Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba [Azadirachta indica A. Juss] FP30, FP40, FP50, Fp60 terhadap kultur sel SiHa - USD Repository

  

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP

30 , FP

40 , FP 50 , dan FP

  60 TERHADAP

KULTUR SEL SIHA

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Bertha Mellina NIM : 038114116

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

  

Just Be

Be strong enough to face the world each day

Be weak enough to know you cannot do everything alone

Be generous to those who need your help

  

Be frugal with what you need yourself

Be wise enough to know that you do not know everything

Be foolish enough to believe in miracles

Be willing to share your joys

  Be willing to share the sorrows of others

Be a leader when you see a path others have missed

Be a follower when you a shrouded in the midst of uncertainty

  

Be the first to congratulate an opponent who succeeds

Be the last to criticize a colleague who fails

Be sure of your final destination, in case you are

going the wrong way

  Be loving to those who love you

Be loving to those who do not love you, and they may

change

  Above all, be yourself Ku persembahkan karyaku ini kepada: Tuhan dan Bunda Maria yang telah membimbing aku,

  

Bapak dan ibu yang telah sabar mendidikku, mendukungku dan

mengiring setiap langkahku dengan doa tulus ikhlasnya, serta Lisa dan Linda yang terkasih, untuk sesorang yang telah mengisi hatiku dan untuk almamaterku.

  

PRAKATA

  Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat rahmat dan i anugerahnya, sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsinya yang berjudul “ Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP , FP ,

  30

  40 FP 50 ,dan FP 60 terhadap Kultur Sel SiHa”.

  Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak. Oleh karena itu itu penulis ingin sekali mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

  2. Drs. Mulyono, Apt, selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik, saran dan waktunya.

  3. dr. Luciana Kuswibawati, M.Kes., selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik, saran dan waktunya.

  4. Rita Suhadi, MSi, Apt selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  5. Mbak Yuli, Pak Rajiman dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan dengan baik.

  6. Orang tua dan adik-adikku tercinta atas doa dan dukungannya selama ini.

7. R. Ari Sidharta atas perhatian, bantuan, dukungan dan kebersamaan selama

  8. Sari, Ana, Vita, Lusi, Jeny, Ndari, Lea, atas kebersaman dan kerjasamanya selama penelitian.

  9. Icha, Mila, Vita,Avi, Sinta, dan teman-teman kost buat kebersamaannya selama ini.

  10. Shinta, Ari, Wenny, Melin, Eka, Mellisa, Willy, Rinto, Galaeh, Agnes dan teman- teman kelas C angkatan 2003 atas persahabatan yang indah.

  11. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

  Harapan penulis karya ini bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa angkatan berikutnya untuk berkarya lebih baik bagi kemajuan dunia farmasi di Indonesia. Oleh karena itu penulis menerima saran dan kritik yang membangun guna tercapainya kesempurnaan tulisan ini.

  

INTISARI

  Banyak studi dilakukan untuk memperoleh senyawa-senyawa baru yang memiliki aktivitas antikanker, termasuk dari bahan-bahan alam. Satu diantaranya adalah tanaman mimba (Azadirachta indica A. juss). Daun mimba banyak digunakan untuk mengatasi berbagai penyakit dan diperkirakan mempunyai efek sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP

  30 , FP 40, FP 50 , FP 60 dapat dikembangkan sebagai antikanker.

  Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak, lengkap, dengan pola satu arah. Metode yang digunakan adalah uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  30 , FP 40, FP 50 , FP 60 terhadap sel SiHa

  dan sel Vero . Efek sitotoksik fraksi protein daun mimba FP

  30 , FP 40, FP 50 , FP

  60

  terhadap sel SiHa dan sel Vero menggunakan metode MTT (3,(4,5- dimetiltiazoldifeniltetrazolium bromide). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel yang kemudian diolah dengan menggunakan analisis probit dan uji T sampel independen.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa harga LC

  50 yang diperoleh dari fraksi

  protein daun mimba FP

  30 , FP 40 , FP

50 , dan FP

60 terhadap sel SiHa berturut- turut

  adalah sebesar 0,38 untuk

  μg/ml; 0,45 μg/ml, 0,72 μg/ml, 0,79μg/ml. Harga LC

  50 FP 30 , FP 40 , FP 50 , dan FP 60 terhadap sel vero berturut- turut adalah 0,01

  μg/ml; > 1 g/ml; 0,03 FP

  30 , FP 50, dan FP 60 menunjukkan

  μg/ml; 0,05 μg/ml. Hasil uji t pada bahwa LC

  50 sel SiHa berbeda tidak bermakna dengan LC 50 sel Vero (sig.>0,05).

