Analisis Ekspresi mRNA Gen GH Eksogen

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (3), 2016, 197-205

Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra

  

IDENTIFIKASI IKAN CUPANG ( Betta imbellis ) TRANSGENIK FOUNDER M EM BAWA GEN

_{*)# **) **) **)}

PENYANDI HORM ON PERTUM BUHAN

_*)

Eni Kusrini , Alimuddin , M uhamm ad Zairin Jr. , dan Dinar Tri Sulistyowati

Program Pascasarjana Ilmu Akuakult ur, Departemen Budidaya Perairan, FPIK, Institut Pert anian Bogor

_**)

Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Ikan Hias

De part emen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Ke laut an, Institut Pert anian Bogor

  ABSTRAK

Penelitian dilakukan untuk mengidentifikasi keberhasilan introduksi gen penyandi hormon pertumbuhan

( Growt h Hormone , GH) pada induk F-0 ikan Bet t a imbellis . Ikan transgenik F-0 dibuat dengan menggunakan

metode transfeksi. Identifikasi dilakukan menggunakan metode RT-PCR. RNA total diekstraksi dari embrio

pooled sample hasil persilangan induk transgenik dan non-transgenik. Berdasarkan analisis ekspresi gen

pada embrio juga menunjukkan adanya aktivitas ekspresi gen GH pada semua perlakuan dibandingkan

dengan kont rol (embrio hasil persilangan non-t ransgenik x non-transgenik). Jumlah individu induk F-0

yang membawa gen GH eksogen berdasarkan analisis PCR dengan DNA t emplat e dari sirip ekor adalah

se banyak 16%. Individu posit if me mbawa ge n GH e ksoge n t e rse but dibe sarkan le bih lanjut unt uk

memproduksi Bet t a imbellis transgenik F-1. Kandidat ikan transgenik jantan F-0 dikawinkan dengan ikan

non-t ransge nik bet ina, sedangkan t ransgenik F-0 be tina dikawinkan de ngan non-transge nik jant an.

Sebanyak 30-50 butir embrio hasil pemijahan F-0 digabung, kemudian DNA genom diekstrak. Sebagian

embrio digunakan untuk ekstraksi RNA total untuk analisis ekspresi mRNA GH eksogen. Hasil analisis PCR

menunjukkan bahwa semua sampel embrio dari induk transgenik F-0 dapat terdeteksi gen GH eksogen,

sedangkan untuk kontrol (non-transgenik) tidak terdeteksi. Ekspresi mRNA juga terdeteksi pada embrio

F-1. Dengan demikian, metode transfeksi embrio Bet t a imbellis efektif digunakan untuk menghasilkan ikan

transgenik, dan sangat berpotensi menghasilkan individu F-1 dengan pertumbuhan lebih

  Bet t a imbellis ce pat.

  KATA KUNCI: Betta imbellis ; hormon pertumbuhan; identifikasi induk F-0

ABSTRACT: Identification of transgenic founder betta fish ( Bet t a imbelis) carried growth hormone gene. By:

Eni Kusrini, Alimuddin, M uhammad Zairin Jr., and Dinar Tri Sulistyowati

The st udy was conduct ed t o ident ify t he successful int roduct ion of t he growt h hormone gene (Growt h Hormone, GH)

on t he F-0 Betta imbellis broodst ock. The F-0 t ransgenic fish was made t hrough t ransfect ion met hods. Ident ificat ion

was done using RT-PCR met hod. Total RNA was ext ract ed from pooled embr yos sample. Based on t he analysis of gene

expression in embryos also showed act ivit y GH gene expression in all t reat ment s compared t o t he cont rol (non-

t ransgenic x non-t ransgenic). The number of individuals F-0 which carried exogenous GH gene by PCR analysis of t he

DNA t emplat e of t he t ail fin was as much as 16%. Posit ive individuals carried t he exogenous GH gene raised furt her t o

produce t ransgenic F-1 B. imbellis. Candidat e of t ransgenic F-0 males fish were mated with non-transgenic female fish,

whereas t he transgenic F-0 females were mat ed with non-transgenic males. The 30-50 embryos obtained were combined,

t hen t heir genomic DNA were ext ract ed. Some of t he embryos was used for t he ext ract ion of t ot al RNA for analysis of

mRNA expression of GH exogenous. The PCR analysis showed t hat all samples of embryos from t he t ransgenic F-0

broodst ock could be det ect ed, whereas for t he cont rol (non-t ransgenic) was not det ect ed. mRNA expression was also

det ect ed in embryos of F-1. The average weight of t he F-0 broodst ocks were 1.55 g and a t ot al lengt h was 12.97 cm.

Thus, t he t ransfect ion met hods t hrough bet t a embryos peaceful effect ively generat ed t ransgenic fish, and pot ent ially

produced fast growt h of individuals F-1 Betta imbellis. _# KEYW ORDS: Betta imbellis; growth hormone; verification of F-0 broodstock

  Ko re spo nd e nsi: Pro gram Pascasarjana Ilm u Akuakult ur, Dep arte m e n Budid aya Pe rairan, FPIK, IPB. Jl. Rasam ala, Kam pus

  IPB Dram aga, Bogo r 16680, Ind o ne sia. Te l.: + (0251) 8627076 _{ennyper ikanan@ yahoo.com} E-m ail:

  197

  Identifikasi ikan cupang (Betta imbellis) trasgenik fouder membawa ..... (Eni Kusrini) PENDAHULUAN

  lac

  t ransmit t er

  untuk memproduksi betta giant selain melalui seleksi dapat juga me lalui aplikasi t ransge ne sis. Me t o de transgenesis dengan mengintroduksikan gen GH ke embrio telah berhasil dilakukan, dan telah didapatkan individu F-0. Pada penelitian ini dilakukan identifikasi terhadap induk-induk F-0 yang merupakan germline

