Isolasi dan karakterisasi pustaka mikrosatelit dengan metode pengkaya (Enrichment) pada tanaman jati (Tectona grandis)
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PUSTAKA MlKROSATELlT
DENGAN METODE PENGKAYAAN (Enrichment)
PADA TANAMAN JATl (Tectona grandis)
ASEP SAEFULLOH
SEKOLAHPASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
SURATPERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PUSTAKA MIKROSATELIT DENGAN
METODE PENGKAYAAN (Enrichment) PADA TANAMAN JATI (Tectona
grandis)
Adalah karya saya sendiri dengan bimbingan dari komisi pembimbing dan belum
pernah dipublikasikan dalam bentuk apapun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian
akhir tesis.
Asep Saefulloh
NRP. P28500024
ABSTRAK
ASEP SAEFULLOH. lsolasi dan Karakterisasi Pustaka Mikrosatelit dengan
Metode Pengkayaan (enrichment) Pada Tanaman Jati (Tectona grandis). Di
bawah bimbingan Agus Purwito, Dedy Duryadi S., dan Adi Pancoro.
Jati (Tecfona grandis Linn. f.) merupakan tanaman kayu yang penting
secara komersial dan dikenal luas sebagai bahan baku industri perkayuan yang
berkualitas. Saat ini dipasaran lokal banyak beredar bibit jati baik yang
diperbanyak dengan biji atau dengan teknik kultur jaringan (stek), bentuk
morfologi yang hampir sama rnembuat kita sulit membedakan jenis mana yang
merupakan bibit unggul. Untuk itu diperlukan suatu penanda rnolekuler yang
dapat membedakan jenis-jenis jati tersebut. lnformasi tentang penanda molekuler
dalam mengidentifikasi perbedaan genetik tanaman jati ini rnasih sangat
terbatas.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi motif mikrosatelit
pada tanaman jati untuk mendapatkan primer-primer spesifik yang dapat
digunakan untuk rnengkarakterisasi keragaman genetik jati. Sebanyak 16
oligonukleotida bermotif mikrosatelit telah dihibridisasi dengan fragmen DNA jati
hasil pemotongan dengan enzim restriksi Alul, Rsal dan Hincll yang telah
diligasikan dengan adaptor Mlul. Fragmen hasil hibridisasi kemudian dielusi dan
diarnplifikasi dengan primer 21-rner untuk memperoleh produk PCR sebagai
fragmen untuk diinsersikan ke vektor plasmid pGEM-T Easy sehingga diperoleh
konstruksi pustaka mikrosatelit jati.
Pada penelitian ini telah diperoleh 6 jenis pustaka mikrosatelit tanaman
jati yaitu: JB-I; JB-2; JB-3; JL-1; JL-2; JL-3, dan berdasarkan pengujianlverifikasi
pada 30 plasmid rekombinan telah diperoleh insert yang merupakan kandidat
fragmen mikrosatelit dengan ukuran sekitar 200 dan 1.200 bp.
Sekuen dilakukan terhadap empat plasmid rekombinan yang berhasil
diisolasi dengan baik dari sekitar 500 koloni transforman (0.8%). Dua sampel
(JB36, JB39) berupa produk PCR dengan ukuran fragmen sisipan yang disekuen
berkisar 200-an pasang basa dan dua sarnpel lain (JBI-I dan JB5C) merupakan
plasmid rekombinan hasil isolasi plasrnid.
Dari keempat sampel yang disekuen, hanya sampel J B I - I yang
cenderung memperlihatkan adanya motif mikrosatelit. Motif yang muncul dari
sampel yang dianalisis adalah [CAI,, merupakan motif campuran tidak sempurna.
Diperoleh satu pasang primer mikrosatelit yang dapat mengamplifikasi suatu
daerah tertentu pada genom tanaman jati. Dari uji primer mikrosatelit hasil
desain dengan teknik PCR, primer tersebut dapat dibuktikan bisa
mengamplifikasi lokus tertentu dari suatu genom jati.
Kata Kunci : Jati, isolasi, karakterisasi, pengkayaan, pustaka mikrosatelit, dan primer
rnikrosatelit
ABSTRACT
ASEP SAEFULLOH. Isolation and Characterization of Microsattelite Library
with Enrichment Method on Teak Plants (Tectona grandis). Adviser Agus
Purwito, Dedy Duryadi S., and Adi Pancoro.
Teak (Tectona grandis Linn. f.) is one important commercial woody plants
that used as a basic material for a high quality wood industry. Nowadays, teak
plant for Indonesian local market are propagated from seed or tissue culture.
Both of these plant materials have similar phenotypes. It makes difficult for teak
plant breeder to select elite lines. Molecular marker is an approach to solve this
problem, in which variation among teak lines can be distinguished. At this
moment, molecular marker to identifying teak genetic diversity is still limited.
In this study we isolate and characterize microsatellite motif of teak to be
obtained specific primers that can be use for characterization genetic diversity of
teak. Teak genome has been cleaved using Alul, Rsal and Hincll restriction
enzymes, then DNA fragments were ligated with Mlul adaptor. Subsequently,
fragments produced were hybridised with 16 oligonucleotides which are motifs of
microsatellite. The hybridised fragments were eluted and amplified with a 21mers primer using PCR and then PCR products have been inserted into pGEM-T
Easy vector.
Results showed there are 6 candidates of teak microsatellite, which were
JB-1, JB-2, JB-3, JL-1, JL-2, and JL-3. Based on EcoRl restriction enzyme site
on 30 tested recombinant plasmids, it may indicate that the insertion fragment
with 200 and 1.200 bp in size, as one candidate of teak microsatellite region.
Four recombinant plasmids that are success isolated from 500
transformant coloni (0,8%) were sequenced. Two samples (JB36, JB 39) are
PCR products with 200 bp fragment insert size and two other samples (JBI-1,
JB5C) are recombinant plasmid
The results show that, only JBI-1 was tending to show microsatellite motif
[CAIn, which is inperfect compound motif. One pair microsatellite primer that can
amplify certain region of teak genome was obtained . From microsatellite primer
assay resulted from PCR technic, the primer proved to be able to amplify certain
locus of teak genome.
Key Words :
teak, isolation, characterization, enrichment, microsatellite library,
microsatellite primer
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PUSTAKA MIKROSATELIT
DENGAN METODE PENGKAYAAN (Enrichment)
PADA TANAMAN JATl (Tectona grandis)
ASEP SAEFULLOH
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
Judul
: lsolasi dan KaraMerisasi Pustaka Mikrosatelit dengan Metode
Nama
NIM
: Asep Saefulloh
: P28500024
Pengkayaan (Enrichment) Pada Tanaman Jati (Tectona grandis)
Disetujui,
Komisi Pembirnbing
Dr. I .
/%-
us Punvito MSc
Ketua
/
Dr. Ir. Dedv Duryadi Solihin, DEA
Anggota
Adi Pancoro. Phd.
Anggota
Dr. ld./rGluhamrnad Jusuf
Tanggal Ujian :
0 5 Jjt!>/2QrJ6
Tanggal Lulus :
2 3 JAN 21106
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SVVT atas segala rahmat
dan karunia yang telah diberikan, sehingga karya ilmiah (laporan penelitian,
tesis) ini dapat diselesaikan. Penelitian ini mengambil tema mengenai Penanda
Molekuler (DNA) Mikrosatelit dengan Judul " lsolasi dan Karakterisasi Pustaka
Mikrosatelit dengan Metode Pengkayaan (Enrichment) Pada Tanarnan Jati
(Tectona grandis) ". Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2004
sampai Desember 2005 merupakan bagian dari Penelitian DlPA yang
diselenggarakan oleh Pusat Studi Regional Penelitian Biologi Tropis (SEAMEO
BIOTROP).
Selama melaksanakan penelitian dan menyelesaikan laporan tesis ini
penulis telah mendapatkan bimbingan, bantuan, dan dukungan dari semua pihak.
Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada :
1. Dr. IT.
Agus Purwito, M.Sc. dan Dr. Dedy Duryadi S., DEA. selaku dosen
pembimbing yang telah banyak memberikan saran, arahan, dorongan dan
bimbinaan.
