7% dan 9%) dan ulangan ke-j (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9)
µ
: Nilai rataan umum
αi
: Pengaruh perlakuan ke-i
εij
: Pengaruh galat perlakuan ke-i (5%, 7% dan 9%) ) dan ulangan
ke-j (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9)
Pada tahap V dilakukan dengan pola faktorial. Adapun model matematika
yang digunakan adalah sebagai berikut:
Yijk = µ + Ai + Bj + ABij + εijk
Keterangan :
Yijk : Pengamatan Faktor A (rumpun ayam) taraf ke-i (ayam kampung, ayam
sentul, ayam silangan KB, dan ayam pelung) , Faktor B (krioprotektan)
taraf ke-j (Gliserol 5%, DMSO 7%, dan DMA 9%) dan Ulangan ke-k (1,
2, 3)
µ
: Rataan umum
Ai
: Pengaruh Faktor A pada taraf ke-i
Bj
: Pengaruh Faktor B pada taraf ke-j
ABij : Interaksi antara Faktor A dengan Faktor B
εijk
: Pengaruh galat pada Faktor A taraf ke-i, Faktor B taraf ke-j dan ulangan
ke-k
Pengujian selanjutnya dilakukan terhadap nilai rata-rata perlakuan pada
tingkat P (
AYAM LOKAL PADA PROGRAM KRIOPRESERVASI
PLASMA NUTFAH INDONESIA
JUNAEDI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Daya Tahan Pembekuan
Semen Empat Genetik Ayam Lokal pada Program Kriopreservasi Plasma Nutfah
Indonesia” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Junaedi
NIM D151130051
RINGKASAN
JUNAEDI. Daya Tahan Pembekuan Semen Empat Genetik Ayam Lokal pada
Program Kriopreservasi Plasma Nutfah Indonesia. Dibimbing oleh CECE
SUMANTRI, ASEP GUNAWAN dan RADEN IIS ARIFIANTINI.
Ayam merupakan ternak yang sangat umum dijumpai di Indonesia, serta
telah terbukti mempunyai potensi yang tinggi sebagai penghasil daging dan telur.
Salah satu upaya pelestarian plasma nutfah ayam adalah dengan pembekuan
(kriopreservasi) semen. Pembekuan semen merupakan cara yang digunakan untuk
memperpanjang daya hidup spermatozoa dan salah satu cara untuk melestarikan
plasma nutfah ayam terancam punah. Tujuan dari penelitian ini adalah
membandingkan kualitas spermatozoa berbagai genetik rumpun ayam pejantan
lokal, menentukan jenis krioprotektan (dimethyl sulfoxide/ DMSO), gliserol, dan
dimethyl acetamide/ DMA) yang terbaik pada proses pembekuan semen setiap
galur ayam lokal, dan menentukan konsentrasi krioprotektan yang paling optimum
pada proses pembekuan semen setiap galur ayam lokal Indonesia
Penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahap yaitu; 1) Uji banding kualitas
semen segar antar rumpun ayam lokal, 2) Penentuan konsentrasi krioprotektan
DMSO pada pengencer ringer laktat dan kuning telur, 3) Penentuan konsentrasi
krioprotektan gliserol pada pengencer ringer laktat dan kuning telur, 4) Penentuan
konsentrasi krioprotektan DMA pada pengencer ringer laktat dan kuning telur, 5)
Uji banding freezing capability antara empat rumpun ayam, yaitu ayam pelung,
ayam kampung, ayam sentul, dan ayam persilangan kampung broiler
menggunakan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing
perlakuan. Penelitian tahap 1 sampai 4 dirancang menggunakan rancangan acak
lengkap sedangkan tahap 5 menggunakan rancangan faktorial. Jika terdapat
perbedaan antar perlakuan dilanjutkan menggunakan uji Duncan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara umum kualitas semen segar
ayam pelung lebih baik dari rumpun ayam lainnya. Penggunaan DMSO 7%
merupakan konsentrasi terbaik pada pembekuan semen ayam kampung
dibandingkan dengan konsentrasi DMSO 5% dan DMSO 9%. Penggunaan
gliserol 5% merupakan konsentrasi terbaik pada pembekuan semen ayam sentul
dibandingkan dengan konsentrasi gliserol 7% dan gliserol 9%. Penggunaan DMA
9% merupakan konsentrasi terbaik pada pembekuan semen ayam silangan
kampung broiler dibandingkan dengan konsentrasi DMA 5% dan DMA 7%.
Penggunaan gliserol 5%, DMSO 7%, dan DMA 9% didapatkan gliserol 5%
terbaik pada pembekuan semen ayam kampung, sentul, pelung dan silangan
kampung broiler. Recovery rate (RR) pada ayam sentul lebih tinggi dibanding
rumpun ayam lokal lainnya. Rumpun ayam dan tipe krioprotektan berpengaruh
pada penurunan motilitas semen beku selama proses pembekuan.
