Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat penghasil bakteriosin dari fermentasi susu jagung
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL BAKTERIOSIN DARI FERMENTASI SUSU
JAGUNG
LISMAYANA HANSUR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Asam Laktat Penghasil Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Lismayana Hansur
NIM G351110021
RINGKASAN
LISMAYANA HANSUR Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Penghasil Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung. Dibimbing oleh IMAN
RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Susu jagung merupakan diversifikasi olahan jagung yang dijumpai pada
masyarakat sebagai sumber nutrisi pilihan selain makanan pokok, namun karena
masih diproduksi secara tradisional sehingga daya tahan produk masih rendah.
Pemanfaatan pengawet kimia dapat digunakan untuk menjaga kontaminasi bakteri
pembusuk tetapi pengawet tersebut sangat berbahaya bagi manusia. Penelitian ini
bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi isolat BAL penghasil
antimikrob dari fermentasi jagung yang dapat memberi produk terbaik pada susu
jagung fermentasi.
Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan dari fermentasi jagung secara
spontan dengan 3 perlakuan dan 2 ulangan. Perlakuan pertama yaitu tabung
dibuka dan tidak dipanaskan (JMB), tabung ditutup dan tidak dipanaskan (JMT)
serta tabung ditutup dan dipanaskan (JMA). Penapisan BAL penghasil aroma
terbaik dilakukan menggunakan uji organoleptik. BAL yang terpilih adalah BAL
yang secara karakteristik organoleptik yang unggul dan juga mampu
mempertahankan aroma setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 40C. Penapisan
antimikrob dilakukan dengan metode antagonisme langsung dengan stab
inokulasi menggunakan galur indikator yaitu Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli. BAL hasil penapisan dari uji organoleptik dan penghasil
senyawa antimikrob di amati fase pertumbuhannya. Bakteri yang menghasilkan
zona bening selanjutnya diuji menggunakan metode difusi sumur agar.
Keberterimaan konsumen terhadap inokulasi BAL diukur menggunakan nilai
hedonik dan dianalisis berdasarkan Fredman tes. Bakteri terpilih selanjutnya di
identifikasi berdasarkan 16S rRNA.
Isolat sebanyak 33 diperoleh dari perlakuan pertama, kedua, dan perlakuan
ketiga menghasilkan 22, 7, 4 isolat secara berturut-turut. BAL yang terpilih
merupakan bakteri dengan zona bening terluas yaitu Lactobacillus JMB 9,
Lactobacillus JMB 13 dan Lactobacillus JMT 6. Lactobacillus JMB 4 dan
Lactobacillus JMB 6 sebagai kandidat BAL yang dapat memberikan aroma
terbaik. Penapisan menggunakan metode antagonis langsung diperoleh 13 isolat
yang menghasilkan daya hambat pada mikroba uji Sthapylococcus aureus dan
E.coli. Selanjutnya, 13 isolat tersebut diuji antagonis metode sumur agar pada
perlakuan pH 4 dan pH 6 menggunakan mikroba uji Sthapylococcus aureus dan
diperoleh isolat BAL JMB 6 yang diduga memiliki kemampuan penghasil
bakteriosin. Pengujian bakteriosin selanjutnya dilakukan dengan menambahkan
enzim protease pada supernatan isolat Lactobacillus JMB 6. Penambahan protease
menyebabkan terhambatnya aktivitas bakteriosin. Sehingga substansi antimikrob
yang dihasilkan oleh Lactobacillus JMB 6 diduga ialah bakteriosin. Aplikasi
bakteriosin dan perlakuan inokulasi bakteri terpilih pada susu jagung
menunjukkan bahwa semua perlakuan memiliki kemampuan mempertahankan
aroma. Hasil identifikasi bakteri terpilih JMB 4 menunjukkan kesamaan 97%
dengan Lactobacillus plantarum.
Kata kunci: Lactic acid bacteria (LAB), sweet corn, fermented milk, bacteriocin
SUMMARY
LISMAYANA HANSUR. Isolation and Characterization Lactid Acid Bacteria
Producing Bacteriocins from Corn Fermented Milk. Supervised by IMAN
RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Corn milk is one of diversification product in the society as a nutrition
source selection than staple food. Corn milk is low durability due to
contamination spoilage bacteria. The use of chemical preservatives can be used to
keep the spoilage bacteria contamination but these preservatives are very harmfull
to humans. The research study purpose is isolation and identification of lactid acid
bacteria producing bacteriocin from fermented corn for biopreservatives on corn
milk.
Isolation of lactid acid bacteria (LAB) from fermented corn was done
spontaneously with 3 treatments and 2 replications. The first treatment of the tube
was opened and not heated (JMB), the tube was closed and not heated (JMT) and
the tube was closed and heated (JMA). Screening LAB performed was used the
best flavour as a organoleptic test. The selected LAB as the best organoleptic
characteristics, also able to maintain the flavor after 6 months of storage at 40C of
temperature. The bacteria was found will be selected by direct antagonism method
with stab inoculation againts indicator bacteria strain Staphylococcus aureus and
Escherichia coli. The bacteria that produced a clear zone was chosen to next
selection by using well diffusion method. The LAB screening results of
organoleptic tests and producing antimicrobial compounds then observed of
growth phase. The 13 isolates were tested by using well diffusion methods which
used S. aureus as microbial test in pH 4, pH 6 after that protease treatments.
Consumer acceptance of the BAL inoculation were measured and analyzed using
hedonic value based Fredman test. The chosen bacteria was identification by 16S
rRNA.
Total of 33 isolates were obtained. The first until third treatment obtained
22, 7, and 5 isolates respectively. The selected LAB is a bacteria by the widest
clear zone is Lactobacillus JMB 9, Lactobacillus JMB 13 dan Lactobacillus JMT
6. Lactobacillus JMB 4 and Lactobacillus JMB 6 as BAL candidate who can give
the best flavor. Direct antagonist screening method obtained 13 isolates that
produce inhibitory effects on Sthapylococcus aureus and E.coli. Based on the
screening results obtained Lactobacillus JMB 6 has the ability to produce
inhibition in pH 6. The addition of protease make a disturb of bacteriocins
activity. The antimicrobial substance produced by Lactobacillus JMB 6 can be
concluded as a bacteriocins. The addition of bacteriocins treatment and
inoculation of lactic acid bacteria showed preference value not significantly
different scents. Bacteriocins added and bacterial selected inoculation on corn
milk showed that all treatments have the ability to retain flavor. Identification
bacterial based on 16 sRNA was showed 97% similarity LAB JMB 4 with
Lactobacillus plantarum.
Keywords : Lactic acid bacteria (LAB), sweet corn, fermented milk, bacteriocin
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL BAKTERIOSIN DARI FERMENTASI SUSU
JAGUNG
LISMAYANA HANSUR
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, MSi
Judul Tesis : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Penghasil
Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung
Nama
: Lismayana Hansur
NIM
: G351110021
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Iman Rusmana, MS
Ketua
Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Anja Meryandini, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
21 November 2013
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Syukur alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, karena
dengan rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian yang dilanjutkan dengan
penyusunan dan penulisan tesis dengan judul ” Isolasi dan Karakterisasi Bakteri
Asam Laktat Penghasil Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung” dapat
terselesaikan. Tesis ini disusun dalam rangka penyelesaian studi Program
Magister (S2) pada Program Studi Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (MIPA), Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini merupakan sebuah upaya untuk mencari alternatif pemanfaatan hasil
pertanian yang dapat dinikmati secara langsung serta mencari alternatif pengawet
alami dari bakteri asam laktat.
Ucapan terima kasih dengan penuh hormat saya sampaikan kepada Bapak
Dr. Ir. Iman Rusmana, MSi, Pembimbing Akademik dan ketua komisi
pembimbing, juga sebagai Ketua Departemen Biologi, Fakultas MIPA IPB, yang
selalu bersedia untuk berdiskusi, memberikan nasihat dan solusi pada setiap
masalah yang dihadapi penulis, tidak hanya menjadi pembimbing tetapi juga
menjadi pembimbing psikologi yang telah menjaga semangat penulis selama di
IPB. Sebagai anggota komisi pembimbing, Ibu Dr Nisa Rachmaia Mubarik, MSi
yang selain sebagai pembimbing juga menjadi seorang motivator selama
penelitian dan penulisan tesis yang tidak pernah bosan menampung keluh kesah,
mengarahkan walau sering terjadi kesalahan dan kecerobohan pribadi penulis,
serta selalu memberikan semangat kepada penulis. Terima kasih saya haturkan
kepada Bapak dan Ibu pembimbing yang telah menyediakan waktu, energi dan
upaya serta telah mau memahami kekurangan penulis.
Kepada yang terhormat Ibu Dr Gayuh Rahayu, MSi dan Ibu Prof Dr
Anja Meryandini, MSi sebagai Ketua Prodi Mikrobiologi yang senantiasa
menyemangati penulis, terimakasih atas segala kesediaan waktu dan masukan
yang telah diberikan. Selanjutnya kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Departemen Pendidikan Nasional, terimakasih atas beasiswa yang telah diberikan.
Penulis juga ucapkan terimakasih kepada Rektor Institut Pertanian Bogor beserta
seluruh civitas akademika atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk
mengikuti pendidikan S2 di IPB.
Ucapan terimakasih dengan tulus juga penulis sampaikan untuk seluruh
civitas akademika Program Studi Mikrobiologi, Kepada Pak Edjen yang telah
banyak membantu. Kepada keluarga kecil Mikrotropisian (WES, TH, IH, ES,
KSN, AU, IPP, RWP, NN, ER, mba 3, FS ) serta rekan-rekan lain yang telah
berpartisipasi dan mendukung penulis baik selama mengikuti studi maupun dalam
penelitian, diucapkan terimakasih atas segala perhatian dan bantuan yang telah
diberikan.
Kepada Ayahanda Hansur Sutte dan Ibunda Astika tercinta yang selalu
mendo’akan penulis, kepada kakak Akil, Asnita, dan adik Irmayanti serta seluruh
keluarga, dengan tulus dan penuh rasa hormat saya ucapkan terimakasih atas
segala dukungan yang diberikan. Kepada Tim squad, penulis haturkan terimakasih
atas bantuan, motivasi, kesabaran dalam bingkai kekeluargaan yang telah terjalin.
Untuk semua pihak yang telah membantu penulis, semoga Allah SWT
memberikan balasan dengan amalan dunia dan akhirat serta selalu menjaga kita
dalam lindungan-Nya. Akhir kata, semoga tesis yang disusun ini menjadi berguna
bagi penulis, masyarakat dan bangsa. Penulis selalu menantikan saran dan kritik
yang bertujuan untuk lebih memperbaiki tesis ini.
Bogor, Juli 2013
Lismayana Hansur
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
i
1
2
2
2 METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Kerja
2
Fermentasi spontan
3
Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat
3
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik
dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
3
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
4
Kurva Pertumbuhan BAL terpilih
5
Fermentasi Susu Jagung Menggunakan Isolat Terpilih dan Uji Organoleptik 5
Analisis Data
5
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S rRNA
6
3 HASIL
7
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Jagung Fermentasi
7
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik
Organoleptik dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
9
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
11
Fase Turbidimetrik Bakteri Asam Laktat Terpilih
13
Uji Organoleptik Susu Fermentasi Jagung Menggunakan
Inokulum Bakteri Asam Laktat Terpilih
13
Karakterisasi Senyawa Antimikrob Lactobacillus JMB 6
14
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S rRNA 14
4 PEMBAHASAN
145
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
19
19
19
DAFTAR PUSTAKA
19
LAMPIRAN
23
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Jumlah isolat bakteri dan khamir hasil isolasi dari susu jagung
fermentasi secara spontan
Karakteristik morfologi BAL hasil isolasi
Hasil
mutu organoleptik susu fermentasi jagung berdasarkan
karakteristik warna, kekentalan dan aroma
Aktivitas antimikrob isolat pada S.aureus dan E.coli melalui uji
antagonisme
Indeks penghambatan supernatan kultur BAL terhadap bakteri
Staphylococcus aureus
Nilai rataan uji mutu penerimaan konsumen terhadap aroma susu
jagung fermentasi setelah masa simpan 5-6 hari
Hasil BLAST-N gen sequen 16 S rRNA dari isolat JMB 4
7
8
10
12
13
15
18
DAFTAR GAMBAR
1 Rata-rata mutu organoleptik berdasarkan karakteristik aroma setelah
penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC.