2. Adi ~ i n c o r o ,PhD. yang telah mengijinkan penulis menggunakan metode
penelitian dan fasilitas Laboratorium Genetika ITB sekaligus
- bersedia menjadi
dosen pembimbing.
3. Dr. Handoko (Direktur SEAMEO BIOTROP) yang telah mendorong penulis
untuk melanjutkan studi di Program Master Bioteknologi Pascasarjana lnstitut
Pertanian Bogor.
4. Ir. Arief Chandra S., M.Si. (Direktur PT. PPA Agricola) selaku atasan penulis
yang selalu memberikan dorongan, dukungan, dan bantuan serta mengijinkan
penulis untuk menyelesaikan studi.
5. Dr. Herman dan Dr. M. Yunus yang telah mengijinkan penulis menggunakan
fasilitas Laboratorium Biologi Molekuler BB-BIOGEN.
6. Proyek DlPA 2003 dan 2005 SEAMEO BIOTROP yang telah mendanai
penelitian penulis.
Ungkapan terima kasih khusus dan penghargaan penulis sampaikan
kepada Bapa dan Mamah, Teh Ai, dan Eneng, serta seluruh keluarga atas
segala do'a dan kasih sayang yang selalu diberikan kepada penulis. Kepada istri
tercinta (Fitri Yelli, SP. M.Si.), terima kasih dan penghargaan sedalam-dalamnya
penulis ucapkan atas segala dorongan dan semangat, kesabaran dan kasih
sayang serta pengorbanan dan pengertiannya.
Rekan-rekan "Lab Biologi Molekuler PAU IPB " seperjuangan terutama
buat Dr. Rini Widayanti, yang selalu siap berdiskusi dengan penulis dan selalu
memberikan masukan, dorongan dan semangat kepada penulis. Tak lupa
kepada lr. S. Sinaga, M.Si., Pak Nunu dan Pak Heri atas segala bantuan dan
kerjasamanya.
DAFTAR IS1
Halaman
DAFTAR IS1
I
DAFTAR TABEL
iii
DAFTAR GAMBAR ... ... .. . ... . .. ... ... ... .. . ... . .. .. . .. . ... . .. ... ... . .. .. . ... ... ... ... ... .
iv
DAFTAR LAMPIRAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
v
PENDAHULUAN
Latar Belakang ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... . . . . . . . . . . . .
..
Tujuan Penel~t~an
... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... .... . ,. . . . . . . . .
1
4
TINJAUAN PUSTAKA
Aplikasi Mikrosate
. .
lsolas~Mikrosatelit ... .. . .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... .......,...
Perancangan Primer ... ... .... ... ... ... . .. .. . ... . .. ... ... ... ... ... ... .. .. ... ... ... ... ...
Perancangan Primer dengan Program Internet . .. ... ... ... ... ... .... .......
METODE PENELlTlAN
Tempat dan Waktu ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
Bahan dan Alat
Metode Pelaksanaan
Pemotongan DNA Genom Jati ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....
Ligasi Fragmen DNA dengan Adaptor ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........
Hibridisasi ... ... ... ... ... .. . .
... .
... ... .., ,,. ... ... .., ... ... ... .... .. .. . ............
Persiapan membran ... ....... ... ... ... ... ... ... ... ... .., ,.. ... ... .,,... ... ... .....
. . .
.
Proses h~brldlsas~
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Amplifikasi DNA elusi ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
Ligasi dengan Vektor Plasmid ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
Transformasi ..... . ...... ... ...... ... ... ...... ... ......... ... ... ...... ... .... .. ... ........ ...
Pembuatan sel kompeten E. Coli DH5-a ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ...
Transformasi ... ... ... .. . .... .. .. . ....,., .. .. . .,, ... ... .,.,..... ... .. . ... . .. ... ......
lsolasi Plasmid ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .,, ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
5
6
6
7
8
I0
I2
13
HASlL DAN PEMBAHASAN
Analisis Sekuensin
Perancangan Primer
Posisi adaptor ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... . .. .. . ... ... .
Motif mikrosatelit ... ... ... ...... .. . ... . .. .. . .. . ... . .. .. . ... ... ... ... .. . ...... ... ....
Desain primer ........ ...... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...
SIMPULAN DAN SARAN
... .. . .. . ... ... ... ,.. . .. . .. ... ...... ,.. ...... . .. ... ... ..
Simpulan ... ... . .. ... ... . .. .. . .....
Saran ... ... ... ... ... ... ... .. ......... . .. .... ... . .. . .. .. . .., , ., ... ... .. . .... ,. ... ...... ...... .
DAFTAR PUSTAKA ... . .. ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .. .
DAFTAR TABEL
Halaman
Perbandingan biaya. waktu dan hasil dari rnetode isolasi rnikrosatelit
Kornposisi reaksi pernotongan DNA genorn .................................
Kornposisi reaksi ligasi DNA dengan adaptor ..............................
Komposisi reaksi PCR DNA terligasi adaptor ...............................
Kornposisi reaksi PCR DNA hasil elusi (enrichment) .....................
Kornposisi reaksi ligasi DNA ke dalarn vektor
GEM" .T Easy
........
Kornposisi reaksi pernotongan plasrnid dengan EcoRl ...................
Pengelompokan oligonukleotida berdasarkan Melting Temperature ..
Hasil skrining biru putih ................... . . .
Hasil skrining antibiotik
Hasil analisis primer3
............
........ .................
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Alur kerja pencarian motif mikrosatelit ........................................
Perpasangan adaptor 21-mer dan 25-mer ..................................
Hasil isolasi DNA genom jati
Pemotongan genom dengan enzim restriksi dan ligasi fragmen DNA
dengan adaptor Mlul
Pengkayaan kandidat-kandidat fragmen DNA bermotif ..................
Koloni biru-putih hasil transformasi ..............................................
Hasil isolasi plasrnid
Pemotongan DNA-Rekombinan dengan enzim restriksi EcoRl .......
Verifikasi fragmen sisipan dengan PCR ......................................
Urutan sekuen DNA sisipan hasil sekuensing .............................
Urutan nukleotida sample JBI-1 ...............................................
Hasil analisis primer3
Produk PCR primer mikrosatelit hasil desain ...............................
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Hasil sekuensing DNA sisipan jati (Charoen Pokphand) sarnpel J B I - I
..........................
........
.................................................
43
2. Output Primer3 ........................................................................
44
3.
4.
Hasil sekuensing DNA sisipan jati (Charoen Pokphand) sarnpel
JB361, JB362, JB363, JB391 dan JB392 ......................................
45
Hasil sekuensing DNA sisipan jati (Charoen Pokphand) Sarnpel JB5C
..............................................................................................
46
Latar Belakang
Jati (Tectona grandis Linn. f.) merupakan tanaman kayu penting secara
komersial dan dikenal luas sebagai bahan baku industri perkayuan yang
berkualitas. Di Indonesia, jati digolongkan sebagai kayu mewah yang termasuk
kelas kayu dengan kualitas dan nilai jual yang tinggi. Penggunaan kayu jati
sudah sangat populer dan masih merupakan pilihan &ma
karena keindahan
seratnya dan dikenal sebagai kayu yang tahan rayap serla jamur. Kebutuhan
kayu jati baik dalam negeri maupun luar negeri selalu meningkat sedangkan
populasi dan pasokannya semakin rnenipis yang disebabkan kendala siklus umur
panen jati konvensional yang relatif lama sekiir 45-60 tahun.
Dalam upaya mengantisipasi ha1 tersebut, saat ini telah dikembangkan
tanaman jati unggul yang berasal dari pohon induk terbaik setelah diseleksi dan
dipilih dari tanaman jati biasa yang mempunyai sifat-sifat "lebih" dari populasi jati
yang ada, kemudian diperbanyak dengan pembiakan vegetatii melalui teknik
"mikropropagasi atau kukur jaringan".
Tanaman induk ini berasal dari hasil
pemuliaan lokal (Indonesia) atau dari luar Indonesia, seperti Malaysia, Myanmar,
dan Thailand.