  Hal ini berarti fraksi protein daun mimba FP FP , dan FP memiliki

  30,

  50

  60

  kemampuan yang sama untuk menginduksi kematian sel SiHa dan sel Vero, sehingga tidak dapat dikembangkan sebagai antikanker. Sedangkan pada FP

  40 dapat dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

  Kata kunci: sitotoksisitas, fraksi protein, daun mimba, sel SiHa, sel Vero, LC

  50

  

ABSTRACT

  Many studies has been done to gain new active compound which have anticancer activity, including from natural resources. One of them is neem plant

  (Azadirachta indica

  A. juss). The neem leaves are used to cure a lot of diseases and suspected have anticancer activity. The objective of this research is to know whether neem leaves protein fraction FP

  30 , FP 40 , FP 50 and FP 60 can be developed to become anticancer or not.

  This research was a pure experiment with one-way completely randomized design. The method which is used is cytotoxicity test od neem leaves protein fration FP30, FP40, FP50 and FP60 against SiHa cells and Vero cells. The cytotoxic effects of neem leaves protein fraction FP

  30 , FP 40 , FP 50 and FP 60 against

  SiHa cells and Vero cells used MTT (3,(4,5-dimetiltiazoldifeniltetrazolium bromide) method. The obtained data (percentage of the death cells) are analyzed with probit test and independent sample T-test.

  The result of the research showed that LC50 value, obtained from neem leaves protein fraction FP

  30 , FP 40 , FP 50 and FP 60 against the SiHa cells

  continuously 0,38 μg/ml; 0,45 μg/ml; 0,72μg/ml; 0,79 μg/ml. The LC50 value for

  FP

  30 , FP 40 , FP 50 dan FP 60 against the Vero cells continuously 0,01

  μg/ml; > 1 g/ml; 0,03 FP and FP showed

  30,

  50

  60

  μg/ml; 0,05 μg/ml. The T-Test result in FP that LC

50 SiHa cells different unsignificant with LC

  50 Vero cells (sig>0,05). From

  the LC

  50 value indicate that protein fraction of mimba’s leaf PF 40 have potency to be developed as anticancer.

  Key word: cytotoxicity, protein fraction, neem leaves, SiHa cells, Vero cells, LC

  50

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................... . i

  HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iii

  HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... v PRAKATA.................................................................................................... vi

  INTISARI...................................................................................................... viii

  

ABSTRACT .................................................................................................... ix

  DAFTAR ISI................................................................................................. x DAFTAR TABEL......................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvi

  DAFTARLAMPIRAN................................................................................ xvii ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH PENTING………………………….. xviii

  BAB I PENDAHULUAN ............................................................................ 1 A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

  1. Permasalahan .............................................................................. 3

  2. Keaslian karya............................................................................. 3

  3. Manfaat penelitian....................................................................... 4

  B. Tujuan Penelitian… ............................................................................. 4

  1. Tujuan umum…… ...................................................................... 4

  2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA........................................................... 6 A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)........................................ 6 1. Keterangan Botani.......................................................................

  6

  2. Kandungan kimia ........................................................................ 6

  3. Khasiat dan penggunaan ............................................................. 6

  4. Deskripsi ..................................................................................... 6

  B. Protein……………. ............................................................................. 7

  C. Kanker… .............................................................................................. 10

  D. Kultur Sel. ………............................................................................... 14

  E. Sel Vero ............................................................................................... 15

  F. Uji Sitotoksisitas .................................................................................. 15

  G. MekanismeSenyawa Antikanker ........................................................ 17

  H. Landasan Teori .................................................................................... 17 I.

  Hipotesis............................................................................................... 18

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 19 A. Jenis dan Rancangan Penelitian........................................................... 19 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...................................... 19