2 Kurva turbiditas pertumbuhan BAL terpilih
3 Kurva pertumbuhan isolat JMB 6
4 Pengujian antimikrob supernatan pH 4 (A), PH 6 (B) penambahan
enzim protease (C)
5 Hasil amplifikasi gen 16s RNA isolat JMB 4
6 Pohon filogenetik isolat JMB 4 menggunakan piranti lunak MEGA 5.0
10
13
15
16
16
17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Rata-rata mutu organoleptik berdasarkan karakteristik aroma setelah
penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC
2 Rata-rata mutu organoleptik hasil inokulasi BAL susu jagung
fermentasi berdasarkan karakteristik organoleptik (warna, kekentalan
dan aroma)
3 Standar error (SE) rata-rata diameter zona hambat isolat
4 Jumlah Log BAL pada fase pertumbuhan
22
23
24
25
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Keanekaragaman sumber daya alam hayati Indonesia berupa hasil
pertanian dapat digunakan sebagai sumber pangan, salah satunya ialah jagung.
Susu jagung merupakan salah satu diversifikasi produk olahan jagung yang
dijumpai di masyarakat sebagai sumber nutrisi pilihan selain makanan pokok.
Susu jagung masih diproduksi secara tradisional di Sulawesi Selatan sehingga
daya tahan produk masih rendah yang berdampak pada rendahnya keberadaan
produk tersebut di pasaran. Susu jagung memiliki nutrisi yang baik bagi tubuh,
karena memiliki kandungan vitamin yang tinggi (Supavititpatana et al. 2008).
Susu jagung adalah produk olahan jagung yang juga dapat mengalami
kerusakan yang diakibatkan kontaminasi mikroba perusak makanan. Kandungan
nutrisi pada pangan menjadi tempat berkembang biak bagi mikroorganisme.
Menurut Jos dan Veld (1996) pembusukan makanan dapat disebabkan oleh
berbagai reaksi yang dipengaruhi faktor fisik, kimia, dan enzim yang dihasilkan
mikroorganisme akibat kontaminasi selama proses produksi (manufacturing).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka diperlukan suatu bahan pengawet yang
berfungsi untuk menghindari kerusakan akibat mikroorganisme sehingga tidak
menimbulkan bahaya bagi kesehatan konsumen. Preservasi merupakan cara untuk
mengawetkan produk pangan hewani maupun nabati sehingga terhindar dari
pembusukan akibat cemaran oleh mikrob (Suardana et al. 2007).
Cara yang digunakan untuk menghindari kontaminasi yaitu penggunaan
bahan kimia sebagai bahan pengawet. Pemanfaatan bahan kimia selain
menyebabkan masalah kesehatan ketika dikonsumsi dalam jangka panjang juga
dapat menyebabkan perubahan warna dan bau pada makanan. Bahan yang kini
dikembangkan untuk preservasi yaitu bakteriosin. Bakteriosin digunakan karena
merupakan bahan pengawet alami yang aman, berasal dari mikroorganisme yaitu
bakteri asam laktat (BAL).
Bakteriosin merupakan zat antimikrob yang dihasilkan oleh BAL dan
bekerja menghambat bakteri lain termasuk bakteri patogen (Razak et al. 2009).
Bakteri asam laktat yaitu Lactobacillus sp. telah umum digunakan sebagai
biopreservasi pada bahan pangan karena tidak adanya residu yang dapat
menimbulkan efek negatif. Lactobacillus sp. merupakan salah satu bakteri pada
bahan pangan dengan hampir 140 spesies yang sebagian besar digunakan pada
industri makanan. Bakteri ini merupakan flora alami dari berbagai produk
makanan seperti susu mentah, produk susu fermentasi, buah-buahan, sayuran, dan
produk daging. Lactobacillus sp. juga berfungsi sebagai starter untuk sejumlah
produk makanan fermentasi baik untuk meningkatkan kualitas ataupun untuk
manfaat kesehatan (Singh et al. 2009).
Trias et al. (2008) telah berhasil mengisolasi BAL yang terdapat pada buah
apel segar dan memiliki potensi daya hambat terhadap bakteri perusak bahan
pangan. Kemampuan penghambatan tersebut disebabkan kemampuan BAL
menghasilkan asam organik atau bakteriosin yang memiliki aktivitas antimikrob.
Selain itu Sankar et al. (2012) berhasil mengkarakterisasi bakteriosin dari isolat
Lactobacillus plantarum yang mempunyai kemampuan untuk menghambat
2
mikroorganisme patogen pada bahan pangan dan juga memiliki kemampuan
probiotik untuk kesehatan konsumen.
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka perlu dilakukan seleksi yaitu
mencari beberapa isolat baru dengan aktivitas antimikrob yang lebih baik. Usaha
ini diharapkan menjadi alternatif biopreservasi pada susu jagung yang
memanfaatkan sumber isolat dari jagung. Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi isolat bakteri asam laktat penghasil bakteriosin dari fermentasi
jagung sebagai biopreservasi pada susu jagung fermentasi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi isolat
BAL penghasil antimikrob dari fermentasi jagung yang dapat memberi produk
terbaik pada susu jagung fermentasi.
Manfaat Penelitian
Isolat bakteri asam laktat penghasil antimikrob dari fermentasi jagung
yang berhasil diisolasi dapat dimanfaatkan sebagai biopreservasi pada susu jagung
fermentasi.
2 METODE
Bahan
Bahan yang akan digunakan ialah jagung Sweetcorn (Zea mays
saccharata) E.coli dan S. aureus sebagai bakteri indikator antimikrob yang
merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA IPB.
Alat
Alat yang digunakan antara lain: blender, swab steril, cawan Petri, tabung
reaksi dan penutup, rak tabung, pipet, gelas piala, bunsen, erlenmeyer, gelas ukur,
tube shaker, batang ose, pinset steril, timbangan, inkubator, sentrifuge, autoklaf,
spreader glass, stearer, pH meter, refrigerator, mikroskop, coloni counter, serta
alat-alat pendukung lainnya.
Prosedur Kerja
Penelitian ini dibagi menjadi 5 tahap, yaitu; (1) isolasi dan identifikasi
bakteri asam laktat dari jagung fermentasi, (2) penapisan BAL berdasarkan
karakteristik organoleptik, (3) seleksi BAL melalui uji antagonis dengan bakteri
patogen, (4) uji organoleptik susu jagung dengan perlakuan penambahan
3
supernatan bakteriosin, dibandingkan dengan organoleptik susu fermentasi
jagung yang diinokulasi oleh isolat terbaik (5) isolasi DNA, amplifikasi DNA,
Blast-N dan pembuatan pohon filogenetik BAL.
Fermentasi Spontan
Jagung sweetcorn dipipil dari tongkolnya dicuci dan dibersihkan dengan
air mengalir. Biji jagung yang telah dibersihkan selanjutnya dimasukkan ke dalam
tabung dan dihancurkan menggunakan batang pengaduk. Selanjutnya
ditambahkan aquades steril dengan perbandingan 1:5. Setelah itu dilakukan
fermentasi selama 24 jam. Proses isolasi BAL dilakukan dengan 3 perlakuan dan
2 ulangan. Perlakuan pertama yaitu tabung dibuka dan tidak dipanaskan (JMB),
tabung ditutup dan tidak dipanaskan (JMT) serta tabung ditutup dan dipanaskan
pada suhu 60oC selama 15 menit (JMA).
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan dari fermentasi jagung secara
spontan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Sebanyak 100 gram sampel cairan
fermentasi diambil, diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis. Bakteri
ditumbuhkan dalam media MRS (de Mann Rogosa Sharpe) agar, selanjutnya
diinkubasi dengan suhu 37oC selama 2 hari. Koloni yang tumbuh diisolasi dan
selanjutnya diseleksi. Koloni yang berbeda kemudian digores pada media untuk
diuji pewarnaan Gram, endospora dan uji katalase. Lama inkubasi, morfologi
bakteri dan koloni diamati. Karakterisasi isolat diidentifikasi taraf genus sesuai
petunjuk Kandler dan Weiss (1995) dalam Bergey's Manual Systematic
Bacteriology.
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik
dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
Sampel penelitian adalah susu jagung, diperoleh dari proses ekstraksi biji
jagung yang dipanaskan dengan suhu 600C selama 15 menit. Susu jagung
kemudian di sterilisasi. Setelah susu jagung dingin, BAL hasil isolasi,
diinokulasikan pada tabung-tabung yang berisi susu jagung steril. Susu jagung
diinkubasi selama 48 jam dan diamati karakteristik organoleptik (warna, aroma,
kekentalan) dan selanjutnya disimpan pada suhu 40C selama 6 bulan.
Pengujian organoleptik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,
panelis yang dipilih yaitu panelis semi terlatih (semi-trained panel) yaitu
mahasiswa di Laboratorium Mikrobiologi. Uji organoleptik setelah fermentasi 48
jam menggunakan panelis perseorangan. Penilaian organoleptik dilakukan dengan
menggunakan uji mutu hedonik. Data penilaian uji mutu hedonik dapat
ditransformasi dalam skala numerik dan selanjutnya dirata-ratakan untuk
interpretasinya.
Penilaian organoleptik untuk penapisan BAL yang dapat memberikan
karakteristik organoleptik (aroma, kekentalan dan warna). Besar skala uji untuk
setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL yaitu rentang 1 hingga 7,
4
terjemahan nilai mutu karakteristik warna hasil fermentasi jagung menggunakan
isolat terpilih yaitu: sangat kuning (7), kuning (6), agak kuning (5), kuning
memudar (4), kuning pucat (3), kuning agak keputih-putihan (2), bening (1) .
Berdasarkan karakteristik kekentalan dengan skor 7-1 : amat sangat kental (7),
sangat kental (6), kental (5), agak kental (4), agak tidak kental (3), tidak kental (2),
encer (1). Berdasarkan karakteristik aroma : khas yoghurt (7), agak khas yoghurt
(6), khas jagung (5), asam (4), agak asam (3), sangat asarn (2), alkohol (1).
Kemampuan BAL mempertahankan aroma selama penyimpanan yang
berhubungan dengan perubahan yang dipengaruhi oleh BAL. Pengujian
organoleptik setelah 6 bulan penyimpanan menggunakan panelis terbatas (3-5
orang) (Setyaningsih et al. 2010). Karakteristik organoleptik bakteri hasil isolasi
dengan batasan: warna 1 hingga 7, besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik
pada perlakuan aplikasi BAL yaitu rentang 1 hingga 7. Terjemahan nilai mutu
hedonik tersebut yaitu; 1 (sangat tidak suka), 2 (tidak suka), 3 (agak tidak suka), 4
(agak suka), 5 (suka), 6 (sangat suka) dan 7 (amat sangat suka).
Penilaian organoleptik menggunakan uji mutu organoleptik, untuk
menentukan tingkat kesukaan panelis terhadap hasil fermentasi. BAL yang terpilih
adalah BAL yang secara karakteristik organoleptik yang unggul dan juga mampu
mempertahankan aroma setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC.
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
Metode Antagonis Langsung
Metode yang digunakan ialah antagonisme langsung dengan stab inokulasi
menggunakan galur indikator (Usmiati dan Marwati 2009). Galur indikator yang
digunakan yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Uji ini dilakukan
pada media semipadat dengan metode agar-agar tuang. Sebelum media dituang,
bakteri indikator dicampurkan pada media semipadat kondisi suam kuku (40oC).
Setelah dituang bakteri uji diambil dan ditimpakan pada permukaan media agaragar yang telah mulai memadat. Setelah itu di atas koloni bakteri yang akan diuji
disentuhkan jarum ose, selanjutnya diletakkan diatas permukaan galur indikator
yang telah dituang bersama media sebelumnya dengan sedikit masuk ke dalam
media. Biakan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Adanya senyawa
antimikrob yang dihasilkan oleh bakteri ditandai dengan zona terang di sekitar
isolat. Isolat yang menghasilkan zona hambatan terluas (diukur dalam satuan mm)
dipakai sebagai bakteri penghasil substansi antimikrob pada uji selanjutnya
(Suardana et al. 2007).
Produksi Bakteriosin
Produksi bakteriosin menggunakan erlenmeyer 100 ml. Kultur diinokulasi
0,1 ml pada media MRS cair pada optical density (OD) tertentu. Inkubasi
dilakukan sampai masa eksponensial pada suhu ruang. Selanjutnya kultur hasil
produksi yang diperoleh disentrifugasi 12.000 rpm, dengan suhu 4°C selama 15
menit sehingga menghasilkan supernatan. Supernatan dinaikkan sampai pH 6
menggunakan NaOH untuk menghilangkan pengaruh asam yang dihasilkan. Asam
laktat yang dihasilkan oleh BAL tidak menghambat pada pH 6 (Desniar et al.
2012). Tahap penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan bakteriosin yang
5
merupakan protein yang memiliki aktivitas paling tinggi terhadap bakteri
indikator. Selanjutnya, supernatan netral diuji aktivitasnya dengan metode sumur
agar-agar.