Bibi jati unggul hasil kuttur jaringan memiliki kecepatan pertumbuhan 3-4
kali dari pertumbuhan bibit jati asal biji, pertumbuhan pohon lebih seragam (>
80%). tingkat pertumbuhan per tahun lebih cepat (umur 2 tahun tinggi 4.75 m dan
diameter batang 7.54 cm; Eliyani 2004), bentuk batang lebih lurus dan silindris,
serta tingkat percabangan ringan. Dengan umur panen yang dapat dicapai 15-20
tahun maka pengembalian modal lebih cepat dengan kualitas kayu layak jual,
sehingga tanaman ini dapat dijadikan bidang investasi yang prospektif dimasa
yang akan datang. Beberapa "merk dagang" jati kultur jaringan yang beredar
dipasaran, yaitu : Jati Biotropika, Jati Emas, Jati Super, Jati Perhutani Plus
(JPP), Jati Prima, Jati Kencana dan Jati Unggul (Tini dan Amri 2002; PPA
Agricola 2003; Saefulloh 2003). Penggunaan bibit jati hasil kuktur jaringan untuk
budidaya telah dikembangkan di beberapa negara seperti India, Costa Rica,
Thailand, Myanmar, Malaysia, dan Indonesia (Tini dan Amri 2002; Rimbawanto
2000).
Saat ini di pasaran lokal banyak beredar bibi jati baik yang diperbanyak
dengan biji atau dengan teknik kulur jaringan, bentuk rnorfologi yang harnpir
sarna rnembuat kiia suli rnernbedakanjenis rnana yang rnerupakan bibi unggul.
Jati konvensional atau jati biasa adalah tanarnan jati yang dihasilkan dari bibi
asal biji (generatiif) yang rnerniliki laju perturnbuhan yang relatif larnbat dengan
tanarnan induk biasanya berasal dari hasil pemuliaan lokal.
Secara genetik sifat-sifat keunggulan jati kultur jaringan rnasih
dipertanyakan. Apakah keunggulan secara rnorfologi dapat dibuktikan secara
genetik? Untuk itu diperlukan suatu penanda rnolekuler yang dapat rnernbedakan
jenisjenis
jati
tersebut.
lnforrnasi tentang
penanda rnolekuler
dalarn
rnengidentiikasi perbedaan genetik tanarnan jati ini rnasih sangat terbatas.
Dalarn penelitian ini akan rnencoba rnengisolasi pustaka rnikrosateli dari dua
jenis jati yaitu : Jati BiotropikafJati Ernas (JB) dan Jati LokalIPerhutani (JL).
Perkembangan sejurnlah penanda rnolekuler (DNA marker) dewasa ini
telah memungkinkan untuk rnelakukan identiikasi terhadap perubahanperubahan genetik yang terjadi dalarn suatu persilangan serta hubungannya
dengan perubahan sifat kuantiiatii dan sifat kualitatif dari suatu klon
(tanarnanlhewan). Selain itu, penanda rnolekuler juga dapat digunakan untuk
rnernbedakan antara suatu ras (tanarnanlhewan) dengan yang lainnya terutarna
dalarn kaitannya dengan upaya pelestarian dan rnenjaga kernumian dari ras
tersebut (Philips dan Vasil2001).
Salah satu penanda rnolekuler (DNA marker) yang sangat populer
dewasa ini adalah rnikrosatelit. Mikrosateli rnerupakan sekuen DNA sederhana
pendek berulang, 1-6 pb berurulan mono-, di-, tri-, atau tetra- nukleotida berulang
dalarn bentuk kopi berdampingan (tandem), (CA1GT)n atau (TCG1AGCT)n
(Harnada ef a/. 1982; Taulz dan Renz 1984). lstilah rnikrosateli yang sering
digunakan oleh para peneliti antara lain : shod tandem repeat (STR) (Craig ef. a/.
1988) dan simple sequences repeats (SSRs) (Jacob et. a/. 1991).
Pernetaan genorn rnenggunakan ale1 rnikrosateli dapat rnengidentifikasi
krornosom yang rnengandung gen-gen spesifik yang berpengaruh terhadap
berbagai sifat kuantiiatif dan kualitatii tanarnanlhewan. Aplikasi rnikrosatelit
banyak digunakan pada analisis keragarnan genetik, pernetaan genetik, studi
evolusi, struktur populasi dan sistern perkawinan (Philips dan Vasil 2001;
Temnicykh et. a/. 2000; Ashley dan Dow 1994).
Pernanfaatan analisis rnikrosatelii untuk studi populasi alami dari tanarnan
tingkat tinggi belurn banyak diselidiki.
Studi awal pada tanarnan hias atau
tanaman budidaya rnembuktikan bahwa rnikrosatelii mempunyai marker
polimotfik yang berlirnpah untuk identiikasi atau pernetaan genom (Philips dan
Vasil 2001).
Penggunaan penanda mikrosatelii untuk analisis keragarnan
genetik dan analisis perubahan genetik dari suatu populasi tanaman telah
dilakukan pada : padi (Prasetiyono 2003; Song etal. 2003; Temnykh etal. 2000;
Chen ef a/. 1997). kedelai (Narvel et. a/. 2000), kelapa (Teulat, et. a/. 2000).
common bean (Yu ef. a/. 2000). Noway spruce (Swtti e t a/. 2002). Cannabis
saliva (Gilmore, S. 2003), pinus (Provan et. a/. 2001) dan legum (Provan e t a/.
2001).
Penelitian ini mencoba mengisolasi dan mengkarakterisasi penanda
rnikrosatelii yang dapat digunakan dalarn mengidentiFikasidan verifikasi asal-usul
dan keaslian sualu klon jati unggul terkait dengan penampakan sifat kuantiiatii
dan kualiiatif dari beberapa klon jati.
Penelitian pendahuluan, pembuatan pustaka rnikrosatelii telah dilakukan
baik pada klon jati unggul (jati emas) maupun pada klon jati lokal dan sampai
saat ini masih berlangsung (Duryadi ef. a/. 2004; Saefulloh 2004, data belurn
dipublikasi).
Tahapan keja untuk rnengisolasi mikrosatelit tanaman secara
urnum dimulai dengan pembuatan pustaka small-insert (200-600 pb), skrining
rnelalui hibridisasi, sekuensing, dan perancangan primer.
Metode yang digunakan dalam peneliian pendahuluan tersebut menurut
Zane e t a/. (2002) merupakan protokol konvensional. Lokus rnikrosateliidiisolasi
dari sebagian pustaka genom (diseleksi ukuran insert kecil), skrining ribuan klon
rnelalui hibridisasi koloni dengan probe yang mengandung repeat (Rasman eta/,
1991).
Meskipun relatii sederhana, khususnya untuk genom yang kaya
mikrosatelii, pendekatan ini dapat membutuhkan waktu yang lama, biaya tinggi
dan tidak efisien untuk spesies yang rnempunyai frekuensi mikrosatelii rendah.
Beberapa strategi alternatii telah diemukan untuk mengurangi waktu yang
diperlukan dalam isolasi rnikrosatelit dan secara nyata dapat meningkatkan hasil
(Zane et. a/. 2002).
Zane et a/. (2002) menjelaskan pengkayaan yang dilakukan sebelum
kloning dengan teknik PCR dapat meningkatkan keberhasilan dalam mengisolasi
rnikrosatelii. Edwards et a/. (1996) rnengatakan penggunaan teknik pengkayaan
(enrichment) kernungkinan rnendapatkan koloni rekornbinan yang disekuensing
rnengandung motif rnikrosatelii rnencapai 50-70% dengan waktu yang relatii
singkat, dan tidak rnernbutuhkan biaya tinggi dibandingkan pendekatan
konvensional.
Teknik enrichment yang dikernbangkan oleh Edwards et a/. (1996) telah
terbukti berhasil rnengisolasi rnikrosatelii pada tanarnan tropis asli Indonesia
seperti rnangga (Mulyani 2003) dan durian (Kristianti 2005) di Laboratonurn
Genetika Departernen Biologi Instiiut Teknologi Bandung. Dengan kin dari Dr.