Kata kunci: DMA, DMSO, gliserol, semen ayam.
SUMMARY
JUNAEDI. Freezing Capability of Semen Four Genetic Local Chicken on
Cryopreservation Germplasm Program Indonesia. Supervised by CECE
SUMANTRI, ASEP GUNAWAN and RADEN IIS ARIFIANTINI.
Chicken is a very common animal in Indonesia, and has been shown high
potential as meat and eggs producer. Semen cryopreservation as one way to
preserve endangered local chicken breed. The purpose of this study was to
compare the genetic quality by analyze of sperm quality of various local chicken
breed, determine the best cyoprotectant concentration (dimethyl sulfoxide/
DMSO), glycerol, and dimethyl acetamide/ DMA) in ringer lactate egg yolk
extender in different breed and to compare freezing capability among breed using
the best concentration of cryoprotectant in each breed.
The research was conducted into 5 step; 1) comparison of fresh semen
quality among local chicken breed 2) determination the best DMSO concentration
in Ringer's lactate diluent egg yolk (RLEY) of kampung chicken breed 3)
determination of the best glycerol concentration in RLEY of sentul chicken breed
4) determination of the DMA concentration in RLEY of kampung broiler cross
breed 5) to compare freezing capability among local chicken breed using the best
cryoprotectan concentration of each breed. Step 1 to step 4 were design using
completely randomized and step 5 using factorial design.
The results showed that fresh semen of pelung chicken demonstrated higher
quality compare to other. The use of 7% DMSO was the best concentration of
frozen semen compared to 5% and 9% of kampung chicken breed. Glycerol 5%
using was the best concentration in frozen semen compared with 7% and 9% of
sentul chicken breed. For kampung broiler cross breed, 9% DMA more suitable
compare to 5% and 7%. When compare between 5% glicerol, 7% DMSO, and 9%
DMA for kampung chicken, sentul chicken, pelung chicken, and kampung broiler
cross breed, 5% glicerol demonstrated the best cryoprotectan for all breed
chicken. Recovery rate (RR) of sentul was higher than kampung chicken, sentul
chicken, pelung chicken, and kampung broiler cross breed. Breed and type
cryoprotectan influenced the decrease of spermatozoa motility during freezing
process.
Key words: chicken semen, DMA , DMSO, glycerol.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
DAYA TAHAN PEMBEKUAN SEMEN EMPAT GENETIK
AYAM LOKAL PADA PROGRAM KRIOPRESERVASI
PLASMA NUTFAH INDONESIA
JUNAEDI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr drh Iman Supriatna
Judul Tesis : Daya Tahan Pembekuan Semen Empat Genetik Ayam Lokalg
PRAKATA
Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Salawat
kepada junjungan Nabi Muhammad Shalallahu‘alaihiwasallam. Karya ilmiah
ditulis berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan pada bulan Mei – Oktober
2014. Judul yang dipilih dalam penelitian yaitu Daya Tahan Pembekuan Semen
Empat Rumpun Genetik Ayam Lokal pada Program Kriopreservasi Plasma
Nutfah Indonesia.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal Perguruan
Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dana beasiswa pada studi Magister
melalui BPPDN-CD (Beasiswa Program Pascasarjana Dalam Negeri Calon
Dosen). Terima kasih penulis ucapkan kepada segenap pembimbing yaitu, Prof
Dr Ir Cece Sumantri, MSc, Dr Agr Asep Gunawan, SPt MSc dan Prof Dr Dra
Raden Iis Arifiantini, MSi. Disamping itu, kepada semua pihak yang telah
membantu penelitian ini, penulis sampaikan ucapan terima kasih kepada Saudara
Khaerudin, Nu’man Hidayat, Muktakim, Pak Dadang dan Pak Bondang beserta
staf Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi IPB.
Ucapan terima kasih kepada Keluarga tercinta Bani Sulaiman (Bapak
Sulaiman, Ibunda Jumiati, Adinda Junardi, Adinda Rumailah, dan Adinda Abu
Abdillah Muhammad Sholih Al Jenepontoji) atas semua kebaikan, do’a, kasih
sayang dan motivasinya. Kepada teman-teman mahasiswa Prodi IPTP 2013
terima kasih atas segenap bantuan dan kerjasamanya. Staf IPB dan jajarannya
serta ikhwan Ahlu Sunnah Wal Jama’ah (As Salafiyyun) di Bogor penulis
mengucapkan terima kasih atas bantuannya.
