Karakterisasi gen endo b 1,4 glukanase pada rayap Coptotermes curvignathus

KARAKTERISASI GEN ENDO- -1,4-GLUKANASE PADA
RAYAP Coptotermes curvignathus

RUT NORMASARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Karakterisasi Gen Endo- -1,4glukanase pada Rayap Coptotermes curvignathus adalah karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
Perguruan Tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2011
Rut Normasari
NIM G352080091

ABSTRACT
RUT NORMASARI. Characterization of endo- -1,4-glucanase gene in termites
Coptotermes curvignathus. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and IMAN
RUSMANA.
Termites are social insects that have a distinct task in form of caste within
their colony. Workers play an important role in finding and degrading the
cellulose food, due to the existence of endo- -1,4-glucanase enzyme. Hence, this
study was aimed to characterize Coptotermes curvignathus endoglucanase gene.
Primers were designed based on the Coptotermes formosanus (CfEG) cDNA and
Nasutitermes takasagoensis (NtEG) genomic DNA. These introns of C.
curvignathus all showed GT/AG rule. Exon two up to five of C. curvignathus
endoglucanase were aligned with exon three up to six from NtEG; while the intron
two to four of C. curvignathus endoglucanase were at the same position with that
of intron three up to five on NtEG. Exon two up to five of C. curvignathus
endoglucanase resulted 564 bp and BLASTN analysis revealed that C.
curvignathus endoglucanase homologous to CfEG. Putative amino acid obtained
from C. curvignathus endoglucanase showed its high homology with CfEG.
Analysis based on Pfam revealed that C. curvignathus endoglucanase was
member of Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF 9) family and six-hairpin

glycosidase superfamily. Motifs found in endoglucanase C. curvignathus were
one consensus signature of GHF 9, nucleophile, co-nucleophile, salt bridge, and
N-terminal. Based on DNA and amino acid homology between CfEG and
endoglukanase C. curvignathus it was expected that endoglukanase C.
curvignathus has similar high cellulase activity as shown in CfEG. This will be an
essential database for finding an effective cellulase enzyme for further
applications.
Keywords: C. curvignathus, endoglucanase, GHF 9

RINGKASAN
RUT NORMASARI. Karakterisasi Gen Endo- -1,4-glukanase pada Rayap
Coptotermes curvignathus. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan IMAN
RUSMANA.
Rayap mampu bertahan hidup dengan memanfaatkan lignoselulosa yang
mengandung sedikit nutrisi. Kemampuan mendegradasi selulosa dimiliki oleh
rayap pekerja. Rayap merupakan serangga sosial yang memiliki pembagian tugas
yang dinyatakan dalam kasta. Kasta rayap terbagi menjadi ratu, pekerja, dan
prajurit. Tugas utama dari pekerja adalah mengumpulkan dan mendegradasi
makanan yang berupa selulosa.
Rayap mampu mendegradasi selulosa karena adanya enzim selulase yang

dihasilkan rayap dan organisme simbion. Enzim selulase yang dihasilkan simbion
berasal dari protozoa (rayap tingkat rendah) dan bakteri (rayap tingkat tinggi).
Enzim selulase rayap berbeda dengan enzim selulase protozoa simbion rayap.
Endoglukanase rayap termasuk ke dalam Glycosyl Hydrolase Family 9 (GHF 9)
dan endoglukanase simbion rayap termasuk ke dalam GHF 7.
Coptotermes curvignathus merupakan salah satu rayap subteran yang
makanan utamanya berupa kayu dan bahan lain yang mengandung selulosa. C.
curvignathus tersebar di Asia Tenggara dan banyak menyerang tanaman di
Indonesia. Hal ini mengindikasikan C. curvignathus memiliki kemampuan yang
tinggi dalam mendegradasi selulosa. Data endoglukanase rayap belum ada pada
daerah tropis, hanya terbatas pada rayap daerah subtropis.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi ekson dan intron gen endoß-1,4-glukanase C. curvignathus. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi
informasi dasar bagi penelitian secara in vitro enzim selulase C. curvignathus di
Indonesia.
Sampel C. curvignathus dikumpulkan dari sarang rayap yang berada di
pohon pinus (Pinus mercusii) pada halaman parkir Perpustakaan IPB, Kampus
IPB Darmaga, Bogor. Berdasarkan data gen endoglukanase C. formosanus
(CfEG) dan N. takasagoensis (NtEG) yang sudah terkarakterisasi, pada penelitian
ini dilakukan karakterisasi gen endoglukanase pada C. curvignathus. Primer
disusun berdasarkan data sekuen CfEG. Karakterisasi gen endoglukanase C.

curvignathus dilakukan melalui tahapan ekstraksi DNA, amplifikasi DNA,
elektroforesis, pewarnaan DNA, serta proses sekuen. Elektroforesis DNA
menggunakan PAGE 6% dan pewarnaan DNA dengan perak nitrat. Proses sekuen
dilakukan menggunakan jasa sekuensing. Hasil sekuen diedit menggunakan
program Genetyx Win versi 4.0. Analisis DNA dan asam amino terdiri dari
alignment DNA dan asam amino menggunakan program Clustal X, analisis
homologi menggunakan BLASTN dan BLASTP melalui situs NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov), serta analisis filogeni dan jarak genetik menggunakan
program MEGA 4. Analisis motif protein putative meliputi consensus signature,
nucleophile, co-nucleophile, salt bridge, dan N-terminal. Data endoglukanase
rayap, echinodermata, cacing tanah, moluska, protozoa simbion rayap, fungi, dan
bakteri digunakan dalam analisis filogeni.
Ukuran pita DNA gen endoglukanase C. curvignathus hasil amplifikasi
menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3 sekitar 900 pasang basa (pb),

pasangan primer CfF3 dan CfR4 sekitar 1100 pb, dan pasangan primer CfF4 dan
CfR5 sekitar 500 pb. Ukuran pita DNA ini diperkirakan berdasarkan sekuen
CfEG. Hasil sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfF2 dan CfR3, CfF3 dan CfR4, CfF4 dan CfR5
masing-masing sebesar 856, 1077, dan 484 pb.