Adi Pancoro (komunikasi pribadi) rnaka pada peneliiian ini akan rnenerapkan
teknik yang telah dikembangkan dan diadaptasikan pada kondisi Indonesia yang
berprospek berhasil baik dan cepat.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1) untuk rnengisolasi dan rnengkarakterisasi rnotii rnikrosatelii pada tanaman jati
(Tectona grandis).
2) rnendapatkan primer-primer spesifik rnikrosatelii yang dapat digunakan untuk
rnengkarakterisasi keragarnan genelik jati.
Jati
Tanaman jati (Tectona grandis
Linn. f.) termasuk anggota famili
Verbenaceae dan genus Tectona yang dibagi ke dalam tiia spesies. Genus
Tectona mencakup spesies Tectona grandis Linn. f. yang dikenal di lndonesia
dan dua spesies lain, yaitu T. hamiltoniana Wall. yang tumbuh di daerah kering
Myanmar dan T. philippinensis Benth B1 Hooker yang tumbuh di hutan Batangas
dan Mindoro (Pulau [ling), Filipina. Dalam sistem taksonomi dan tatanama,
klasifikasitanaman jati menurut ahli botani adalah sebagai berikut :
Divisi
: Spermatophyta
Kelas
: Angiospermae
Sub kelas
: Dicotyledoneae
Ordo
: Verbenales
Famili
: Verbenaceae
Genus
: Tedona
Spesies
: Teetonagrandis Linn. f.
Areal penyebaran alami tanaman jati terdapat di India, Myanmar,
Thailand dan bagian baral Laos. Batas utara pada garis 25"LU di Myanmar,
batas selatan pada garis 9"LU di India. Jati tersebar pada garis 70"-100" BT.
Jati bukan tanaman asli Indonesia telapi sudah tumbuh sejak beberapa abad
yang lalu di P. Kangean, Muna, Sumbawa dan Jawa (Rachrnawati ef. a/. 2002;
Sumama 2001).
Di Indonesia, jati digolongkan sebagai kayu mewah termasuk kelas kayu
dengan kualitas dan nilai jual yang tinggi.
Kayu ini tahan rayap serta jamur
dengan angka kembang susut yang kecil.
Salah satu kayu serbaguna,
digunakan untuk konstruksi ringan dan berat, bahan bangunan rumah, kayu
pertukangan, ukiran dan lain-lain. Penggunaan kayu jati sudah sangat populer
dan masih merupakan pilihan utama karena keindahan seratnya.
Secara historis, nama Tectona berasal dari bahasa Portugis (teMon)
artinya tumbuhan yang memiliki kualitas tinggi. Di India, tanaman jati memiliki
banyak nama daerah seperti : ching-jagu (di wilayah Asam); saigun, segun
(Bengali); tekku (Bombay); kyun (Burma); saga, sagach (Gujarat); sagun,
sagwan (Hindi); jadi, saguan, tega, fiayagadamara (Kannad); sag, saga, sgwan
(Manthi); singutu (Oriya); bardaru, bhumisah, dwardaru, kaharachchad, saka
(Sangskrit);
fekkumaran,
tekku
(Tamil);
dan
adaviteeku,
peddafekku,
feekuchekka (Telugu). Dalam bahasa Jerman jati dikenal dengan nama Teck,
Teakbaun, atau Java Teak, Teak (Inggris), Lyiu (Burma), Mai Sak (Thailand),
Teck (Perancis), dan di Spanyol disebut Teca (Rachmawati ef. a/., 2002;
Sumarna. 2001).
Jati Unggul
Jati unggul merupakanjati yang memiliki sifat-sifat unggul yang dihasilkan
dari pembiakan vegetatii melalui teknik mikropropagasi (kultur jaringan) dan
memiliki laju pertumbuhan yang cepat (fast growing). Jati konvensional atau jati
biasa adalah tanaman jati yang dihasilkan dari bibi asal biji (generaw yang
memiliki laju pertumbuhan yang relatii larnbat. Tanaman induk yang diklon untuk
menghasilkan jati unggul merupakan tanaman jati terbaik setelah diseleksi dan
dipilih dari tanaman jati biasa yang mempunyai sifat-sifat "lebih" dari populasi jati
yang ada. Tanaman induk ini berasal dari jati hasil budidaya lokal (Indonesia)
atau jati hasil budidaya di luar Indonesia, seperti Malaysia, Myanmar, dan
Thailand (Tini dan Amri 2002; PPA Agricola 2003; Saefulloh 2003).
Bibit jati hasil kultur jaringan memiliki kecepatan pertumbuhan 5-4 kali
dari pertumbuhan bibit jati asal biji, pertumbuhan pohon lebih seragam (> 80 %),
tinggi perlumbuhan per tahun lebih cepat (umur 2 tahun tinggi 4.75 m dan
diameter batang 7.54 cm; Eliyani 2004), bentuk batang lebih lurus dan silindris,
serta tingkat percabangan ringan.
Dengan umur panen 15-20 tahun
pengembalian modal lebih cepat dengan kualitas kayu layak jual. Bibit jati hasil
teknologi kultur jaringan dapat lersedia dalam jumlah besar (ratusan ribu hingga
jutaan bib6 per tahun) sehingga tanaman ini dapat dijadikan salah satu bidang
investasi yang prospektii di masa yang akan datang. Saaf ini, di Indonesia telah
beredar trade mark jati unggul seperti Jati Biotropika, Jati Emas, Jati Super, Jati
Plus, Jati Prima, dan Jati Unggul (Tini dan Amri 2002; Saefulloh 2003). Jenis jati
unggul yang digunakan dalam peneliian ini adalah Jati Biotropika (Jati Emas).
Penanda DNA (DIVA markerJ
Materi genetik (DNA) yang dijumpai dalam semua organisme sebagian
besar belum diketahui fungsinya, hanya sebagian kecil (10% dari total DNA
genom) yang diketahui beriungsi sebagai penyandi genetik yang menentukan
karakteristik keturunan yang disebut gen. Segmen DNA (selain gen) ini dapat
diidentiikasi, dikarakterisasi, dan dlentukan posisinya di dalam genom.
Segmen-segmen ini kemudian diketahui ada yang khas dalam suatu individu,
jumlahnya sangat berlimpah, dan memiliki polimorfisme yang sangat tinggi
sehingga dapat digunakan sebagai penciri DNA (DNA marker) dalam analisis
genom (Philips dan Vasil 2001).
Dalam banyak kasus, marker DNA sangat membantu dalam menentukan
posisi gen karena marker DNA ini sering terletak pada kromosom yang sama dan
berdekatan dengan gen. Dengan demikian, semakin banyak marker DNA yang
diketahui posisinya pada kromosom, maka semakin banyak pula kemungkinan
untuk mengetahui posisi gen. Marker DNA juga sangat bermanfaat dalarn studi
kekerabatan genetik dan evolusi serta aplikasi lainnya. Kenyataan ini membuat
marker DNA ini menjadi sangat menentukan dalam perkembangan teknologi
rekayasa DNA terutama dalam rangka pembuatan peta genetik (Philips dan Vasil
2001).
Mikrosalell
Salah satu penanda molekuler (DNA marker) yang sangat populer
dewasa ini adalah mikrosatelii. Mikrosatelit merupakan sekuen DNA sederhana
pendek berulang, 1-6 pasang basa (pb) berunitan mono-, di-, tri-, atau tetranukleotida berulang dalam bentuk kopi berdampingan (tandem), (CA/GT)n atau
(TCG1AGCT)n secara umum terdiri dari sekiiar 20-30 pb untai p l y GT, poly A
dan poly GA (Hamada et al. 1982; Tautz and Renz 1984). lstilah mikrosatelii
yang sering digunakan oleh para penelii antara lain : short tandem repeat (STR)
(Craig et. a/. 1988); dan simple sequences repeats (SSRs) (Jacob ef. al. 1991).
Mikrosatelit tersebar secara acak sepanjang genom inti pada individu
tingkat tinggi (Hamada ef. al. 1982; Tautz dan Renz 1984; dan Tautz e t a/.