  1. Variabel bebas............................................................................. 19

  2. Variabel tergantung..................................................................... 19

  3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 19

  4. Variabel pengacau tak terkendali ................................................ 19

  5. Definisi operasional .................................................................... 20

  C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 20

  1. Alat ............................................................................................ 20

  2. Bahan .......................................................................................... 20

  D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 21

  1. Determinasi tanaman................................................................... 21

  2. Pengumpulan daun mimba........................................................... 22

  3. Sterilisasi alat dan bahan............................................................. 22

  4. Preparasi fraksi protein daun mimba .......................................... 22

  5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV ............ 24

  6. Propagasi dan panen sel SiHa ..................................................... 24

  7. Propagasi dan panen sel Vero…………………………………... 25

  8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel SiHa........ 26

  9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero......... 27

  E. Analisis Hasil....................................................................................... 28

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 29 A. Determinasi Tanaman .......................................................................... 29 B. Sterilisasi Alat dan Bahan .................................................................... 29 C. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba .................................... 30 D. Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Spektrofotometri UV ...... 32 E. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba...................................... 33 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 42 A. Kesimpulan .......................................................................................... 42 B. Saran..................................................................................................... 42

  DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 43 LAMPIRAN.................................................................................................. 46 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 87

  DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm ....................... 33

  Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel SiHa ………………….……………………………. 36 Tabel III. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero………………….…………………………….. 37 Tabel IV. Harga LC fraksi protein daun mimba terhadap

  50

  sel SiHa………………….…………………………….. 39 Tabel V. Hasil LC

  50 fraksi protein daun mimba terhadap

  sel Vero………………….…………………………… 39 Tabel VI. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm .............................47

  Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  30

  terhadap kultur sel SiHa................................................... 48 Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  40

  terhadap kultur sel SiHa................................................... 48 Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  50

  terhadap kultur sel SiHa................................................... 49

  terhadap kultur sel SiHa................................................... 49 Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  30

  terhadap kultur sel Vero................................................... 50 Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  40

  terhadap kultur sel Vero......................................................50 Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  50

  terhadap kultur sel Vero.......................................................50 Tabel XIV. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  60

  terhadap kultur sel Vero........................................................51

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Sel SiHa dan Sel Vero tanpa perlakuan …………..…...

  33 Gambar 2. Kultur sel SiHa yang diberi perlakuan fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 34 Gambar 3. Kultur sel Vero yang diberi perlakuan fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 34 Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan................................. 35 Gambar 5. Kristal Formazan di Bawah Mikroskop ............................... 35 Gambar 6. Grafik Persen kematian sel SiHa vs konsentrasi fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 37 Gambar 7. Grafik Persen kematian sel SiHa vs konsentrasi fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 38 Gambar 8. Foto tanaman mimba …………............................................. 83 Gambar 9. Foto daun mimba …………................................................... 83 Gambar 10. Foto ELISA reader SLT 340ATC…………........................... 84 Gambar 11. Foto Spektrofotometer UV ………….................................... 84 Gambar 12. Foto Sentrifuse KPLC Series …………................................. 85

  DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat................................. .. 46 Lampiran 2. Cara Perhitungan Kadar Protein ............................................. 47 Lampiran 3. Absorbansi Sel dengan Metode MTT...................................... 48 Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba

  (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel SiHa dengan metode MTT…………………………………....…… 52 Lampiran 5. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba

  (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel vero dengan metode MTT…………………………………....…… 63 Lampiran 6. Uji distribusi data dengan Kolmogorov- Smirnov pada sel SiHa dan sel Vero………….……………………… 74 Lampiran 7. Hasil Uji Signifikansi LC

  50 antara Sel SiHa

  dan Sel Vero dengan Analisis Statistik …………………… 78 Lampiran 8. Perhitungan nilai kolerasi LC Sel SiHa dan Sel Vero

  50

  pada Taraf Kepercayaan 95%…………….……………….. 81 Lampiran 10. Foto tanaman dan daun mimba.............................................. 82 Lampiran 11. Foto ELISA reader, Spektrofotometer UV, dan Sentrifuge... 83 Lampiran 12. Surat Determinasi Tanaman ………………………………... 86

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

  FBS : Fetal Bovine Serum FP : Fraksi Protein LC

  50 : Lethal Concentration 50%

  MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid ) reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N RPMI : Rosswell Park Memorial Institute SDS : Sodium Dodesil Sulfat

  tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan

  leher bengkok 96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas

  FP

  30 : fraksi protein yang diendapkan dengan larutan amonium

  sulfat dengan kadar 30% dari kadar ammonium sulfat jenuh FP

  40 : fraksi protein yang diendapkan dengan larutan amonium

  sulfat dengan kadar 40% dari kadar ammonium sulfat jenuh FP : fraksi protein yang diendapkan dengan larutan amonium