Berdasarkan hasil alignment didapatkan panjang ekson 2, intron 2, ekson 3,
intron 3, ekson 4, intron 4, dan ekson 5 masing-masing sebesar 160, 118, 96, 842,
183, 187, dan 125 pb. Alignment dengan NtEG menunjukkan posisi ekson dua
sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus berada pada ekson tiga sampai
enam NtEG dan ekson dua sampai lima CfEG. Sedangkan intron dua sampai
empat gen endoglukanase C. curvignathus berada pada intron tiga sampai lima
pada NtEG. Panjang ekson tiga dan empat gen endoglukanase C. curvignathus
sama dengan ekson empat dan lima NtEG serta ekson tiga dan empat CfEG.
Sedangkan panjang ekson dua dan lima gen endoglukanase C. curvignathus
berbeda dengan panjang ekson tiga dan enam NtEG dan ekson dua dan lima
CfEG. Perbedaan panjang juga terdapat pada masing-masing intron gen
endoglukanase C. curvignathus dengan intron NtEG.
Intron dua sampai empat gen endoglukanase C. curvignathus didominasi
oleh basa AT yaitu masing-masing sebesar 66.06, 58.81, dan 55.96%, serta
diawali dengan basa GT dan diakhiri dengan basa AG. Kesamaan intron dua
sampai empat gen endoglukanase C. curvignathus dengan intron tiga sampai lima
NtEG masing-masing sebesar 8.8, 24.8, dan 46.5%.
Hasil analisis BLASTN ekson dua sampai lima gen endoglukanase C.
curvignathus homolog dengan CfEG dengan nomor akses EU853671 (95%)
dengan E-value 0.0. Kandungan GC ekson dua sampai lima gen endoglukanase C.

curvignathus adalah 55.82%. Asam amino putative yang didapatkan sebesar 188
asam amino. Hasil analisis homologi asam amino putative gen endoglukanase C.
curvignathus menggunakan BLASTP homolog (94%) dengan CfEG (BAB40696)
dengan E-value sebesar 9e-92.
Gen endoglukanase C. curvignathus mengelompok dengan GHF 9 pada
kelompok rayap dan terpisah dengan GHF 9 pada kelompok moluska,
echinodermata, cacing tanah, dan bakteri. Gen endoglukanase C. curvignathus
juga terpisah dengan GHF 7 pada kelompok fungi dan protozoa. Hasil
perhitungan jarak genetik gen endoglukanase C. curvignathus lebih dekat dengan
gen endoglukanase C. formosanus EG3, C. formosanus, dan C. formosanus EG4
dengan nilai jarak genetik yang paling kecil yaitu 0.055. Hubungan gen
endoglukanase N. takasagoensis yang terjauh adalah dengan gen endoglukanase
C. acinaciformis dengan jarak genetik terbesar yaitu 0.174.
Analisis motif protein putative gen endoglukanase C. curvignathus
menunjukkan adanya satu consensus signature GHF 9, nucleophile, conucleophile, salt bridge, dan N-terminal. Pencarian dengan Pfam menunjukkan
endoglukanase C. curvignathus masuk ke dalam gen famili GHF 9 yang termasuk
ke dalam CL0059 yaitu six-hairpin glycosidase superfamily.
Besarnya gen endoglukanase C. curvignathus yang berhasil dikarakterisasi
pada penelitian ini adalah 564 pb. Sedangkan CfEG yang telah dikarakterisasi
besarnya sekitar 1347 pb. Hal ini menandakan bahwa masih sebagian besar gen

endoglukanase C. curvignathus yang belum diketahui sekuen basanya dan perlu
dilakukan karakterisasi. Selain itu, pada CfEG ditemukan adanya tiga consensus

signature GHF 9, sedangkan pada gen endoglukanase C. curvignathus baru
ditemukan satu consensus signature GHF 9 dan belum ditemukan posisi dari
pusat katalitik. CfEG diekspresikan selulase pada kelenjar saliva dan usus tengah.
Berdasarkan penelitian ini, untuk membuktikan ekspresi selulase pada C.
curvignathus perlu dilakukan analisis mRNA pada gen endoglukanase C.
curvignathus terutama pada rayap pekerja. Selain itu perlu dilakukan uji aktivitas
endoglukanase untuk aplikasi selanjutnya.
Kata kunci: C. curvignathus, endoglukanase, GHF 9

Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis

dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI GEN ENDO- -1,4-GLUKANASE PADA
RAYAP Coptotermes curvignathus

RUT NORMASARI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biosains Hewan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Idham Sakti Harahap, M.Si

Judul Tesis

Nama
NIM

: Karakterisasi Gen Endo- -1,4-glukanase pada Rayap
Coptotermes curvignathus
: Rut Normasari
: G352080091

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si.
Ketua

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si.
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi

Biosains Hewan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Bambang Suryobroto

Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.

Tanggal Ujian: 23 Desember 2010

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus atas segala berkat
dan kasihNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini
merupakan syarat untuk memperoleh gelar Magister di Institut Pertanian Bogor.
Judul yang dipilih dalam penelitian ini ialah Karakterisasi Gen Endo- -1,4glukanase pada Rayap Coptotermes curvignathus.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si dan Dr.
Ir. Iman Rusmana, M.Si selaku pembimbing yang telah banyak memberikan ilmu,
bimbingan, masukan, dan dorongan kepada penulis. Terima kasih penulis ucapkan

kepada Dr. Ir. Idham Sakti Harahap, M.Si selaku penguji yang telah memberikan
saran dan masukan kepada penulis. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada
Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Achmad Farajallah, Bapak Tri Atmowidi,
Bapak Tri Heru Widarto, Ibu Taruni Sri Prawasti, Ibu RR Dyah Perwitasari, dan
Mbak Kanthi Arum W atas semua ilmu, pengalaman, bimbingan, nasihat, dan
dorongan yang telah diberikan. Bapak Adi, Ibu Tini, dan Ibu Ani atas bantuannya
selama di laboratorium. Teman-teman Biosains Hewan 2008, Ruth MW, Jazirotul,
Dzulfaqor, Mbak Tetri, teman-teman zoologi, dan teman-teman Villga atas
dukungan semangat, kebersamaan, bantuan, dan doanya.
Terima kasih juga kepada Sari, Wahyu, dan Dona atas dukungan dan
persahabatan yang telah terjalin selama ini. Tak lupa kepada kakak, adek, temanteman PA, serta Jemaat Bogor atas perhatian, dukungan, canda tawa, dan
kekompakannya. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ayah, Ibu,
dan Kakak-kakak tercinta atas dukungan, doa, cinta, dan kasih sayang yang sangat
besar yang telah diberikan kepada penulis, serta pihak-pihak yang membantu
dalam penyelesaian karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2011
Rut Normasari

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tuban pada tanggal 2 Oktober 1984 sebagai putri dari
Sukarman dan Wagiarti. Penulis merupakan putri keempat dari empat bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Tuban dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI). Penulis memilih Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Pada tahun 2008 penulis melanjutkan perkuliahan di Sekolah Pascasarjana
IPB, Mayor Biosains Hewan, Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan. Pada masa
perkuliahan penulis berkesempatan menjadi asisten untuk mata kuliah Fungsi
Hayati Hewan dan Mikroteknik pada tahun ajaran 2009/2010.

