UJI DAYA ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2- PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS (Citrus sinensis (L.) Osbeck)
UJI DAYA ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2- PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS (Citrus sinensis (L.) Osbeck) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh : Augustinus Teti
NIM : 098114121
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
UJI DAYA ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2- PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS (Citrus sinensis (L.) Osbeck) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh : Augustinus Teti
NIM : 098114121
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
HALAMAN PERSEMBAHAN
“When you walk through a storm keep your head up high and don’t be
afraid of the dark. At the end of the storm is a golden sky and the sweet
silver song of lark. Walk on through the wind, walk on through the rain,
tho’ your dream be tossed and blown. Walk on, walk on with hope in your
heart.
And you’ll never walk alone.”
-Oscar H.-
“It’s fine to talk and it’s even okay to have
fun, but when we’re doing something, do it
properly”
Skripsi ini aku persembahkan kepada: Tuhan Yesus Bapak, Ibu dan keluarga dari keduanya Sahabat-sahabatku
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis d apat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI DAYA
ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-
PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL
FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS
(Citrus sinensis (L.) Osbeck)” ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati atas segala bantuan yang telah diberikan, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi, saat dilakukan penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian.
3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt., sebagai Dosen Penguji atas pengarahan, kritik, saran yang membangun dan kesediaannya menguji skripsi ini.
4. Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. sebagai Dosen Penguji sekaligus Dosen Pembimbing Akademik atas pengarahan, kritik, saran yang membangun dan kesediaannya menguji skripsi ini.
5. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Mas Wagiran) dan Kimia Analisis Instrumental (Mas Bimo) atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.
6. Wisnu dan Ozy sebagai teman seperjuangan, atas segala kritik, saran, bantuan selama mengerjakan skripsi ini, baik selama di laboratorium maupun pada saat penyusunan naskah.
7. Danu, Kael, Felix, Julio, Nindy dan Nio “Kodrat” sebagai tim antioksidan 2009 atas segala bantuan dan masukan yang sangat berarti dalam penyusunan skripsi ini.
8. Victor, Agnes, Novia, Ina, Topan, Leo, Jo, Netty dan Jimmy atas segala canda tawa, bantuan, dan kenangan tidak terlupakan selama bekerja di laboratorium.
9. Tri “Tejo” Pamulatsih (seksi konsumsi) atas segala bantuan, dukungan, serta pemberi informasi penting di saat mendesak.
10. Tabita Ribka Alvianita, atas pinjaman laptopnya selama pelaksanaan ujian.
11. Yansen Nama Hada, atas bantuannya sebagai perkap selama persiapan ujian.
12. Haris, Arvi, dan Laras atas keikhlasannya memberikan waktu ujian mereka untuk dipakai.
13. Chelsea F.C., my best football team, atas segala tontonan menarik dan
14. Krisna House beserta seluruh penghuninya, atas segala kekonyolan,canda tawa dan kebersamaan yang tidak terlupakan.
15. Febrin Nessy Triana, The Special One, yang merupakan sumber inspirasi, atas segala kesabaran dalam membimbing, mengajarkan, mengarahkan, selama proses pengerjaan skripsi ini, dimulai dari pengerjaan di laboratorium sampai selesai penyusunan naskah, dan akhirnya bisa melaksanakan ujian bersama. Terima kasih telah memberi warna dalam hidup.
16. Teman-teman Farmasi 2009, atas kebersamaan yang tidak terlupakan selama empat tahun.
17. Semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis.
Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.
Yogyakarta, Juli 2013 Penulis
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .................................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... iv PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ................................................... v HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. viPRAKATA ................................................................................................. viii
DAFTAR ISI .............................................................................................. xDAFTAR TABEL ...................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xv
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xvii
INTISARI ................................................................................................... xviii
ABSTRACT ................................................................................................. xix
BAB I PENGANTAR ................................................................................1 A.
1 Latar Belakang ..................................................................................
1.
3 Permasalahan .................................................................................
2.
3 Keaslian penelitian ........................................................................
3.
3 Manfaat penelitian .........................................................................
B.
4 Tujuan penelitian .............................................................................
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................
5 A.
5 Jeruk Manis ..................................................................................
1.
5 Morfologi tumbuhan ..................................................................
2.
5 Klasifikasi tumbuhan .................................................................
B.