Metode Difusi Sumur Agar-Agar
Inokulum bakteri indikator (bakteri uji) masing-masing dimasukkan ke
dalam medium agar-agar lunak yaitu media natrium (NA) cair. Media sebanyak
240 ml yang mengandung agar-agar 1.2% dituang secara aseptis ke dalam cawan
Petri dan dibiarkan membeku, kemudian dituang ke cawan Petri. Sumur-sumur
dibuat untuk pengujian pada media yang memadat. Supernatan antimikrob
dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 40 μl, lalu diinkubasikan pada suhu kamar
selama 24 jam. Zona hambatan yang terbentuk diukur.
Kurva Pertumbuhan BAL Terpilih
Sebanyak 0.1 ml dari kultur cair dan kultur agar-agar miring segar ditanam
dalam MRS cair dan diinkubasi pada suhu ruang. Pertumbuhan bakteri diikuti
setiap 3 jam dengan mengamati nilai kerapatan optik atau optical density (OD)
dari starter pada media MRS dengan metode turbidimetrik dengan panjang
gelombang 600 nm. Tahap ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan
dan fase pertumbuhan bakteri terbaik hasil uji antagonis langsung. Kurva
pertumbuhan bakteri dilakukan sampai mencapai fase kematian. Hal ini
dimaksudkan untuk mengetahui fase-fase kehidupan bakteri yang berguna untuk
menentukan waktu generasi bakteri, khususnya fase eksponensial yang erat
hubungannya dengan sekresi substansi antimikrob.
Kultur bakteri diambil untuk mengetahui jumlah BAL pada kerapatan
optik yang akan diukur. Kerapatan optik diukur selanjutnya diencerkan 1:1, 1:2,
1:4, 1:8, 1:16. Kultur cair di ambil sebanyak 1 ml dan diencerkan sampai
pengenceran 10-8, selanjutnya disebar pada media MRS agar-agar. Bakteri hasil
plating digunakan sebagai dasar penentuan kurva standar.
Fermentasi Susu Jagung Menggunakan Isolat Terpilih dan Uji Organoleptik
Sampel penelitian adalah susu jagung, diperoleh dari proses ekstraksi biji
jagung yang dipanaskan dengan suhu 600C selama 15 menit. Susu jagung
kemudian di sterilisasi. Uji organoleptik dengan 2 perlakuan yaitu: penambahan
supernatan (bakteriosin ekstrak kasar) bakteri dan susu jagung fermentasi yang
diinokulasikan bakteri terpilih. Kedua perlakuan tersebut akan dibandingkan
dengan susu jagung tanpa inokulan sebagai pembanding.
Pengujian organoleptik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi. Panelis
yang dipilih yaitu panelis semi terlatih (semi-trained panel) yaitu mahasiswa di
Laboratorium Mikrobiologi. Sebelum melakukan penilaian, panelis diberi
penjelasan secukupnya mengenai uji organoleptik yang dilakukan. Panelis yang
digunakan yaitu sebanyak 15 – 25 orang.
Penilaian organoleptik dilakukan dengan menggunakan uji mutu hedonik.
Pada uji mutu hedonik data penilaian dapat ditransformasi dalam skala numerik
dan selanjutnya dapat dianalisis statistik untuk interpretasinya (Setyaningsih et al.
2010). Besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL
6
yaitu rentang 1-7. Penilaian organoleptik ditujukan untuk menilai perubahan
aroma selama penyimpanan yang berhubungan dengan sifat biopreservasi yang
dipengaruhi oleh BAL.
Analisis Data
Untuk kualitas organoleptik, data yang diperoleh diuji dengan uji nonparametrik Friedman’s test (Setyaningsih et al. 2010) dan apabila berpengaruh
nyata dilanjutkan dengan uji LSD untuk melihat perbedaan antar perlakuan.
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S
rRNA
Isolasi DNA
Isolasi DNA bakteri dilakukan sesuai protokol stanadar Xprerp soil DNA
Mini Kit (PhileKorea Technology). Kultur sel diambil menggunakan ose dan
dimasukkan ke dalam tabung mikro steril, dan disentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 1 menit. Pelet sel isolat bakteri dicuci sebanyak tiga kali
dengan cara 200 μL bufer Tris-EDTA (TE) dituang kedalam tabung mikro,
disuspensi dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit.
Sebanyak 250 µL XPSDE buffer 1, 20 µL proteinase-K (2mg/ml), dan 2 mg glass
beads ditambahkan ke pelet sel, lalu diinkubasi pada suhu 70oC selama 10 menit.
Sampel ditambahkan 100 µL XPSDE buffer 2 dan diinkubasi pada es selama 5
menit, setalah itu sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan
selanjutnya dipindahkan pada ke tabung mikro baru dan ditambahkan 200 µL
XPSDE buffer 3 selanjutnya di inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit.
Supernatan selanjutnya dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambahkan 250
µL XPSDE buffer 4 dan ethanol 100% kedalam supernatan. Setelah
dihomogenkan, sampel dipindahkan ketabung mikro kolom dan di sentrifugasi,
kemudian ditambahkan 750 µL buffer elusi di sentrifugasi lagi. Selanjutnya
tabung mikro kolom dipindahkan ketabung mikro yang baru dan ditambahkan 50
µL buffer elusi dan disentrifugasi. DNA genom hasil isolasi selanjutnya dapat
digunakan untuk amplifikasi gen 16S RNA. Hasil isolasi diperiksa dengan
dimigrasi pada gel agarosa 1% dengan kondisi voltase 75V selama 30 menit.
Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR
Komponen reaksi PCR pada proses amplifikasi gen 16S rDNA untuk 25
µL volume total terdiri atas 3 µL DNA bakteri, 0,1 µl ex taq DNA polimerase,
primer forward 20F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’), primer reverse
1541R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’). masing-masing primer sebanyak
1,25 µL, 0,5 µL dNTP, bufer PCR sebanyak 5 µL, 0,5 µL MgCl2, dan 13,4 µL
akuabides steril (ddH2O). Proses PCR terdiri atas pre-denaturasi pada suhu 95ºC
selama 2 menit, kemudian denaturasi 95ºC selama 30 detik, annealing primer
55ºC selama 45 detik, extension primer 72ºC selama 1 menit, dan final extension
72ºC selama 5 menit. DNA diamplifikasi sebanyak 30 siklus. Produk hasil PCR
dielektroforesis pada 1% gel agarosa, dan diamati pita tunggal yang terbentuk di
7
atas paparan sinar UV untuk memastikan fragmen DNA yang diamplifikasi pada
ukuran pasang basa yang tepat (~1500 pb) (Sambrook et al. 1989).
Sekuensing Gen 16S rRNA, Analisis Bioinformatika dan Konstruksi Pohon
Filogenetik
Total produk akhir hasil purifikasi PCR sebanyak 10 µL, dan selanjutnya
disekuensing sesuai dengan protokol standar DNA sekuenser (ABI PRISM 3100)
di Laboratorium 1st Base Singapura. Hasil sekuen nukleotida dibandingkan
dengan GenBank database melalui NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
Untuk analisis filogenetik atau kekerabatan antar isolat bakteri asam laktat
berdasarkan neighbor-joining method, dan menggunakan program Bioedit versi
7.0.4.01 dan Clustal_X.
3 HASIL
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu Jagung Fermentasi
Hasil isolasi dari fermentasi jagung diperoleh 33 isolat bakteri yang
mampu tumbuh pada media agar-agar MRS. Perlakuan pertama diperoleh BAL
sebanyak 22 isolat, JMT sebanyak 7 isolat dan JMA sebanyak 4 isolat (Tabel 1).
Karakteristik Gram berdasarkan pengamatan mikroskopis diketahui terdapat
khamir pada JMB sebanyak 7 isolat dan JMT sebanyak 4 isolat, pada perlakukan
ketiga (JMA) tidak ditemukan isolat khamir. Terdapat bakteri Gram negatif pada
JMB, JMT dan JMA masing-masing 3, 1 dan 1 isolat. Gram positif yang
merupakan tujuan dari penelitian ini diperoleh pada JMB, JMT dan JMA masingmasing 12 , 2 dan 3 isolat (Tabel 1).
Tabel 1 Jumlah isolat bakteri dan khamir hasil isolasi dari susu jagung fermentasi
secara spontan
Jumlah bakteri Gram
Perlakuan
No
Khamir
Total
Isolasi
Gram +
Gram JMB
12
3
7
22
JMT
2
1
4
7
JMA
3
1
0
4
17
5
11
33
Keterangan: JMB; Tabung dibuka dan tidak dipanaskan JMT; Tabung ditutup dan
tidak dipanaskan, JMA; Tabung ditutup dan dipanaskan
Proses isolasi dengan perlakuan dimaksudkan untuk mengetahui asal
populasi BAL. BAL ditemukan paling banyak pada perlakuan pertama yaitu
tabung dibuka dan tidak dipanaskan (JMB) sebanyak 12 isolat (Tabel 1). Tabung
ditutup dan tidak dipanaskan (JMT) serta tabung ditutup dan dipanaskan (JMA)
diperoleh masing-masing 2 dan 3 isolat. Jumlah keseluruhan isolat BAL dari 3
perlakuan tersebut yaitu 17 isolat yang selanjutnya akan dikarakterisasi lebih
lanjut.
8
Terdapat 17 bakteri Gram positif merupakan BAL yang karakteristiknya
diamati berdasarkan kecepatan pertumbuhan, bentuk sel, morfologi koloni, dan
kemampuan menghasilkan enzim katalase (Tabel 2). Bakteri dapat tumbuh setelah
masa inkubasi 24 jam dan 48 jam. Morfologi sel secara umum yaitu basil, kokus,
dan batang pendek. Morfologi koloni secara umum yaitu bulat, cembung, warna
putih susu. Perbedaan ukuran koloni berbeda signifikan ada yang koloninya besar,
sedang dan sangat kecil. Sebanyak 17 bakteri bersifat katalase negatif.
Tabel 2 Karakteristik morfologi BAL hasil isolasi
No
Kode
Isolat
Kecepatan
pertumbuhan
Bentuk
Sel
Morfologi Koloni
Katalase
Bulat cembung, ukuran sedang,
Negatif
putih susu
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
2 JMB 2
Coccus
Negatif
++
susu
Basil
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
3 JMB 4
Negatif
++
pendek susu
Basil
cembung, ukuran kecil, putih
+
4 JMB 6
Negatif
pendek susu
5 JMB 8
Basil
Bulat, ukuran kecil, putih
Negatif
+
6 JMB 9
Basil
Cembung, ukuran kecil,putih.
Negatif
+
7 JMB 10
Basil
Warna krem, pipih, kecil
Negatif
+
Putih susu, cembung, ukuran
+
8 JMB 11
Basil
Negatif
sedang
9 JMB 12
Basil
Bulat,ukuran kecil
Negatif
+
Putih cembung,bulat ukuran
+
10 JMB 13
Basil
Negatif
sedang
Bulat, warna krem, ukuran sangat
11 JMB 14
Basil
Negatif
++
kecil
12 JMB 18
Basil
Putih, sangat kecil
Negatif
+
Bulat cembung, ukuran
13 JMB 19
Basil
Negatif
sedang,putih
++
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
14 JMT 1
Basil
Negatif
+
susu
Basil
Bulat cembung, ukuran sedang,
+
15 JMT 6
Negatif
pendek putih susu
Basil
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
+
16 JMA 1
Negatif
pendek susu
Basil
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
+
17 JMA 2
Negatif
pendek susu
Keterangan: JMB: Tabung dibuka dan tidak dipanaskan JMT: Tabung ditutup dan
tidak dipanaskan, JMA: Tabung ditutup dan dipanaskan , ++ : koloni
tumbuh pada jam ke 24, + : Koloni tumbuh pada jam ke-48.
1 JMB 1
+
Basil
Data hasil isolasi tersebut di tentukan berdasarkan identifikasi Kandler dan
Weiss (1995) dalam Bergey's Manual Systematic Bacteriology yaitu bakteri
bersifat Gram positif, basil, tidak berspora dan katalase negatif dimasukkan dalam
9
kategori Lactobacillus spp. Bakteri hasil isolasi yang merupakan Gram positif,
bentuk selnya basil dan bersifat katalase negatif merupakan genus Streptococcus
spp. Hasil isolasi diperoleh 16 genus Lactobacillus spp. dan 1 genus
Streptococcus spp. pada Tabel diberi kode JMB 2.
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik
dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
Kemampuan bakteri dalam mempengaruhi sifat organoleptik sangat
penting dalam pengembangan suatu produk karena hal ini menentukan
penerimaan konsumen terhadap susu jagung fermentasi. Penilaian konsumen
terhadap kesukaan suatu produk ditentukan oleh warna, kekentalan, dan aroma.
Uji organoleptik susu jagung fermentasi pada penelitian ini meliputi uji warna,
kekentalan, dan aroma (Tabel 3).