Meskipun karya ilmiah ini dibuat sedemikian teliti dan kehati-hatian dari
kesalahan akan tetapi karena keterbatasan Penulis sebagai manusia yang tak luput
dari kesalahan. Penulis memohon maaf atas kekurangan yang ada pada karya
ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat menjadi referensi yang bermanfaat bagi
pembaca dan menambah khasanah keilmuan.
Bogor, Agustus 2015
Junaedi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
3
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Materi Penelitian
Metode Penelitian
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
3
3
4
4
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Banding Kualitas Semen Segar
Kualitas Semen Beku Ayam Kampung dengan Konsentrasi DMSO
Kualitas Semen Beku Ayam Sentul dengan Konsentrasi Gliserol
Kualitas Semen Beku Ayam KB dengan Konsentrasi DMA
Uji Banding Freezing Capability antar Rumpun Genetik Ayam
Recovery Rate Semen Beku
Penurunan Motilitas Spermatozoa Semen Beku Ayam
9
9
11
13
14
15
17
18
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
20
20
20
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
24
DAFTAR TABEL
1 Kandungan zat gizi pakan dari perusahaan pt. Gold coin indonesia
2 Komposisi bahan pengencer semen beku ayam kampung
menggunakan kadar dmso yang berbeda
3 Komposisi bahan pengencer semen beku ayam sentul menggunakan
kadar gliserol yang berbeda
4 Komposisi bahan pengencer semen beku silangan KB menggunakan
kriprotektan dma dengan kadar yang berbeda.
5 Jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing
perlakuan pada tahap II, III, dan IV.
6 Karakteristik semen segar ayam kampung, ayam silangan KB, sentul,
dan pelung.
7 Kualitas semen beku ayam kampung pada berbagai tahapan
pembekuan dalam pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai
dosis DMSO
8 Kualitas semen beku ayam sentul pada berbagai tahapan pembekuan
dalam pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai dosis
gliserol
9 Kualitas semen beku ayam silangan KB pada berbagai tahapan
pembekuan pada pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai
dosis DMA
10 Karakteristik semen beku berbagai rumpun ayam lokal dalam
pengencer ringer laktat kuning telur pada jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
11 Recovery rate semen beku berbagai rumpun ayam lokal dalam
pengencer ringer laktat kuning telur pada berbagai jenis
krioprotektan
3
6
7
8
8
10
12
13
14
16
18
DAFTAR GAMBAR
1 Skema alur penelitian
2 Penurunan motilitas semen beku berbagai rumpun ayam lokal pada
setiap tahap pebekuan
3 Penurunan motilitas semen beku ayam lokal pada setiap tahap
pembekuan dengan penggunaan jenis krioprotektan yang berbeda
4
19
20
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
Proses pembuatan pengencer
Proses koleksi semen ayam
Proses pengemasan dan ekuilibrasi semen ayam
Prosedur pembekuan dan penyimpana semen beku
Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan abnormalitas total
semen segar empat rumpun ayam lokal Indonesia
24
24
25
25
26
6 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan abnormalitas primer
semen segar empat rumpun ayam lokal indonesia
7 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan abnormalitas sekunder
semen segar empat rumpun ayam lokal indonesia
8 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas semen segar
empat rumpun ayam lokal indonesia
9 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas semen segar
empat rumpun ayam lokal indonesia
10 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan konsentrasi semen
segar empat rumpun ayam lokal indonesia
11 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan volume semen segar
empat rumpun ayam lokal indonesia
12 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
13 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
14 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
15 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan recovery rate semen
ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
16 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
17 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
18 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
19 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
20 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan recovery rate semen
ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
21 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi gliserol yang berbeda
22 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dmso yang berbeda
23 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen ayam dengan konsentrasi dma yang berbeda
24 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dma yang berbeda
25 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan rr semen ayam
dengan konsentrasi dma yang berbeda
26 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen ayam dengan konsentrasi dma yang berbeda
27 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas semen
segar pada tahap terakhir
28 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas semen
segar pada tahap penelitian
26
27
27
28
28
29
29
30
30
31
31
32
32
32
32
33
33
33
34
34
35
35
36
29 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
ekuilibrasi semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
30 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
ekuilibrasi semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
31 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan motilitas setelah
thawing semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
32 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan viabilitas setelah
thawing semen beku ayam dengan jenis dan konsentrasi
krioprotektan terbaik dari perlakuan
33 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan recovery rate semen
beku ayam dengan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari
perlakuan
34 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan penurunan kualitas
semen segar- ekuilibrasi dari berbagai rumpun ayam lokal dengan
jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari perlakuan
35 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan penurunan kualitas
semen dari ekuilibrasi - setelah thawing dari berbagai rumpun ayam
lokal dengan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari
perlakuan
36 Hasil analisis ragam (ANOVA) dan uji Duncan penurunan kualitas
semen segar- thawing dari berbagai rumpun ayam lokal dengan jenis
dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari perlakuan
37
37
38
39
40
41
41
42
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ayam merupakan ternak yang sangat umum dijumpai di Indonesia, dan
telah terbukti mempunyai potensi yang tinggi sebagai penghasil daging dan telur.