7 Radikal Bebas dan Antioksidan .......................................................
1.
7 Radikal bebas ...............................................................................
2.
7 Defenisi antioksidan .....................................................................
3.
8 Mekanisme antioksidan ................................................................
4.
8 Penggolongan antioksidan .............................................................
5.
10 Manfaat antioksidan .....................................................................
C.
10 Metode DPPH ................................................................................
D.
11 Ekstraksi ........................................................................................
E.
13 Spektrofotometri .............................................................................
F.
14 Validasi Metode Analisis .................................................................
G.
16 Landasan Teori ...............................................................................
H.
17 Hipotesis .......................................................................................
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ...................................................
18 A.
18 Jenis dan Rancangan Penelitian .......................................................
B.
18 Variabel Penelitian .........................................................................
C.
18 Defenisi Operasional ......................................................................
D.
18 Bahan Penelitian ............................................................................
E.
19 Alat Penelitian ...............................................................................
F.
19 Tata Cara Penelitian .......................................................................
1.
19 Pemilihan dan pengumpulan sampel ..............................................
2.
19 Pembuatan simplisia ....................................................................
3.
20 Ekstraksi dan fraksinasi simplisia ..................................................
4.
20 Uji pendahuluan ..........................................................................
5.
21 Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak ..........................................
6.
22 Penetapan aktivitas antioksidan .....................................................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................
24
B.
24 Hasil Pengumpulan Bahan ..............................................................
C.
25 Hasil Ekstraksi Sampel ...................................................................
D.
28 Hasil Uji Pendahuluan ....................................................................
1.
28 Uji fenolik ..................................................................................
2.
29 Uji aktivitas antioksidan ..............................................................
E.
30 Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ..........
1.
30 Penentuan OT penetapan kandungan fenolik total ..........................
2.
31 Penetapan λ maksimum penetapan kandungan fenolik total .......
F.
32 Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ...........
1.
32 Presisi penetapan kandungan fenolik total ......................................
2.
33 Linearitas penetapan kandungan fenolik total .................................
3.
33 Spesifitas penetapan kandungan fenolik total ................................
G.
34 Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total ..........................................
H.
37 Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ............................
1. Penentuan λ maksimum metode uji aktivitas antioksidan ................ 38 2. Penentuan OT metode uji aktivitas antioksidan ...............................
39 I. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ..............................
40 1.
42 Presisi metode uji aktivitas antioksidan ..........................................
2.
44 Linearitas metode uji aktivitas antioksidan ....................................
3.
45 Spesifitas metode uji aktivitas antioksidan .................................... J. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan Dengan Radikal DPPH ....
46 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................
50 A.
50 Kesimpulan ........................................................................................
B.
50 Saran ..................................................................................................
LAMPIRAN ............................................................................................
55 BIOGRAFI PENULIS .............................................................................
74
DAFTAR TABEL
Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Armala, 2009) ....................................................................11 Tabel II. Rentang kesalahan yang diperbolehkan (Harmita, 2004) ...
15 Tabel III. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004) ...
16 Tabel IV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter ..............
33 Tabel V. Hasil pengukuran seri baku asam galat ............................
36 Tabel VI. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ..........................................
36 Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar rutin .................
43 Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ............
43 Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH .....
44 Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan metode DPPH ...........................
45 Tabel XI. Hasil perhitungan IC
50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ......................................................
47 Tabel XII. Penggolongan Tingkat Kekuatan Antioksidan Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Kulit Jeruk Manis .........
49
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Buah jeruk manis ..........................................................6 Gambar 2. Struktur rutin ..................................................................
10 Gambar 3. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asam galat] + reagen fenol Folin-Ciocalteu, B =,larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis] + reagen fenol Folin-Ciocalteu, C = kontrol negatif [blanko reagen fenol Folin-Ciocalteu]) ........................................
29 Gambar 4. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol positif [rutin], B = kontrol negatif [blanko DPPH], C = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk
manis] + DPPH) ..........................................................
30 Gambar 5. Kurva penentuan OT penetapan kandungan fenolik ........
31 Gambar 6. Kurva persamaan regresi linear penetapan kadar fenolik
total ............................................................................
32 Gambar 7. Reaksi asam galat dengan molibdenum, komponen dari reagen Folin-Ciocalteu (Nunes, et al., 2012) ....................