1986). Sekuen ini mempuyai tingkat polimorfik yang tinggi terhadap keragaman
dalam jumlah ulangan, dengan panjang
DENGAN METODE PENGKAYAAN (Enrichment)
PADA TANAMAN JATl (Tectona grandis)
ASEP SAEFULLOH
SEKOLAHPASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
SURATPERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PUSTAKA MIKROSATELIT DENGAN
METODE PENGKAYAAN (Enrichment) PADA TANAMAN JATI (Tectona
grandis)
Adalah karya saya sendiri dengan bimbingan dari komisi pembimbing dan belum
pernah dipublikasikan dalam bentuk apapun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian
akhir tesis.
Asep Saefulloh
NRP. P28500024
ABSTRAK
ASEP SAEFULLOH. lsolasi dan Karakterisasi Pustaka Mikrosatelit dengan
Metode Pengkayaan (enrichment) Pada Tanaman Jati (Tectona grandis). Di
bawah bimbingan Agus Purwito, Dedy Duryadi S., dan Adi Pancoro.
Jati (Tecfona grandis Linn. f.) merupakan tanaman kayu yang penting
secara komersial dan dikenal luas sebagai bahan baku industri perkayuan yang
berkualitas. Saat ini dipasaran lokal banyak beredar bibit jati baik yang
diperbanyak dengan biji atau dengan teknik kultur jaringan (stek), bentuk
morfologi yang hampir sama rnembuat kita sulit membedakan jenis mana yang
merupakan bibit unggul. Untuk itu diperlukan suatu penanda rnolekuler yang
dapat membedakan jenis-jenis jati tersebut. lnformasi tentang penanda molekuler
dalam mengidentifikasi perbedaan genetik tanaman jati ini rnasih sangat
terbatas.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi motif mikrosatelit
pada tanaman jati untuk mendapatkan primer-primer spesifik yang dapat
digunakan untuk rnengkarakterisasi keragaman genetik jati. Sebanyak 16
oligonukleotida bermotif mikrosatelit telah dihibridisasi dengan fragmen DNA jati
hasil pemotongan dengan enzim restriksi Alul, Rsal dan Hincll yang telah
diligasikan dengan adaptor Mlul. Fragmen hasil hibridisasi kemudian dielusi dan
diarnplifikasi dengan primer 21-rner untuk memperoleh produk PCR sebagai
fragmen untuk diinsersikan ke vektor plasmid pGEM-T Easy sehingga diperoleh
konstruksi pustaka mikrosatelit jati.
Pada penelitian ini telah diperoleh 6 jenis pustaka mikrosatelit tanaman
jati yaitu: JB-I; JB-2; JB-3; JL-1; JL-2; JL-3, dan berdasarkan pengujianlverifikasi
pada 30 plasmid rekombinan telah diperoleh insert yang merupakan kandidat
fragmen mikrosatelit dengan ukuran sekitar 200 dan 1.200 bp.
Sekuen dilakukan terhadap empat plasmid rekombinan yang berhasil
diisolasi dengan baik dari sekitar 500 koloni transforman (0.8%). Dua sampel
(JB36, JB39) berupa produk PCR dengan ukuran fragmen sisipan yang disekuen
berkisar 200-an pasang basa dan dua sarnpel lain (JBI-I dan JB5C) merupakan
plasmid rekombinan hasil isolasi plasrnid.
Dari keempat sampel yang disekuen, hanya sampel J B I - I yang
cenderung memperlihatkan adanya motif mikrosatelit. Motif yang muncul dari
sampel yang dianalisis adalah [CAI,, merupakan motif campuran tidak sempurna.
Diperoleh satu pasang primer mikrosatelit yang dapat mengamplifikasi suatu
daerah tertentu pada genom tanaman jati. Dari uji primer mikrosatelit hasil
desain dengan teknik PCR, primer tersebut dapat dibuktikan bisa
mengamplifikasi lokus tertentu dari suatu genom jati.
Kata Kunci : Jati, isolasi, karakterisasi, pengkayaan, pustaka mikrosatelit, dan primer
rnikrosatelit
ABSTRACT
ASEP SAEFULLOH. Isolation and Characterization of Microsattelite Library
with Enrichment Method on Teak Plants (Tectona grandis). Adviser Agus
Purwito, Dedy Duryadi S., and Adi Pancoro.
Teak (Tectona grandis Linn. f.) is one important commercial woody plants
that used as a basic material for a high quality wood industry. Nowadays, teak
plant for Indonesian local market are propagated from seed or tissue culture.
Both of these plant materials have similar phenotypes. It makes difficult for teak
plant breeder to select elite lines. Molecular marker is an approach to solve this
problem, in which variation among teak lines can be distinguished. At this
moment, molecular marker to identifying teak genetic diversity is still limited.
In this study we isolate and characterize microsatellite motif of teak to be
obtained specific primers that can be use for characterization genetic diversity of
teak. Teak genome has been cleaved using Alul, Rsal and Hincll restriction
enzymes, then DNA fragments were ligated with Mlul adaptor. Subsequently,
fragments produced were hybridised with 16 oligonucleotides which are motifs of
microsatellite. The hybridised fragments were eluted and amplified with a 21mers primer using PCR and then PCR products have been inserted into pGEM-T
Easy vector.
Results showed there are 6 candidates of teak microsatellite, which were
JB-1, JB-2, JB-3, JL-1, JL-2, and JL-3. Based on EcoRl restriction enzyme site
on 30 tested recombinant plasmids, it may indicate that the insertion fragment
with 200 and 1.200 bp in size, as one candidate of teak microsatellite region.
Four recombinant plasmids that are success isolated from 500
transformant coloni (0,8%) were sequenced. Two samples (JB36, JB 39) are
PCR products with 200 bp fragment insert size and two other samples (JBI-1,
JB5C) are recombinant plasmid
The results show that, only JBI-1 was tending to show microsatellite motif
[CAIn, which is inperfect compound motif. One pair microsatellite primer that can
amplify certain region of teak genome was obtained . From microsatellite primer
assay resulted from PCR technic, the primer proved to be able to amplify certain
locus of teak genome.
Key Words :
teak, isolation, characterization, enrichment, microsatellite library,
microsatellite primer
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PUSTAKA MIKROSATELIT
DENGAN METODE PENGKAYAAN (Enrichment)
PADA TANAMAN JATl (Tectona grandis)
ASEP SAEFULLOH
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
Judul
: lsolasi dan KaraMerisasi Pustaka Mikrosatelit dengan Metode
Nama
NIM
: Asep Saefulloh
: P28500024
Pengkayaan (Enrichment) Pada Tanaman Jati (Tectona grandis)
Disetujui,
Komisi Pembirnbing
Dr. I .
/%-
us Punvito MSc
Ketua
/
Dr. Ir. Dedv Duryadi Solihin, DEA
Anggota
Adi Pancoro. Phd.
Anggota
Dr. ld./rGluhamrnad Jusuf
Tanggal Ujian :
0 5 Jjt!>/2QrJ6
Tanggal Lulus :
2 3 JAN 21106
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SVVT atas segala rahmat
dan karunia yang telah diberikan, sehingga karya ilmiah (laporan penelitian,
tesis) ini dapat diselesaikan. Penelitian ini mengambil tema mengenai Penanda
Molekuler (DNA) Mikrosatelit dengan Judul " lsolasi dan Karakterisasi Pustaka
Mikrosatelit dengan Metode Pengkayaan (Enrichment) Pada Tanarnan Jati
(Tectona grandis) ". Penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2004
sampai Desember 2005 merupakan bagian dari Penelitian DlPA yang
diselenggarakan oleh Pusat Studi Regional Penelitian Biologi Tropis (SEAMEO
BIOTROP).
Selama melaksanakan penelitian dan menyelesaikan laporan tesis ini
penulis telah mendapatkan bimbingan, bantuan, dan dukungan dari semua pihak.
Untuk itu penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada :
1. Dr. IT.
Agus Purwito, M.Sc. dan Dr. Dedy Duryadi S., DEA. selaku dosen
pembimbing yang telah banyak memberikan saran, arahan, dorongan dan
bimbinaan.