  B. imbellis ). Upaya

  . Keberadaan gen GH eksogen pada embrio d ari p e m ijah a n ika n F-0 d e n gan n o n -t ran s ge nik dianalisis me nggunakan metode PCR, dan ekspresi mRNA d iuji me nggunakan me t o de RT-PCR unt uk mengevaluasi potensi dihasilkannya ikan betta cepat tumbuh. Ikan betta cepat tumbuh sedang menjadi tren pasar yang dike nal dengan betta giant. Betta giant memiliki ukuran yang lebih besar (> 7 cm) dari ukuran betta normal (3-4 cm ukuran normal

  t ransmit t er

  Pada penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi terhadap induk-induk F-0 yang merupakan germline

  et al ., 2014).

  menggunakan metode transfeksi efektif pada individu F-0 dan didapatkan sebesar 16% (Kusrini

  Bet t a i m b el l i s

  Be rdasarkan hasil pe nelit ian sebelumnya unt uk in t r o d u k s i g e n GH t e r h a d a p

  Z pada ikan transgenik st abil menunjukkan intensitas yang bervariasi pada organ d a n ja rin ga n ya n g b e rb e d a d a n ka d a n g-ka d a n g bervariasi pada sel-sel yang berbeda dalam jaringan yang sama pada ge nerasi t ransge nik pe rt ama dan kedua.

  lac

  Z dengan promoter  -aktin ikan mas pada ikan nila menunjukkan adanya pola mosaic dari ekspresi lac Z pada jaringan somatik berbeda antar garis keturunan, tetapi konsisten dalam satu garis keturunan. Analisis ekspresi gen reporter pada jaringan yang didasarkan pada ekspresi gen

  ., 2008). Tin g ka t e ks p re s i t ra n s g e n p a d a o rg a n is m e transgenik yang stabil dipengaruhi oleh banyak faktor, te rutama promo te r yang me nge ndalikan transge n, jumlah kopi transgen dalam ge no m, dan int eraksi antara transgen dan sekuens yang mengapit transgen (Rahman et al ., 2000). Selanjut nya dikatakan o le h Rahman et al . (2000) yang mengintroduksi gen reporter

  Pada ikan dan vertebrata lainnya, pertumbuhan d iko n t ro l a n t a ra la in o le h ke b e ra d a a n h o rm o n pertumbuhan. Transfer gen growt h hormone (GH) telah diaplikasikan pada beberapa spesies ikan budidaya dan t e rbukt i ma mpu me ningkat kan pe rt umbuhannya. Keberhasilan penelitian transfer gen telah dilakukan terhadap ikan-ikan konsumsi dengan menggunakan gen hormon pertumbuhan di antaranya adalah ikan salmon t ransgenik dengan menggunakan promoter

  et al

  ., 1982). Be rdasarkan pe ne litian ini maka dipe ro le h petunjuk untuk keberhasilan produksi ikan transgenik de ngan pe rt umbuhan yang ce pat , yait u re gulat o r t rans ge n d ari sp e sie s ya ng ke ke ra bat an nya ja uh ke mungkinan t idak dike nali o le h RNA gen asing. Na m u n d e m ikia n , h a s il o b s e r va s i s e la n ju t n ya menunjukkan bahwa transgenik GH yang berasal dari s p e s ie s ya n g ke k e ra b a t a n n ya d e k a t e fe kt if me ningkat kan pe rt umbuhan he wan inang, t e t api ap abila me nggu nakan s e kue ns ge n GH h o mo lo g dengan promoternya yang sama dari spesies yang sama ke mungkinan t idak t e rlalu e fe kt if kare n a adanya potensi pengaturan umpan balik negatif (Nam

  et al

  Peningkatan laju pertumbuhan ikan merupakan salah satu motivasi awal pada rekayasa genetika ikan yang d id a sa rka n p a da p e n e lit ia n b a h wa t iku s se ca ra signifikan dapat ditingkatkan setelah diintroduksi gen hormon pertumbuhan tikus tanah (sekuen heterolog) yang disambungkan dengan promoter met allot hionein (MT) t ikus ke dalam ge no m t ikus (Palmit e r

  ., 2001), dan ikan nila dengan pertumbuhan 2-7 kali lebih cepat (Kobayashi et al ., 2007).

  et al

  bahwa ikan mas, ikan salmon, no rthe rn pike , ikan loach, ikan trout, dan ikan lele dapat ditransformasi dengan berbagai hormon pertumbuhan dengan pro - moter yang berbeda untuk memproduksi ikan dengan p e n in g ka t a n p e rt u m b u h a n le b ih d a r i 1 0 0 % d ib an d in gkan ko n t ro l (Ha cke t t , 1 99 3 ). Ge n GH merupakan salah satu gen target yang paling banyak digunakan dalam t ransgenik ikan. Transfe r gen GH telah diaplikasikan pada ikan salmon sehingga dapat tumbuh lebih cepat dari ikan normal (Devlin et al ., 1994), ikan mud loach dengan kecepatan tumbuh 32 kali lebih cepat (Nam

  et al ., 1992). Hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan

  ., 198 7). Pada sa at ini b e rk e m b a n g p ro d u k s i ik a n t r a n s ge n ik d e n g a n menggunakan gen GH yang berasal dari ikan (Du

  et al

  Ho rmo n pe rt umbuhan m e rupakan bagian dari ho rmo n yang disirkulasika n u nt u k m e ns t im ula si p e rt u m b u h a n t u b u h . Pa d a a wa l p r o d u ks i ik a n transgenik digunakan gen GH dari manusia atau tikus yang disambungkan dengan promoter metalotionein- 1 dari t ikus (Macle an

  et al ., 2001).

  d a n g e n p e n ya n d i h o rm o n pertumbuhan yang diisolasi dari ikan salmon, ikan nila transgenik menggunakan promoter  -aktin medaka dan gen GH dari ikan nila (Yaskowiak et al ., 2006), serta ikan mud loach transgenik menggunakan pro - moter  -aktin dan GH dari ikan mud loach (Nam

  m et h al l ot h i on ei n

  . Keberadaan gen GH eksogen pada embrio d ari p e m ijah a n ika n F-0 d e n gan n o n -t ran s ge nik dianalisis me nggunakan metode PCR, dan ekspresi mRNA d iuji me nggunakan me t o de RT-PCR unt uk mengevaluasi potensi dihasilkannya ikan betta cepat tumbuh. amplifikasi PCR adalah: pradenaturasi 94°C selama lima me nit; de nat urasi 94°C selama 30 detik, annealing 58°C selama 30 detik, dan ekstensi 72°C selama 30 de tik sebanyak 35 siklus; dan e kste nsi akhir 72°C selama tiga menit.