35 Gambar 8. Struktur asam galat ...........................................................
35 Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH ..........................
38 Gambar 10. Grafik penentuan OT larutan rutin ...................................
39 Gambar 11. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat .............................
40 Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin .................................................................................
41
Gambar 13. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit jeruk manis ...........
42 Gambar 14. Hasil uji normalitas data rutin ...........................................
48 Gambar 15. Hasil uji normalitas data fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis .............................................................
48 Gambar 16. Hasil uji T tidak berpasangan ...........................................
49
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambar buah jeruk manis dari Purwokerto, Jawa Tengah...............................................................................56 Lampiran 2. Bobot fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ...
56 Lampiran 3. Data penimbangan penetapan kandungan fenolik total ....
57 Lampiran 4. Optimasi penetapan kandungan fenolik total ...................
58 Lampiran 5. Penetapan Kandungan fenolik total .................................
60 Lampiran 6. Data penimbangan uji aktivitas antioksidan .....................
62 Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi larutan DPPH, larutan pembanding rutin, dan larutan uji ....................................
63 Lampiran 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan .......................
64 Lampiran 9. Uji akitivitas antioksidan dengan menggunakan radikal DPPH ...............................................................................
67 Lampiran 10. Perhitungan nilai IC
50 rutin dan Fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ....................................................
69 Lampiran 11. Scanning pengkoreksi ......................................................
70
INTISARI
Antioksidan merupakan senyawa yang menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat. Kulit jeruk manis diketahui memiliki senyawa fenolik. Senyawa tersebut beraktivitas antioksidan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition
Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan
mengubah warna larutan DPPH dari ung u menjadi kuning. DPPH memiliki λ maksimum di 515 nm. Ketika elektronnya berpasangan oleh keberadaan senyawa antioksidan, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.
Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu dan dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi air). Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan dengan warna biru. Larutan t ersebut memiliki λ maksimum di 750 nm.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis mempunyai aktivitas antioksidan lemah dengan nilai IC
50 sebesar
292,09 ± 0,379 μg/mL. Kandungan fenolik total sebesar 25,81 ± 0,314 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.
Kata kunci : fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis, Citrus sinensis (L.) Osbeck, antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total
ABSTRACT
Antioxidants are compounds that inhibit oxidation reactions by binding to free radicals. As a result, the cell damage by free radicals can be inhibited. Sweet orange peel phenolic compounds known to possess. This study was conducted to determine the antioxidant activity and total phenolic content of ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel. Radical antioxidant activity assays using 1,1-diphenyl-2-pikrilhidrazil (DPPH) and expressed by the value Inhibition Concentration 50 (IC ). The existence of active antioxidant compounds
50 DPPH solution will change color from purple to yellow. DPPH has a maximum
λ at 515 nm. When the electron pairs by the presence of antioxidant compounds, the absorbance decreases corresponding stoichiometric number of electrons captured.
Total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method and expressed by the value of the mass of gallic acid equivalents (mg gallic acid equivalents per g fraction of water). Phenolic compounds will be oxidized by the Folin-Ciocalteu phenol reagent under alkaline conditions, forming a blue solution. The solution has a maximum λ at 750 nm.
The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel has a weak antioxidant activity with IC values of 292,09 ±
50
0.379 µg/mL. Total phenolic content of 25.81 ± 0.314 mg gallic acid equivalents per g of ethyl acetate fraction.
Keywords : ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel, Citrus sinensis (L.) Osbeck, antioxidants, DPPH, total phenolic content
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Tanpa disadari, dalam tubuh manusia terbentuk radikal bebas secara terus
menerus, baik melalui proses metabolisme sel normal maupun akibat respon terhadap pengaruh dari luar tubuh, seperti paparan polusi lingkungan, ultraviolet, dan asap rokok. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan elektron, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul sekitarnya misalnya protein, asam lemak tak jenuh, dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker (Salganik, 2001; Winarsi, 2007). Selain itu radikal bebas dalam tubuh dapat memicu munculnya berbagai penyakit degeneratif, seperti kardiovaskuler, penuaan dini (Palmer dan Kitchin, 2010), dan osteoporosis akibat dari perusakan sel secara oksidatif (Winarsi, 2007).
