Pertumbuhan Tanaman Dan Isolasi Protoplas

BAB II BAHAN, ALAT DAN METODE

i. Pertumbuhan Tanaman Dan Isolasi Protoplas

kekurangan nitrat reduktase. Streptomycin tahan mutan ganda tanaman nicotiana tabacum NRSR ditumbuhkan dalam hidroponik sebagai pra viously dijelaskan Hamil et al, 19830. Protoplas diisolasi dari daun mesofil dari nicotiana tabacum NRSR seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk kekrurangan nitrat reduktase mutan dari nicotiana tabacum. Kalus induksi pembentukan suspensi sel dan isolasi protoplas dari nicotiana rustica cv VL2 adalah seperti yang dijelaskan untuk nicotiana tobacum. Alat Protoplas dari nicotiana rustica diisolasi dari 2-3 bulan suspensi sel tua. ii. Fusion Protoplas, Kultur Protoplas, Dan Pemilihan Somatik Kalus Hybrid Fusionpenggabungan dilakukan antara protoplas daun mesophyil dari nicotiana tabacum dan protoplas suspensi sel nicotiana rustica dengan mengikuti tinggi metode pHCa + + Keller dan Melchers, 1973. Frekuensi pembentukan heterokarion dihitung dengan pengamatan mikroskopis dari jumlah heterokarion utuh yang mncul di antara protoplas tertua 12 jam setelah kultur campuran pasca fusi protoplas. Heterokarion yang diketahui dari kloroplas mesofil induk dan helai padat sitoplasma dari suspensi sel induk . Setelah perlakuan fusionpenggabungan, protoplas dihentikan pada MS-i menengah 1962 media murashige dan skoog dimodifikasi dengan menghilangkan anorganik nitrogen dan dengan penambahan 6 mM L-glutamine, 2 mM asam L-aspartat, 1 mM L-arginine dan 01 m glisin, dengan 2 mg 1 NAA napthaleneacetic a asam dan 05 mg l BAP -6 benzilaminopurin yang mengandung 9 persen w v manitol, pH 58 sebelum di sterilisasi filter. Protoplas dikultur di 5 cm cawan petri A S Nunclon Kamstrup, Roskilde, Denmark, kemudian di 4 ml cairan MS-I menengah lebih dari 4 ml MS-i media dipadatkan dengan 0-6 persen w v agar Sigma dalam cahaya kontinyu 600 lux pada 24 ± 2 °C. Kepadatan awal protoplas adalah 5 x l0 protoplas mI di lapisan cair. Setelah protoplas berkembang menjadi koloni sel kecil 10-12 hari, sekitar 30 sel, sel dipindahkan ke sebuah pemilihan tersebut seleksi media ditunjuk sebagai MS-2 - media MS yang dimodifikasi dengan menggunakan 38 mM KNO3 bukan konsentrasi biasa NH4NO3 dan KNO3, 1 mM streptomisin sulfat dengan mg 0L l NAA dan 0-5 mg l BAP yang mengandung 4 - 5 persen b v manitol, pH 5-8 sebelum sterilisasi filter. Koloni yang berbudaya di 10 ml dari MS-2 media, ditempatkan di atas 10 ml dari MS-2 media kemudian dipadatkan dengan 06 w v agar, dengan kepadatan dari 10 koloni ml dalam lapisan cair di 9 cm petri hidangan Sterilin Ltd, Teddington, UK di bawah cahaya konstan neon 2000 lux pada 24 ±2° C. Osmotikum dalam medium diturunkan seperti yang dijelaskan sebelumnya Pental et aL, 1982b. iii. Tembak Regenerasi Dan Transfer Ke Rumah Kaca Koloni hijau pulihrecovery dari media seleksi dan yang sekitar 10 mm dipindahkan untuk menembak regenerasi media MS-3-MS yang mengandung 0,5 mg l BAP dan 2 mg 1_I IAA Gambar 1. a b PLATE 1 a. Vegetatif umum dan morfologi bunga kiri ke kanan dari nitrat reduktase kekurangan tahan mutan ganda streptomycin dari nicotiana tabacum NRSR, hibrida somatik dan induk nicotiana rustica. Nicotiana tabacum NRSR adalah tanaman kerdil dan menunjukkan chlorisis daun karena kekurangan nitrogen. Karakter kurcaci dari nicotiana tabacum NRSR diwariskan dari ibu yang nicotiana tabacum SRi yang merupakan tembakau kerdil. Menunjukkan tanaman hibrida semangat heterosis dalam pertumbuhan vegetatif nya. PLATE 1 b. Morfologi bunga kiri ke kanan dari nicotiana rustica, hibrida somatik dan nicotiana tabacum NRSR. Hybrid bunga adalah antara karakteristik, dan memiliki ovarium hitam berdinding seperti nicotiana ruslica induk. Gambar 2.a PLATE 2 a. Isoelektrik fokus dari Fraksi 1 protein dari nicotiana tabacum NRSR jalur f, nicotiana rustica lane h dan hibrida 1-10 lajur a-c, g, i-I. Semua sepuluh hibrida memiliki satu choroplast dikodekan polipeptida subunit besar nicotiana tabacum dan dikodekan nuklir polipeptida subunit kecil dari kedua orang tua. Hybrid II dianalisis pada gel lain dan ditemukan memiliki pola pita mirip dengan hibrida yang digambarkan. Gambar 2.b PLATE 2 b. Isoelektrik fokus dari esterases daun nicotiana rustica jalur, nicotiana tabacum NRSR jalur b, campuran nicotiana rustica, nicotiana tabacum jalur c dan hibrida somatik I-Il jalur d-n. Semua sebelas regeneran memiliki band karakteristik dari kedua induknya. Hibrida 8 jalur k dan 11 jalur n kekurangan nicotiana rustica Band induk menunjukkan variabilitas antara hibrida. indole-3-acetic acid, pH 5 - 8 sebelum autoklaf. Kultur dipelihara pada 24 ± 2 ° C di bawah lampu neon konstan 3000 lux. Tunas regenerasi yang dipotong dan ditanam di media MS dipadatkan dengan agar- agar. Ketika tunas dengan panjang 5 cm atau lebih tinggi, dan telah dikembangkan akar, mereka dipindahkan ke rumah kaca dan tumbuh sebagai untuk jenis liar nicotiana tabacum Pental et aL, l982b. iv. Analisis Tanaman Untuk Bukti Hibriditas Tanaman diregenerasi dari koloni yang dipilih ditandai untuk vegetatif dan morfologi bunga. Tanaman juga ditandai biokimia oleh isoelektrik fokus dari fraksi 1 polipeptida protein dan esterase daun. Fraksi protein 1 analisis dilakukan dengan menggunakan metode Cammaerts dan Jacobs 1980. Polimerisasi isoelektrik fokus gel dilakukan dengan amonium persul- Nasib bukan riboflavin. Untuk analisis esterases daun, protein yang diekstrak dari tanaman di tahap berbunga. Ekstraksi penyangga adalah sama seperti yang digunakan untuk fraksi 1 analisis protein. Sebuah sampel dari 100 g protein, yang diukur dengan metode Lowry et al. 1951, diaplikasikan 05 mm tebal poliakrilamida pre-cast gel pH gradien 35-95, LKB. Isoelektrik fokus dilakukan untuk 4 h 1500 V, max saat 15 mA, 10 ° C dan gel.  

BAB III HASIL