  50

  sulfat dengan kadar 50% dari kadar ammonium sulfat jenuh FP : fraksi protein yang diendapkan dengan larutan amonium

  60

  sulfat dengan kadar 60% dari kadar ammonium sulfat jenuh

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penyakit kanker menempati urutan kedua di Amerika setelah penyakit

  jantung, sedangkan di Indonesia penyakit kanker menempati urutan keenam setelah penyakit jantung. Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, World Health

  

Organization (WHO) dalam 10 tahun mendatang diperkirakan 9 juta orang akan

  meninggal setiap tahun akibat kanker. Di negara-negara industri sekitar satu dari lima orang meninggal karena tumor ganas. Saat ini kanker dengan demikian merupakan salah satu penyebab kematian yang paling sering terjadi dan kasus penderita kanker senantiasa bertambah (Nafrialdi dan Sulistya, 1995). Penyakit yang diderita oleh sekitar tujuh juta orang lebih ini menjadi penyakit yang paling ditakuti oleh semua orang.

  Pengobatan kanker dilakukan dengan cara operasi, penyinaran, dan kemoterapi, menggunakan obat-obat sintetik maupun menggunakan obat-obat tradisional. Obat-obat yang termasuk obat-obat sintetik memiliki toksisitas tinggi, selain itu obat sintetik juga memiliki efek samping yang tinggi pula. Oleh karena itu perlu dikembangkan obat antikanker dari bahan alami yang memiliki efek samping yang relatif kecil daripada obat antikanker sintetik (Mulyadi, 1996).

  Salah satu tanaman yang telah terbukti memiliki kegunaan sebagai obat antikanker adalah tanaman mimba. Tanaman mimba secara tradisional telah dikenal oleh masyarakat sebagai tanaman obat alami untuk mengobati berbagai penyakit, diantaranya tukak lambung, cacar air, penyakit kulit, penyakit lepra, penyakit kuning, bisul, atau borok, dll (Anonim,2006e). Daun mimba diteliti sebagai antikanker dalam penelitian yang berjudul “Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) Hasil Pengendapan dengan Ammonium Sulfat 30%, 60%, dan 100% Jenuh terhadap Kultur Sel SiHa (Candra, 2006)”. Penelitian Candra (2006) menyebutkan bahwa harga LC fraksi protein

  50

  daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30%, 60% dan 100% jenuh berturut-turut adalah sebesar 1,72 μg/ml; 0,04 μg/ml; dan 32,56 μg/ml.

  Menurut NCI (National Cancer Institute) suatu senyawa berpotensi sebagai antikanker bila harga LC

  50

  ≤ 20 µg/ml (Suffnes and Pezzuto, 1991). Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa fraksi protein 60% berefek paling sitotoksik terhadap sel SiHa dan fraksi protein 30% dan 60% diperkirakan memiliki aktivitas sebagai antikanker.

  Dari hasil penelitian tersebut diduga bahwa fraksi protein daun mimba yang lebih spesifik yaitu antara fraksi protein daun mimba 30% dan 60% jenuh juga mempunyai efek sitotoksik terhadap sel SiHa dan diperkirakan memiliki aktivitas sebagai antikanker. Hal tersebut yang mendasari dilakukannya penelitian dengan cara fraksinasi protein daun mimba dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat FP , FP , FP ,dan FP terhadap kultur sel SiHa untuk

  30

  40

  50

  60

  mengetahui fraksi protein mana yang menghasilkan efek sitotoksik paling besar dan lebih berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

  Hasil yang didapatkan dari penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan tentang khasiat dan kegunaan tanaman mimba, juga untuk memberikan informasi sitotoksik dari daun mimba terhadap sel kanker.

1. Rumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang dari penelitian timbul berbagai permasalahan, yaitu : a.

  30

  , FP , FP ,dan fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  40

  50 FP 60 , manakah yang mempunyai efek sitotoksisitas paling besar terhadap sel

  SiHa?

  b. dari fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica seberapa besar nilai LC

50 A. Juss) FP 30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 terhadap sel SiHa? c.

  30

  , FP , apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  40 FP 50 ,dan FP 60 , juga memiliki efek sitotoksisitas terhadap sel Vero?

  d. apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 ,

  FP ,dan FP memiliki efek sitotoksisitas sehingga berpotensi untuk

  50

  60

  dikembangkan sebagai antikanker?