Tabel 3 Rata-rata mutu organoleptik susu fermentasi jagung berdasarkan
karakteristik warna, kekentalan, dan aroma
N
Kode
Warna
Aroma
Kekentalan
o
isolat
1
JMB 1
Agak kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
2
JMB 2
Agak kuning
Khas jagung
Kental
3
JMB 4
Kuning
Agak khas yoghurt Kental
4
JMB 6
Sangat Kuning
Khas yoghurt
Amat Sagat kental
5
JMB 8
Kuning
Khas jagung
Agak Tidak kental
6
JMB 9
Sangat Kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
7
JMB 10 Kuning
Khas jagung
Agak kental
8
JMB 11 Kuning
Agak khas yoghurt Agak Tidak kental
9
JMB 12 Sangat Kuning
Khas yoghurt
Amat Sagat kental
10 JMB 13 Sangat Kuning
Khas yoghurt
Amat Sagat kental
11 JMB 14 Sangat Kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
12 JMB 18 Kuning memudar Alkohol
Sangat Encer
13 JMB 19 Kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
14
JMT 1
Agak kuning
Alkohol
Agak Tidak kental
15
JMT 6
Kuning memudar Agak Asam
Agak Tidak kental
16
JMA 1
Kuning memudar Khas jagung
Agak kental
17
JMA 2
Agak kuning
Khas jagung
Agak kental
Keterangan: JMB: Tabung dibuka dan tidak dipanaskan JMT: Tabung ditutup dan
tidak dipanaskan, JMA: Tabung ditutup dan dipanaskan. Aroma :
khas yoghurt (7), agak khas yoghurt (6), khas jagung (5), asam (4),
agak asam (3), sangat asarn (2), alkohol (1). Kekentalan: amat
sangat kental (7), sangat kental (6), kental (5), agak kental (4), agak
tidak kental (3), tidak kental (2), sangat encer (1)
Hasil uji organoleptik (Tabel 3) setelah diinokulasi isolat yang berbeda
memperlihatkan pengaruh terhadap warna, aroma dan kekentalan fermentasi susu
jagung. Warna dinilai oleh panelis setelah diinokulasikan BAL menunjukkan
kisaran perubahan warna dari nilai sangat kuning, kuning, kuning memudar, agak
10
kuning masing-masing mempengaruhi 5 isolat, 5 isolat, 3 isolat, 4 isolat secara
berurutan. Penilaian panelis terhadap aroma susu jagung menunjukkan khas
yoghurt, agak khas yoghurt, khas jagung, agak asam dan aroma alkohol masingmasing mempengaruhi 3 isolat, 6 isolat, 5 isolat, 1 isolat, 2 isolat secara
berurutan. Kekentalan: amat sangat kental, sangat kental, kental, agak kental, agak
tidak kental, encer masing-masing dipengaruhi 3 isolat, 4 isolat, 2 isolat, 3 isolat,
4 isolat, 1 isolat secara berurutan.
Bakteri yang dapat memberi karakteristik yang baik dari segi warna,
aroma dan kekentalan akan di seleksi berdasarkan rata-rata hasil organoleptik
(Lampiran 2). Penilaian panelis berdasarkan rata-rata karakteristik organoleptik
susu jagung fermentasi diperoleh 8 isolat bakteri rata–rata tertinggi yaitu
Lactobacillus JMB 1, Lactobacillus JMB 4, Lactobacillus JMB 6, Lactobacillus
JMB 9, Lactobacillus JMB 12, Lactobacillus JMB 13, Lactobacillus JMB 14,
Lactobacillus JMB 19 (Lampiran 2) yang selanjutnya akan diseleksi berdasarkan
kemampuan mempertahankan aroma setelah penyimpanan.
Untuk mendapatkan bakteri yang dapat mempertahankan aroma sampai
waktu yang cukup lama, maka selanjutnya dilakukan penapisan BAL yang dapat
memberi aroma terbaik pada masa simpan 6 bulan (Gambar 1).
7
Skala Organoleptik
6
5
4
3
2
1
JMA2
JMA1
JMA6
JMT1
JMB19
JMB18
JMB 14
JMB13
JMB12
JMB11
JMB10
JMB8
JMB 9
JMB6
JMB4
JMB2
JMB 1
0
Kode Isolat
Gambar 1 Rata-rata mutu organoleptik berdasarkan karakteristik aroma setelah
penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC. 1 (sangat tidak suka), 2 (tidak
suka), 3 (agak tidak suka), 4 (agak suka), 5 (suka), 6 (sangat suka) dan
7 (amat sangat suka).
Berdasarkan penilaian panelis, susu jagung fermentasi pada taraf suka
dengan nilai 5 diperoleh 2 isolat bakteri yang dapat mempertahankan aroma
setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 40C yaitu Lactobacillus JMB 4,
Lactobacillus JMB 6 (Gambar 1). BAL tersebut akan digunakan pada proses
penelitian selanjutnya.
11
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
Metode Antagonis Langsung Menggunakan Bakteri Patogen S.aureus dan
E.coli
Aktivitas penghambatan BAL menggunakan bakteri uji S.aureus dan
E.coli (Tabel 4). Berdasarkan hasil uji terdapat 13 isolat yang memiliki
kemampuan aktivitas antimikrob terhadap S. aureus.
Tabel 4 Aktivitas antimikrob isolat pada S.aureus dan E.coli melalui uji
antagonism
Aktivitas Antimikrob
No
Kode Isolat
S.aureus
E.coli
1
Lactobacillus JMB 1
+
2
Streptococcus JMB 2
++
3
Lactobacillus JMB 4
4
Lactobacillus JMB 6
++
5
Lactobacillus JMB 8
+
6
Lactobacillus JMB 9
+++
7
Lactobacillus JMB 10
+
8
Lactobacillus JMB 11
++
9
Lactobacillus JMB 12
10
Lactobacillus JMB 13
+++
11
Lactobacillus JMB 14
+++
12
Lactobacillus JMB 18
+
13
Lactobacillus JMB 19
++
14
Lactobacillus JMT 1
+
15
Lactobacillus JMT 6
+++
16
Lactobacillus JMA 1
17
Lactobacillus JMA 2
Keterangan : - = tidak memiliki daya hambat, + =0.5 mm-0.6mm, ++=0.70.8mm, +++ = 0.9 - 1.0 mm.
Aktivitas antimikrob terbesar yaitu 0,9-1,0 mm dihasilkan oleh isolat
Lactobacillus JMB 9, Lactobacillus JMB 13, Lactobacillus JMB 14 dan
Lactobacillus JMT 6 secara berturut-turut. Aktivitas antimikrob pada kisaran 0.70.8 mm yaitu Lactobacillus JMB 2, Lactobacillus JMB 6, Lactobacillus JMB 11,
Lactobacillus JMB 16, Lactobacillus JMB 19. Bakteri menghambat pada
Sthapylococcus aureus tetapi tidak menghambat bakteri uji E. coli.
Penapisan BAL Penghasil Bakteriosin Menggunakan Metode Sumur
Penapisan selanjutnya hanya menggunakan supernatan untuk mengetahui
kemampuan metabolit yang dihasilkan BAL untuk menghambat S. aureus dan
untuk mengetahui senyawa antimikrob yang dihasilkan. BAL yang memperoleh
zona hambat terbesar pada pH 4 yaitu: Lactobacillus JMB 9, Lactobacillus JMB
13, Lactobacillus JMT6, Lactobacillus JMB 6 masing masing daya hambat 27
mm, 25 mm, 18 mm, 17 mm (Tabel 5).
12
Tabel 5 Indeks penghambatan (IP) supernatan kultur BAL umur 24 jam terhadap
bakteri Staphylococcus aureus
Rata-rata index penghambatan
(IP) supernatan
No
Kode isolat
IP±SE
pH 4
pH 6
1
Lactobacillus JMB 1
1,55 ±1,5
2
Streptococcus JMB 2
1,25±1,5
3
Lactobacillus JMB 6
1,70±5
0,5±0,5
4
Lactobacillus JMB 9
2,70±0
5
Lactobacillus JMB 10
1,30±0,5
6
Lactobacillus JMB 11
1,05±9
7
Lactobacillus JMB 13
2,50±1
8
Lactobacillus JMB 14
1,40±0,5
10
Lactobacillus JMB 18
0,95±0,5
11
Lactobacillus JMB 19
1,10±0
12
Lactobacillus JMT1
13
Lactobacillus JMT6
1,80±5
Keterangan: IP: index penghambatan, SE: standar error, (-): tidak memiliki daya
hambat terhadap bakteri uji.
Pada pH 6 hanya diperoleh 1 isolat yang menghasilkan luas penghambatan
0.5 (Tabel 5). Berdasarkan hasil penapisan BAL tersebut diperoleh 1 bakteri yang
diduga menghasilkan bakteriosin yaitu Lactobacillus JMB 6 .
Fase Turbidimetrik Bakteri Asam Laktat
Kurva pertumbuhan ini dimaksudkan untuk mengetahui fase serta jumlah
sel pada nilai OD tertentu. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui jumlah sel
yang diinokulasikan pada saat pengujian. Fase eksponensial dimulai pada OD 0.8
dengan jumlah sel ± 1 x 1010 sel/ml pada masa inkubasi 12 jam. Hal ini akan
menjadi pedoman dalam inokulasi dan produksi bakteriosin BAL pada pengujian
selanjutnya.
Fase pertumbuhan dapat menjadi gambaran dalam sintesis senyawa yang
dihasilkan misalnya bakteriosin yang merupakan substansi antibakteri yang disintesis
langsung di ribosom selama pertumbuhan bakteri asam laktat (pada fase
eksponensial), sehingga bakteriosin disebut sebagai metabolit primer. Sedangkan
fase stasioner dihasilkan metabolit sekunder. Fase pertumbuhan bakteri asam laktat
(BAL) terdiri atas fase lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian.
Bakteri melakukan proses penyesuaian terhadap kondisi lingkungan seperti
pH, suhu, nutrisi yang juga disebut fase lag. Fase ini merupakan proses peningkatan
jumlah sel bakteri yang lambat karena masih berada pada tahap mempersiapkan
materi-materi dan organel dalam sel untuk perkembangan dan pembelahan sel. Fase
lag BAL pada penelitian ini terjadi selama jam ke 6 sampai jam ke-11 (Gambar 2).
Fase kedua adalah fase eksponensial yang merupakan fase pertumbuhan bakteri yang
berlangsung cepat. Fase eksponensial terjadi pada jam ke-11 sampai jam ke-13
(Gambar 2) yang juga fase dimana terjadi proses sintesis senyawa bakteriosin. Fase
berikutnya adalah fase stasioner, pada fase ini tidak terjadi penambahan jumlah
13
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
14
12
10
8
6
4
Log 10 Jumlah Sel
Absorbansi (OD) 600 nm
bakteri karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati, hal ini
terjadi dari jam 12 sampai jam ke 21 (Gambar 2), pada fase ini senyawa metabolit
sekunder di produksi, misalnya senyawa asam laktat yang merupakan hasil metabolit
sekunder bakteri asam laktat.
2
0
6 10.5 12 13.5 15 16.5 18 19.5 21 22.5 24
Waktu (Jam)
OD
TPC
Gambar 2 Kurva pertumbuhan isolat JMB 6
Fase terakhir adalah fase kematian, fase kematian pada pertumbuhan
bakteri terjadi mulai jam ke-22 terjadi penurunan jumlah sel bakteri karena nutrisi
dalam media mulai habis (Lampiran 5). Bakteri umumnya memproduksi metabolit
sekunder yang disintesis selama fase stasioner pada masa pertumbuhan bakteri.
Uji Organoleptik Susu Fermentasi Jagung Menggunakan Inokulum Bakteri
Asam Laktat (BAL) Terpilih
Berdasarkan penapisan antimikrob BAL yang terpilih merupakan bakteri
dengan yang mampu menghasilkan zona bening pada pH 6. Kandidat BAL yaitu
Lactobacillus JMB 6. Bakteri terpilih diinokulasi pada susu jagung, susu jagung
yang ditambahankan bakteriosin serta susu jagung tanpa perlakuan akan
dibandingkan dalam kemampuan bakteri mempertahankan aroma.
Tabel 6 Nilai rataan uji mutu penerimaan konsumen terhadap aroma susu jagung
fermentasi setelah masa simpan 5-6 hari
No
Perlakuan
Rata-rata mutu aroma
1
Kontrol (Tanpa bakteri)
2.35 a
2
Kontrol (Bakteriosin)
4.7 b
5
Lactobacillus JMB6
4.9b
Keterangan: a,b,): Nilai dengan huruf superskrip di belakang angka yang berbeda
pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p
PENGHASIL BAKTERIOSIN DARI FERMENTASI SUSU
JAGUNG
LISMAYANA HANSUR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Asam Laktat Penghasil Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Lismayana Hansur
NIM G351110021
RINGKASAN
LISMAYANA HANSUR Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Penghasil Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung. Dibimbing oleh IMAN
RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Susu jagung merupakan diversifikasi olahan jagung yang dijumpai pada
masyarakat sebagai sumber nutrisi pilihan selain makanan pokok, namun karena
masih diproduksi secara tradisional sehingga daya tahan produk masih rendah.