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................. xv
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
Tujuan Penelitian ................................................................................................ 2
Manfaat Penelitian .............................................................................................. 2
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 3
Klasifikasi dan Biologi Rayap ............................................................................ 3
Taksonomi dan Biologi C. curvignathus ............................................................ 5
Simbiosis Pada Saluran Pencernaan Rayap dan Metabolisme Selulosa ............. 7
Struktur Ekson-Intron dan Ekspresi Gen Endoglukanase Rayap ........................ 9
BAHAN DAN METODE ..................................................................................... 12
Waktu dan Tempat ............................................................................................ 12
Alat dan Bahan .................................................................................................. 12
Metode............................................................................................................... 12
Ekstraksi DNA .............................................................................................. 13
Amplifikasi DNA .......................................................................................... 14
Elektroforesis dan Pewarnaan DNA ............................................................. 15
Sekuen dan Alignment DNA dan Asam Amino ............................................ 15
Analisis Filogeni dan Jarak Genetik ............................................................. 16
Analisis Protein Putative ............................................................................... 16
HASIL ................................................................................................................... 18
Amplifikasi DNA Gen Endoglukanase C. curvignathus .................................. 18
Sekuen dan Alignment DNA dan Asam Amino Gen Endoglukanase C.
curvignathus ...................................................................................................... 18
Analisis Filogeni dan Jarak Genetik Gen Endoglukanase C. curvignathus ...... 24
Analisis Protein Putative Gen Endoglukanase C. curvignathus ....................... 26
PEMBAHASAN ................................................................................................... 27
Amplifikasi DNA Gen Endoglukanase C. curvignathus .................................. 27
Homologi DNA dan Asam Amino Putative Gen Endoglukanase C.
curvignathus dan C. formosanus ....................................................................... 28
Analisis Filogeni dan Jarak Genetik Gen Endoglukanase C. curvignathus ...... 29
Analisis Protein Putative dan Homologi Ekspresi Gen Endoglukanase C.
curvignathus dengan C. formosanus ................................................................. 30
Homologi Genomik dan Aktivitas Selulase Gen Endoglukanase C.
curvignathus, C. formosanus, dan N. takasagoensis ......................................... 34

SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 36
Simpulan ........................................................................................................... 36
Saran .................................................................................................................. 36
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 37
LAMPIRAN .......................................................................................................... 43

DAFTAR TABEL

Halaman
1 Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA target gen endoglukanase
C. curvignathus ................................................................................................ 14
2 Data endoglukanase pembanding dari GenBank .............................................. 16
3 Jarak genetik gen endoglukanase C. curvignathus dengan gen endoglukanase C.
acinaciformis, C. formosanus, N. takasagoensis , R. flavipes, dan R. speratus 25

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1

Filogeni rayap berdasarkan morfologi dan DNA mitokondria (16S rRNA dan
NADH 5 dehydrogenease) (Kambhampati & Eggleton 2000) ........................ 4

2

Filogeni genus Reticulitermes, Coptotermes, dan Nasutitermes berdasarkan
gen cytochrome oxidase II (COII) (Austin et al. 2004) ................................... 6

3

Rayap C. curvignathus (a) pekerja dan (b) prajurit.......................................... 7

4

Morfologi saluran pencernaan rayap (Scharf & Tartar 2008) .......................... 8

5

Filogeni rayap berdasarkan gen endoglukanase dan pergeseran tempat
ekspresi (Tokuda et al. 2004)......................................................................... 11

6

Skema posisi primer untuk amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus
berdasarkan CfEG (AB058670) ..................................................................... 15

7

Pita DNA hasil amplifikasi gen endoglukanase C. curvignathus pada gel
poliakrilamid dengan menggunakan (a) pasangan primer CfF2 dan CfR3; (b)
pasangan primer CfF3 dan CfR4 (no 3-4) dan pasangan primer CfF4 dan
CfR5 (no 5-6) ................................................................................................. 18

8

Hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan menggunakan
pasangan primer (a) CfF2 dan CfR3, (b) CfF3 dan CfR4, dan (c) CfF4 dan
CfR5 ............................................................................................................... 19

9

Sekuen DNA gen endoglukanase C. curvignathus ........................................ 20

10 Skema posisi ekson dan intron NtEG (AB019146), CfEG (AB058670), dan
gen endoglukanase C. curvignathus (hasil penelitian ini) ............................. 21
11 Hasil analisis BLASTN gen endoglukanase C. curvignathus dengan CfEG
(EU853671).................................................................................................... 22
12 Asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus. .......................... 23
13 Hasil analisis BLASTP asam amino putative gen endoglukanase C.
curvignathus dengan gen CfEG (BAB40696) ............................................... 24
14 Hasil rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan asam amino putative gen
endoglukanase C. curvignathus menggunakan metode Maximum Parsimony
(bootstrap 1000 kali). ..................................................................................... 25
15 Analisis protein putative gen endoglukanase C. curvignathus ...................... 26

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfF2 ............................................................ 44
2 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfR3 ............................................................ 46
3 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfF3 ............................................................ 48
4 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfR4 ............................................................ 51
5 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfF4 ............................................................ 53
6 Kromatogram hasil sekuen gen endoglukanase C. curvignathus dengan
menggunakan pasangan primer CfR5 ............................................................ 54
7 Hasil BLASTN exon dua sampai lima gen endoglukanase C. curvignathus.. 55
8 Hasil BLASTP asam amino putative gen endoglukanase C. curvignathus .... 56
9 Alignment NtEG, CfEG, dan endoglukanase C. curvignathus........................ 57
10 Alignment asam amino NtEG, CfEG, dan asam amino putative gen
endoglukanase C. curvignathus ..................................................................... 59