  Gen  -aktin digunakan sebagai kontrol internal

  Isolasi RNA total diekstraksi dari 50 sampel (butir telur) dilakukan me ngikuti prosedur Tri Reagent Kit ( M RC/ © 2 0 1 5 M ol ecu l ar Resea r ch Cen t er , In c . ) . Selanjutnya cDNA disintesis menggunakan Transcriptor

  loading DNA. Primer yang digunakan adalah primer

  F : 5’- TAT GAA GGT TAT GCT CTG CCC -3’, dan primer b-aktin R : 5’- CAT ACC CAG GAA AGA TGG CTG-3’ (Alimuddin, tidak dipublikasikan). Amplifikasi PCR dilakukan dengan program: pradenaturasi 94°C selama t ig a m e n it ; d e n a t u ra s i 9 4 °C s e la m a 3 0 d e t ik ,

  annealing 62°C selama 30 detik dan e kst ensi 72°C

  selama 30 detik sebanyak 35 siklus; dan ekstensi akhir 72°C selama tiga menit.

  Pro d u k a m p lifik a s i PCR d is e p a ra s i d e n ga n e le k t r o fo r e s is m e n gg u n a k a n g e l a g a ro s a 1 %. Dokumentasi dilakukan menggunakan gel doc UV transiluminator. Target amplifikasi untuk Ph GH adalah 334 bp, dan  -aktin adalah 300 bp.

  Analisis Ekspresi mRNA Gen GH Eksogen

  Fi r st St r an d cD NA Syn t h esi s Ki t d e n ga n p r im e r

  konsentrasinya 200 ng/µL), dan nuclease free wat er sampai volume total menjadi 25 µL. Program

  dT3’RACE-VECT (5’GTA ATA CGA ATA ACT ATA GGG CAG GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT-3’). Analisis e kspre si dilakukan menggunakan RT-PCR. Primer yang digunakan CcBA- PhGH-F : 5’- TCT TTA GTC AAG GCG CGA CAT TCG

  AGA-3’, 1 µL primer CcBA-PhGH-R : 3’- CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT TCA-5’ (Dewi et al ., 2010).

  Proses amplifikasi dijalankan pada mesin PCR Applied Biosystem dengan program suhu denaturasi awal 94°C selama tiga menit; suhu denaturasi 94°C selama 30 de t ik, s uhu

  annealing

  6 2°C s e lam a 3 0 de t ik d an ekstensi 72°C se lama satu detik; siklus ini diulang sebanyak 35 kali; diakhiri dengan ekstensi akhir 72°C selama tiga menit dan pengkondisian akhir pada suhu 4°C. Sebagai kontrol internal digunakan gen  -aktin unive rsal. De t e ksi ge n  -akt in dilakukan de n gan menggunakan metode RT-PCR dengan primer bact-F (5’-TAT GAA GGT TAT GCT CTG CCC-3’) dan bact-R (5’-CAT ACC CAG GAA AGA TGG CTG-3’) (Alimuddin, tidak dipublikasi). Panjang fragmen

• aktin universal yang diapit oleh kedua primer tersebut sekitar 300 bp. PCR dilakukan dengan program denaturasi awal 94°C selama tiga menit; suhu denaturasi 94°C selama 30 detik, suhu

  

  annealing

  GH: 5’-CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT TCA-3’; (Dewi et al ., 2012), 2 µL DNA (berapa

  199

  DNA dilakukkan menggunakan

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (3), 2016, 197-205 BAHAN DAN M ETODE Pemeliharaan Calon Induk dan Pem ijahan Ikan Transgenik F-0

  Calon induk ikan transgenik F-0 yang membawa gen GH eksogen pada sirip dipelihara sampai mencapai umur 7-9 bulan (matang gonad). Pakan yang diberikan untuk pembesaran dan pematangan gonad induk-induk F-0 berupa bloodworm (larva chironomus beku) dan

  t ubifex yang dibe rikan secara berse ling se hari dan secara ad libit um .

  Pemijahan berpasangan 1:1 dilakukan secara alami di dalam wadah berupa baskom. Induk yang digunakan masing-masing be rjumlah tiga ekor de ngan jant an rataan panjang 5,48 ± 0,13 cm dan bobot 2,56 ± 0,23 g; sedangkan betina rataan panjang 4,98 ± 0,33 cm dan bobot 2,44 ± 0,60 g. Persilangan dilakukan secara resiprokal yaitu menggunakan induk transgenik dengan induk non-transgenik masing-masing dengan tiga ulangan induk yang berbeda. Perlakuan A (induk jantan transgenik x betina transgenik); perlakuan B (induk jantan t ransge nik x be tina non-transge nik); perlakuan C (induk jant an non-t ransgenik x betina t ran sge nik); dan pe rlaku an D (induk jant an no n- t ransge nik x bet ina no n-t ransge nik). Pe ngambilan sampel berupa embrio hasil pemijahan masing-masing pasangan induk secara pooled sample (50 butir).

  Analisis DNA Genom

  DNA genom diekstraksi dari 50 sampel (butir telur) u n t u k u ji k o n fir m a s i m a s u kn ya g e n h o r m o n pertumbuhan ke embrio dan larva

  B. imbellis . Ekstraksi

  GeneJET Genomic DNA Purificat ion Kit se suai prosedur manual. DNA hasil ekstraksi dilarutkan menggunakan 100 µL elution buffer ,

  Ph

  dan disimpan dalam

  freezer

  hingga akan digunakan dalam proses PCR. Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan maxima hot st art green PCR mast er mix 2x (Thermo science).