2. Keaslian Karya

  Sebelumnya telah dilakukan penelitian mengenai “Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, dan 100% Jenuh terhadap Kultur Sel SiHa (Candra, 2006)”. Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi potein daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP , FP ,

  30

  40 FP 50 ,dan FP 60 terhadap kultur sel SiHa.

3. Manfaat Penelitian a.

  Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat melengkapi dan memperkaya informasi yang telah ada mengenai khasiat, penggunaan dan efek sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap kultur sel SiHa dan sel Vero.

  b.

  Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif untuk pengobatan kanker dengan menggunakan bahan dari alam.

B. Tujuan Penelitian

  1. Tujuan Umum Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah fraksi protein daun

  Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 berpotensi sebagai antikanker.

2. Tujuan khusus dari penelitian ini adalah :

  40

  , FP

  a. untuk mengetahui fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30

  60 terhadap sel SiHa.

  ,dan FP

  50

  , FP

  40

  30

  , FP

  A. Juss) FP

  50 dari fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

  b. untuk mengetahui nilai LC

  , FP

  60

  ,dan FP

  50

  yang mempunyai efek sitotoksisitas paling besar terhadap sel SiHa. c. untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

  A. Juss) FP

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 , juga memiliki efek sitotoksisitas terhadap sel Vero.

  d. untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

  A. Juss) FP

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 memiliki efek sitotoksisitas sehingga berpotensi dikembangkan sebagai antikanker.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Azadirachta indica A. Juss

  1. Keterangan Botani Daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan divisi spermatophyta dan termasuk dalam kelas dikotiledon, famili Meliaceae, Genus

  Azadirachta, Spesies Azadirachta indica A. Juss, Sinonim Melia azadirachta Linn (Backer dan Backuizen van den Brink, 1965; Hutapea, 1993).

  2. Kandungan kimia Daun mimba mempunyai kandungan azadirachtin, nimbin, nimbinene, nimbandiol, nimbolide, quercetin, dan margosin (Anonim,2006a).

  3. Khasiat dan penggunaan Tanaman mimba secara tradisional digunakan oleh masyarakat untuk mengobati bisul atau borok, penyakit kuning, penyakit kulit, tukak lambung, dll.

  Daun mimba dapat menghilangkan toksin, membersihkan darah, dan mencegah kerusakan karena senyawa radikal bebas dalam tubuh. (Anonim,2006e).

  4. Deskripsi Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak, berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, dan berwarna coklat.

  Daun berwarna hijau, majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, dan tangkai daun panjang 8-20 cm. Bunga berwarna putih, majemuk, berkelamin dua, terletak di ujung cabang, bertangkai silindris, panjang 8-15 cm, kelopak hijau, mahkota halus, benang sari silindris berwarna putih kekuningan, putih lonjong, dan coklat muda. Buah berwarna hijau, berbentuk bulat telur, dan buni. Biji berbentuk bulat, berwarna putih, dan mempunyai diameter 1 cm.

  Tanaman mimba mempunyai akar tunggang yang berwarna coklat (Hutapea, 1993).

B. Protein

  Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Di samping berat molekul yang berbeda-beda, protein mempunyai sifat yang berbeda-beda pula. Ada protein yang mudah larut dalam air, tetapi ada juga yang sukar larut dalam air (Poedjiadi, 1994).

  Fraksinasi protein dilakukan dengan memisahkan masing–masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Ada dua macam cara yang biasa digunakan dalam proses fraksinasi yakni dengan jalan pengendapan dan kromatografi. Fraksinasi protein dengan jalan pengendapan dapat dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat dalam konsentrasi tertentu (Poedjiadi, 1994).

  Keuntungan fraksinasi menggunakan amonium sulfat adalah lebih efektif dari garam kation yang lain, selain itu harganya lebih murah dan ada manfaat yang lebih besar lagi yaitu dapat menstabilkan protein yang dimurnikan. Pada konsentrasi garam yang tinggi dapat mencegah terjadinya proteolisis dan juga mencegah pertumbuhan bakteri. Selain itu, amonium sulfat bersifat inert, tidak bereaksi dengan protein yang dipisahkan. Namun kelemahannya, amonium sulfat biasanya terkontaminasi oleh logam berat seperti besi, sehingga dapat mengganggu proses pengendapan. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan yang diinginkan dapat ditentukan dengan rumus yang mudah (Scopes, 1994).

  Beberapa metode tersedia untuk determinasi protein, antara lain: 1) metode Spektrofotometri

  Sebagian besar protein memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 280 nm karena adanya residu asam amino tirosin dan triptofan.