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Rayap merupakan hewan unik yang teradaptasi untuk bertahan hidup
dengan mendapatkan makanan yang berasal dari lignoselulosa yang mengandung
sedikit nutrisi (Ohkuma 2003). Kemampuan mendegradasi selulosa dimiliki oleh
rayap pekerja. Rayap merupakan serangga sosial yang memiliki pembagian tugas
yang dinyatakan dalam kasta. Kasta rayap terbagi menjadi ratu, pekerja, dan
prajurit. Tugas utama dari pekerja adalah mengumpulkan dan mendegradasi
makanan yang berupa selulosa (Krishna 1969).
Rayap mampu mendegradasi selulosa karena adanya enzim selulase yang
dihasilkan rayap (endogenous cellulose) dan organisme simbion (Nakashima et al.
2002a, 2002b; Tokuda et al. 2007). Enzim selulase yang dihasilkan simbion
berasal dari protozoa (rayap tingkat rendah) dan bakteri (rayap tingkat tinggi)
(Krishna 1969).
Data genomik DNA lengkap gen endo-ß-1,4-glukanase (Endoglukanase,
EG, EC 3.2.1.4) pada rayap berhasil dikarakterisasi pada N. takasagoensis
(Tokuda et al. 1999) dan data partial genomik pada R. speratus (Itakura et al.
2006). Data cDNA lengkap gen endoglukanase terdiri atas R. flavipes (Scharf et
al. 2005), R. speratus (Tokuda et al. 1999), C. formosanus (Nakashima et al.
2002b), C. acinaciformis, dan N. walkeri (Tokuda et al. 1999). Data partial cDNA
gen endoglukanase terdiri atas M. darwiniensis (Tokuda et al. 1999; Li et al.
2003), H. sjoestedti (Tokuda et al. 2004), H. japonica (Lo et al. 2000), N.
koshunensis (Lo et al. 2000; Tokuda et al. 2004), S. mushae, dan O. formosanus
(Tokuda et al. 2004).
Endoglukanase rayap termasuk ke dalam Glycosyl Hydrolase Family 9
(GHF 9) (Tokuda et al. 1997, 1999; Watanabe & Tokuda 2001) dan
endoglukanase simbion rayap termasuk ke dalam GHF 7 (Tokuda et al. 2007).
Terdapat perbedaan lokasi ekspresi pada rayap tingkat rendah dan rayap tingkat
tinggi. Endoglukanase pada rayap tingkat rendah diekspresikan di kelenjar saliva,
usus depan, dan usus tengah, sedangkan endoglukanase pada rayap tingkat tinggi

2

diekspresikan di usus tengah (Tokuda et al. 1997, 1999, 2004; Watanabe &
Tokuda 2001; Nakashima et al. 2002b). Endoglukanase simbion rayap
diekspresikan pada usus belakang rayap. Hal ini mengindikasikan ada dua sistem
enzim selulase yang terlibat dalam proses pencernaan rayap tingkat rendah
(Tokuda et al. 2007; Nakashima et al. 2002b; Zhou et al. 2007).
Rayap memanfaatkan tanaman yang mengandung selulosa, hemiselulosa,
dan lignin. Selulosa merupakan biomassa yang paling melimpah di bumi. Selulosa
dapat dihidrolisis menjadi glukosa dengan menggunakan selulase. Rayap
memiliki gen yang dapat menghasilkan selulase. Khamir memiliki kemampuan
untuk mengubah glukosa menjadi etanol dengan cara fermentasi. Hal ini
memungkinkan untuk menyisipkan gen dari rayap yang menghasilkan enzim
selulase ke khamir, sehingga khamir dapat menghasilkan selulase dan mengubah
glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis selulosa menjadi etanol (Matsui et al.
2009; Scharf & Boucias 2010).
Coptotermes curvignathus merupakan salah satu rayap subteran dan tersebar
di Asia Tenggara (Krishna 1969; Roonwal 1970). C. curvignathus termasuk ke
dalam Famili Rhinotermitidae yang makanan utamanya berupa kayu dan bahan
lain yang mengandung selulosa (Bignell & Eggleton 2000). C. curvignathus
merupakan hama yang banyak menyerang tanaman di Indonesia. Hal ini
mengindikasikan C. curvignathus yang memiliki kemampuan yang tinggi dalam
mendegradasi selulosa.
Data endoglukanase rayap belum ada pada daerah tropis. Data yang ada
terbatas pada rayap daerah subtropik yaitu C. formosanus dari Jepang dengan
nomor aksesi Genbank AB058670.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi ekson dan intron gen
endo-ß-1,4-glukanase C. curvignathus.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi dasar bagi
penelitian secara in vitro enzim selulase C. curvignathus di Indonesia.

TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi dan Biologi Rayap
Rayap di daerah subtropik disebut dengan ’semut putih’ (white ants) karena
memiliki morfologi yang mirip dengan semut. Berdasarkan hubungan evolusi
(filogeni), tidak ada hubungan antara rayap dengan semut. Hubungan lebih dekat
terjadi antara rayap dengan kecoa (Blattodea) (Lo et al. 2000; Inward et al. 2007).
Rayap merupakan salah satu kelompok serangga dengan jumlah keragaman
yang besar. Rayap (Ordo Isoptera) terdiri atas tujuh famili, yaitu Mastotermitidae,
Kalotermitidae, Termopsidae, Hodotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae,
dan Termitidae. Sampai sekarang sudah tercatat 14 subfamili, 281 genus dan lebih
dari 2600 spesies termasuk dalam kelompok ini (Kambhampati & Eggleton 2000).
Famili Termitidae merupakan famili terbesar dalam Ordo Isoptera dan
mencakup tiga perempat spesies yang diketahui dan merupakan kelompok rayap
yang paling maju. Spesies rayap yang termasuk famili Termitidae dikelompokkan
ke dalam rayap tingkat tinggi, sedangkan enam famili yang lain dikelompokkan
ke dalam rayap tingkat rendah (Gambar 1). Pembagian kelompok ini didasarkan
atas morfologi dan DNA mitokondria (16S rRNA dan NADH 5 dehydrogenease).
Karakter yang digunakan sebanyak 197 karakter morfologi dan biologi dari
pekerja

dan

prajurit

dengan

menekankan

pada

struktur

usus

pekerja

(Kambhampati & Eggleton 2000). Gen pada mitokondria seperti 16S rRNA,
NADH 5 dehydrogenease, dan cytochrome oxidase II (COII) dapat digunakan
sebagai kronometer evolusi karena bukan merupakan hasil rekombinasi, berubah
sesuai dengan waktu tetapi tidak terlalu cepat, ada pada semua organisme, dan
memiliki fungsi yang sama (Sogin et al. 1986; Hoy 1994; Gupta 1998; Philippe et
al. 2000; Freeland 2005)
Rayap merupakan serangga sosial yang memiliki pembagian tugas yang
jelas yang dinyatakan dalam pembagian kasta. Berdasarkan kemampuan
bereproduksi rayap dibagi menjadi dua kasta yaitu kasta reproduktif dan kasta
steril (Krishna 1969; Lee & Wood 1971).
Kasta reproduktif terdiri atas reproduktif primer dan reproduktif sekunder.
Kasta reproduktif primer (pendiri koloni) biasa disebut laron terdiri atas jantan
(raja) and betina (ratu). Ciri khas kasta reproduktif primer adalah adanya sepasang

4

sayap pada bagian toraks. Sedangkan kasta reproduktif sekunder berfungsi
menggantikan kasta reproduktif apabila raja atau ratu mati atau untuk menambah
jumlah telur apabila telur yang dihasilkan oleh ratu tidak mencukupi kebutuhan
koloni (Krishna 1969).