  Komposisi reaksi PCR adalah 12,5 µL master mix, 1 µL primer Ph GH d e n g a n ko n s e n t ra s i 2 0 p m o l

  (F3

  Ph

  GH: 5’TCT TTA GTC AAG GCG CGA CAT TCG AGA-3’, dan R3

  58°C selama 30 detik, dan e kste nsi 72°C se lama 30 de t ik; siklus ini diulang sebanyak 30 kali; diakhiri dengan ekstensi akhir 72°C selama tiga menit dan pengkondisian akhir pada suhu 4°C. Untuk melihat keberhasilan amplifikasi fragmen DNA t a rge t h as il PCR d ie le kt ro fo re s is p a d a ge l agarose 1% dan didokumentasi dengan Gel Documen- t at io n Syst e m (Bio rad). Unt uk me ne nt ukan be rat molekul fragmen DNA digunakan marker VC 100 bp p lu s DNA Le a d e r (Viva n t is ). Ha s il a n a lis is PCR dievaluasi secara deskriptif.

  

  Tingkat ke berhasilan pe warisan transge n pada ke t uruna n ind ividu F-0

  Poeciliopsis lucida

  . Be rdasarkan pe ne lit ian terse but, Sarmasik et al . (2001a; 2001b) melaporkan bahwa keberhasilan pewarisan transgen pada keturunan hasil persilangan individu F-0 transgenik x non-transgenik adalah sebesar 45%-70%. Hal tersebut kemungkinan bahan

  reagen

  yang digunakan berbeda dan kondisi telur juga berbeda. Pada penelitian Sarmasik et al . (2001a; 2001b) menggunakan me to de

  ret r ovir al vect or

  dan ukuran telur ikan yang lebih kecil se hingga korion lebih tipis.

  B. im belli s t ran sge nik ini

  w ild bet t a

  tergolong tinggi jika dibandingkan dengan penelitian Tewari et al . (1992). Berdasarkan Tewari et al . (1992) t in gka t k e b e r h a s ila n p e w a ris a n t ra n s ge n p a d a ke t uru na n h as il pe rs ila nga n ika n ra inb o w t ro u t t ransge nik x no n-transge nik pada ge nerasi ke dua adalah sebesar 3%-19%. Menurut penelitian Sun

  et al .

  (2005), terhadap udang vaname ( Lit openaeus vannamei ) yang me mbandingkan meto de antara mikroinjeksi, t ransfe ks i, dan e le kt ro po rasi; m e t o d e t ran sfe ksi menunjukkan hasil yang le bih efektif dibandingkan mikroinjeksi dan elektroporasi. Di lain pihak, dengan metode transfeksi terhadap ikan zebra dengan bahan dasar lemak FuGene6 menghasilkan sint asan 58%. Me t o de t ransfe ksi me nggunakan larut an X-t re me Gene, daya tetas telur

  Bet t a imbellis

  dapat mencapai 80%, jauh lebih besar dibandingkan dengan ikan zebra tersebut. Berdasarkan pertimbangan tersebut, metode transfer gen yang dapat dikembangkan pada embrio ikan yang berukuran kecil khususnya ikan hias yang pemijahannya secara alami terutama adalah metode transfeksi menggunakan larutan X-treme Gene.

  Analisis RT-PCR juga menunjukkan adanya aktivitas ekspresi mRNA gen GH eksogen yang ditandai dengan fragm e n DNA pa da po sisi yang dit arge t kan pada embrio F-1, sedangkan pada kontrol tidak ada. Pada RT-PCR ko nt ro l in t e rn al

  menunjukkan nilai yang lebih rendah jika dibandingkan penelitian Sarmasik et al . (2001a; 2001b) terhadap ikan

  yang diint ro duksi ge n GFP didapat kan individu positif F-1 sebesar 20%-33,33% (Kusrini et al ., 2012). Ke be rhasilan me t o de t ransfe ksi

  Identifikasi ikan cupang (Betta imbellis) trasgenik fouder membawa ..... (Eni Kusrini)

  juga dilakukan untuk

  Se b a g a i p a r a m e t e r p e n d u k u n g d ila k u k a n pengukuran pertumbuhan induk-induk F-0 yang positif membawa gen GH yang diintroduksikan. Pertumbuhan diukur setiap bulan selama tujuh bulan masing-masing p o p u la s i s e b a n ya k 3 0 e ko r. Ad a p u n p a ra m e t e r pendukung lainnya adalah kualit as air yang diukur setiap bulan meliputi parameter fisik dan kimia.

  HASIL DAN BAHASAN

  Induk-induk transgenik dan non-transgenik yang digunakan untuk pemijahan guna menghasilkan telur diseleksi terlebih dahulu dan dilakukan pengukuran bobot dan panjangnya. Induk F-0 yang digunakan telah mencapai umur 7-9 bulan.

  Hasil dari PCR dengan templat DNA dari embrio ditampilkan pada Gambar 2A. Berdasarkan hasil PCR didapatkan bahwa semua pasangan induk yang diambil s a m p e l u n t u k in d u k t r a n s g e n ik x t r a n s g e n ik (p e m ijah a n A) da n t ran s ge nik x n o n -t ra n s ge n ik (pemijahan B dan C) semua positif membawa gen GH dalam tubuhnya dengan indikasi keberadaan fragmen DNA pada posisi sekitar 334 bp, yang tidak didapatkan pada embrio kontrol (pemijahan D).

  Analis is e kspre s i ge n PhGH pada e mbrio ikan

  B. imbellis

  pooled sampled

  B. imbellis

  terhadap semua perlakuan. Dari empat perlakuan persilangan diperoleh hasil pada perlakuan A, B, dan C semua positif yang berarti menunjukkan bahwa gen PhGH terekspresi pada gonad F-0 (Gambar 3A). Hal tersebut juga m e nunjukkan b ahwa  -akt in ikan mas yang digunakan mampu mengendalikan ekspresi gen PhGH terhadap ikan cupang alam

  B. imbellis . Hasil ekspresi

  juga menunjukkan potensi yang tinggi dihasilkan ikan transgenik F-1. Selanjutnya, keberhasilan deteksi gen GH e ksogen pada embrio F-1 menunjukkan bahwa pembuat an ikan bet t a transge nik dapat dilakukan menggunakan metode transfeksi dengan X-t reme Gene . Hal ini merupakan pertama kali dilaporkan. Selain itu, hasil yang dipe ro le h pad a pe ne lit ian ini me n jadi ko n fir m a s i u la n g ke b e rh a s ila n t ra n s fe ks i ya n g dilaporkan oleh Prasetio et al . (2013) menggunakan gen GFP ( Green Flourescent Prot ein ) sebagai reporter.