2. Adi ~ i n c o r o ,PhD. yang telah mengijinkan penulis menggunakan metode
penelitian dan fasilitas Laboratorium Genetika ITB sekaligus
- bersedia menjadi
dosen pembimbing.
3. Dr. Handoko (Direktur SEAMEO BIOTROP) yang telah mendorong penulis
untuk melanjutkan studi di Program Master Bioteknologi Pascasarjana lnstitut
Pertanian Bogor.
4. Ir. Arief Chandra S., M.Si. (Direktur PT. PPA Agricola) selaku atasan penulis
yang selalu memberikan dorongan, dukungan, dan bantuan serta mengijinkan
penulis untuk menyelesaikan studi.
5. Dr. Herman dan Dr. M. Yunus yang telah mengijinkan penulis menggunakan
fasilitas Laboratorium Biologi Molekuler BB-BIOGEN.
6. Proyek DlPA 2003 dan 2005 SEAMEO BIOTROP yang telah mendanai
penelitian penulis.
Ungkapan terima kasih khusus dan penghargaan penulis sampaikan
kepada Bapa dan Mamah, Teh Ai, dan Eneng, serta seluruh keluarga atas
segala do'a dan kasih sayang yang selalu diberikan kepada penulis. Kepada istri
tercinta (Fitri Yelli, SP. M.Si.), terima kasih dan penghargaan sedalam-dalamnya
penulis ucapkan atas segala dorongan dan semangat, kesabaran dan kasih
sayang serta pengorbanan dan pengertiannya.
Rekan-rekan "Lab Biologi Molekuler PAU IPB " seperjuangan terutama
buat Dr. Rini Widayanti, yang selalu siap berdiskusi dengan penulis dan selalu
memberikan masukan, dorongan dan semangat kepada penulis. Tak lupa
kepada lr. S. Sinaga, M.Si., Pak Nunu dan Pak Heri atas segala bantuan dan
kerjasamanya.
DAFTAR IS1
Halaman
DAFTAR IS1
I
DAFTAR TABEL
iii
DAFTAR GAMBAR ... ... .. . ... . .. ... ... ... .. . ... . .. .. . .. . ... . .. ... ... . .. .. . ... ... ... ... ... .
iv
DAFTAR LAMPIRAN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
v
PENDAHULUAN
Latar Belakang ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... . . . . . . . . . . . .
..
Tujuan Penel~t~an
... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... .... . ,. . . . . . . . .
1
4
TINJAUAN PUSTAKA
Aplikasi Mikrosate
. .
lsolas~Mikrosatelit ... .. . .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... .......,...
Perancangan Primer ... ... .... ... ... ... . .. .. . ... . .. ... ... ... ... ... ... .. .. ... ... ... ... ...
Perancangan Primer dengan Program Internet . .. ... ... ... ... ... .... .......
METODE PENELlTlAN
Tempat dan Waktu ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
Bahan dan Alat
Metode Pelaksanaan
Pemotongan DNA Genom Jati ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....
Ligasi Fragmen DNA dengan Adaptor ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........
Hibridisasi ... ... ... ... ... .. . .
... .
... ... .., ,,. ... ... .., ... ... ... .... .. .. . ............
Persiapan membran ... ....... ... ... ... ... ... ... ... ... .., ,.. ... ... .,,... ... ... .....
. . .
.
Proses h~brldlsas~
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Amplifikasi DNA elusi ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
Ligasi dengan Vektor Plasmid ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
Transformasi ..... . ...... ... ...... ... ... ...... ... ......... ... ... ...... ... .... .. ... ........ ...
Pembuatan sel kompeten E. Coli DH5-a ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ...
Transformasi ... ... ... .. . .... .. .. . ....,., .. .. . .,, ... ... .,.,..... ... .. . ... . .. ... ......
lsolasi Plasmid ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .,, ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
5
6
6
7
8
I0
I2
13
HASlL DAN PEMBAHASAN
Analisis Sekuensin
Perancangan Primer
Posisi adaptor ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... . .. .. . ... ... .
Motif mikrosatelit ... ... ... ...... .. . ... . .. .. . .. . ... . .. .. . ... ... ... ... .. . ...... ... ....
Desain primer ........ ...... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ...... ... ... ...
SIMPULAN DAN SARAN
... .. . .. . ... ... ... ,.. . .. . .. ... ...... ,.. ...... . .. ... ... ..
Simpulan ... ... . .. ... ... . .. .. . .....
Saran ... ... ... ... ... ... ... .. ......... . .. .... ... . .. . .. .. . .., , ., ... ... .. . .... ,. ... ...... ...... .
DAFTAR PUSTAKA ... . .. ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... .. .
DAFTAR TABEL
Halaman
Perbandingan biaya. waktu dan hasil dari rnetode isolasi rnikrosatelit
Kornposisi reaksi pernotongan DNA genorn .................................
Kornposisi reaksi ligasi DNA dengan adaptor ..............................
Komposisi reaksi PCR DNA terligasi adaptor ...............................
Kornposisi reaksi PCR DNA hasil elusi (enrichment) .....................
Kornposisi reaksi ligasi DNA ke dalarn vektor
GEM" .T Easy
........
Kornposisi reaksi pernotongan plasrnid dengan EcoRl ...................
Pengelompokan oligonukleotida berdasarkan Melting Temperature ..
Hasil skrining biru putih ................... . . .
Hasil skrining antibiotik
Hasil analisis primer3
............
........ .................
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Alur kerja pencarian motif mikrosatelit ........................................
Perpasangan adaptor 21-mer dan 25-mer ..................................
Hasil isolasi DNA genom jati
Pemotongan genom dengan enzim restriksi dan ligasi fragmen DNA
dengan adaptor Mlul
Pengkayaan kandidat-kandidat fragmen DNA bermotif ..................
Koloni biru-putih hasil transformasi ..............................................
Hasil isolasi plasrnid
Pemotongan DNA-Rekombinan dengan enzim restriksi EcoRl .......
Verifikasi fragmen sisipan dengan PCR ......................................
Urutan sekuen DNA sisipan hasil sekuensing .............................
Urutan nukleotida sample JBI-1 ...............................................
Hasil analisis primer3
Produk PCR primer mikrosatelit hasil desain ...............................
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Hasil sekuensing DNA sisipan jati (Charoen Pokphand) sarnpel J B I - I
..........................
........
.................................................
43
2. Output Primer3 ........................................................................
44
3.
4.
Hasil sekuensing DNA sisipan jati (Charoen Pokphand) sarnpel
JB361, JB362, JB363, JB391 dan JB392 ......................................
45
Hasil sekuensing DNA sisipan jati (Charoen Pokphand) Sarnpel JB5C
..............................................................................................
46
Latar Belakang
Jati (Tectona grandis Linn. f.) merupakan tanaman kayu penting secara
komersial dan dikenal luas sebagai bahan baku industri perkayuan yang
berkualitas. Di Indonesia, jati digolongkan sebagai kayu mewah yang termasuk
kelas kayu dengan kualitas dan nilai jual yang tinggi. Penggunaan kayu jati
sudah sangat populer dan masih merupakan pilihan &ma
karena keindahan
seratnya dan dikenal sebagai kayu yang tahan rayap serla jamur. Kebutuhan
kayu jati baik dalam negeri maupun luar negeri selalu meningkat sedangkan
populasi dan pasokannya semakin rnenipis yang disebabkan kendala siklus umur
panen jati konvensional yang relatif lama sekiir 45-60 tahun.
Dalam upaya mengantisipasi ha1 tersebut, saat ini telah dikembangkan
tanaman jati unggul yang berasal dari pohon induk terbaik setelah diseleksi dan
dipilih dari tanaman jati biasa yang mempunyai sifat-sifat "lebih" dari populasi jati
yang ada, kemudian diperbanyak dengan pembiakan vegetatii melalui teknik
"mikropropagasi atau kukur jaringan".
Tanaman induk ini berasal dari hasil
pemuliaan lokal (Indonesia) atau dari luar Indonesia, seperti Malaysia, Myanmar,
dan Thailand.