Hodotermitidae
Termopsidae
Kalotermitidae
Serritermitidae
Rhinotermitidae

Rayap tingkat rendah

Mastotermitidae

Macrotermitinae
Termitinae
Rayap tingkat tinggi

Termitinae

Termitidae

Apicotermitinae

Nasutitermitinae

Gambar 1

Filogeni rayap berdasarkan morfologi dan DNA mitokondria (16S
rRNA dan NADH 5 dehydrogenease) (Kambhampati & Eggleton
2000).

Kasta steril terdiri atas pekerja dan prajurit. Ciri dari kasta ini adalah tidak
adanya sayap dan perkembangan organ seksual ditekan atau tidak berkembang.
Pekerja bertanggungjawab untuk mencari makan dan memelihara telur, larva dan
ratu. Larva, prajurit dan ratu tidak mampu untuk memberi makan dirinya sendiri
sehingga bergantung pada makanan yang diberikan pekerja. Jumlah pekerja
mencapai 90% dari seluruh anggota koloni. Rayap prajurit bertugas menjaga
koloni dari serangan musuh dan juga menjaga pekerja yang mencari makan di
sekitar sarang. Prajurit dibedakan dengan pekerja berdasarkan modifikasi bagian
mulut dan kepala yang mengalami kitinasi yang kuat, biasanya terpigmentasi dan
seringkali lebih besar daripada ukuran kepala kasta yang lain (Krishna 1969).
Secara umum makanan rayap adalah semua bahan yang mengandung
selulosa. Bignell dan Eggleton (2000), membagi rayap menjadi beberapa
kelompok berdasarkan jenis makanannya. Pertama, rayap pemakan tanah (soil-

5

feeder) yang mendapatkan makanan dari mineral tanah. Material yang dicerna
sangat heterogen, mengandung banyak bahan organik tanah dan silika. Rayap
jenis ini ditemukan pada Apicotermitinae, Termitinae, Nasutitermitinae, dan
Indotermitinae. Kedua, rayap pemakan kayu (wood-feeder) yang mendapatkan
makanan dengan memakan kayu dan sampah berkayu, termasuk cabang mati yang
masih menempel di pohon. Hampir semua rayap tingkat rendah adalah pemakan
kayu, semua subfamili dari Termitinae kecuali Apicotermitinae. Ketiga, rayap
pemakan serasah (litter-feeder). Rayap jenis ini mendapatkan makanan dari daun
atau kayu-kayu kecil. Rayap ini terdapat pada Macrotermitinae, Apicotermitinae,
Termitinae, dan Nasutitermitinae.
Beberapa jenis rayap yang ada di Indonesia antara lain Neotermes
tectonae, Cryptotermes cyanocephalus, C. curvignathus, Schedorhinotermes
javanicus, Procapritermes setiger, Pericapritermes semarangi, Macrotermes
gilvus, Microtermes insperatus, Microtermes jacobseni, Nasutitermes javanicus,
dan Nasutitermes matangensis (Lee & Wood 1971; Harris 1971; Teguh 2009).
Taksonomi dan Biologi C. curvignathus
Coptotermes curvignathus merupakan salah satu rayap subteran. Secara
taksonomi C. curvignathus termasuk dalam Klas Insekta, Ordo Isoptera, Famili
Rhinotermitidae, Subfamili Coptotermitinae, Genus Coptotermes (Ahmad 1958;
Krishna 1969). Berdasarkan analisis gen cytochrome oxidase II (COII) genus
Coptotermes terletak diantara genus Reticulitermes dan Nasutitermes (Gambar 2)
(Austin et al. 2004).
Rayap C. curvignathus berwarna pucat (Gambar 3a). Prajurit memiliki
kepala berbentuk oval, melebar, dan datar dengan fontanel menonjol yang dapat
mengeluarkan cairan berwarna putih seperti susu apabila diserang. Eksudat ini
berguna untuk melumpuhkan musuhnya. Mandibula berwarna merah kecoklatan
dan melengkung di bagian ujungnya. Ukuran prajurit relatif besar (±4.5 mm);
lebar kepala 1.34-1.52 mm; antena 14-15 ruas, ruas kedua dua kali panjangnya
atau sedikit lebih panjang daripada ruas ketiga (Gambar 3b) (Ahmad 1958).
Perbedaan rayap prajurit C. curvignathus dengan beberapa rayap prajurit
spesies Coptotermes yang lain adalah pada Coptotermes gestroi lebar pronotum
0.65 mm, kepala kuning dengan rambut yang jarang, antenna 15 ruas, ruas ketiga

6

sedikit lebih pendek dari ruas keempat. Sedangkan pada Coptotermes formosanus
kepala menyempit sebanding dengan panjang, perbedaan antara panjang dan lebar
kepala 0.26-0.38, tebal kepala 0.86, antenna 13-15 ruas, ruas kedua sedikit lebih
panjang dari ruas ketiga. Ciri Coptotermes havilandi adalah pronotum menyempit
dan tepi anterior sedikit cembung, labrum lebih panjang dari lebarnya dan lancip,
kepala oval memanjang, dan antena 15-18 ruas, ruas kedua satu setengah kali
lebih panjang daripada ruas ketiga (Ahmad 1958).

Rhinotermitidae

Reticulitermes
Coptotermes
Termitidae

Nasutitermes

Gambar 2 Filogeni genus Reticulitermes, Coptotermes, dan Nasutitermes
berdasarkan gen cytochrome oxidase II (COII) (Austin et al. 2004).

7

1 mm

(a)

1 mm

(b)
Gambar 3 Rayap C. curvignathus (a) pekerja dan (b) prajurit.
Coptotermes curvignathus terdapat di Asia Tenggara seperti Malaysia,
Singapura, Indonesia (Jawa, Sumatra, Kalimantan), Thailand, Vietnam, Kamboja,
Filipina, dan Cina bagian selatan. Rayap ini termasuk hama yang serius
menyerang pohon karet hidup di Asia Tenggara dan menyerang kulit kayu dan
bagian lain termasuk bagian dalam kayu, bahkan sering membunuh tanaman.
Untuk mencapai makanannya rayap ini membuat saluran bawah tanah dan jika
diperlukan mampu membentuk saluran-saluran yang ditutupi tanah yang dibuat di
atas tanah (Roonwal 1970).
Simbiosis Pada Saluran Pencernaan Rayap dan Metabolisme Selulosa
Saluran pencernaan rayap terdiri atas usus depan, usus tengah, dan usus
belakang (Gambar 4). Saluran pencernaan ini menempati sebagian besar dari
abdomen. Usus depan terdiri atas esofagus dan tembolok yang dilengkapi dengan
kelenjar saliva. Esofagus dan tembolok memanjang pada bagian posterior atau
bagian tengah dari thorak. Kelenjar saliva mensekresikan endoglukanase dan
enzim lain ke dalam saluran pencernaan. Usus tengah merupakan bagian yang
berbentuk tubular yang mensekresikan suatu membrane peritrofik di sekeliling
material makanan. Usus tengah pada rayap tingkat juga diketahui mensekresikan
endoglukanase. Usus belakang merupakan tempat bagi sebagian besar simbion
(Noirot & Noirot-Timothée 1969; Scharf & Tartar 2008).