keanekaragaman hayati dari ternak ayam cukup besar, terbuka peluang untuk
melakukan pemuliabiakan jenis ternak tersebut sehingga dapat dihasilkan ras atau
bangsa ayam baru (proven breed) yang produktivitasnya lebih baik. Program
pemuliaan pengujian kualitas sperma jantan berbagai genetik pejantan perlu
dilakukan untuk mendapatkan produktivitas yang tinggi. Semen yang mempunyai
kualitas jelek menyebabkan fertilitas telur rendah dan sebaliknya untuk semen
kualitas baik akan menghasilkan persentase telur fertil yang lebih baik. Hal ini
tergantung dari pejantan, khususnya kualitas semen yang dihasilkan pejantan.
Salah satu upaya pelestarian plasma nutfah ayam adalah dengan
kriopreservasi semen. Pembekuan semen merupakan upaya yang digunakan untuk
memperpanjang daya hidup spermatozoa. Teknik kriopreservasi akan menjadi alat
yang sangat berharga bagi industri unggas (Fulton 2006) dan untuk keberhasilan
pelestarian sumber daya genetik unggas yang masih ada. Namun dalam proses
pembekuan yang sering dihadapi adalah cold shock dan kerusakan sel akibat
terbentuknya kristal es. Pengolahan semen beku perlu memperhatikan beberapa
faktor diantaranya pengencer dan krioprotektan yang tepat sehingga dapat
melindungi spermatozoa dari efek pembekuan. Pengencer semen harus
mengandung sumber nutrisi, larutan penyangga, bahan anti cold shock,
krioprotektan, dan antibiotika.
Pembekuan semen perlu ditambahkan zat pelindung yang biasa disebut
sebagai krioprotektan yang dapat mencegah terbentuknya kristal es dan
menstabilkan membran plasma spermatozoa selama proses pembekuan.
Krioprotektan yang digunakan harus mudah larut dalam air dan harus mempunyai
bobot molekul yang kecil agar lebih cepat penetrasi ke dalam sel dan mengurangi
toksisitas akibat osmolaritas yang tinggi. Jenis dan konsentrasi krioprotektan
yang tepat dalam bahan pengencer sangat penting untuk melindungi spermatozoa
selama pembekuan (Suidzinska dan Lukaszewicz 2008).
Krioprotektan berperan dalam mengurangi pengaruh mematikan selama
pembekuan, baik berupa pengaruh larutan maupun adanya pembentukan kristal es
sehingga viabilitas sel dapat dipertahankan. Krioprotektan dikelompokkan
menjadi krioprotektan yang bekerja di dalam dan di luar sel (Chen et al. 2005;
Luz et al. 2009). Sementara itu, berdasarkan bahan krioprotektan dikelompokkan
menjadi dua golongan, yaitu kelompok alkohol seperti etilen glikol, dan gliserol
serta kelompok amida seperti dimetilformamid, asetamid, dan metilformamid
(Alvarenga et al. 2005).
Dimethyl sulfoxide (DMSO) adalah campuran organosulfur dengan rumus
kimia (CH3)2SO dan mempunyai berat molekul sebesar 78.13 g/mol dengan titik
beku yang tinggi. Gerzilov (2010) melaporkan DMSO bisa digunakan pada
pembekuan semen unggas. Konsentrasi DMSO dalam pengencer semen bervariasi,
pada semen itik terbaik adalah 10% (Han et al. 2005) sedangkan pada ayam
2
white leghorn, ovambo, dan potchefstrom koekoek terbaik adalah 5% (Makhafola
et al. 2009).
Dimethyl acetamide (DMA) merupakan senyawa dengan berat molekul
87.12 g/mol dan berat jenis 0.94 g/cm3 merupakan larutan yang mudah larut
dalam air, alkohol, ether, aseton, benzena dan larutan lain. Krioprotektan DMA
mempunyai kemampuan penetrasi yang baik pada sel-sel dengan kandungan lipid
membran yang banyak. Dosis optimum DMA dalam pengencer semen itik sebesar
10% (Han et al. 2005), dan ayam arab sebesar 7% (Iskandar et al. 2006).
Gliserol (C3H8O3) merupakan senyawa golongan alkohol polihidrat dengan
tiga buah gugus hidroksil dalam satu molekul, bersifat polar, berat molekul 92.09
g/mol, dan berat jenis 1.26 g/cm3. Gliserol merupakan krioprotektan intraseluler
yang paling banyak digunakan untuk pembekuan semen. Gliserol dapat masuk ke
dalam sel spermatozoa untuk mengikat sebagian air bebas, sehingga kristal-kristal
es yang terbentuk di dalam medium pengencer pada waktu pembekuan dapat
dicegah. Konsentrasi gliserol yang digunakan berbeda bergantung jenis semen
serta pengencer yang digunakan (Azizah dan Arifiantini 2009).