Pemanfaatan pengawet kimia dapat digunakan untuk menjaga kontaminasi bakteri
pembusuk tetapi pengawet tersebut sangat berbahaya bagi manusia. Penelitian ini
bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi isolat BAL penghasil
antimikrob dari fermentasi jagung yang dapat memberi produk terbaik pada susu
jagung fermentasi.
Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan dari fermentasi jagung secara
spontan dengan 3 perlakuan dan 2 ulangan. Perlakuan pertama yaitu tabung
dibuka dan tidak dipanaskan (JMB), tabung ditutup dan tidak dipanaskan (JMT)
serta tabung ditutup dan dipanaskan (JMA). Penapisan BAL penghasil aroma
terbaik dilakukan menggunakan uji organoleptik. BAL yang terpilih adalah BAL
yang secara karakteristik organoleptik yang unggul dan juga mampu
mempertahankan aroma setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 40C. Penapisan
antimikrob dilakukan dengan metode antagonisme langsung dengan stab
inokulasi menggunakan galur indikator yaitu Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli. BAL hasil penapisan dari uji organoleptik dan penghasil
senyawa antimikrob di amati fase pertumbuhannya. Bakteri yang menghasilkan
zona bening selanjutnya diuji menggunakan metode difusi sumur agar.
Keberterimaan konsumen terhadap inokulasi BAL diukur menggunakan nilai
hedonik dan dianalisis berdasarkan Fredman tes. Bakteri terpilih selanjutnya di
identifikasi berdasarkan 16S rRNA.
Isolat sebanyak 33 diperoleh dari perlakuan pertama, kedua, dan perlakuan
ketiga menghasilkan 22, 7, 4 isolat secara berturut-turut. BAL yang terpilih
merupakan bakteri dengan zona bening terluas yaitu Lactobacillus JMB 9,
Lactobacillus JMB 13 dan Lactobacillus JMT 6. Lactobacillus JMB 4 dan
Lactobacillus JMB 6 sebagai kandidat BAL yang dapat memberikan aroma
terbaik. Penapisan menggunakan metode antagonis langsung diperoleh 13 isolat
yang menghasilkan daya hambat pada mikroba uji Sthapylococcus aureus dan
E.coli. Selanjutnya, 13 isolat tersebut diuji antagonis metode sumur agar pada
perlakuan pH 4 dan pH 6 menggunakan mikroba uji Sthapylococcus aureus dan
diperoleh isolat BAL JMB 6 yang diduga memiliki kemampuan penghasil
bakteriosin. Pengujian bakteriosin selanjutnya dilakukan dengan menambahkan
enzim protease pada supernatan isolat Lactobacillus JMB 6. Penambahan protease
menyebabkan terhambatnya aktivitas bakteriosin. Sehingga substansi antimikrob
yang dihasilkan oleh Lactobacillus JMB 6 diduga ialah bakteriosin. Aplikasi
bakteriosin dan perlakuan inokulasi bakteri terpilih pada susu jagung
menunjukkan bahwa semua perlakuan memiliki kemampuan mempertahankan
aroma. Hasil identifikasi bakteri terpilih JMB 4 menunjukkan kesamaan 97%
dengan Lactobacillus plantarum.
Kata kunci: Lactic acid bacteria (LAB), sweet corn, fermented milk, bacteriocin
SUMMARY
LISMAYANA HANSUR. Isolation and Characterization Lactid Acid Bacteria
Producing Bacteriocins from Corn Fermented Milk. Supervised by IMAN
RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK.
Corn milk is one of diversification product in the society as a nutrition
source selection than staple food. Corn milk is low durability due to
contamination spoilage bacteria. The use of chemical preservatives can be used to
keep the spoilage bacteria contamination but these preservatives are very harmfull
to humans. The research study purpose is isolation and identification of lactid acid
bacteria producing bacteriocin from fermented corn for biopreservatives on corn
milk.
Isolation of lactid acid bacteria (LAB) from fermented corn was done
spontaneously with 3 treatments and 2 replications. The first treatment of the tube
was opened and not heated (JMB), the tube was closed and not heated (JMT) and
the tube was closed and heated (JMA). Screening LAB performed was used the
best flavour as a organoleptic test. The selected LAB as the best organoleptic
characteristics, also able to maintain the flavor after 6 months of storage at 40C of
temperature. The bacteria was found will be selected by direct antagonism method
with stab inoculation againts indicator bacteria strain Staphylococcus aureus and
Escherichia coli. The bacteria that produced a clear zone was chosen to next
selection by using well diffusion method. The LAB screening results of
organoleptic tests and producing antimicrobial compounds then observed of
growth phase. The 13 isolates were tested by using well diffusion methods which
used S. aureus as microbial test in pH 4, pH 6 after that protease treatments.
Consumer acceptance of the BAL inoculation were measured and analyzed using
hedonic value based Fredman test. The chosen bacteria was identification by 16S
rRNA.
Total of 33 isolates were obtained. The first until third treatment obtained
22, 7, and 5 isolates respectively. The selected LAB is a bacteria by the widest
clear zone is Lactobacillus JMB 9, Lactobacillus JMB 13 dan Lactobacillus JMT
6. Lactobacillus JMB 4 and Lactobacillus JMB 6 as BAL candidate who can give
the best flavor. Direct antagonist screening method obtained 13 isolates that
produce inhibitory effects on Sthapylococcus aureus and E.coli. Based on the
screening results obtained Lactobacillus JMB 6 has the ability to produce
inhibition in pH 6. The addition of protease make a disturb of bacteriocins
activity. The antimicrobial substance produced by Lactobacillus JMB 6 can be
concluded as a bacteriocins. The addition of bacteriocins treatment and
inoculation of lactic acid bacteria showed preference value not significantly
different scents. Bacteriocins added and bacterial selected inoculation on corn
milk showed that all treatments have the ability to retain flavor. Identification
bacterial based on 16 sRNA was showed 97% similarity LAB JMB 4 with
Lactobacillus plantarum.
Keywords : Lactic acid bacteria (LAB), sweet corn, fermented milk, bacteriocin
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL BAKTERIOSIN DARI FERMENTASI SUSU
JAGUNG
LISMAYANA HANSUR
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, MSi
Judul Tesis : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Penghasil
Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung
Nama
: Lismayana Hansur
NIM
: G351110021
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Iman Rusmana, MS
Ketua
Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Anja Meryandini, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
21 November 2013
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Syukur alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, karena
dengan rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian yang dilanjutkan dengan
penyusunan dan penulisan tesis dengan judul ” Isolasi dan Karakterisasi Bakteri
Asam Laktat Penghasil Bakteriosin dari Fermentasi Susu Jagung” dapat
terselesaikan. Tesis ini disusun dalam rangka penyelesaian studi Program
Magister (S2) pada Program Studi Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (MIPA), Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini merupakan sebuah upaya untuk mencari alternatif pemanfaatan hasil
pertanian yang dapat dinikmati secara langsung serta mencari alternatif pengawet
alami dari bakteri asam laktat.
Ucapan terima kasih dengan penuh hormat saya sampaikan kepada Bapak
Dr. Ir. Iman Rusmana, MSi, Pembimbing Akademik dan ketua komisi
pembimbing, juga sebagai Ketua Departemen Biologi, Fakultas MIPA IPB, yang
selalu bersedia untuk berdiskusi, memberikan nasihat dan solusi pada setiap
masalah yang dihadapi penulis, tidak hanya menjadi pembimbing tetapi juga
menjadi pembimbing psikologi yang telah menjaga semangat penulis selama di
IPB. Sebagai anggota komisi pembimbing, Ibu Dr Nisa Rachmaia Mubarik, MSi
yang selain sebagai pembimbing juga menjadi seorang motivator selama
penelitian dan penulisan tesis yang tidak pernah bosan menampung keluh kesah,
mengarahkan walau sering terjadi kesalahan dan kecerobohan pribadi penulis,
serta selalu memberikan semangat kepada penulis. Terima kasih saya haturkan
kepada Bapak dan Ibu pembimbing yang telah menyediakan waktu, energi dan
upaya serta telah mau memahami kekurangan penulis.
Kepada yang terhormat Ibu Dr Gayuh Rahayu, MSi dan Ibu Prof Dr
Anja Meryandini, MSi sebagai Ketua Prodi Mikrobiologi yang senantiasa
menyemangati penulis, terimakasih atas segala kesediaan waktu dan masukan
yang telah diberikan. Selanjutnya kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Departemen Pendidikan Nasional, terimakasih atas beasiswa yang telah diberikan.
Penulis juga ucapkan terimakasih kepada Rektor Institut Pertanian Bogor beserta
seluruh civitas akademika atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk
mengikuti pendidikan S2 di IPB.
Ucapan terimakasih dengan tulus juga penulis sampaikan untuk seluruh
civitas akademika Program Studi Mikrobiologi, Kepada Pak Edjen yang telah
banyak membantu. Kepada keluarga kecil Mikrotropisian (WES, TH, IH, ES,
KSN, AU, IPP, RWP, NN, ER, mba 3, FS ) serta rekan-rekan lain yang telah
berpartisipasi dan mendukung penulis baik selama mengikuti studi maupun dalam
penelitian, diucapkan terimakasih atas segala perhatian dan bantuan yang telah
diberikan.
Kepada Ayahanda Hansur Sutte dan Ibunda Astika tercinta yang selalu
mendo’akan penulis, kepada kakak Akil, Asnita, dan adik Irmayanti serta seluruh
keluarga, dengan tulus dan penuh rasa hormat saya ucapkan terimakasih atas
segala dukungan yang diberikan. Kepada Tim squad, penulis haturkan terimakasih
atas bantuan, motivasi, kesabaran dalam bingkai kekeluargaan yang telah terjalin.
Untuk semua pihak yang telah membantu penulis, semoga Allah SWT
memberikan balasan dengan amalan dunia dan akhirat serta selalu menjaga kita
dalam lindungan-Nya. Akhir kata, semoga tesis yang disusun ini menjadi berguna
bagi penulis, masyarakat dan bangsa. Penulis selalu menantikan saran dan kritik
yang bertujuan untuk lebih memperbaiki tesis ini.
Bogor, Juli 2013
Lismayana Hansur
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
i
1
2
2
2 METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Kerja
2
Fermentasi spontan
3
Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat
3
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik
dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
3
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
4
Kurva Pertumbuhan BAL terpilih
5
Fermentasi Susu Jagung Menggunakan Isolat Terpilih dan Uji Organoleptik 5
Analisis Data
5
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S rRNA
6
3 HASIL
7
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Jagung Fermentasi
7
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik
Organoleptik dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
9
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
11
Fase Turbidimetrik Bakteri Asam Laktat Terpilih
13
Uji Organoleptik Susu Fermentasi Jagung Menggunakan
Inokulum Bakteri Asam Laktat Terpilih
13
Karakterisasi Senyawa Antimikrob Lactobacillus JMB 6
14
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S rRNA 14
4 PEMBAHASAN
145
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
19
19
19
DAFTAR PUSTAKA
19
LAMPIRAN
23
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Jumlah isolat bakteri dan khamir hasil isolasi dari susu jagung
fermentasi secara spontan
Karakteristik morfologi BAL hasil isolasi
Hasil
mutu organoleptik susu fermentasi jagung berdasarkan
karakteristik warna, kekentalan dan aroma
Aktivitas antimikrob isolat pada S.aureus dan E.coli melalui uji
antagonisme
Indeks penghambatan supernatan kultur BAL terhadap bakteri
Staphylococcus aureus
Nilai rataan uji mutu penerimaan konsumen terhadap aroma susu
jagung fermentasi setelah masa simpan 5-6 hari
Hasil BLAST-N gen sequen 16 S rRNA dari isolat JMB 4
7
8
10
12
13
15
18
DAFTAR GAMBAR
1 Rata-rata mutu organoleptik berdasarkan karakteristik aroma setelah
penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC.
2 Kurva turbiditas pertumbuhan BAL terpilih
3 Kurva pertumbuhan isolat JMB 6
4 Pengujian antimikrob supernatan pH 4 (A), PH 6 (B) penambahan
enzim protease (C)
5 Hasil amplifikasi gen 16s RNA isolat JMB 4
6 Pohon filogenetik isolat JMB 4 menggunakan piranti lunak MEGA 5.0
10
13
15
16
16
17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Rata-rata mutu organoleptik berdasarkan karakteristik aroma setelah
penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC
2 Rata-rata mutu organoleptik hasil inokulasi BAL susu jagung
fermentasi berdasarkan karakteristik organoleptik (warna, kekentalan
dan aroma)
3 Standar error (SE) rata-rata diameter zona hambat isolat
4 Jumlah Log BAL pada fase pertumbuhan
22
23
24
25
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Keanekaragaman sumber daya alam hayati Indonesia berupa hasil
pertanian dapat digunakan sebagai sumber pangan, salah satunya ialah jagung.