8

KS
UT
UB
E

T

Gambar 4 Morfologi saluran pencernaan rayap (Scharf & Tartar 2008).
KS=kelenjar saliva, E=esofagus, T=tembolok, UT=usus tengah,
UB=usus belakang.
Rayap

bersimbiosis

dengan

bakteri

dan

protozoa

pada

saluran

pencernaannnya. Pada rayap tingkat rendah lebih banyak bersimbiosis dengan
protozoa dibandingkan dengan bakteri, sebaliknya pada rayap tingkat tinggi lebih
banyak bersimbiosis dengan bakteri dibandingkan dengan protozoa (Krishna
1969; Bignell 2000; Breznak 2000).
Protozoa yang bersimbiosis dengan rayap tingkat rendah berbeda pada tiap
spesies.

Zootermopsis

angusticollis

bersimbiosis

dengan

Tricercomitis,

Hexamastix, dan Trichomitopsis. Mastotermes darwiniensis bersimbiosis dengan
Mixotricha paradoxa (Breznak 2000). Coptotermes formosanus bersimbiosis
dengan Pseudotrichonympha grassii, Spirotrichonympha leidy, Holomastigoides
mirabile (Inoue et al. 2005; Nakashima et al. 2002b), dan Holomastigoides
hartmanni (Tanaka et al. 2006). Coptotermes lacteus bersimbiosis dengan
Holomastigoides mirabile (Watanabe et al. 2002). Reticulitermes speratus
bersimbiosis dengan Teranympha mirabilis, Triconympha agilis (Ohtoko et al.
2000), Dinenympha exilis dan Pyrsonympha grandis (Todaka et al. 2007).
Rayap dapat bertahan hidup dengan memanfaatkan lignoselulosa yang
mengandung sedikit nutrisi (Ohkuma 2003). Rayap dapat mencerna lignoselulosa
dengan menggunakan enzim selulase yang dihasilkan oleh rayap itu sendiri dan
simbion (Watanabe et al. 1998; Ohkuma 2003; Scharf & Tartar 2008).
Lignoselulosa adalah suatu campuran dari tiga polimer yang dihasilkan
tanaman yaitu selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Selulosa adalah polimer glukosa
yang terikat oleh ikatan -1,4 dan terikat bersama dengan hemiselulosa (Scharf &
Tartar 2008).

9

Selulase merupakan enzim ekstraseluler yang terdiri atas kompleks endo-ß1,4-glukanase (endoglukanase), kompleks ekso-ß-1,4-glukanase (eksoglukanase)
yang terdiri dari cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) atau cellodextranase (EC
3.2.1.74), dan ß-glukosidase (EC 3.2.1.21). Endoglukanase aktif dalam
menghancurkan kristal atau selulosa murni. Eksoglukanase menghidrolisis
selulosa

non-kristal

atau

turunan

selulosa

terlarut.

ß-1,4-glukosidase

menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa (Wood & Garcia-Campayo 1990).
Endoglukanase rayap termasuk ke dalam GHF 9. Anggota GHF 9 rayap
terdiri dari endoglukanase dari rayap tingkat tinggi (Tokuda et al. 1999, 2004;
Watanabe & Tokuda 2001) dan rendah (Nakashima et al. 2002b). Anggota GHF 9
famili selulase yang secara taksonomi tersebar luas, termasuk pada tanaman,
bakteri, slime mold, dan rayap. Selulase simbion diklasifikasikan menjadi
beberapa famili GHF yaitu 3, 5, 7, 8, 10, 11, 26, 43, 45, 62. Selulase simbion dari
C. formosanus termasuk anggota GHF 5 (Inoue et al. 2005) dan GHF 7
(Nakashima et al. 2002a). Selulase simbion dari C. lacteus (Watanabe et al. 2002)
dan R. flavipes (Zhou et al. 2007) termasuk anggota GHF 7. Selulase simbion dari
R. speratus termasuk anggota GHF 3, 5, 7, 8, 10, 11, 26, 43, 45, dan 62 (Ohtoko
et al. 2000; Todaka et al. 2007). Selulase simbion dari M. darwiniensis termasuk
anggota GHF 45 (Li et al. 2003) dan selulase bakteri simbion Nasutitermes
termasuk anggota GHF 11 (Brennan et al. 2004).
Rayap tingkat rendah secara utama memakan kayu yang kaya selulosa
kristalin dan amorf, hemiselulosa dan lignin. Tingkat hidrolisis hemiselulosa dan
lignin yang tinggi dapat membatasi aktivitas selulolitik melalui penghambatan
produk akhir. Hal ini yang menyebabkan rayap mengekspresikan berbagai macam
gen selulase. Pada R. speratus dan R. flavipes dihasilkan selulase yang termasuk
GHF 7, 9, dan 45 (Ohtoko et al. 2000; Zhou et al. 2007).
Struktur Ekson-Intron dan Ekspresi Gen Endoglukanase Rayap
Struktur ekson-intron gen endoglukanase rayap belum banyak diketahui.
Sebagian besar data yang ada merupakan data sebagian (partial) cDNA dan
cDNA lengkap. Data genomik DNA lengkap pada N. takasagoensis (Tokuda et al.
1999) dan data partial genomik gen endoglukanase terdapat pada R. speratus
(Itakura et al. 2006). Genom DNA NtEG memiliki panjang 13005 pb terdiri atas