Selain jenis krioprotektan yang digunakan, konsentrasi krioprotektan pun
akan memengaruhi kualitas semen beku. Adanya keragaman kualitas spermatozoa
unggas serta efektivitas optimum dari krioprotektan pada proses kriopreservasi
yang berbeda dari hasil setiap peneliti. Penelitian terdahulu didapatkan kinerja
optimum dari DMA, DMSO, maupun gliserol yaitu 5-10%. Penelitian ini
dilaksanakan untuk menentukan efektifitas setiap jenis dan konsentrasi
krioprotektan (5%, 7% dan 9%) dalam pengencer ringer laktat kuning telur pada
pembekuan semen ayam dan untuk menguji kualitas spermatozoa berbagai
rumpun genetik ayam pejantan, menguji daya tahan terhadap pembekuan (freezing
capability) dari berbagai rumpun genetik ayam lokal.
Rumusan Masalah
Uraian di atas dapat diambil rumusan masalah;
1. Apakah kualitas semen segar dari berbagai rumpun ayam lokal berbeda?
2. Bagaimanakah daya tahan spermatozoa terhadap pembekuan (freezing
capability) dari berbagai rumpun genetik ayam pejantan?
3. Jenis dan konsentrasi krioprotektan manakah yang memberikan kinerja
optimum terhadap kemampuan daya tahan spermatozoa selama proses
pembekuan (freezing capability) dari berbagai rumpun genetik ayam
pejantan?
Tujuan Penelitian
1.
2.
3.
Membandingkan kualitas spermatozoa berbagai genetik rumpun ayam
pejantan local.
Menentukan konsentrasi krioprotektan yang terbaik pada proses
pembekuan semen setiap galur ayam lokal.
Menentukan jenis krioprotektan yang paling optimum pada proses
pembekuan semen setiap galur ayam lokal.
3
Manfaat Penelitian
1. Mendapatkan satu paket teknologi untuk meningkatkan populasi ayam.
2. Menghasilkan peluang usaha baru di bidang pembenihan unggas
khususnya ayam.
3. Merintis pembentukan bank genetik khusus dalam bentuk semen ayam
dalam rangka pelestarian satwa aves lokal Indonesia.
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di kandang Pemuliaan Ternak Unggas, Fakultas
Peternakan IPB dan di Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Bagian
Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran Hewan IPB pada bulan MeiOktober 2014.
Materi Penelitian
Sumber Semen
Ayam jantan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari empat genetik
ayam jantan yang berbeda, masing-masing 3 ekor ayam jantan pelung, 3 ekor
ayam jantan kampung, 3 ekor ayam jantan sentul, dan 3 ekor ayam jantan
persilangan kampung broiler. Ayam jantan yang digunakan telah dewasa kelamin
dan berumur 1 tahun. Ayam jantan dikandangkan secara individual. Ayam jantan
yang digunakan diadaptasikan terhadap kolektor semen maupun pada lingkungan
kandang. Adaptasi memerlukan waktu dua bulan. Setelah terbiasa dengan
lingkungan kandang dan kolektor, baru ayam tersebut bisa dipakai dalam
penelitian untuk ditampung semennya.
Pakan yang diberikan berupa pakan jadi (pakan komersial) berbentuk pellet
dari perusahaan PT. Gold Coin Indonesia. Pakan diberikan dengan takaran 150
gram/hari dan pemberian air minum secara adlibitum. Kandungan zat gizi pakan
dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Kandungan zat gizi pakan dari perusahaan PT. Gold Coin Indonesia.
Komposisi
Protein kasar (%)
Abu (%)
Serat kasar (%)
Lemak kasar(%)
Kalsium (%)
Fosfor (%)
Kandungan Gizi
17.00
14.00
6.00
3.00
4.20
0.60
Bahan dan Peralatan
Bahan-bahan yang dipakai untuk penelitian diantaranya NaCl fisiologis,
kuning telur ayam, ringer laktat, antibiotik (penisilin dan streptomisin), pewarna
eosin negrosin, alkohol, kertas tissue, dan nitrogen cair. Krioprotektan gliserol,
dimethyl sulfoxide (DMSO), dan dimethyl acetamide (DMA).
4
Peralatan yang dipakai untuk penampungan dan evaluasi adalah spoit 1 mL,
microtube 2 mL, mikroskop, obyek gelas, gelas penutup, rak tabung semen,
counting chamber, pipet plastik, gunting atau straw cutter, dan lemari es.