Susu jagung merupakan salah satu diversifikasi produk olahan jagung yang
dijumpai di masyarakat sebagai sumber nutrisi pilihan selain makanan pokok.
Susu jagung masih diproduksi secara tradisional di Sulawesi Selatan sehingga
daya tahan produk masih rendah yang berdampak pada rendahnya keberadaan
produk tersebut di pasaran. Susu jagung memiliki nutrisi yang baik bagi tubuh,
karena memiliki kandungan vitamin yang tinggi (Supavititpatana et al. 2008).
Susu jagung adalah produk olahan jagung yang juga dapat mengalami
kerusakan yang diakibatkan kontaminasi mikroba perusak makanan. Kandungan
nutrisi pada pangan menjadi tempat berkembang biak bagi mikroorganisme.
Menurut Jos dan Veld (1996) pembusukan makanan dapat disebabkan oleh
berbagai reaksi yang dipengaruhi faktor fisik, kimia, dan enzim yang dihasilkan
mikroorganisme akibat kontaminasi selama proses produksi (manufacturing).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka diperlukan suatu bahan pengawet yang
berfungsi untuk menghindari kerusakan akibat mikroorganisme sehingga tidak
menimbulkan bahaya bagi kesehatan konsumen. Preservasi merupakan cara untuk
mengawetkan produk pangan hewani maupun nabati sehingga terhindar dari
pembusukan akibat cemaran oleh mikrob (Suardana et al. 2007).
Cara yang digunakan untuk menghindari kontaminasi yaitu penggunaan
bahan kimia sebagai bahan pengawet. Pemanfaatan bahan kimia selain
menyebabkan masalah kesehatan ketika dikonsumsi dalam jangka panjang juga
dapat menyebabkan perubahan warna dan bau pada makanan. Bahan yang kini
dikembangkan untuk preservasi yaitu bakteriosin. Bakteriosin digunakan karena
merupakan bahan pengawet alami yang aman, berasal dari mikroorganisme yaitu
bakteri asam laktat (BAL).
Bakteriosin merupakan zat antimikrob yang dihasilkan oleh BAL dan
bekerja menghambat bakteri lain termasuk bakteri patogen (Razak et al. 2009).
Bakteri asam laktat yaitu Lactobacillus sp. telah umum digunakan sebagai
biopreservasi pada bahan pangan karena tidak adanya residu yang dapat
menimbulkan efek negatif. Lactobacillus sp. merupakan salah satu bakteri pada
bahan pangan dengan hampir 140 spesies yang sebagian besar digunakan pada
industri makanan. Bakteri ini merupakan flora alami dari berbagai produk
makanan seperti susu mentah, produk susu fermentasi, buah-buahan, sayuran, dan
produk daging. Lactobacillus sp. juga berfungsi sebagai starter untuk sejumlah
produk makanan fermentasi baik untuk meningkatkan kualitas ataupun untuk
manfaat kesehatan (Singh et al. 2009).
Trias et al. (2008) telah berhasil mengisolasi BAL yang terdapat pada buah
apel segar dan memiliki potensi daya hambat terhadap bakteri perusak bahan
pangan. Kemampuan penghambatan tersebut disebabkan kemampuan BAL
menghasilkan asam organik atau bakteriosin yang memiliki aktivitas antimikrob.
Selain itu Sankar et al. (2012) berhasil mengkarakterisasi bakteriosin dari isolat
Lactobacillus plantarum yang mempunyai kemampuan untuk menghambat
2
mikroorganisme patogen pada bahan pangan dan juga memiliki kemampuan
probiotik untuk kesehatan konsumen.
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka perlu dilakukan seleksi yaitu
mencari beberapa isolat baru dengan aktivitas antimikrob yang lebih baik. Usaha
ini diharapkan menjadi alternatif biopreservasi pada susu jagung yang
memanfaatkan sumber isolat dari jagung. Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi isolat bakteri asam laktat penghasil bakteriosin dari fermentasi
jagung sebagai biopreservasi pada susu jagung fermentasi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi isolat
BAL penghasil antimikrob dari fermentasi jagung yang dapat memberi produk
terbaik pada susu jagung fermentasi.
Manfaat Penelitian
Isolat bakteri asam laktat penghasil antimikrob dari fermentasi jagung
yang berhasil diisolasi dapat dimanfaatkan sebagai biopreservasi pada susu jagung
fermentasi.
2 METODE
Bahan
Bahan yang akan digunakan ialah jagung Sweetcorn (Zea mays
saccharata) E.coli dan S. aureus sebagai bakteri indikator antimikrob yang
merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA IPB.
Alat
Alat yang digunakan antara lain: blender, swab steril, cawan Petri, tabung
reaksi dan penutup, rak tabung, pipet, gelas piala, bunsen, erlenmeyer, gelas ukur,
tube shaker, batang ose, pinset steril, timbangan, inkubator, sentrifuge, autoklaf,
spreader glass, stearer, pH meter, refrigerator, mikroskop, coloni counter, serta
alat-alat pendukung lainnya.
Prosedur Kerja
Penelitian ini dibagi menjadi 5 tahap, yaitu; (1) isolasi dan identifikasi
bakteri asam laktat dari jagung fermentasi, (2) penapisan BAL berdasarkan
karakteristik organoleptik, (3) seleksi BAL melalui uji antagonis dengan bakteri
patogen, (4) uji organoleptik susu jagung dengan perlakuan penambahan
3
supernatan bakteriosin, dibandingkan dengan organoleptik susu fermentasi
jagung yang diinokulasi oleh isolat terbaik (5) isolasi DNA, amplifikasi DNA,
Blast-N dan pembuatan pohon filogenetik BAL.
Fermentasi Spontan
Jagung sweetcorn dipipil dari tongkolnya dicuci dan dibersihkan dengan
air mengalir. Biji jagung yang telah dibersihkan selanjutnya dimasukkan ke dalam
tabung dan dihancurkan menggunakan batang pengaduk. Selanjutnya
ditambahkan aquades steril dengan perbandingan 1:5. Setelah itu dilakukan
fermentasi selama 24 jam. Proses isolasi BAL dilakukan dengan 3 perlakuan dan
2 ulangan. Perlakuan pertama yaitu tabung dibuka dan tidak dipanaskan (JMB),
tabung ditutup dan tidak dipanaskan (JMT) serta tabung ditutup dan dipanaskan
pada suhu 60oC selama 15 menit (JMA).
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi bakteri asam laktat (BAL) dilakukan dari fermentasi jagung secara
spontan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Sebanyak 100 gram sampel cairan
fermentasi diambil, diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis. Bakteri
ditumbuhkan dalam media MRS (de Mann Rogosa Sharpe) agar, selanjutnya
diinkubasi dengan suhu 37oC selama 2 hari. Koloni yang tumbuh diisolasi dan
selanjutnya diseleksi. Koloni yang berbeda kemudian digores pada media untuk
diuji pewarnaan Gram, endospora dan uji katalase. Lama inkubasi, morfologi
bakteri dan koloni diamati. Karakterisasi isolat diidentifikasi taraf genus sesuai
petunjuk Kandler dan Weiss (1995) dalam Bergey's Manual Systematic
Bacteriology.
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik
dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
Sampel penelitian adalah susu jagung, diperoleh dari proses ekstraksi biji
jagung yang dipanaskan dengan suhu 600C selama 15 menit. Susu jagung
kemudian di sterilisasi. Setelah susu jagung dingin, BAL hasil isolasi,
diinokulasikan pada tabung-tabung yang berisi susu jagung steril. Susu jagung
diinkubasi selama 48 jam dan diamati karakteristik organoleptik (warna, aroma,
kekentalan) dan selanjutnya disimpan pada suhu 40C selama 6 bulan.
Pengujian organoleptik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,
panelis yang dipilih yaitu panelis semi terlatih (semi-trained panel) yaitu
mahasiswa di Laboratorium Mikrobiologi. Uji organoleptik setelah fermentasi 48
jam menggunakan panelis perseorangan. Penilaian organoleptik dilakukan dengan
menggunakan uji mutu hedonik. Data penilaian uji mutu hedonik dapat
ditransformasi dalam skala numerik dan selanjutnya dirata-ratakan untuk
interpretasinya.
Penilaian organoleptik untuk penapisan BAL yang dapat memberikan
karakteristik organoleptik (aroma, kekentalan dan warna). Besar skala uji untuk
setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL yaitu rentang 1 hingga 7,
4
terjemahan nilai mutu karakteristik warna hasil fermentasi jagung menggunakan
isolat terpilih yaitu: sangat kuning (7), kuning (6), agak kuning (5), kuning
memudar (4), kuning pucat (3), kuning agak keputih-putihan (2), bening (1) .
Berdasarkan karakteristik kekentalan dengan skor 7-1 : amat sangat kental (7),
sangat kental (6), kental (5), agak kental (4), agak tidak kental (3), tidak kental (2),
encer (1). Berdasarkan karakteristik aroma : khas yoghurt (7), agak khas yoghurt
(6), khas jagung (5), asam (4), agak asam (3), sangat asarn (2), alkohol (1).
Kemampuan BAL mempertahankan aroma selama penyimpanan yang
berhubungan dengan perubahan yang dipengaruhi oleh BAL. Pengujian
organoleptik setelah 6 bulan penyimpanan menggunakan panelis terbatas (3-5
orang) (Setyaningsih et al. 2010). Karakteristik organoleptik bakteri hasil isolasi
dengan batasan: warna 1 hingga 7, besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik
pada perlakuan aplikasi BAL yaitu rentang 1 hingga 7. Terjemahan nilai mutu
hedonik tersebut yaitu; 1 (sangat tidak suka), 2 (tidak suka), 3 (agak tidak suka), 4
(agak suka), 5 (suka), 6 (sangat suka) dan 7 (amat sangat suka).
Penilaian organoleptik menggunakan uji mutu organoleptik, untuk
menentukan tingkat kesukaan panelis terhadap hasil fermentasi. BAL yang terpilih
adalah BAL yang secara karakteristik organoleptik yang unggul dan juga mampu
mempertahankan aroma setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC.
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
Metode Antagonis Langsung
Metode yang digunakan ialah antagonisme langsung dengan stab inokulasi
menggunakan galur indikator (Usmiati dan Marwati 2009). Galur indikator yang
digunakan yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Uji ini dilakukan
pada media semipadat dengan metode agar-agar tuang. Sebelum media dituang,
bakteri indikator dicampurkan pada media semipadat kondisi suam kuku (40oC).
Setelah dituang bakteri uji diambil dan ditimpakan pada permukaan media agaragar yang telah mulai memadat. Setelah itu di atas koloni bakteri yang akan diuji
disentuhkan jarum ose, selanjutnya diletakkan diatas permukaan galur indikator
yang telah dituang bersama media sebelumnya dengan sedikit masuk ke dalam
media. Biakan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Adanya senyawa
antimikrob yang dihasilkan oleh bakteri ditandai dengan zona terang di sekitar
isolat. Isolat yang menghasilkan zona hambatan terluas (diukur dalam satuan mm)
dipakai sebagai bakteri penghasil substansi antimikrob pada uji selanjutnya
(Suardana et al. 2007).
Produksi Bakteriosin
Produksi bakteriosin menggunakan erlenmeyer 100 ml. Kultur diinokulasi
0,1 ml pada media MRS cair pada optical density (OD) tertentu. Inkubasi
dilakukan sampai masa eksponensial pada suhu ruang. Selanjutnya kultur hasil
produksi yang diperoleh disentrifugasi 12.000 rpm, dengan suhu 4°C selama 15
menit sehingga menghasilkan supernatan. Supernatan dinaikkan sampai pH 6
menggunakan NaOH untuk menghilangkan pengaruh asam yang dihasilkan. Asam
laktat yang dihasilkan oleh BAL tidak menghambat pada pH 6 (Desniar et al.
2012). Tahap penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan bakteriosin yang
5
merupakan protein yang memiliki aktivitas paling tinggi terhadap bakteri
indikator. Selanjutnya, supernatan netral diuji aktivitasnya dengan metode sumur
agar-agar.
Metode Difusi Sumur Agar-Agar
Inokulum bakteri indikator (bakteri uji) masing-masing dimasukkan ke
dalam medium agar-agar lunak yaitu media natrium (NA) cair. Media sebanyak
240 ml yang mengandung agar-agar 1.2% dituang secara aseptis ke dalam cawan
Petri dan dibiarkan membeku, kemudian dituang ke cawan Petri. Sumur-sumur
dibuat untuk pengujian pada media yang memadat. Supernatan antimikrob
dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 40 μl, lalu diinkubasikan pada suhu kamar
selama 24 jam. Zona hambatan yang terbentuk diukur.