10

sepuluh ekson dengan sembilan intron. Semua intron NtEG diawali dengan GT
dan diakhiri dengan AG. Pada partial genomik RsEG diketahui ukuran dari tiga
intron. Dua intron pada RsEG memiliki posisi yang identik dengan NtEG yaitu
intron tujuh dan delapan (Tokuda et al. 1999). Itakura et al. (2006)
mengkarakterisasi intron sembilan RsEG sebesar 529 pb. Situs pemotongan intron
10 berbeda dengan situs pemotongan eukariot pada umumnya (GT/AG), yaitu
diawali dengan AG dan diakhiri dengan GC.
Data cDNA lengkap terdiri atas R. flavipes (Scharf et al. 2005), R. speratus
(Tokuda et al. 1999), C. formosanus (Nakashima et al. 2002b), C. acinaciformis,
N. walkeri (Tokuda et al. 1999). Data partial cDNA terdiri atas M. darwiniensis
(Tokuda et al. 1999; Li et al. 2003), H. sjoestedti (Tokuda et al. 2004), H.
japonica (Lo et al. 2000), Glyptotermes sp. (Tokuda et al. 1999), N. koshunensis
(Lo et al. 2000; Tokuda et al. 2004), R. speratus (Watanabe et al. 1998; Itakura et
al. 2006), S. mushae, dan O. formosanus (Tokuda et al. 2004).
Endoglukanase rayap diekspresikan pada saluran pencernaan rayap.
Terdapat perbedaan ekspresi endoglukanase pada rayap tingkat rendah dan rayap
tingkat tinggi. Ekspresi NtEG dan NwEG yang termasuk ke dalam rayap tingkat
tinggi terjadi di usus tengah (Tokuda et al. 1999). Sedangkan pada rayap tingkat
rendah terjadi perbedaan ekspresi dari tiap spesies. Ekspresi RsEG terjadi di
kelenjar saliva/usus depan (Tokuda et al. 1999), CfEG diekspresikan di kelenjar
saliva, usus depan, dan usus tengah, dan RfEG terdapat pada bagian kelenjar
saliva, usus depan, usus tengah, dan usus belakang (Zhou et al. 2007). RfEG
diekspresikan paling tinggi pada pekerja kemudian nimfa. Ekspresi EGase
menurun pada laron tetapi meningkat 50% pada kasta reproduktif sekunder
(Scharf et al. 2005).
Secara filogeni, taksa rayap yang berada pada bagian basal secara konsisten
mengekspresikan selulase secara spesifik pada kelenjar saliva (Mastotermitidae,
Termopsidae, Kalotermitidae, Rhinotermitidae). Sedangkan taksa yang lebih maju
mengekspresikan selulase terutama pada bagian usus tengah (Termitidae)
(Gambar 5). Hal ini menunjukkan adanya pergeseran tempat ekspresi selulase dari
kelenjar saliva ke usus tengah selama proses evolusi (Tokuda et al. 2004).

11

Aktivitas selulase rayap tingkat rendah dan rayap tingkat tinggi berbeda.
Pada rayap tingkat rendah M. darwiniensis (Mastotermitidae), H. sjoestedti
(Termopsidae), N. koshunensis (Kalotermitidae), R. speratus (Rhinotermitidae),
dan C. formosanus (Rhinotermitidae), aktivitas endoglukanase tertinggi
ditemukan di kelenjar saliva (45-86%). Secara keseluruhan pada rayap tingkat
rendah

aktivitas

endoglukanase

tertinggi

pada

Kalotermitidae

dan

Rhinotermitidae. Sedangkan Termitidae yang termasuk rayap tingkat tinggi yaitu
O. formosanus (Macrotermitinae), N. takasagoensis (Nasutitermitinae), dan S.
mushae (Termitinae) aktivitas endoglukanase tertinggi ditemukan di usus tengah

Termitidae

(96-99%) (Tokuda et al. 2004).
Termitinae
Nasutitermitinae
Macrotermitinae

Pergeseran ekspresi selulase dari kelenjar saliva ke usus tengah
Termitidae (kehilangan flagelata pada usus belakang)
Dibutuhkan habitat pada tempat jamur tumbuh

Rhinotermitidae

Kalotermitidae

Ekspresi nenek moyang
pada kelenjar saliva

Termopsidae
Rayap

Kecoa

Mastotermitidae

Gambar 5

Cryptocercidae
Blattidae

Filogeni rayap berdasarkan gen endoglukanase dan pergeseran
tempat ekspresi (Tokuda et al. 2004).

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian berlangsung dari Agustus 2009–Juli 2010. Koleksi sampel
dilakukan di lingkungan kampus IPB Darmaga Kabupaten Bogor. Identifikasi,
analisis molekular dan pengolahan data dilakukan di Bagian Fungsi dan Perilaku
Hewan dan Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat untuk ekstraksi DNA terdiri atas Cetyl Trimetyl Amonium
Bromide (CTAB 0.2% (b/v) (7.5 ml 1M Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH
8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75 ml)), proteinase K (5 mg/ml), PCI
(Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1), CIAA (Chloroform :
Isoamyl alcohol = 24 : 1), fenol, isopropanol, etanol 70% (v/v), Tris-HCl EDTA
((TE) (10 mM Tris-HCl-EDTA pH 8; 1 mM EDTA)), nitrogen cair, grinder,
pinset, scalpel, dan tabung 1.5 ml. Bahan untuk campuran PCR yaitu akuades
steril, primer forward, primer reverse, dan KAPA Taq ReadyMix DNA
Polymerase (bufer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4 mM, 0.05 U/µl KapaTaq
DNA polymerase). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah medium
polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 6% (12 ml akuades; 4 ml acrylamide
30%; 5xTBE 4 ml; TEMED (tetramethylethylene-diamine) 15 µl; 10% APS
(Amonium Peroxo Sulfat) 150 µl), bufer 1xTBE (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M,
EDTA 0.02M), penanda 100 pb DNA ladder (Promega), dan 6x loading dye
(Promega). Visualisasi DNA menggunakan CTAB (0.2 g/200 ml akuades),
NH4OH (2.4 ml/200 ml akuades), AgNO3 (0.32 g/200 ml akuades), Na2CO3 (4
g/200 ml akuades), NaOH (4 g/10 ml akuades), formalin, dan asam asetat (200
µl/200 ml akuades).
Metode
Koleksi Coptotermes curvignathus
Coptotermes curvignathus dikumpulkan dari sarang rayap yang berada di
pohon pinus (Pinus mercusii) pada halaman parkir Perpustakaan IPB, Kampus

13

IPB Darmaga, Bogor. Rayap yang didapatkan dimasukkan ke dalam tabung 1.5
ml yang berisi alkohol absolut, kemudian dilakukan penggantian alkohol absolut
sebanyak dua kali. Sampel yang didapatkan diidentifikasi berdasarkan Triplehorn
& Johnson (2005) sampai dengan tingkat famili dan Ahmad (1958) untuk tingkat
genus dan spesies.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB 0.2% dan presipitasi
alkohol (Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi. Sebelum ekstraksi, rayap
dimasukkan ke dalam TE (10 mM Tris-HCl EDTA pH 8; 1 mM EDTA) untuk
menghilangkan etanol dari jaringan. Penggantian TE dilakukan sebanyak tiga kali.
Jaringan sumber DNA yang digunakan adalah kepala dan toraks rayap pekerja.
Kepala dan toraks rayap dipisahkan dari bagian abdomen dengan
menggunakan scalpel. Tabung berisi satu kepala dan satu toraks rayap
dimasukkan ke dalam nitrogen cair selama 15 menit, kemudian toraks digerus
sampai hancur. Bufer CTAB 0.2% ditambahkan sebanyak 200 µl ke dalam tabung
yang berisi hancuran kepala dan toraks. Proteinase K (5 mg/ml) ditambahkan
sebanyak 14 µl untuk mendegradasi protein, kemudian diinkubasi pada suhu 55
0