  Kontrol internal dilakukan PCR dengan beta aktin u n ive rs a l d a n m e n u n ju kk a n h a s il ya n g p o s it if terdeteksi pada 300 bp pada semua perlakuan bak

  A, B, C, d an D, s e d a ngka n s e b aga i pe m ba nd in g digunakan kontrol positif dari plasmid dan kontrol ne gat if air se b agai t em plat e . Hasil e le kt ro fo re s is kontrol internal beta aktin tersebut ditampilkan pada Gambar 1.

• a kt in , s e m ua s a mp e l me miliki pro du k d e ngan u kuran yan g s ama . Hal tersebut menunjukkan bahwa gen yang telah disisipkan tersebut terekspresi pada semua perlakuan kecuali kontrol non-transgenik. Hasil tersebut masih harus dikonfirmasi untuk masing-masing individu pada tiap-

  Pada penelitian identifikasi induk ini belum dapat d ih it un g p e rse n t a s e ke be rha s ila n in d ividu yan g membawa ge n yang diintroduksikan, karena untuk analisis per individu diperlukan potongan organ sirip untuk diisolasi. Untuk keperluan analisis per individu masih menunggu benih dapat dipotong siripnya dan perlu dilakukan pemijahan berikutnya unt uk dapat dihitung persentase yang lebih akurat per pemijahan per pasang induk. Pada pe nelitian terdahulu untuk

  201

  . Selain itu, dapat juga memperlihatkan bahwa gen GH yang disisipkan dapat dit ransmisikan pada keturunannya, sehingga induk F-0 tersebut merupakan germline t rasmit t er . Rahman & Maclean (1999) melakukan penyisipan gen GH ikan salmon-gen anti beku

  GH BA 334 bp 300 bp

  Not e: M = marka 100 bp (Vi vant is); A= spaw ning of F-0 t r ansgenic x t r ansgeni c; B= spawning of F-0 t ransgeni c male x non-t ransgenic; C= spawni ng of non-t ransgenic x F- 0 t ransgenic female; D= spawni ng of non-t ransgenic x non-t ransgenic; P= posit i ve cont rol plasmid; K= negat i ve cont rol NFW. 3 34 bp= fragment size of GH pangasi us gen; 300 bp= fr agment size f -actin universal

   aktin ikan bet ta

  

Figure 1. Result of PCR by specific primer gene marker from pangasius wit h t empelat e

DNA t hat was ext ract ed from polled embryos of first generat ion of bet t a fish

Ke terangan: M= marka 100 bp (Vivant is); A= em brio dari pem ijahan transge nik x t ransge nik F-

0; B= pem ijahan jantan transgenik F-0 x bet ina no n-transgenik; C= pem ijahan jantan no n-t ransgenik x be tina t ransgenik F-0; D= pe mijahan no n-transgenik x no n- transgenik; P= kont rol positif plasmid; K= kont rol negatif NFW. Angka d i sebelah kanan gam bar (334 bp dan 300 bp) masing-masing adalah ukuran pro duk PCR unt uk ge n GH ikan pat in dan 

  (OPAFPcsGH), laju Gambar 1. Hasil PCR menggunakan primer spesifik gen penyandi hormon pertumbuhan ikan patin (GH) dan  -aktin (BA) dengan templat DNA yang diekstraksi dari kumpulan embrio ikan bet t a keturunan pertama

  ocean pout

  pooled sampled

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (3), 2016, 197-205

  . Berdasarkan hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa gen yang telah disisipkan tersebut terekspresi, walaupun kemungkinan tidak semua mengekspresikan transgen untuk seluruh populasi F-1 apabila dianalisis per individu, mengingat pada tahap ide ntifikasi ini masih merupakan

  clease

  sehingga akan t erdapat dua macam se l yait u sel yang membawa t ransge n dan se l yang t idak me mbawa t ransge n. Menurut Chou et al . (2001), ketika fragmen DNA yang terdiri atas suatu gen target atau gen penanda ho - molog maupun heterolog ditransfer, maka akan sangat u mu m m e n e mu kan ke jad ia n m o sa ik. Se la in it u , menurut Alimuddin et al . (2003), selain terintegrasi ke dalam genom, ada sebagian dari gen asing berada dalam suatu posisi ekstrakromosomal. Lebih lanjut dijelaskan bahwa gen asing yang terinte grasi akan stabil di dalam genom, sementara dalam bentuk ekstra kromosomal akan terdegradasi oleh endogeneus nu-

  blast omer

  Menurut Lyenger et al . (1996), bahwa pada awal pe rke mba ngan e mbrio , ge n yang dit rans fe r akan direplikasi tanpa mengalami integrasi ke dalam genom re sip ie n . Le b ih la nju t d ije la s kan b ah wa s e t e la h mengalami beberapa pembelahan sel, sebagian gen asing t e rse b ut t e rint e grasi se cara a cak ke dalam genom resipien di salah satu

  t ia p p e r la k u a n . Ha s il p e n e lit ia n t e r s e b u t me mperlihatkan bahwa dengan t ransfeksi gen GH, ekspresi gen relatif lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (tanpa transfeksi).