Sedangkan peralatan yang dilibatkan untuk kriopresevasi semen temasuk
pembekuan dan pencairan semen beku yaitu meliputi tabung koleksi semen 2 mL,
tabung reaksi 5 mL, mikropipet, tip mikropipet, kotak styrofoam, seperangkat
penyimpanan semen beku (storage container) atau kontainer nitrogen cair (196oC), pipet, jerami plastik (straw) berukuran 0.25 mL, spoit 1 mL dilengkapi
dengan konektor straw, rak tabung, semen dalam kotak plastik, bunsen,
thermometer, dan lemari es.
Metode Penelitian
Penelitian dibagi menjadi beberapa tahap dan dijelaskan secara detail dalam
skema alur penelitian yang disajikan pada Gambar 1.
Penampungan Semen Empat Rumpun Ayam
Uji KualitasSemen Segar
Tahap I
Pembuatan Pengencer Semen
Tahap II
Tahap III
Tahap IV
DMSO
5%, 7%, 9%
Gliserol
5%, 7%, 9%
DMA
5%, 7%, 9%
Ayam Kampung
Ayam Sentul
Ayam KB
Didapatkan
Jenis dan Level KrioprotektanTerbaik
Uji Freezing Capability
Ayam Kampung
Ayam Sentul
Ayam KB
Gambar 1 Skema alur penelitian
Tahap V
Ayam Pelung
5
Tahap 1: Uji Banding Kualitas Semen Segar Empat Rumpun Ayam Lokal
Koleksi Semen Segar
Koleksi semen dari tiap perlakuan dilakukan tiga kali seminggu. Adapun
teknik penampungan semen yang digunakan adalah dengan pengurutan (masase)
pada bagian punggung ayam. Penampungan semen dilakukan oleh dua orang.
Seorang memegang ayam pada kedua pahanya dengan tangan kiri sambil
mengurut bagian punggung ayam untuk merangsang keluarnya semen, dan
seorang lagi menyiapkan tabung penampung semen berskala dan tissue pembersih
kotoran ayam. Pengurutan dilakukan beberapa kali sampai terjadinya rangsangan
pada ayam yang ditandai dengan peregangan tubuh ayam dan keluarnya papillae
dari proktodaeum kloaka. Ketika ereksi mencapai maksimal, tangan kanan dan
kiri orang yang melakukan pengurutan bekerjasama memerah semen. Pada saat
yang sama, orang kedua bersiap-siap menampung semen dengan tabung
penampung berskala.
Evaluasi Semen Segar
Setelah koleksi semen dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis.
Evaluasi secara makroskopis dilakukan terhadap volume, warna, konsistensi, dan
derajat keasamaan (pH). Volume semen diukur dengan menggunakan pipet ukur,
pH semen diukur menggunakan pH special indicator paper, konsistensi semen
dibedakan antara kental dan sedang, dan warna dibedakan menjadi krem dan putih
susu dilihat secara visual. Evaluasi secara mikroskopis meliputi gerakan massa,
motilitas spermatozoa, konsentrasi spermatozoa per ml, spermatozoa hidup, dan
morfologi spermatozoa.
Gerakan massa spermatozoa dinilai dengan cara meneteskan semen segar
pada objek glass lalu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 X 10
(100X). Penilaian dilakukan berdasarkan tebal tipisnya gelombang massa serta
kecepatan gelombang massa berpindah tempat, dengan kriteria penilaian sangat
baik (+++/3), baik (++/2), lumayan (+/1), dan buruk (tidak ada gelombang).
Motilitas spermatozoa adalah persentase spermatozoa yang maju ke depan
(progresif), dinilai dengan cara meneteskan 1 tetes semen ditambah 8-10 tetes
NaCl fisiologis, dihomogenkan dan dipindahkan 1 tetes di atas obyek gelas yang
lain dan ditutup dengan gelas penutup. Motilitas spermatozoa dinilai secara
estimasi dari lima lapangan pandang dengan cara membandingkan jumlah
spermatozoa yang bergerak maju ke depan dengan gerakan spermatozoa yang lain
dinyatakan dalam persentase (Arifiantini 2012).
Konsentrasi spermatozoa adalah jumlah spermatozoa per ml dihitung
dengan menggunakan kamar hitung neubauer, dengan pengenceran 500 kali (998
µl formolsalin dengan 2 µL semen). Jumlah spermatozoa dari lima kotak hitung
dikalikan 25 X 106 (faktor pengenceran, faktor koreksi menghitung 5 kotak
hitung dan konversi dari mm3 ke mL). Persentase spermatozoa hidup dievaluasi
dengan menggunakan zat warna eosin negrosin. Satu tetes semen ditambah 8-10
tetes eosin negrosin, dihomogenkan dan dibuat preparat ulas dan dikeringkan pada
suhu 37 oC. Penghitungan dilakukan di bawah mikroskop pembesaran 40 x 10
(400 X) pada 10 lapangan pandang. Spermatozoa yang hidup tidak menyerap
warna dan yang mati berwarna merah ungu pada bagian kepala. Jumlah
6
spermatozoa hidup adalah jumlah spermatozoa yang hidup dibagi jumlah
spermatozoa terhitung dikali 100%.