Kurva Pertumbuhan BAL Terpilih
Sebanyak 0.1 ml dari kultur cair dan kultur agar-agar miring segar ditanam
dalam MRS cair dan diinkubasi pada suhu ruang. Pertumbuhan bakteri diikuti
setiap 3 jam dengan mengamati nilai kerapatan optik atau optical density (OD)
dari starter pada media MRS dengan metode turbidimetrik dengan panjang
gelombang 600 nm. Tahap ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan
dan fase pertumbuhan bakteri terbaik hasil uji antagonis langsung. Kurva
pertumbuhan bakteri dilakukan sampai mencapai fase kematian. Hal ini
dimaksudkan untuk mengetahui fase-fase kehidupan bakteri yang berguna untuk
menentukan waktu generasi bakteri, khususnya fase eksponensial yang erat
hubungannya dengan sekresi substansi antimikrob.
Kultur bakteri diambil untuk mengetahui jumlah BAL pada kerapatan
optik yang akan diukur. Kerapatan optik diukur selanjutnya diencerkan 1:1, 1:2,
1:4, 1:8, 1:16. Kultur cair di ambil sebanyak 1 ml dan diencerkan sampai
pengenceran 10-8, selanjutnya disebar pada media MRS agar-agar. Bakteri hasil
plating digunakan sebagai dasar penentuan kurva standar.
Fermentasi Susu Jagung Menggunakan Isolat Terpilih dan Uji Organoleptik
Sampel penelitian adalah susu jagung, diperoleh dari proses ekstraksi biji
jagung yang dipanaskan dengan suhu 600C selama 15 menit. Susu jagung
kemudian di sterilisasi. Uji organoleptik dengan 2 perlakuan yaitu: penambahan
supernatan (bakteriosin ekstrak kasar) bakteri dan susu jagung fermentasi yang
diinokulasikan bakteri terpilih. Kedua perlakuan tersebut akan dibandingkan
dengan susu jagung tanpa inokulan sebagai pembanding.
Pengujian organoleptik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi. Panelis
yang dipilih yaitu panelis semi terlatih (semi-trained panel) yaitu mahasiswa di
Laboratorium Mikrobiologi. Sebelum melakukan penilaian, panelis diberi
penjelasan secukupnya mengenai uji organoleptik yang dilakukan. Panelis yang
digunakan yaitu sebanyak 15 – 25 orang.
Penilaian organoleptik dilakukan dengan menggunakan uji mutu hedonik.
Pada uji mutu hedonik data penilaian dapat ditransformasi dalam skala numerik
dan selanjutnya dapat dianalisis statistik untuk interpretasinya (Setyaningsih et al.
2010). Besar skala uji untuk setiap sifat organoleptik pada perlakuan aplikasi BAL
6
yaitu rentang 1-7. Penilaian organoleptik ditujukan untuk menilai perubahan
aroma selama penyimpanan yang berhubungan dengan sifat biopreservasi yang
dipengaruhi oleh BAL.
Analisis Data
Untuk kualitas organoleptik, data yang diperoleh diuji dengan uji nonparametrik Friedman’s test (Setyaningsih et al. 2010) dan apabila berpengaruh
nyata dilanjutkan dengan uji LSD untuk melihat perbedaan antar perlakuan.
Identifikasi dan Filogenetik Bakteri Asam Laktat Berdasarkan 16S
rRNA
Isolasi DNA
Isolasi DNA bakteri dilakukan sesuai protokol stanadar Xprerp soil DNA
Mini Kit (PhileKorea Technology). Kultur sel diambil menggunakan ose dan
dimasukkan ke dalam tabung mikro steril, dan disentrifugasi pada kecepatan
10000 rpm selama 1 menit. Pelet sel isolat bakteri dicuci sebanyak tiga kali
dengan cara 200 μL bufer Tris-EDTA (TE) dituang kedalam tabung mikro,
disuspensi dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit.
Sebanyak 250 µL XPSDE buffer 1, 20 µL proteinase-K (2mg/ml), dan 2 mg glass
beads ditambahkan ke pelet sel, lalu diinkubasi pada suhu 70oC selama 10 menit.
Sampel ditambahkan 100 µL XPSDE buffer 2 dan diinkubasi pada es selama 5
menit, setalah itu sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan
selanjutnya dipindahkan pada ke tabung mikro baru dan ditambahkan 200 µL
XPSDE buffer 3 selanjutnya di inkubasi pada suhu ruang selama 2 menit.
Supernatan selanjutnya dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambahkan 250
µL XPSDE buffer 4 dan ethanol 100% kedalam supernatan. Setelah
dihomogenkan, sampel dipindahkan ketabung mikro kolom dan di sentrifugasi,
kemudian ditambahkan 750 µL buffer elusi di sentrifugasi lagi. Selanjutnya
tabung mikro kolom dipindahkan ketabung mikro yang baru dan ditambahkan 50
µL buffer elusi dan disentrifugasi. DNA genom hasil isolasi selanjutnya dapat
digunakan untuk amplifikasi gen 16S RNA. Hasil isolasi diperiksa dengan
dimigrasi pada gel agarosa 1% dengan kondisi voltase 75V selama 30 menit.
Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR
Komponen reaksi PCR pada proses amplifikasi gen 16S rDNA untuk 25
µL volume total terdiri atas 3 µL DNA bakteri, 0,1 µl ex taq DNA polimerase,
primer forward 20F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’), primer reverse
1541R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’). masing-masing primer sebanyak
1,25 µL, 0,5 µL dNTP, bufer PCR sebanyak 5 µL, 0,5 µL MgCl2, dan 13,4 µL
akuabides steril (ddH2O). Proses PCR terdiri atas pre-denaturasi pada suhu 95ºC
selama 2 menit, kemudian denaturasi 95ºC selama 30 detik, annealing primer
55ºC selama 45 detik, extension primer 72ºC selama 1 menit, dan final extension
72ºC selama 5 menit. DNA diamplifikasi sebanyak 30 siklus. Produk hasil PCR
dielektroforesis pada 1% gel agarosa, dan diamati pita tunggal yang terbentuk di
7
atas paparan sinar UV untuk memastikan fragmen DNA yang diamplifikasi pada
ukuran pasang basa yang tepat (~1500 pb) (Sambrook et al. 1989).
Sekuensing Gen 16S rRNA, Analisis Bioinformatika dan Konstruksi Pohon
Filogenetik
Total produk akhir hasil purifikasi PCR sebanyak 10 µL, dan selanjutnya
disekuensing sesuai dengan protokol standar DNA sekuenser (ABI PRISM 3100)
di Laboratorium 1st Base Singapura. Hasil sekuen nukleotida dibandingkan
dengan GenBank database melalui NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
Untuk analisis filogenetik atau kekerabatan antar isolat bakteri asam laktat
berdasarkan neighbor-joining method, dan menggunakan program Bioedit versi
7.0.4.01 dan Clustal_X.
3 HASIL
Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Susu Jagung Fermentasi
Hasil isolasi dari fermentasi jagung diperoleh 33 isolat bakteri yang
mampu tumbuh pada media agar-agar MRS. Perlakuan pertama diperoleh BAL
sebanyak 22 isolat, JMT sebanyak 7 isolat dan JMA sebanyak 4 isolat (Tabel 1).
Karakteristik Gram berdasarkan pengamatan mikroskopis diketahui terdapat
khamir pada JMB sebanyak 7 isolat dan JMT sebanyak 4 isolat, pada perlakukan
ketiga (JMA) tidak ditemukan isolat khamir. Terdapat bakteri Gram negatif pada
JMB, JMT dan JMA masing-masing 3, 1 dan 1 isolat. Gram positif yang
merupakan tujuan dari penelitian ini diperoleh pada JMB, JMT dan JMA masingmasing 12 , 2 dan 3 isolat (Tabel 1).
Tabel 1 Jumlah isolat bakteri dan khamir hasil isolasi dari susu jagung fermentasi
secara spontan
Jumlah bakteri Gram
Perlakuan
No
Khamir
Total
Isolasi
Gram +
Gram JMB
12
3
7
22
JMT
2
1
4
7
JMA
3
1
0
4
17
5
11
33
Keterangan: JMB; Tabung dibuka dan tidak dipanaskan JMT; Tabung ditutup dan
tidak dipanaskan, JMA; Tabung ditutup dan dipanaskan
Proses isolasi dengan perlakuan dimaksudkan untuk mengetahui asal
populasi BAL. BAL ditemukan paling banyak pada perlakuan pertama yaitu
tabung dibuka dan tidak dipanaskan (JMB) sebanyak 12 isolat (Tabel 1). Tabung
ditutup dan tidak dipanaskan (JMT) serta tabung ditutup dan dipanaskan (JMA)
diperoleh masing-masing 2 dan 3 isolat. Jumlah keseluruhan isolat BAL dari 3
perlakuan tersebut yaitu 17 isolat yang selanjutnya akan dikarakterisasi lebih
lanjut.
8
Terdapat 17 bakteri Gram positif merupakan BAL yang karakteristiknya
diamati berdasarkan kecepatan pertumbuhan, bentuk sel, morfologi koloni, dan
kemampuan menghasilkan enzim katalase (Tabel 2). Bakteri dapat tumbuh setelah
masa inkubasi 24 jam dan 48 jam. Morfologi sel secara umum yaitu basil, kokus,
dan batang pendek. Morfologi koloni secara umum yaitu bulat, cembung, warna
putih susu. Perbedaan ukuran koloni berbeda signifikan ada yang koloninya besar,
sedang dan sangat kecil. Sebanyak 17 bakteri bersifat katalase negatif.
Tabel 2 Karakteristik morfologi BAL hasil isolasi
No
Kode
Isolat
Kecepatan
pertumbuhan
Bentuk
Sel
Morfologi Koloni
Katalase
Bulat cembung, ukuran sedang,
Negatif
putih susu
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
2 JMB 2
Coccus
Negatif
++
susu
Basil
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
3 JMB 4
Negatif
++
pendek susu
Basil
cembung, ukuran kecil, putih
+
4 JMB 6
Negatif
pendek susu
5 JMB 8
Basil
Bulat, ukuran kecil, putih
Negatif
+
6 JMB 9
Basil
Cembung, ukuran kecil,putih.
Negatif
+
7 JMB 10
Basil
Warna krem, pipih, kecil
Negatif
+
Putih susu, cembung, ukuran
+
8 JMB 11
Basil
Negatif
sedang
9 JMB 12
Basil
Bulat,ukuran kecil
Negatif
+
Putih cembung,bulat ukuran
+
10 JMB 13
Basil
Negatif
sedang
Bulat, warna krem, ukuran sangat
11 JMB 14
Basil
Negatif
++
kecil
12 JMB 18
Basil
Putih, sangat kecil
Negatif
+
Bulat cembung, ukuran
13 JMB 19
Basil
Negatif
sedang,putih
++
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
14 JMT 1
Basil
Negatif
+
susu
Basil
Bulat cembung, ukuran sedang,
+
15 JMT 6
Negatif
pendek putih susu
Basil
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
+
16 JMA 1
Negatif
pendek susu
Basil
Bulat pipih, ukuran sedang, putih
+
17 JMA 2
Negatif
pendek susu
Keterangan: JMB: Tabung dibuka dan tidak dipanaskan JMT: Tabung ditutup dan
tidak dipanaskan, JMA: Tabung ditutup dan dipanaskan , ++ : koloni
tumbuh pada jam ke 24, + : Koloni tumbuh pada jam ke-48.
1 JMB 1
+
Basil
Data hasil isolasi tersebut di tentukan berdasarkan identifikasi Kandler dan
Weiss (1995) dalam Bergey's Manual Systematic Bacteriology yaitu bakteri
bersifat Gram positif, basil, tidak berspora dan katalase negatif dimasukkan dalam
9
kategori Lactobacillus spp. Bakteri hasil isolasi yang merupakan Gram positif,
bentuk selnya basil dan bersifat katalase negatif merupakan genus Streptococcus
spp. Hasil isolasi diperoleh 16 genus Lactobacillus spp. dan 1 genus
Streptococcus spp. pada Tabel diberi kode JMB 2.
Penapisan Bakteri Asam Laktat Menggunakan Karakteristik Organoleptik
dan Kemampuan Mempertahankan Aroma
Kemampuan bakteri dalam mempengaruhi sifat organoleptik sangat
penting dalam pengembangan suatu produk karena hal ini menentukan
penerimaan konsumen terhadap susu jagung fermentasi. Penilaian konsumen
terhadap kesukaan suatu produk ditentukan oleh warna, kekentalan, dan aroma.
Uji organoleptik susu jagung fermentasi pada penelitian ini meliputi uji warna,
kekentalan, dan aroma (Tabel 3).