  M A B C D P K-

  Identifikasi ikan cupang (Betta imbellis) trasgenik fouder membawa ..... (Eni Kusrini)

  M A B C D P K- GH

  334 bp 300 bp BA

  

Ke terangan: M= marka 100 bp (Vivantis); A= e mbrio d ari pem ijahan transgenik x transgenik F-0;

B= pem ijahan jantan transgenik F-0 x bet ina no n-transgenik; C= pemijahan jant an no n-t ransgenik x be tina t ransgenik F-0; D= pe mijahan no n-transgenik x no n- transgenik; P = kontro l po sit if plasmid ; K= ko ntrol negatif NFW. Angka d i se belah kanan gam bar (334 bp dan 300 bp) masing-masing adalah ukuran pro duk PCR unt uk ge n GH ikan pat in dan -aktin ikan betta

  

Not e: M = mar ka 100 bp (Vi vant is); A= spawning of F-0 t ransgenic x t ransgenic; B= spawni ng

of F-0 t r ansgeni c male x non-t ransgenic; C= spawni ng of non-t ransgenic x F-0 t ransgenic femal e; D= spaw ning of non-t r ansgenic x non-t ransgenic; P= posit i ve cont rol plasmi d; K= negat i ve cont rol NFW. 33 4 bp= fragment size of GH pangasi us gen; 30 0 bp= fr agment size f  -act in uni versal

  Gambar 2. Hasil RT-PCR menggunakan primer spesifik gen penyandi hormon pertumbuhan

  

  ikan patin (GH) dan aktin (BA) dengan cDNA dari kumpulan embrio ikan betta keturunan pertama

• t emplat e

  

Figure 2. Result s of RT-PCR by specific primer growt h hormone of pangasius as marker gene and

akt in wit h t empelat e cDNA from polled embryos for first generat ion of bet t a fish  -

germline t ransmision dari F-0 ke F-1 hanya kurang dari (Kusrini et al ., 2014). Hasil tersebut untuk F-0 cukup

  10%, namun laju t ransmisi t ransgen dari F-1— F-2 t in ggi a p a b ila d ib a n d in gka n d e n ga n p e n e lit ia n adalah sekitar 50% (sesuai dengan hukum Mendel). se be lumnya meskipun menggunakan meto de yang

  et al

  Berdasarkan hasil penelitian Kobayashi . (2007) berbeda-beda. Hasil penelitian sebelumnya pada ikan yang juga menggunakan gen mBP- t iGH pada generasi nila transge nik dengan konst ruksi gen yang sama pert ama ditransmisikan se besar 5,71% dan 14,3%. membe rikan hasil transmisi pada generasi pe rtama

  mud loach

  Setiap individu yang terintegrasi gen asing ke dalam sebesar 5,7%-14,3%. Pada ikan laju transmisi ge no m akan dit ransmisikan ke pada ke turunannya. transgen pada generasi pertama bervariasi berkisar

  et al

  Untuk mengaplikasikan teknik ini pada akuakult ur antara 2%-33% (Nam ., 2001). Menurut Alimuddin maka pro duksi massal ikan transge nik dipe rlukan et al . (2005), laju transmisi transgen pada generasi (Yoshizaki et al ., 2001). Pada penelitian ini diperoleh pertama bervariasi antara 4,2%-44,1%. hasil bahwa individu ikan Bet t a imbellis founder (induk)

  Sebagai parameter pendukung dalam pembesaran m e m b a wa g e n ya n g t e la h d is is ip k a n k e p a d a sampai pematangan gonad induk-induk F-0 diamati ket urunannya sebesar 16% pada ge ne rasi pe rt ama

  203

  3 P

  4

  5

  6

  7

  1

  2

  e rt u m b u h an ( G ro w th )

  2

  Kelo mpo k (

  Group

  ) Panjang (

  Lengt h

  ) Bobot (

  Weight

  3

  1

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (3), 2016, 197-205

  transgenik F-0 memiliki panjang dan bo bot yang bervariasi. Data pertumbuhan untuk induk-induk F-0 ini tidak dapat dianalisis secara statistik karena jumlah individu per perlakuan per ulangan tidak sama sehingga penampilan hasil secara deskriptif.

  pu la p e rt u mb uh an s e cara be rkala. Ada pu n ha sil pengamatan panjang dan bobot induk-induk F-0 yang digunakan untuk koleksi telur dan larva ditampilkan pada Gambar 3. Berdasarkan hasil pengamatan selama tujuh bulan induk-induk F-0 yang positif membawa gen GH diperoleh pertumbuhan panjang dan bobot yang berbeda antara perlakuan dengan kontrol. Induk- induk F-0 yang positif membawa gen merupakan hasil introduksi embrionya dan telah berumur tujuh bulan ke atas. Transfeksi embrio F-0 yang telah dilakukan o le h Kusrini et al . (2016) me nggunakan be rbagai

  konsentrasi DNA yaitu dari 0,25 µL; 0,50 µL; dan 0,75 µL dengan konsentrasi transfast 0,75 µL.

  Berdasarkan hasil penelit ian t entang pe rbedaan konsentrasi DNA, telah didapatkan konsentrasi 0,25

  µL dan transfast 0,75 µL memberikan pertumbuhan

  panjang yang paling baik. Ole h karena it u, untuk produksi individu F-1 selanjutnya menggunakan induk- induk F-0 yang telah membawa gen GH hasil introduksi

  0,25 µL DNA dan 0,75 µL transfast. Induk-induk B. imbelis

  Be rdasa rkan pe n e lit ian ini, be b e rap a in dividu transgenik menunjukkan laju pertambahan panjang yang pesat, namun untuk pertambahan bobot relatif sama antar ulangan. Pada ikan

  

Figure 3. Growt h of F-0 broodst ock at seven mont hs old, t hat was use for embry-

onic collect ion, consist ed of t hree groups

  B. imbellis , transfer gen

  PhGH yang berasal dari spesies yang sangat berbeda memberikan ekspre si yang sama ant ar pe rlakuan. Keberhasilan transfer ge n PhGH eksogen ke dalam resipien dan efeknya pada pertumbuhan, penggunaan

  konsentrasi DNA 25 µL dan transfast 0,75 µL optimal

  untuk memperoduksi ikan

  B. imbellis transgenik. Hal

  ini sangat pe rlu e valuasi selanjutnya yait u tingkat t ransmisi dan laju pe rt ubuhan individu F-1 untuk memberikan informasi yang lebih lengkap.