Morfologi spermatozoa dilakukan menggunakan pewarnaan yang sama
dengan spermatozoa hidup. Morfologi dibedakan berdasarkan morfologi yang
normal dan morfologi yang abnormal. Abnormalitas spermatozoa dihitung
minimal 200 sel berdasarkan perhitungan 10 lapang pandang (Arifiantini et al.
2005). Persentase spermatozoa yang abnormal dibedakan berdasarkan
abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder (Alkan et al. 2002).
Pengukuran Tekanan Osmotik Semen Segar dan Bahan Pengencer
Dilakukan pengukuran tekanan osmotik semen segar semua jenis ayam
dan tekanan osmotik bahan pengencer yang digunakan.
Tahap II: Penentuan Konsentrasi Krioprotektan DMSO pada Pengencer
Ringer Laktat dan Kuning Telur
Koleksi Semen dan Evaluasi Semen
Koleksi semen dari tiap perlakuan dilakukan tiga kali seminggu. Adapun
teknik penampungan semen yang digunakan adalah dengan pengurutan (masase).
Semen yang diperoleh dievaluasi seperti yang dilakukan pada tahap I.
Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer yang digunakan larutan ringer laktat dengan tiga
konsentrasi DMSO (Tabel 2).
Tabel 2 Komposisi bahan pengencer semen beku menggunakan kadar DMSO
yang berbeda
Komposisi
Ringer laktat (mL)
Kuning telur (mL)
DMSO (mL)
Penisilin (IU mL-1)
Streptomisin (mg mL-1)
Total (mL)
Tekanan osmotik (mOsmol kg -1)a
pHb
5%
8.5
1
0.5
1 000
1
10
738
7
DMSO
7%
8.3
1
0.7
1 000
1
10
1 010
7
9%
8.1
1
0.9
1 000
1
10
1 042
7
a
Tekanan osmotik pengencer diukur menggunakan osmometer. bpH pengencer di-ajust (dipaskan)
dengan Tris hydroxymethyl aminomethan.
Pengenceran dan Pengemasan Semen
Semen yang menunjukkan motilitas spermatozoa lebih dari 75% dengan
konsentrasi spermatozoa lebih dari 2500 x 106 per mL, dibagi ke dalam tiga
tabung, masing-masing diencerkan dengan pengencer ringer laktat kuning telur
(RLKT) dengan DMSO 5% (RLKT5), RLKT DMSO 7% (RLKT7) dan RLKT
DMSO 9% (RLKT9) dengan dosis 50x106 per 0.25 mL. Semen yang diencerkan
dikemas ke dalam mini straw (Minitub, Germany) 0.25 mL dan disusun dalam
rak pembekuan.
7
Ekuilibrasi dan Pembekuan Semen
Straw selanjutnya diekuilibrasi pada suhu 5 oC selama 2 jam (Bearden et
al. 2004), dibekukan pada uap nitrogen cair selama 10 menit (Han et al. 2005),
kemudian disimpan pada kontainer nitrogen cair (-196 oC) untuk pengujian
berikutnya.
Penyimpanan
Semen beku disimpan dalam nitrogen cair selama 24 jam untuk pengujian
lebih lanjut.
Pengujian Kualitas Semen Beku
Pengujian kualitas semen beku dilakukan 24 jam setelah penyimpanan,
dengan cara melakukan thawing semen beku dalam air hangat (37 oC) selama 30
detik. Pengujian dilakukan terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa seperti
yang dilakukan pada semen segar. Keberhasilan pembekuan juga dinilai dengan
Recovery rate yaitu persentase spermatozoa yang berhasil pulih dari proses
pembekuan yang dihitung dengan membandingkan persentase spermatozoa motil
pada semen segar dan setelah thawing
.
Tahap III: Penentuan Konsentrasi Krioprotektan Gliserol pada Pengencer
Ringer Laktat dan Kuning Telur
Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer yang digunakan pada tahap III sama dengan tahap yang
ke II, perbedaannya adalah pada jenis dan konsentrasi krioprotektan yang
digunakan, dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi bahan pengencer semen beku menggunakan kadar gliserol
yang berbeda
Komposisi
Ringer laktat (mL)
Kuning telur (mL)
Gliserol (mL)
Penisilin (IU mL-1)
Streptomisin (mg mL-1)
Total (mL)
Tekanan osmotik (mOsmol kg -1)a
pHb
5%
8.5
1
0.5
1 000
1
10
1 230
7
Gliserol
7%
8.3
1
0.7
1 000
1
10
1 800
7
9%
8.1
1
0.9
1 000
1
10
2 298
7
a
Tekanan osmotik pengencer diukur menggunakan osmometer. bpH pengencer di-ajust (dipaskan)
dengan Tris hydroxymethyl aminomethan.