Tabel 3 Rata-rata mutu organoleptik susu fermentasi jagung berdasarkan
karakteristik warna, kekentalan, dan aroma
N
Kode
Warna
Aroma
Kekentalan
o
isolat
1
JMB 1
Agak kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
2
JMB 2
Agak kuning
Khas jagung
Kental
3
JMB 4
Kuning
Agak khas yoghurt Kental
4
JMB 6
Sangat Kuning
Khas yoghurt
Amat Sagat kental
5
JMB 8
Kuning
Khas jagung
Agak Tidak kental
6
JMB 9
Sangat Kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
7
JMB 10 Kuning
Khas jagung
Agak kental
8
JMB 11 Kuning
Agak khas yoghurt Agak Tidak kental
9
JMB 12 Sangat Kuning
Khas yoghurt
Amat Sagat kental
10 JMB 13 Sangat Kuning
Khas yoghurt
Amat Sagat kental
11 JMB 14 Sangat Kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
12 JMB 18 Kuning memudar Alkohol
Sangat Encer
13 JMB 19 Kuning
Agak khas yoghurt Sangat kental
14
JMT 1
Agak kuning
Alkohol
Agak Tidak kental
15
JMT 6
Kuning memudar Agak Asam
Agak Tidak kental
16
JMA 1
Kuning memudar Khas jagung
Agak kental
17
JMA 2
Agak kuning
Khas jagung
Agak kental
Keterangan: JMB: Tabung dibuka dan tidak dipanaskan JMT: Tabung ditutup dan
tidak dipanaskan, JMA: Tabung ditutup dan dipanaskan. Aroma :
khas yoghurt (7), agak khas yoghurt (6), khas jagung (5), asam (4),
agak asam (3), sangat asarn (2), alkohol (1). Kekentalan: amat
sangat kental (7), sangat kental (6), kental (5), agak kental (4), agak
tidak kental (3), tidak kental (2), sangat encer (1)
Hasil uji organoleptik (Tabel 3) setelah diinokulasi isolat yang berbeda
memperlihatkan pengaruh terhadap warna, aroma dan kekentalan fermentasi susu
jagung. Warna dinilai oleh panelis setelah diinokulasikan BAL menunjukkan
kisaran perubahan warna dari nilai sangat kuning, kuning, kuning memudar, agak
10
kuning masing-masing mempengaruhi 5 isolat, 5 isolat, 3 isolat, 4 isolat secara
berurutan. Penilaian panelis terhadap aroma susu jagung menunjukkan khas
yoghurt, agak khas yoghurt, khas jagung, agak asam dan aroma alkohol masingmasing mempengaruhi 3 isolat, 6 isolat, 5 isolat, 1 isolat, 2 isolat secara
berurutan. Kekentalan: amat sangat kental, sangat kental, kental, agak kental, agak
tidak kental, encer masing-masing dipengaruhi 3 isolat, 4 isolat, 2 isolat, 3 isolat,
4 isolat, 1 isolat secara berurutan.
Bakteri yang dapat memberi karakteristik yang baik dari segi warna,
aroma dan kekentalan akan di seleksi berdasarkan rata-rata hasil organoleptik
(Lampiran 2). Penilaian panelis berdasarkan rata-rata karakteristik organoleptik
susu jagung fermentasi diperoleh 8 isolat bakteri rata–rata tertinggi yaitu
Lactobacillus JMB 1, Lactobacillus JMB 4, Lactobacillus JMB 6, Lactobacillus
JMB 9, Lactobacillus JMB 12, Lactobacillus JMB 13, Lactobacillus JMB 14,
Lactobacillus JMB 19 (Lampiran 2) yang selanjutnya akan diseleksi berdasarkan
kemampuan mempertahankan aroma setelah penyimpanan.
Untuk mendapatkan bakteri yang dapat mempertahankan aroma sampai
waktu yang cukup lama, maka selanjutnya dilakukan penapisan BAL yang dapat
memberi aroma terbaik pada masa simpan 6 bulan (Gambar 1).
7
Skala Organoleptik
6
5
4
3
2
1
JMA2
JMA1
JMA6
JMT1
JMB19
JMB18
JMB 14
JMB13
JMB12
JMB11
JMB10
JMB8
JMB 9
JMB6
JMB4
JMB2
JMB 1
0
Kode Isolat
Gambar 1 Rata-rata mutu organoleptik berdasarkan karakteristik aroma setelah
penyimpanan 6 bulan pada suhu 4oC. 1 (sangat tidak suka), 2 (tidak
suka), 3 (agak tidak suka), 4 (agak suka), 5 (suka), 6 (sangat suka) dan
7 (amat sangat suka).
Berdasarkan penilaian panelis, susu jagung fermentasi pada taraf suka
dengan nilai 5 diperoleh 2 isolat bakteri yang dapat mempertahankan aroma
setelah penyimpanan 6 bulan pada suhu 40C yaitu Lactobacillus JMB 4,
Lactobacillus JMB 6 (Gambar 1). BAL tersebut akan digunakan pada proses
penelitian selanjutnya.
11
Penapisan Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Menghasilkan
Antimikrob
Metode Antagonis Langsung Menggunakan Bakteri Patogen S.aureus dan
E.coli
Aktivitas penghambatan BAL menggunakan bakteri uji S.aureus dan
E.coli (Tabel 4). Berdasarkan hasil uji terdapat 13 isolat yang memiliki
kemampuan aktivitas antimikrob terhadap S. aureus.
Tabel 4 Aktivitas antimikrob isolat pada S.aureus dan E.coli melalui uji
antagonism
Aktivitas Antimikrob
No
Kode Isolat
S.aureus
E.coli
1
Lactobacillus JMB 1
+
2
Streptococcus JMB 2
++
3
Lactobacillus JMB 4
4
Lactobacillus JMB 6
++
5
Lactobacillus JMB 8
+
6
Lactobacillus JMB 9
+++
7
Lactobacillus JMB 10
+
8
Lactobacillus JMB 11
++
9
Lactobacillus JMB 12
10
Lactobacillus JMB 13
+++
11
Lactobacillus JMB 14
+++
12
Lactobacillus JMB 18
+
13
Lactobacillus JMB 19
++
14
Lactobacillus JMT 1
+
15
Lactobacillus JMT 6
+++
16
Lactobacillus JMA 1
17
Lactobacillus JMA 2
Keterangan : - = tidak memiliki daya hambat, + =0.5 mm-0.6mm, ++=0.70.8mm, +++ = 0.9 - 1.0 mm.
Aktivitas antimikrob terbesar yaitu 0,9-1,0 mm dihasilkan oleh isolat
Lactobacillus JMB 9, Lactobacillus JMB 13, Lactobacillus JMB 14 dan
Lactobacillus JMT 6 secara berturut-turut. Aktivitas antimikrob pada kisaran 0.70.8 mm yaitu Lactobacillus JMB 2, Lactobacillus JMB 6, Lactobacillus JMB 11,
Lactobacillus JMB 16, Lactobacillus JMB 19. Bakteri menghambat pada
Sthapylococcus aureus tetapi tidak menghambat bakteri uji E. coli.
Penapisan BAL Penghasil Bakteriosin Menggunakan Metode Sumur
Penapisan selanjutnya hanya menggunakan supernatan untuk mengetahui
kemampuan metabolit yang dihasilkan BAL untuk menghambat S. aureus dan
untuk mengetahui senyawa antimikrob yang dihasilkan. BAL yang memperoleh
zona hambat terbesar pada pH 4 yaitu: Lactobacillus JMB 9, Lactobacillus JMB
13, Lactobacillus JMT6, Lactobacillus JMB 6 masing masing daya hambat 27
mm, 25 mm, 18 mm, 17 mm (Tabel 5).
12
Tabel 5 Indeks penghambatan (IP) supernatan kultur BAL umur 24 jam terhadap
bakteri Staphylococcus aureus
Rata-rata index penghambatan
(IP) supernatan
No
Kode isolat
IP±SE
pH 4
pH 6
1
Lactobacillus JMB 1
1,55 ±1,5
2
Streptococcus JMB 2
1,25±1,5
3
Lactobacillus JMB 6
1,70±5
0,5±0,5
4
Lactobacillus JMB 9
2,70±0
5
Lactobacillus JMB 10
1,30±0,5
6
Lactobacillus JMB 11
1,05±9
7
Lactobacillus JMB 13
2,50±1
8
Lactobacillus JMB 14
1,40±0,5
10
Lactobacillus JMB 18
0,95±0,5
11
Lactobacillus JMB 19
1,10±0
12
Lactobacillus JMT1
13
Lactobacillus JMT6
1,80±5
Keterangan: IP: index penghambatan, SE: standar error, (-): tidak memiliki daya
hambat terhadap bakteri uji.
Pada pH 6 hanya diperoleh 1 isolat yang menghasilkan luas penghambatan
0.5 (Tabel 5). Berdasarkan hasil penapisan BAL tersebut diperoleh 1 bakteri yang
diduga menghasilkan bakteriosin yaitu Lactobacillus JMB 6 .
Fase Turbidimetrik Bakteri Asam Laktat
Kurva pertumbuhan ini dimaksudkan untuk mengetahui fase serta jumlah
sel pada nilai OD tertentu. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui jumlah sel
yang diinokulasikan pada saat pengujian. Fase eksponensial dimulai pada OD 0.8
dengan jumlah sel ± 1 x 1010 sel/ml pada masa inkubasi 12 jam. Hal ini akan
menjadi pedoman dalam inokulasi dan produksi bakteriosin BAL pada pengujian
selanjutnya.
Fase pertumbuhan dapat menjadi gambaran dalam sintesis senyawa yang
dihasilkan misalnya bakteriosin yang merupakan substansi antibakteri yang disintesis
langsung di ribosom selama pertumbuhan bakteri asam laktat (pada fase
eksponensial), sehingga bakteriosin disebut sebagai metabolit primer. Sedangkan
fase stasioner dihasilkan metabolit sekunder. Fase pertumbuhan bakteri asam laktat
(BAL) terdiri atas fase lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian.
Bakteri melakukan proses penyesuaian terhadap kondisi lingkungan seperti
pH, suhu, nutrisi yang juga disebut fase lag. Fase ini merupakan proses peningkatan
jumlah sel bakteri yang lambat karena masih berada pada tahap mempersiapkan
materi-materi dan organel dalam sel untuk perkembangan dan pembelahan sel. Fase
lag BAL pada penelitian ini terjadi selama jam ke 6 sampai jam ke-11 (Gambar 2).
Fase kedua adalah fase eksponensial yang merupakan fase pertumbuhan bakteri yang
berlangsung cepat. Fase eksponensial terjadi pada jam ke-11 sampai jam ke-13
(Gambar 2) yang juga fase dimana terjadi proses sintesis senyawa bakteriosin. Fase
berikutnya adalah fase stasioner, pada fase ini tidak terjadi penambahan jumlah
13
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
14
12
10
8
6
4
Log 10 Jumlah Sel
Absorbansi (OD) 600 nm
bakteri karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati, hal ini
terjadi dari jam 12 sampai jam ke 21 (Gambar 2), pada fase ini senyawa metabolit
sekunder di produksi, misalnya senyawa asam laktat yang merupakan hasil metabolit
sekunder bakteri asam laktat.
2
0
6 10.5 12 13.5 15 16.5 18 19.5 21 22.5 24
Waktu (Jam)
OD
TPC
Gambar 2 Kurva pertumbuhan isolat JMB 6
Fase terakhir adalah fase kematian, fase kematian pada pertumbuhan
bakteri terjadi mulai jam ke-22 terjadi penurunan jumlah sel bakteri karena nutrisi
dalam media mulai habis (Lampiran 5). Bakteri umumnya memproduksi metabolit
sekunder yang disintesis selama fase stasioner pada masa pertumbuhan bakteri.
Uji Organoleptik Susu Fermentasi Jagung Menggunakan Inokulum Bakteri
Asam Laktat (BAL) Terpilih
Berdasarkan penapisan antimikrob BAL yang terpilih merupakan bakteri
dengan yang mampu menghasilkan zona bening pada pH 6. Kandidat BAL yaitu
Lactobacillus JMB 6. Bakteri terpilih diinokulasi pada susu jagung, susu jagung
yang ditambahankan bakteriosin serta susu jagung tanpa perlakuan akan
dibandingkan dalam kemampuan bakteri mempertahankan aroma.
Tabel 6 Nilai rataan uji mutu penerimaan konsumen terhadap aroma susu jagung
fermentasi setelah masa simpan 5-6 hari
No
Perlakuan
Rata-rata mutu aroma
1
Kontrol (Tanpa bakteri)
2.35 a
2
Kontrol (Bakteriosin)
4.7 b
5
Lactobacillus JMB6
4.9b
Keterangan: a,b,): Nilai dengan huruf superskrip di belakang angka yang berbeda
pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p