  Keuntungan metode ini yaitu sensitifitasnya tinggi dan tidak membutuhkan reagen. Komponen yang mengandung cincin purin dan pirimidin akan menyerap UV pada panjang gelombang 260 nm. Dengan demikian keberadaan beberapa komponen tersebut akan mengganggu pengukuran absorbansi protein pada panjang gelombang 280 nm. Oleh karena itu untuk pengukuran protein dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 untuk mengoreksi adanya komponen- komponen tersebut (Kerese, 1984). 2) metode Biuret

  Prinsip dari metode biuret adalah mencampur larutan yang mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan CuSO

  4 yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai

  biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan

  2+

  karena reaksi antara Cu dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain

  2+

  berikatan dengan Cu sehingga membentuk kompleks warna biru violet, dimana semakin lama warna yang terbentuk akan semakin pekat (tua). Reaksi ini tidak dapat terjadi pada dipeptida dan asam amino bebas (kecuali serin dan treonin). Range protein yang dapat dianalisis menggunakan merode biuret yaitu 0,2 sampai 2 mg.

  3) metode Lowry Prinsip dari metode Lowry adalah mencampur larutan yang mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan

  CuSO yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai

  4

  biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan

  2+

  karena reaksi antara Cu dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain

  2+ berikatan dengan Cu sehingga membentuk kompleks warna biru violet.

  Kemudian terjadi reduksi reagen fosfomolibdat- fosfotungstat (reagen Folin- Ciocalteau) oleh tirosin, triptofan, dan sistein.

  4) metode “Dye- Binding” Interaksi antara reagen Coomassie Brilliant Blue G250 dengan protein memberikan perubahan warna yang teramati, sehingga kadar protein dapat ditetapkan dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm (Alexander, 1985).

C. Kanker

  1. Definisi Kanker Kanker merupakan penyakit berbahaya yang merusak bagian-bagian tubuh, ditandai pertumbuhan yang cepat dan tidak terkendali dari sel-sel secara abnormal serta membentuk massa yang sangat banyak yang bersama-sama membentuk suatu tumor. Apabila proses tersebut tidak ditahan pertumbuhannya akan menyebabkan kematian sel organisme (Dewick, 1989).

  Sifat umum dari kanker adalah : 1) pertumbuhan berlebihan umumnya berbentuk tumor; 2) gangguan diferensiasi dari sel dan jaringan; 3) bersifat infasif, mampu tumbuh di jaringan sekitarnya; 4) bersifat metastatik, menyebar ke tempat lain dan mengakibatkan pertumbuhan baru; 5) memiliki hereditas bawaan; dan 6) pergeseran metabolisme ke arah pembentukkan makromolekul dari nukleosida dan asam amino serta peningkatan katabolisme karbohidrat untuk energi sel (Nafrialdi dan Sulistya, 1995).

  Neoplasma merupakan pertumbuhan baru yang lazim dikenal dengan tumor. Neoplasma cenderung untuk diuraikan sebagai suatu pertumbuhan pada jaringan yang tidak terkendali. Menurut cara penyebarannya neoplasma ini dapat dibagi menjadi dua : a). tumor benigna

  Tumor benigna dapat terus membesar namun tidak akan menyerang jaringan-jaringan di sekitarnya dan juga tidak akan menyebar di luar lokasi yang semestinya (metastasis). Tumor benigna ini umumnya dianggap lebih tidak berbahaya dibandingkan tumor malignan. Namun, suatu pertumbuhan yang terus menerus membesar sekalipun tidak menyebar, dapat pula berakibat fatal jika pertumbuhanya kemudian mengganggu organ-organ vital tubuh dan fungsinya.

  b). tumor malignan Berbeda dengan tumor benigna, tumor malignan dapat menyerang jaringan-jaringan di sekitarnya dan juga mampu melakukan metastasis sehingga dianggap lebih berbahaya. Banyak tumor malignan pada manusia berasal dari jaringan epitel. Hal ini dapat terjadi karena jaringan ini memiliki kontak langsung dengan lingkungan yang cukup tinggi (Greens & Harris, 2000). Umumnya, yang dimaksud dengan kanker adalah tumor malignan karena sel-selnya dapat menyebar ke daerah lain, merusak jaringan tubuh di sekitarnya dan bahkan dapat merusak bagian organ lain dalam tubuh. Salah satunya, dengan jalan menyebar atau metastasis lewat aliran darah. Ketika mencapai organ baru, sel-sel tersebut akan membentuk lagi tumor yang baru (Kardinan & Taryono, 2003).