C selama 2 jam. Setelah diinkubasi, tabung beserta isinya disentrifugasi 13000

rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung yang baru, kemudian
ditambahkan larutan PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1),
sebanyak 250 µl, digoyang dengan tangan perlahan selama 5 menit lalu
disentrifugasi 13000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang berisi DNA
dipindahkan ke tabung yang baru, kemudian ditambahkan larutan CIAA
(Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1) sebanyak 200 µl, digoyang dengan tangan
perlahan selama 5 menit dan disentrifugasi 13000 rpm selama 3 menit. Tahapan
ini dilakukan dua kali ulangan.
Lapisan atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung yang baru. Presipitasi
DNA dilakukan dengan menambahkan isopropanol 300 µl dan disimpan selama
semalam pada suhu 4 0C. Pengendapan DNA dilakukan dengan sentrifugasi
13000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 0C. Porsi isopropanol dibuang, kemudian
ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µl dan disentrifugasi 13000 rpm selama 10
menit pada suhu 4 0C. Etanol 70% dibuang, kemudian pelet DNA dikeringkan

14

dengan cara divakum selama 30 menit. Pelet DNA kemudian disuspensikan dalam
TE 0.5 mM sebanyak 15-20 µl dan disimpan pada suhu –4 0C.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan secara in vitro dengan teknik
PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan mesin thermocycler (ESCO
SWIFT

MAXI-BLC1).

Segmen

DNA

yang

diamplifikasi

adalah

gen

endoglukanase C. curvignathus. Amplifikasi DNA target diamplifikasi dengan
menggunakan beberapa pasang primer (Tabel 1, Gambar 6). Primer disusun
secara manual berdasarkan CfEG nomor aksesi Genbank AB058670 dan NtEG
nomor aksesi Genbank AB019146 dan verifikasi menggunakan program Primer3
(Rozen & Skaletsky 2000; Koressaar & Remm 2007). Primer disusun
menggunakan template dari CfEG yang merupakan endoglukanase yang berasal
dari kelenjar saliva dan perkiraan posisi intron berdasarkan NtEG.
Total pereaksi yang digunakan adalah sebanyak 20 µl, terdiri atas 7.4 µl
akuades steril, 10 µl KAPA Taq ReadyMix DNA Polymerase (bufer dengan 1.5
mM Mg2+, dNTP 0.4 mM, 0.05 U/µl KapaTaq DNA polymerase), 0.8 µl primer
forward 10 µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, dan1 µl DNA hasil ekstraksi.
Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu pra-denaturasi 94 0C selama
5 menit, dilanjutkan 30 siklus yang terdiri atas tahap denaturasi DNA 94 0C
selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 53 0C (pasangan primer CfF2 dan
CfR3), 58 0C (pasangan primer CfF3 dan CfR4, CfF4 dan CfR5) selama 1 menit
dan sintesis DNA ruas target pada suhu 72 0C selama 2 menit. Proses diakhiri
dengan sintesis DNA akhir pada suhu 72 0C selama 7 menit.
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA target gen
endoglukanase C. curvignathus
Ekson

Primer

Urutan basa (5’-3’)

Posisi berdasarkan cDNA C.
formosanus (AB058670)

2

CfF2
CfR2
CfF3
CfR3
CfF4
CfR4
CfF5
CfR5

gcttacgactacaagacag
tatccccctgtcaggtcctcg
cggcttccctatggcgtacac
gccttgcgaccatcatccagagc
gcgctctggatgatggtcgcaaggc
ctggtttggacgtgtcgatcttgta
gagacagccgccgccctcgctgc
gccgcgataattgttggcgaagtcg

49-67
180-200
228-248
307-329
305-329
463-487
505-527
600-624

3
4
5

15

CfF2

CfF3 CfF4

CfR2

Gambar 6

CfR3

CfF5

CfR4

CfR5

Skema posisi primer untuk amplifikasi gen endoglukanase C.
curvignathus
berdasarkan
CfEG
(AB058670).
Kotak
menunjukkan ekson, angka di dalam kotak menunjukkan posisi
ekson.

Elektroforesis dan Pewarnaan DNA
Segmen DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan PAGE 6% menggunakan
bufer 1xTBE. Pemisahan dilakukan pada tegangan 200 V selama 50 menit.
Visualisasi DNA pada gel poliakrilamid menggunakan metode pewarnaan perak
(Tegelstrom 1986) di dalam shaking bath.
Setelah dielektroforesis gel dicuci dengan larutan CTAB selama 8 menit.
Kemudian dicuci dengan akuades sebanyak dua kali masing-masing selama 2
menit. Selanjutnya gel tersebut direndam dalam larutan NH4OH selama 8 menit.
Kemudian gel direndam dalam larutan perak (0.32 g AgNO3; 0.8 ml NH4OH; 80
µl NaOH; akuades 200 ml) selama 10 menit. Setelah proses ini gel dicuci kembali
dengan akuades sebanyak tiga kali, masing-masing selama 2 menit. Untuk tahap
pemunculan pita DNA, gel direndam dalam larutan Na2CO3 (4 g Na2CO3; 100 µl
formalin; 200 ml akuades). Tahap terakhir adalah proses perendaman gel pada
larutan asam asetat 1%.
Sekuen dan Alignment DNA dan Asam Amino
Proses sekuen DNA menggunakan jasa sekuensing. Produk sekuen diedit
menggunakan program Genetyx Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment
menggunakan Clustal X (Thompson et al. 1997) dan Mega 4.0 (Tamura et al.
2007). Alignment DNA dilakukan antara sekuen gen endoglukanase C.
curvignathus dengan sekuen CfEG (AB058670) dan NtEG (AB019146) dari
GenBank

(www.ncbi.nlm.nih.gov).

Analisis

homologi

dilakukan

melalui

BLASTN untuk urutan basa dan BLASTP untuk urutan asam amino hasil translasi
melalui situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

16

Analisis Filogeni dan Jarak Genetik
Analisis filogeni menggunakan program Mega 4.0 (Tamura et al. 2007).
Analisis filogeni berdasarkan asam amino dengan menyamakan awal dan akhir
asam amino terlebih dahulu berdasarkan hasil alignment. Rekonstruksi filogeni
menggunakan metode Maximum Parsimony dengan bootstrap 1000 kali. Data
endoglukanase bakteri, protozoa simbion rayap, fungi, rayap, echinodermata,
cacing

tanah,

dan

moluska

(Tabel

2)

diambil

dari

genbank

(www.ncbi.nlm.nih.gov). Perhitungan jarak genetik dilakukan antara gen
endoglukanase C. curvignathus dengan gen endoglukanase rayap lain dengan
program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007).
Analisis Protein Putative
Analisi