  Fa k t o r ya n g t id a k k a la h p e n t in g t e r h a d a p pertumbuhan induk ikan cupang F-0 hasil transgenik adalah faktor lingkungan yaitu kualitas air. Pengamatan parameter kualitas air dilakukan setiap bulan untuk me mant au fluktuasi lingkungan yang berpe ngaruh terhadap pertumbuhan ikan yang digunakan untuk memproduksi benih selanjutnya. Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu, pH, oksigen terlarut, ke sadahan, alkalinit as, amonia, dan ko ndukt ivitas. Adapun data pengamatan kalitas air ditampilkan pada Tabel 1. Kualitas air selama pemeliharaan masih berada pada kisaran yang optimal untuk pemeliharaan ikan cupang karena nilai yang dihasilkan di atas standar baku mutu sesuai PP No. 82 untuk kegiatan budidaya ikan air tawar. Kesadahan pada tendon dan akuarium sangat tinggi, jauh di atas standar. Tetapi hal tersebut t id a k t e rla lu m e m e n ga ru h i p e rke m b a n ga n d a n kehidupan ikan cupang. Gambar 3. Pertumbuhan induk-induk F-0 pada umur tujuh bulan yang digunakan untuk koleksi embrio yang terdiri atas tiga kelompok

  )

  Identifikasi ikan cupang (Betta imbellis) trasgenik fouder membawa ..... (Eni Kusrini)

  (mg/L) 4 .2 4-7 .4 2 4.7 1-6.43 > 5

  Reservoar Akuarium

  Aquarium St andar

  Standard Referensi

  Reference

  Suh u

  Temperat ure (°C)

  26 .0 -2 7.30 26.3 0-29 .3 0 24 -3 0

  IBC (20 04 ) p H 6 .8 9-7 .7 2 6.0 5-8.49 5 .2 -6 .8

  IBC (20 05 ) Oksig en terlarut

  Dissolved oxygen

  IBC (20 06 ) Kesad ahan

  Table 1. Wat er qualit y during rearing periods Param et er

  Hardness

  (mg/L) 23 .1 0-4 6.20 40.0 4-63 .1 4 8 -10

  IBC (20 07 ) Alkalin itas

  Alkalinit y

  (mg/L) 33 .9 8-5 6.64 11.3 3-56 .6 4

  0.02 PP No . 8 2 (2 00 1) Amon ia-N

  Ammonia-N (mg/L)

  0.00 -0 .195 0.0 0-0.01 ≤ 1 PP No . 8 2 (2 00 2) Nitrit-N

  Nit rit e-N (mg/L)

  0.00 1-0 .0 22 0.0 0-0.04 Kon du ktivitas

  Conduct ivit y

  Parameters Tandon

  ) over expressing growth hormone show reduced am- monia excretion. Aquacult ure , 270, 427-435. Tabel 1. Kualitas air selama pemeliharaan

  Berdasarkan hasil identifikasi dapat disimpulkan ikan transgenik F-0

  Pa ng asi a nod on h yp oph t h al m u s ).

  germline transmitter

  dapat dihasilkan me ngguna kan me t o de t ra nsfe ksi. Pro mo t e r ccBA dapat mengendalikan ekspresi mRNA gen GH eksogen pada ikan bet t a. Ke be rhasilan t ransfe r ge n PhGH e ks o ge n k e d a la m re s ip ie n d a n e fe kn ya p a d a p e rt u mb u ha n, d a n in du k-ind uk F-0 ya ng po sit if selanjut nya dapat digunakan unt uk me mpro duksi benih F-1 transgenik GH.

  UCAPAN TERIM A KASIH

  Penulis mengucapkan t e rima kasih ke pada tim pe ne lit i dan te knisi ge net ika Balai Pe ne lit ian dan Pe n ge mb anga n Bud idaya Ikan Hias a t as bant uan selama penelitian. Pe nelit ian ini dibiayai oleh DIPA tahun anggaran 2015.

  DAFTAR ACUAN

  Alim u d d in , Yo s h iz a ki, G., Ca r m a n , O., & Sumantadinata, K. (2003). Aplikasi transfer gen dalam akuakultur.

  J. Akua. Indonesia , 2(1), 41-50.

  Alimu dd in , Yo s hiz aki, G., Kiro n, V., Sa t o h , S., & Takeuchi, T. (2005). Enhancement of EPA and DHA biosynthesis by over-expression of masu salmon Ä6-desaturase-like gene in zebrafish.

  Trans. Res

  ., 14, 159-165.

  De w i, R.R.S.P.S., Alim u d d in , Su d ra d ja t , A.O., & Somantadinata, K. (2012) Efektivitas transfer dan e k s p r e s i g e n Ph GH p a d a ik a n p a t in s ia m (

  Ju r n al Ri set Akuakult ur , 7(2), 171-180.

  Oreochromis nilot icus

  Chou, C.Y., Horng, L.S., & Tsai, H.J. (2001). Uniform GFP-e xp re ss io n in t rans ge nic me daka Or yzi as

  lat ipes at the F0 generation.

  Transgenic Research

  , 10: 303-315. Devlin, R.H., Yesaki, T.Y., Biagy, C.A., Donaldson, E.M.,

  Swanson, P., & Chan, W.K. (1994). Extraordinary salmon growth. Nat ure , 371, 209-210. Du, S.J., Gong, Z., Fletcher, G.L., Shears, M.A., King,

  M.J., Idler, D.R., & Hew, C.L. (1992). Growth en- hancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an “all fish” chimeric growth hormone gene construct. Biol. Tech ., 10, 176-180. Ha cke t t , P.B. (1 9 9 3 ). Th e m o le cu la r b io lo gy o f transgenic fish. (p. 207-240).

  In

  Hochachka, P.W., & Mommsen, T.P. (Eds.). Biochemist r y and M olecu-

  lar Biology of Fishes

  . Elsevier Science. Amsterdam, Vol. 2. Kobayashi, S., Alimuddin, Morita T., Miwa, M., Lu, J., Endo, M., Takeuchi, T., & Yo shizaki, G. (2007).