2. Proses terjadinya kanker

  Sel-sel normal dapat berubah menjadi sel-sel kanker karena adanya satu atau lebih mutasi yang terjadi pada DNA sel. Perkembangan penyakit kanker merupakan suatu proses rumit yang melibatkan tidak hanya suatu perubahan genetik namun juga faktor-faktor epigenetik (misalnya, aksi hormonal tubuh, bahan-bahan karsinogen, dan lain-lain) yang tidak berkembang menjadi tumor itu sendiri namun dapat meningkatkan kemungkinan terjadinya mutasi pada DNA sel yang pada akhirnya dapat menyebabkan terjadinya kanker (Rang et al, 2003).

  Ada dua kategori utama perubahan genetik yang mampu mendorong terjadinya kanker : a). aktivasi proto-onkogen menjadi onkogen

  Proto-onkogen adalah gen yang berfungsi untuk mengontrol proses pembelahan, apoptosis dan diferensiasi pada sel-sel normal. Pada kejadian kanker proto-onkogen ini dapat berubah menjadi onkogen oleh adanya virus maupun aksi dari senyawa-senyawa karsinogen.

  b). inaktivasi gen penekan terbentuknya tumor Sel-sel normal memiliki suatu gen yang mempunyai kemampuan untuk menekan terbentuknya tumor yang disebut gen penekan terbentuknya tumor atau anti-onkogen. Saat ini, telah ditemukan bukti bahwa adanya mutasi pada gen tersebut terlibat dalam banyak kejadian kanker. Hilangnya fungsi dari gen penekan terbentuknya tumor tersebut dapat menjadi penyebab utama terjadinya kanker (Rang et al, 2003).

  Beberapa karakteristik umum yang dapat membedakan antara sel kanker dengan sel normal antara lain, sel kanker memiliki pertumbuhan yang tidak terkontrol, proses pembelahan pada sel kanker tidak lagi dapat dikendalikan oleh proses regulasi dari pembelahan dan pertumbuhan sel yang normal sehingga terjadilah gangguan diferensiasi dan fungsi dari sel tersebut. Sel normal umumnya akan berdiferensiasi menjadi sel yang matang dan bergabung dengan sel-sel lainnya membentuk jaringan dan baru kemudian dapat melaksanakan fungsi yang semestinya. Pada sel kanker, proses pembelahan yang terlalu cepat mengakibatkan sel-sel tersebut tidak terdiferensiasi sempurna. Akibatnya, sel tidak mature sehingga tidak dapat menjalankan fungsi yang semestinya. Sel kanker juga memiliki kemampuan berinvasif yakni, kemampuan untuk tumbuh di jaringan sekitarnya dan mengganggu fungsi jaringan tersebut. Selain itu, sel kanker juga mampu melakukan metastasis yang merupakan penyebaran dari tumor induk membentuk tumor sekunder, yang mampu mencapai daerah lain pada tubuh, lewat pembuluh darah atau pun limpa. Dilaporkan bahwa metastasis merupakan penyebab utama kematian pada banyak kasus kanker dan hal ini pulalah yang mendasari permasalahan utama pada terapi kanker (Rang et al, 2003).

  Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut: 1. hiperplasi adalah pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel- sel baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan.

  2. metaplasi yaitu pertumbuhan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga dewasa.

  3. displasi yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar dan orientasinya yang masih bersifat reversibel.

  4. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang bersifat ireversibel.

  5. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif.

  6. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan (Kuswibawati, 2000).

  2. Kanker leher rahim Penyebab dari terjadinya kanker leher rahim (cervix) disebut–sebut karena adanya infeksi dari HPV (Human Papiloma Virus). Human Papiloma Virus

  (HPV) merupakan virus DNA yang sangat kecil namun infektif serta dapat menimbulkan lesi pada kulit maupun sel epitel pipih. Ada lebih dari 100 tipe HPV, tipe yang umum adalah tipe 16 dan 18. Kedua tipe ini dapat menimbulkan perubahan abnormal sel–sel cervix (CIN) dan selanjutnya menyebabkan terjasinya kanker cervix atau kanker leher rahim (Widyani, 2005).