Bibi jati unggul hasil kuttur jaringan memiliki kecepatan pertumbuhan 3-4
kali dari pertumbuhan bibit jati asal biji, pertumbuhan pohon lebih seragam (>
80%). tingkat pertumbuhan per tahun lebih cepat (umur 2 tahun tinggi 4.75 m dan
diameter batang 7.54 cm; Eliyani 2004), bentuk batang lebih lurus dan silindris,
serta tingkat percabangan ringan. Dengan umur panen yang dapat dicapai 15-20
tahun maka pengembalian modal lebih cepat dengan kualitas kayu layak jual,
sehingga tanaman ini dapat dijadikan bidang investasi yang prospektif dimasa
yang akan datang. Beberapa "merk dagang" jati kultur jaringan yang beredar
dipasaran, yaitu : Jati Biotropika, Jati Emas, Jati Super, Jati Perhutani Plus
(JPP), Jati Prima, Jati Kencana dan Jati Unggul (Tini dan Amri 2002; PPA
Agricola 2003; Saefulloh 2003). Penggunaan bibit jati hasil kuktur jaringan untuk
budidaya telah dikembangkan di beberapa negara seperti India, Costa Rica,
Thailand, Myanmar, Malaysia, dan Indonesia (Tini dan Amri 2002; Rimbawanto
2000).
Saat ini di pasaran lokal banyak beredar bibi jati baik yang diperbanyak
dengan biji atau dengan teknik kulur jaringan, bentuk rnorfologi yang harnpir
sarna rnembuat kiia suli rnernbedakanjenis rnana yang rnerupakan bibi unggul.
Jati konvensional atau jati biasa adalah tanarnan jati yang dihasilkan dari bibi
asal biji (generatiif) yang rnerniliki laju perturnbuhan yang relatif larnbat dengan
tanarnan induk biasanya berasal dari hasil pemuliaan lokal.
Secara genetik sifat-sifat keunggulan jati kultur jaringan rnasih
dipertanyakan. Apakah keunggulan secara rnorfologi dapat dibuktikan secara
genetik? Untuk itu diperlukan suatu penanda rnolekuler yang dapat rnernbedakan
jenisjenis
jati
tersebut.
lnforrnasi tentang
penanda rnolekuler
dalarn
rnengidentiikasi perbedaan genetik tanarnan jati ini rnasih sangat terbatas.
Dalarn penelitian ini akan rnencoba rnengisolasi pustaka rnikrosateli dari dua
jenis jati yaitu : Jati BiotropikafJati Ernas (JB) dan Jati LokalIPerhutani (JL).
Perkembangan sejurnlah penanda rnolekuler (DNA marker) dewasa ini
telah memungkinkan untuk rnelakukan identiikasi terhadap perubahanperubahan genetik yang terjadi dalarn suatu persilangan serta hubungannya
dengan perubahan sifat kuantiiatii dan sifat kualitatif dari suatu klon
(tanarnanlhewan). Selain itu, penanda rnolekuler juga dapat digunakan untuk
rnernbedakan antara suatu ras (tanarnanlhewan) dengan yang lainnya terutarna
dalarn kaitannya dengan upaya pelestarian dan rnenjaga kernumian dari ras
tersebut (Philips dan Vasil2001).
Salah satu penanda rnolekuler (DNA marker) yang sangat populer
dewasa ini adalah rnikrosatelit. Mikrosateli rnerupakan sekuen DNA sederhana
pendek berulang, 1-6 pb berurulan mono-, di-, tri-, atau tetra- nukleotida berulang
dalarn bentuk kopi berdampingan (tandem), (CA1GT)n atau (TCG1AGCT)n
(Harnada ef a/. 1982; Taulz dan Renz 1984). lstilah rnikrosateli yang sering
digunakan oleh para peneliti antara lain : shod tandem repeat (STR) (Craig ef. a/.
1988) dan simple sequences repeats (SSRs) (Jacob et. a/. 1991).
Pernetaan genorn rnenggunakan ale1 rnikrosateli dapat rnengidentifikasi
krornosom yang rnengandung gen-gen spesifik yang berpengaruh terhadap
berbagai sifat kuantiiatif dan kualitatii tanarnanlhewan. Aplikasi rnikrosatelit
banyak digunakan pada analisis keragarnan genetik, pernetaan genetik, studi
evolusi, struktur populasi dan sistern perkawinan (Philips dan Vasil 2001;
Temnicykh et. a/. 2000; Ashley dan Dow 1994).
Pernanfaatan analisis rnikrosatelii untuk studi populasi alami dari tanarnan
tingkat tinggi belurn banyak diselidiki.
Studi awal pada tanarnan hias atau
tanaman budidaya rnembuktikan bahwa rnikrosatelii mempunyai marker
polimotfik yang berlirnpah untuk identiikasi atau pernetaan genom (Philips dan
Vasil 2001).
Penggunaan penanda mikrosatelii untuk analisis keragarnan
genetik dan analisis perubahan genetik dari suatu populasi tanaman telah
dilakukan pada : padi (Prasetiyono 2003; Song etal. 2003; Temnykh etal. 2000;
Chen ef a/. 1997). kedelai (Narvel et. a/. 2000), kelapa (Teulat, et. a/. 2000).
common bean (Yu ef. a/. 2000). Noway spruce (Swtti e t a/. 2002). Cannabis
saliva (Gilmore, S. 2003), pinus (Provan et. a/. 2001) dan legum (Provan e t a/.
2001).
Penelitian ini mencoba mengisolasi dan mengkarakterisasi penanda
rnikrosatelii yang dapat digunakan dalarn mengidentiFikasidan verifikasi asal-usul
dan keaslian sualu klon jati unggul terkait dengan penampakan sifat kuantiiatii
dan kualiiatif dari beberapa klon jati.
Penelitian pendahuluan, pembuatan pustaka rnikrosatelii telah dilakukan
baik pada klon jati unggul (jati emas) maupun pada klon jati lokal dan sampai
saat ini masih berlangsung (Duryadi ef. a/. 2004; Saefulloh 2004, data belurn
dipublikasi).
Tahapan keja untuk rnengisolasi mikrosatelit tanaman secara
urnum dimulai dengan pembuatan pustaka small-insert (200-600 pb), skrining
rnelalui hibridisasi, sekuensing, dan perancangan primer.
Metode yang digunakan dalam peneliian pendahuluan tersebut menurut
Zane e t a/. (2002) merupakan protokol konvensional. Lokus rnikrosateliidiisolasi
dari sebagian pustaka genom (diseleksi ukuran insert kecil), skrining ribuan klon
rnelalui hibridisasi koloni dengan probe yang mengandung repeat (Rasman eta/,
1991).
Meskipun relatii sederhana, khususnya untuk genom yang kaya
mikrosatelii, pendekatan ini dapat membutuhkan waktu yang lama, biaya tinggi
dan tidak efisien untuk spesies yang rnempunyai frekuensi mikrosatelii rendah.
Beberapa strategi alternatii telah diemukan untuk mengurangi waktu yang
diperlukan dalam isolasi rnikrosatelit dan secara nyata dapat meningkatkan hasil
(Zane et. a/. 2002).
Zane et a/. (2002) menjelaskan pengkayaan yang dilakukan sebelum
kloning dengan teknik PCR dapat meningkatkan keberhasilan dalam mengisolasi
rnikrosatelii. Edwards et a/. (1996) rnengatakan penggunaan teknik pengkayaan
(enrichment) kernungkinan rnendapatkan koloni rekornbinan yang disekuensing
rnengandung motif rnikrosatelii rnencapai 50-70% dengan waktu yang relatii
singkat, dan tidak rnernbutuhkan biaya tinggi dibandingkan pendekatan
konvensional.
Teknik enrichment yang dikernbangkan oleh Edwards et a/. (1996) telah
terbukti berhasil rnengisolasi rnikrosatelii pada tanarnan tropis asli Indonesia
seperti rnangga (Mulyani 2003) dan durian (Kristianti 2005) di Laboratonurn
Genetika Departernen Biologi Instiiut Teknologi Bandung. Dengan kin dari Dr.