  Transgenic nile tilapia (

  (µS) 2.87 -15 4.20 4.07 -2 09 .5 0

  205

  T.T. (2001a). Transgenic live-bearing fish and crus- taceans produced by transforming immature go - n a d s wit h r e p lic a t io n -d e fe c t ive p a n t r o p ic retroviral vectors. M arine Biot echnology Vol. 3, Is-

  Prasetio, A.B., Kusrini, E., Kusumah, R.V., Cindelaras, S., & Murniasih, S. (2013). Efe kt ivit as me to de t ransfe ksi dalam t ransfe r ge n pada zigo t ikan cupang alam (wild be t t a) Bet t a imbellis . J. Ris.

  Akuakult ur , 8(2), 191-199.

  Rahman, M.A., & Maclean, N. (1999). Growth perfor- mance of t ransge nic tilapia co ntaining an exo - genous piscine growth hormone gene.

  Aquacul- t ure

  , 173, 333-346. Robles, V., & Cancela, M.L. (2007). Lipid-based trans- fection as a method for gene delivery in zebrafish

  (

  Danio rerio ) embryos.

  Aquacult ure Research

  , 38, 1317-1322. Sarmasik, A., Jang, I.K., Chun, C.Z., Lu, J.K., & Chen,

  sue 5, pp 470-477 .

  Parenrengi, A., Alimuddin, Sukenda, Sumantadinata, K., & Tenriulo, A. (2010). Uji aktivitas promoter ant ivirus pada udang windu Penaeus monodon menggunakan gen EGFP sebagai penanda. Forum

  Sarmasik, A., Chun, C.Z., Jang, I.K., Lu, J.K., & Chen, T.T. (2001b). Production of transgenic live-bear- ing fish and crust aceans with replication-defec- tive pantropic retroviral vectors.

  M arine Biot ech- nology , 3(1), S177-S184.

  Sun, P.S., Venzon, N.C., Calderon, F.R.O., & Esaki, D.M.

  (2005). Evaluation of methods for DNA delivery int o s hrim p z ygo t e s o f Penaeus ( Lit openaeus )

  vannamei .

  Aquacult ure , 243, 19-26.

  Te w a r i, R., Mic h a rd -Va n h e e , C., Pe r ro t , E., & Chourrout, D. (1992). Me ndelian transmissio n, structure and expression of transgenes following their injection into the cytoplasm of trout eggs.

  Transgenic Res ., 1, 250-260.

  Yo shizaki, G. (2001). Gene transfe r in salmo nidae: applications to aquaculture. Suisanzoshoku , 49, 137- 142. Yaskowiak, E.S., Shears, M.A., Agarwal-Mawal A., &

  Inovasi Teknolog i Akuakul t ur (FITA). Lam pu ng, 18 hlm.

  Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Hammer, R.E., Trumbauer, M.E., & Rosenfeld, M.G. (1982). Dramatic growth of mice that developed from eggs microinjected wit h me t allo t hio ne in-gro wt h ho rmo ne fusio n genes. Nat ure , 30, 611-615.

  Jurnal Riset Akuakult ur, 11 (3), 2016, 197-205

  Envir onment al risk assessment f genet ically modified organisms , Vol. 3.

  Kusrini, E., Kusumah, R.V., Prasetio, A.B., Murniasih, S., Rahmawat i, R., Cindelaras, S., & Alimuddin.

  (2012). Verifikasi individu F-0 calon induk ikan wild betta ( Bet t a sp.) hasil rekayasa genetika. Laporan Hasil Penelitian 2012, 15 hlm. Ku s rin i, E., Ha yu n in gt ya s , E.P., Ra h m a w a t i, R.,

  Kusumah, R.V., & Cindelaras, S. (2014). Transfer gen hormon pertumbuhan pada embrio wild betta,

  Bet t a imbelli s . Lapo ran Has il Pe n e lit ian 201 4, 13 hlm.

  Lyengar, A., Muller, F., & Maclean, N. (1996). Regula- tion and expression of transge ne s in fish-a re- view. Transgenic Research , 5, 147-166. Maclean, N., Penman, D., & zhu, Z. (1987). Introduc- tion of novel genes into fish. Biotechnology , 5, 257-

  261. Nam, Y.K., Maclean, N., Fu, C., Pandian, T.J., & Eguia,

  M.R.R. (2007). Development of transge nic fish: scientific background.

  In

  Kapuscinski, A.R., Hayes, K.R., Li, S., & Dana, G. (Eds.).

  Methodologies for transgenic fish. CABI, UK, p. 61–94. Rahman, M.A., Hwang, G., Razak, S.A., Sohm, F., &

  Res ., 10, 353-362.

  MacLe an, N. (2000). Co py number de pe nde nt transgene expression in hemizygous and homozy- gous transgenic tilapia ( Oreochromis nilot icus ). Trans.

  Res ., 9, 417-427.

  Nam, Y.K., Noh, J.K., Cho, Y.S., Cho, H.J., Cho, K.N., Kim, G., & Kim, D.S. (2001). Dramatically acceler- a t e d gro wt h an d e xt rao rdina r y giga nt is m o f transgenic mud loach

  M isgurnus mizolepis .

  Trans. Res ., 10, 353-362.

  Nam, Y.K., Maclean, N., Hwang, G., & Kim, D.S. (2008).

  Autotransgenic and allotransgenic of growth traits in fish for aquaculture: a review.

  J. Fish. Biol

  ., 72, 1-26. Nam, Y.K., Noh, J.K., Cho, Y.S., Cho, H.J., Cho, K.N.,

  Kim, G., & Kim, D.S. (2001). Dramatically acceler- a t e d gro wt h an d e xt rao rdina r y giga nt is m o f transgenic mud loach M isgurnus mizolepis . Trans.

  Fletcher, G.L. (2006). Characterization and multi- ge nerat io nal st abilit y o f t he growt h ho rmo ne t ra n sge ne (EO -1 á) re s po n sib le fo r e nh a n ce d growth rates in Atlantic salmon. Trans. Res ., 15, 465-480.