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan dan merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dihambat (Winarsi, 2007). Penambahan antioksidan ke dalam formulasi makanan juga efektif mengurangi oksidasi lemak yang menyebabkan ketengikan, toksisitas, dan destruksi biomolekul makanan (Decker, 1998).
Saat ini antioksidan alami lebih diminati dibandingkan antioksidan sintetik karena dianggap lebih aman. Antioksidan sintetik seperti BHT (butylated hidroxy
toluene ) dan BHA (butylated hidroxy anisole) telah diragukan keamanannya
karena memiliki efek samping yang besar dan dapat menyebabkan kerusakan hati.Hal ini menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang sangat dibutuhkan oleh masyarakat saat ini (Rohdiana, 2001; Sunarni, 2005).
Buah jeruk manis mengandung betakaroten dan bioflavonoid yang dapat memperkuat dinding pembuluh darah kapiler, sedangkan kulit jeruk manis banyak mengandung pektin yang dapat membantu menurunkan kadar kolesterol jahat (LDL) dan meningkatkan kolesterol baik (HDL) (Anonim, 2011).
Untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari kulit jeruk manis dipilih metode DPPH. Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap (Sunarni, 2005). Metode ini sederhana untuk dikerjakan, mudah, cepat dan peka. Aktivitas antioksidan dari suatu senyawa dapat diketahui dari penurunan absorbansi DPPH yang terjadi akibat penambahan senyawa tersebut (Zuhra, et al., 2008).
Pada penelitian kali ini peneliti ingin mengetahui apakah kulit jeruk
manis ( Citrus sinensis (L.) Osbeck) memiliki daya antioksidan serta seberapa
1. Permasalahan a.
Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis? b.
Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC 50 ?
2. Keaslian penelitian Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan oleh penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai seberapa besar daya antioksidan serta penetapan kadar fenolik total ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan fraksi etil asetat.
3. Manfaat penelitian a.
Manfaat teoritis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya tentang aktivitas antioksidan yang dimiliki kulit jeruk manis, sehingga dapat menjadi acuan untuk penelitian selanjutnya.
b. Manfaat metodologis. Penelitian ini dapat dijadikan acuan metode uji
aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dan penentuan kadar fenolik total pada suatu bahan tumbuhan.
c. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi bagi penelitian lebih lanjut maupun masyarakat luas mengenai potensi kulit jeruk manis sebagai salah satu sumber antioksidan alami .
B. Tujuan Penelitian 1.
Tujuan umum. Tujuan umum penelitian ini adalah menguji aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dan menetapkan kadar fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu dari fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.
2. Tujuan khusus.
a) Mengetahui kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.
b) Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC 50 .
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Jeruk Manis
1. Morfologi tumbuhan Tanaman jeruk manis mempunyai batang yang dapat mencapai
ketinggian 6 meter, bercabang banyak, tajuk daun bundar, dan umumnya berbuah
satu kali dalam satu tahun. Daunnya bertangkai, tangkai daunnya bersayap, dan
berbau sedap.Bunga jeruk manis berukuran agak besar yang mempunyai kelopak
bunga membentuk cawan, tangkai bunganya berwarna putih atau kuning dengan
daun bunga sebanyak lima helai, dan mempunyai 20-30 benang sari.Buah jeruk manis berbentuk bulat atau hampir bulat, berukuran agak
besar, bertangkai kuat, kulit buah berwarna hijau sampai kuning dan mengkilat
(Rukmana, 2003).2. Klasifikasi tumbuhan Jeruk manis dalam bahasa Ingris dikenal dengan nama sweet orange.
Jeruk manis diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom : Plantae Sub-kingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta
Sub-kelas : Rosidae Ordo : Sapindales Famili : Rutaceae Genus : Citrus L.
Spesies : Citrus sinensis (L.) Osbeck (USDA, 2013).
Gambar 1. Buah jeruk manis
3. Habitat dan penyebaran
Jeruk manis merupakan tanaman asli melayu tetapi sekarang penyebarannya sangat luas hampir disemua daerah tropis dan subtropis di dunia.
Temperatur optimum antara 25-30 C namun ada yang masih dapat tumbuh normal pada 38 C. Kelembaban optimum untuk pertumbuhan tanaman ini sekitar 70-80% (Rukmana, 2003).