Adi Pancoro (komunikasi pribadi) rnaka pada peneliiian ini akan rnenerapkan
teknik yang telah dikembangkan dan diadaptasikan pada kondisi Indonesia yang
berprospek berhasil baik dan cepat.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1) untuk rnengisolasi dan rnengkarakterisasi rnotii rnikrosatelii pada tanaman jati
(Tectona grandis).
2) rnendapatkan primer-primer spesifik rnikrosatelii yang dapat digunakan untuk
rnengkarakterisasi keragarnan genelik jati.
Jati
Tanaman jati (Tectona grandis
Linn. f.) termasuk anggota famili
Verbenaceae dan genus Tectona yang dibagi ke dalam tiia spesies. Genus
Tectona mencakup spesies Tectona grandis Linn. f. yang dikenal di lndonesia
dan dua spesies lain, yaitu T. hamiltoniana Wall. yang tumbuh di daerah kering
Myanmar dan T. philippinensis Benth B1 Hooker yang tumbuh di hutan Batangas
dan Mindoro (Pulau [ling), Filipina. Dalam sistem taksonomi dan tatanama,
klasifikasitanaman jati menurut ahli botani adalah sebagai berikut :
Divisi
: Spermatophyta
Kelas
: Angiospermae
Sub kelas
: Dicotyledoneae
Ordo
: Verbenales
Famili
: Verbenaceae
Genus
: Tedona
Spesies
: Teetonagrandis Linn. f.
Areal penyebaran alami tanaman jati terdapat di India, Myanmar,
Thailand dan bagian baral Laos. Batas utara pada garis 25"LU di Myanmar,
batas selatan pada garis 9"LU di India. Jati tersebar pada garis 70"-100" BT.
Jati bukan tanaman asli Indonesia telapi sudah tumbuh sejak beberapa abad
yang lalu di P. Kangean, Muna, Sumbawa dan Jawa (Rachrnawati ef. a/. 2002;
Sumama 2001).
Di Indonesia, jati digolongkan sebagai kayu mewah termasuk kelas kayu
dengan kualitas dan nilai jual yang tinggi.
Kayu ini tahan rayap serta jamur
dengan angka kembang susut yang kecil.
Salah satu kayu serbaguna,
digunakan untuk konstruksi ringan dan berat, bahan bangunan rumah, kayu
pertukangan, ukiran dan lain-lain. Penggunaan kayu jati sudah sangat populer
dan masih merupakan pilihan utama karena keindahan seratnya.
Secara historis, nama Tectona berasal dari bahasa Portugis (teMon)
artinya tumbuhan yang memiliki kualitas tinggi. Di India, tanaman jati memiliki
banyak nama daerah seperti : ching-jagu (di wilayah Asam); saigun, segun
(Bengali); tekku (Bombay); kyun (Burma); saga, sagach (Gujarat); sagun,
sagwan (Hindi); jadi, saguan, tega, fiayagadamara (Kannad); sag, saga, sgwan
(Manthi); singutu (Oriya); bardaru, bhumisah, dwardaru, kaharachchad, saka
(Sangskrit);
fekkumaran,
tekku
(Tamil);
dan
adaviteeku,
peddafekku,
feekuchekka (Telugu). Dalam bahasa Jerman jati dikenal dengan nama Teck,
Teakbaun, atau Java Teak, Teak (Inggris), Lyiu (Burma), Mai Sak (Thailand),
Teck (Perancis), dan di Spanyol disebut Teca (Rachmawati ef. a/., 2002;
Sumarna. 2001).
Jati Unggul
Jati unggul merupakanjati yang memiliki sifat-sifat unggul yang dihasilkan
dari pembiakan vegetatii melalui teknik mikropropagasi (kultur jaringan) dan
memiliki laju pertumbuhan yang cepat (fast growing). Jati konvensional atau jati
biasa adalah tanaman jati yang dihasilkan dari bibi asal biji (generaw yang
memiliki laju pertumbuhan yang relatii larnbat. Tanaman induk yang diklon untuk
menghasilkan jati unggul merupakan tanaman jati terbaik setelah diseleksi dan
dipilih dari tanaman jati biasa yang mempunyai sifat-sifat "lebih" dari populasi jati
yang ada. Tanaman induk ini berasal dari jati hasil budidaya lokal (Indonesia)
atau jati hasil budidaya di luar Indonesia, seperti Malaysia, Myanmar, dan
Thailand (Tini dan Amri 2002; PPA Agricola 2003; Saefulloh 2003).
Bibit jati hasil kultur jaringan memiliki kecepatan pertumbuhan 5-4 kali
dari pertumbuhan bibit jati asal biji, pertumbuhan pohon lebih seragam (> 80 %),
tinggi perlumbuhan per tahun lebih cepat (umur 2 tahun tinggi 4.75 m dan
diameter batang 7.54 cm; Eliyani 2004), bentuk batang lebih lurus dan silindris,
serta tingkat percabangan ringan.
Dengan umur panen 15-20 tahun
pengembalian modal lebih cepat dengan kualitas kayu layak jual. Bibit jati hasil
teknologi kultur jaringan dapat lersedia dalam jumlah besar (ratusan ribu hingga
jutaan bib6 per tahun) sehingga tanaman ini dapat dijadikan salah satu bidang
investasi yang prospektii di masa yang akan datang. Saaf ini, di Indonesia telah
beredar trade mark jati unggul seperti Jati Biotropika, Jati Emas, Jati Super, Jati
Plus, Jati Prima, dan Jati Unggul (Tini dan Amri 2002; Saefulloh 2003). Jenis jati
unggul yang digunakan dalam peneliian ini adalah Jati Biotropika (Jati Emas).
Penanda DNA (DIVA markerJ
Materi genetik (DNA) yang dijumpai dalam semua organisme sebagian
besar belum diketahui fungsinya, hanya sebagian kecil (10% dari total DNA
genom) yang diketahui beriungsi sebagai penyandi genetik yang menentukan
karakteristik keturunan yang disebut gen. Segmen DNA (selain gen) ini dapat
diidentiikasi, dikarakterisasi, dan dlentukan posisinya di dalam genom.
Segmen-segmen ini kemudian diketahui ada yang khas dalam suatu individu,
jumlahnya sangat berlimpah, dan memiliki polimorfisme yang sangat tinggi
sehingga dapat digunakan sebagai penciri DNA (DNA marker) dalam analisis
genom (Philips dan Vasil 2001).
Dalam banyak kasus, marker DNA sangat membantu dalam menentukan
posisi gen karena marker DNA ini sering terletak pada kromosom yang sama dan
berdekatan dengan gen. Dengan demikian, semakin banyak marker DNA yang
diketahui posisinya pada kromosom, maka semakin banyak pula kemungkinan
untuk mengetahui posisi gen. Marker DNA juga sangat bermanfaat dalarn studi
kekerabatan genetik dan evolusi serta aplikasi lainnya. Kenyataan ini membuat
marker DNA ini menjadi sangat menentukan dalam perkembangan teknologi
rekayasa DNA terutama dalam rangka pembuatan peta genetik (Philips dan Vasil
2001).
Mikrosalell
Salah satu penanda molekuler (DNA marker) yang sangat populer
dewasa ini adalah mikrosatelii. Mikrosatelit merupakan sekuen DNA sederhana
pendek berulang, 1-6 pasang basa (pb) berunitan mono-, di-, tri-, atau tetranukleotida berulang dalam bentuk kopi berdampingan (tandem), (CA/GT)n atau
(TCG1AGCT)n secara umum terdiri dari sekiiar 20-30 pb untai p l y GT, poly A
dan poly GA (Hamada et al. 1982; Tautz and Renz 1984). lstilah mikrosatelii
yang sering digunakan oleh para penelii antara lain : short tandem repeat (STR)
(Craig et. a/. 1988); dan simple sequences repeats (SSRs) (Jacob ef. al. 1991).
Mikrosatelit tersebar secara acak sepanjang genom inti pada individu
tingkat tinggi (Hamada ef. al. 1982; Tautz dan Renz 1984; dan Tautz e t a/.
1986). Sekuen ini mempuyai tingkat polimorfik yang tinggi terhadap keragaman
dalam jumlah ulangan, dengan panjang