Prosedur selanjutnya adalah koleksi, evaluasi, dan pengolahan semen sama
seperti yang dilakukan pada tahap II.
8
Tahap IV: Penentuan Konsentrasi Krioprotektan DMA pada Pengencer
Ringer Laktat dan Kuning Telur
Penyiapan Bahan Pengencer
Bahan pengencer yang digunakan pada tahap III sama dengan tahap yang
ke II, perbedaannya adalah pada jenis dan konsentrasi krioprotektan yang
digunakan, dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Komposisi bahan pengencer semen beku menggunakan kriprotektan
DMA dengan kadar yang berbeda.
Komposisi
Ringer laktat (mL)
Kuning telur (mL)
DMA (mL)
Penisilin (IU mL-1)
Streptomisin (mg mL-1)
Total (mL)
Tekanan osmotik mOsmol kg -1)a
pHb
5%
8.5
1
0.5
1 000
1
10
889
7
DMA
7%
8.3
1
0.7
1 000
1
10
1 104
7
9%
8.1
1
0.9
1 000
1
10
1 294
7
a
Tekanan osmotik pengencer diukur menggunakan osmometer. bpH pengencer di-ajust (dipaskan)
dengan Tris hydroxymethyl aminometha
Prosedur selanjutnya adalah koleksi, evaluasi, dan pengolahan semen sama
seperti yang dilakukan pada tahap II dan III.
Tahap V: Uji Banding Freezing Capability Empat Genetik Rumpun Ayam
Uji banding freezing capability antar empat genetik rumpun ayam yaitu
ayam pelung, ayam kampung, ayam sentul dan ayam persilangan kampung broiler
menggunakan jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing
perlakuan (Tabel 5). Parameter yang diukur dalam pemeriksaan semen adalah
persentase motilitas dan viabilitas.
Tabel 5 Jenis dan konsentrasi krioprotektan terbaik dari masing-masing perlakuan
pada tahap II, III, dan IV
Jenis ayam
Pelung
Kampung
Sentul
Kampung broiler
Pengencera
RL Gliserol (%) RL DMSO (%) RL DMA (%)
5
7
9
5
7
9
5
7
9
5
7
9
a
RL DMSO (konsentrasi terbaik Tahap II), RL Gliserol (Konsentrasi terbaik Tahap III), dan RL
DMA ( terbaik Tahap IV)
Proses koleksi, evaluasi, pengolahan semen beku dan pengujian kualitas
dilakukan sesuai dengan tahap II, III dan IV.
9
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Pelaksanaan proses penelitian pada tahap I menggunakan rancangan acak
lengkap (RAL) dengan empat perlakuan (ayam kampung, sentul, silangan KB,
dan pelung). Sedangkan mulai dari tahap II - IV dianalisa dengan menggunakan
RAL tiga perlakuan dengan model matematika sebagai berikut:
Yij = µ + αi+ εij
Keterangan:
Yij
: Respon yang diperoleh dari pengaruh perlakuan (DMSO/Gliserol/DMA)
ke-i (5%, 7% dan 9%) dan ulangan ke-j (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9)
µ
: Nilai rataan umum
αi
: Pengaruh perlakuan ke-i
εij
: Pengaruh galat perlakuan ke-i (5%, 7% dan 9%) ) dan ulangan
ke-j (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9)
Pada tahap V dilakukan dengan pola faktorial. Adapun model matematika
yang digunakan adalah sebagai berikut:
Yijk = µ + Ai + Bj + ABij + εijk
Keterangan :
Yijk : Pengamatan Faktor A (rumpun ayam) taraf ke-i (ayam kampung, ayam
sentul, ayam silangan KB, dan ayam pelung) , Faktor B (krioprotektan)
taraf ke-j (Gliserol 5%, DMSO 7%, dan DMA 9%) dan Ulangan ke-k (1,
2, 3)
µ
: Rataan umum
Ai
: Pengaruh Faktor A pada taraf ke-i
Bj
: Pengaruh Faktor B pada taraf ke-j
ABij : Interaksi antara Faktor A dengan Faktor B
εijk
: Pengaruh galat pada Faktor A taraf ke-i, Faktor B taraf ke-j dan ulangan
ke-k
Pengujian selanjutnya dilakukan terhadap nilai rata-rata perlakuan pada
tingkat P (