Pada tahun 1920, jeruk manis dikembangkan secara komersial di dan negara-negara lainnya. Di Indonesia, tanaman jeruk manis ditanam di berbagai daerah, seperti Jawa Barat, Jawa Tengah, dan Sumatera Utara (Rukmana, 2003).
B.
Radikal bebas dan Antioksidan
1. Radikal bebas
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda (polyunsaturated fat) pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker (Winarsi, 2007).
2. Definisi antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya kerusakan sel dapat dihambat
Kebanyakan antioksidan (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi). Pengertian antioksidan yang lebih relevan secara biologis ialah senyawa alami atau sintetik yang ditambahkan ke dalam produk untuk mencegah atau menunda kerusakan yang disebabkan oleh udara (Huang, Ou, dan Prior, 2005).
3. Mekanisme antioksidan
Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoksida dismutase, katalase, glutation peroksidase, dan glutation reduktase (Winarsi, 2007).
Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai berikut: a.
Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E, b. Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA, c. Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen, dan d. Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation peroksidase (Huang, et al., 2005).
4. Penggolongan antioksidan
Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam, yaitu antioksidan sintetik dan alami (Gulcin, Uguz, Oktay, Beydemir, dan a.
Antioksidan sintetik Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang dibuat melalui sintesis secara kimia, contohnya: tert-Butylhydroquinone (tBHQ), butylated
hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), dan propil galat (PG)
(Gulcin, et al., 2004). tBHQ dan BHA telah lama digunakan untuk mencegah oksidasi dari produk makanan sehingga dapat menstabilkan produk tersebut (nutrisi, rasa, maupun warna). Dalam konsentrasi yang tinggi, tBHQ dapat menyebabkan kanker (Gharavi, Haggarty, dan El-Kadi, 2007).
b.
Antioksidan alami Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diproduksi langsung oleh tanaman maupun tubuh, contohnya: senyawa polifenol, flavonoid, tanin, enzim katalase, glutation peroksidase, dan superoksid dismutase. Glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H
2 O 2 menjadi H
2 O dan O 2 , sedangkan superoksid
dismutase bekerja dengan cara mengkatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi H O (Percival, 1998; Gulcin, et al., 2004; Winarsi, 2007 ).
2
2 Contoh lain senyawa antioksidan alami adalah rutin (Gambar 2).
Senyawa ini bekerja jika moietas gula diketahui melebihi aktivitas flavonoid. Antioksidan ini diduga dapat mencegah serangan lipid membran. Rutin menunjukkan kerjanya sebagai inhibitor peroksidasi lipid yang bergantung pada Fe (Winarsi, 2007).
Gambar 2. Struktur rutin 5. Manfaat antioksidan
Antioksidan bermanfaat dalam mencegah kerusakan oksidatif yang disebabkan radikal bebas dan ROS sehingga mencegah terjadinya berbagai macam penyakit seperti penyakit kardiovaskuler, jantung koroner (Ames, 1983; Mbata, 2010), kanker (Salganik, 2001) serta penuaan dini (Palmer dan Kitchin, 2010).
Penambahan antioksidan ke dalam formulasi makanan, juga efektif mengurangi oksidasi lemak yang menyebabkan ketengikan, toksisitas, dan destruksi biomolekul yang ada dalam makanan (Decker, 1998).
C. Metode DPPH
Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah dengan menggunakan radikal bebas DPPH (Shivaprasad, et al., 2005). Tujuannya adalah mengetahui parameter konsentrasi yang memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC ). Hal ini dapat dicapai dengan cara
50
menginterpretasikan data eksperimental dari metode tersebut (Molyneux, 2004).DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida, 1994).
DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).
Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2010).
Menurut Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji menggunakan metode DPPH dapat digolongkan menurut nilai IC
50 (Tabel I).
Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Armala, 2009)
Intensitas Nilai IC50 Sangat kuat < 50 µg/mL
Kuat 50-100 µg/mL Sedang 101-150 µg/mL
Lemah > 150 µg/mL D.
Ekstraksi
Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, selanjutnya pelarut diuapkan sampai semua atau hampir semua pelarut menguap (Departemen Kesehatan, 1995).
Dalam memilih cairan penyari, seseorang harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini.
(1) Murah dan mudah diperoleh, (2) stabil secara fisika dan kimia, (3) selektif, (4) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan (5) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku (Departemen Kesehatan, 1986).
Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan zat dari bahan yang akan disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi : infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Departemen Kesehatan, 1986).
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah diendaptuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Departemen Kesehatan, 1986).
E.
Spektrofotometri
Spektrofotometri adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik (Mulja dan Suharman, 1995).
Senyawa yang mempunyai gugus kromofor apabila mengalami interaksi dengan radiasi elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) maka akan menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra absorbansi. Spektra absorbansi tersebut dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dikarenakan jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap sebanding dengan jumlah molekul penyerapnya. Spektrum UV mempunyai absorbansi antara 100 400 nm, sedangkan spektrum
visibel atau tampak mempunyai absorbansi antara 400-800 nm (Fessenden dan
Fesenden, 1995).Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan.
A
= ε bc Harga ε adalah karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam pelarut tertentu dan pada panjang gelombang tertentu. Pada persamaan menunjukkan bahwa penentuan absorbansi akan menghasilkan konsentrasi jika ε dan b diketahui (Sastrohamidjojo, 2001).
F.
Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).
Paramater-parameter validasi metode analisis yang diperlukan untuk menilai kesahihan metode analisis antara lain meliputi akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas. Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) baku yang ditambahkan. Kriteria akurasi sangat bergantung kepada konsentrasi baku dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode. Akurasi ditentukan dengan % recovery (Harmita, 2004).
Tabel II. Rentang kesalahan yang diperbolehkan (Harmita, 2004)
Analit pada matrik Rata-rata yang sampel diperoleh (%) 100 98-102
>10 98-102 >1 97-103
>0,1 95-105 0,01 90-107
0,001 90-107 0,000.1 (1 ppm) 80-110
0,000.01 (100 ppb) 80-110 0,000.001 (10 ppb) 60-115
0,000.000.1 (1 ppb) 40-120 Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi dinyatakan dalam standar deviasi atau koefisien variasi. Tabel berikut merupakan syarat presisi yang dapat diterima berdasarkan kadar analit.
Tabel III. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004)
Analit pada matrik KV (%) sampel (%) >1 2,5
0,001
5 0,000.1 (1 ppm)
16 0,0000.000.1 (1 ppb)
32 Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Persyaratan data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003).
Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel yang mungkin ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).
G.
Landasan Teori
Buah jeruk manis mengandung betakaroten dan bioflavonoid yang dapat memperkuat dinding pembuluh darah kapiler dan dapat berfungsi sebagai antioksidan. Antioksidan berguna untuk menangkal radikal bebas dengan cara memberikan pasangan elektron bebas untuk menetralkan radikal bebas sehingga menjadi tidak reaktif. Antioksidan alami lebih aman digunakan dibandingkan antioksidan sintesis.
Metode pengujian antioksidan yang umum digunakan terutama untuk senyawa dari bahan alam adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan sumber radikal bebas berupa senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Metode ini memiliki kelebihan yaitu mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman.
Kandungan fenolik total dapat ditentukan dengan reagen Folin-Ciocalteu. Adanya senyawa fenolik dalam sampel uji akan mereduksi reagen fosfomolibdat- fosfotungstat menjadi produk berwarna biru. Intensitas warna biru yang dihasilkan sebanding dengan kandungan fenolik yang terdapat dalam sampel.
H.
Hipotesis
Fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis mempunyai aktivitasantioksidan yang ditunjukkan oleh besarnya nilai IC50 melalui pengujian
menggunakan metode DPPH dan kandungan fenolik total dalam fraksi etil asetat
ekstrak etanol kulit jeruk manis yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam
galat.BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan tahapan
penelitian sebagai berikut : a.
Pemilihan dan pengumpulan sampel b. Pembuatan simplisia c. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia d. Penetapan aktivitas antioksidan e. Penetapan kadar fenolik total dalam ekstrak
B. Variabel Penelitian
Variabel bebas : konsentrasi ekstrak sampel Variabel tergantung : IC
50 C.
Definisi Operasional
Ekstrak kulit jeruk manis adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil proses maserasi dengan menggunakan pelarut etanol.
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit jeruk yang
berupa metanol dan natrium karbonat. Bahan pro analitik (Sigma) berupa DPPH
(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), rutin, asam galat, dan pereaksi Folin-Ciocalteu.
Bahan kualitas teknis (Brataco Chemica), yaitu wash bensin dan etil asetat.