  Faktor seluler dari HPV yang bertanggung jawab atas munculnya kanker leher rahim adalah viral E6 dan E7. DNA E6 dan E7 dari virus ini mampu menyebabkan kekacauan pada siklus dan proliferasi sel akibat tidak aktifnya gen penekan tumor p53 dan pRb pada sel normal. Viral DNA E6 akan mengikat kuat p53 sedangkan DNA E7 akan mengikat pRb (King, 2000).

D. Kultur Sel

  Penggunaan kultur sel sebagai subyek uji dikarenakan selain banyaknya tekanan publik untuk mengurangi bahkan tidak menggunakan hewan sebagai subyek uji dalam percobaan mengingat segi moral. Alasan lain tidak menggunakan hewan percobaan ialah untuk menghemat biaya yang besar apabila menggunakan hewan percobaan dan juga rendahnya nilai korelasi antara hasil yang diperoleh dengan penelitian menggunakan hewan jika dikorelasikan dengan manusia. Dengan menggunakan kultur sel sebagai alternatif subyek dalam pengujian toksikologi, maka mekanisme toksisitas biokimia dapat dikerjakan dengan lebih efektif. Hal ini dikarenakan kondisi dari sel dapat dikontrol dan dimodifikasi (Wallin, 1998).

  Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel jaringan primer dari suatu karsinoma cervix dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi. Sel ini ditemukan pada manusia sekitar tahun 1995. Morfologi sel SiHa mirip dengan sel epitelial dan tipe inti selnya tidak diketahui. Sel ini mengandung

  Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2006d).

E. Sel Vero Sel Vero ditemukan pertama pada tahun 1962 oleh Y. Yasumura dan Y.

  Kawakita di Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel Vero diambil dari ginjal kera dewasa (jenis African Green Monkey) yang sehat. Selain sering digunakan dalam produksi vaksin, sel Vero juga sering digunakan untuk mendeteksi Verotoksin. Saat ini, sel Vero telah banyak digunakan untuk mengembangkan pengobatan berbagai macam penyakit, salah satu diantaranya yaitu diabetes (Anonim, 2006c).

  Sel Vero digunakan secara luas pada studi replikasi virus dan uji penyakit pes. Selain itu juga digunakan untuk uji berbagai penyakit yang diakibatkan oleh virus (Anonim, 1983).

F. Uji Sitotoksisitas

  Uji sitotoksisitas ialah suatu uji yang secara in vitro menggunakan kultur sel dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun bahan-bahan kimia lainnya (Freshney, 1986).

  Uji sitotoksisitas ini merupakan suatu uji yang cepat, terstandarisasi, sensitif dan tidak terlalu mahal, dengan kepentingan untuk menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksis) secara biologik dalam jumlah yang signifikan. Sensitifitas yang tinggi dari uji ini karena adanya sel uji yang terisolasi dalam kultur dan tidak adanya mekanisme protektif tubuh yang mempengaruhi sel uji (Wallin, 1998).

  Ada beberapa metode untuk mengetahui hasil uji sitotoksisitas, yaitu metode Trypan Blue Staining, Tritium-labeled Thymidine dan MTT. Trypan Blue

  

Staining adalah cara sederhana untuk mengevaluasi integritas dari membran sel,

yang kemudian dari hasilnya dapat menunjukkan kematian atau proliferasi sel.

  Namun metode ini kurang sensitif. Metode kedua yaitu Tritium-labeled Thymidine adalah metode yang menggunakan senyawa radioaktif tritium yang dilabelkan pada timidin. Pengukuran jumlah bahan radioaktif yang terambil oleh sel ini sangat akurat namun metode ini memerlukan waktu yang lebih lama. Sedangkan metode MTT adalah metode kolorimetrik yang mengukur hasil reduksi dengan garam tetrazolium menjadi kristal formazan yang berwarna ungu oleh mitokondria sel hidup melalui metabolismenya. Kemudian warna ungu yang dibentuk diukur dengan pembacaan ELISA plate reader. Jumlah warna yang dibentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup. Metode MTT bersifat kuantitatif dan lebih sensitif bila dibandingkan dengan metode Trypan Blue karena adanya hubungan yang linear antara keaktifan sel dan absorbansi,

  Staining

  jumlah sel yang tumbuh maupun mati dapat diukur. Sedangkan Trypan Blue bersifat kualitatif dan hanya mengindikasikan sel yang masih hidup

  Staining (Anonim, 2006b).