Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel kanker payudara T47D - USD Repository

  

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MER AH

(Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP

KULTUR SEL KANKER PAYUDARA T47D

SKRIPSI

  Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Kartina Neritika NIM : 048114112

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

  Demi masa. Sesungguhnya manusia pasti akan rugi. Kecuali orang-orang yang beriman dan beramal shaleh, serta saling berwasiat untuk berlaku sabar.

  (Al ‘Ashr)

  Ku persembahkan karyaku ini kepada:

Bapak dan ibu yang telah mendidik, mendukung dan mengiring

setiap langkahku dengan doa tulus ikhlasnya, serta Mas Tigor dan Nanda yang terkasih, untuk seseorang yang telah mengisi hatiku dan untuk almamaterku.

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Kartina Neritika Nomor Mahasiswa : 048114112

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

  

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz

& Pav) terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D”

  beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me- ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 18 Juli 2008 Yang menyatakan, ( Kartina Neritika )

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta,

  18 Juli 2008 Penulis,

  Kartina Neritika

  INTISARI

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH

(Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP

KULTUR SEL KANKER PAYUDARA T47D

  Banyak studi dilakukan untuk memperoleh senyawa-senyawa baru yang memiliki aktivitas antikanker, termasuk dari bahan-bahan alam. Satu diantaranya adalah tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Daun sirih merah secara empiris telah digunakan untuk mengobati penyakit kanker, tetapi belum ada data ilmiah yang mendukung. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah dapat dikembangkan sebagai antikanker.

  Uji aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel kanker payudara T47D dilakukan dengan metode direct counting menggunakan triphan blue dan diamati secara visual setelah diinkubasi selama 24 jam. Data yang diperoleh berupa persen kematian sel dan jumlah sel hidup setelah perlakuan yang kemudian diolah dengan menggunakan analisis probit dan uji one-way ANOVA.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel T47D, dengan harga LC sebesar 587,7

  50

  μg/ml, dengan demikian ekstrak etanolik daun Sirih merah dimungkinkan mengandung senyawa yang mempunyai aktivitas antikanker. Kata kunci : sitotoksisitas, daun sirih merah, sel T47D, LC

  50

  

ABSTRACT

THE CYTOTOXICITY ASSAY OF ETHANOLIC EXTRACT

OF CELEBES PEPPER LEAVES (Piper crocatum Ruiz & Pav)

AGAINST BREAST CANCER CELL LINE T47D CULTURE

  Many studies has been done to gain new active compound having anticancer activity, including from natural resources. One of them is celebes pepper plant (Piper crocatum Ruiz & Pav). The celebes pepper leaves empirically has been used for cancer treatment. There is no scientific evidence yet to support it. Therefore the objective of this research is to determine whether celebes pepper leaves ethanolic extract can be developed to be anticancer medicine.

  The cytotoxic activity of ethanolic extract of the celebes pepper leaves was tested on breast cancer cell line T47D culture used direct counting method and was visually investigated after 24 hours of incubation by triphan blue. The obtained data (percentage of the death cells and lived cells after treatment) are analyzed with probit test and one-way ANOVA test.

  The result of the research showed that ethanolic extract of celebes pepper’s leaf has cytotoxic activity on breast cancer cell line T47D, with LC50 value was 587.7

  μg/ml. That is indicate that ethanolic extract of Celebes pepper’s leaf probably to be developed as anticancer. Key word: cytotoxicity, celebes pepper leaves, T47D cells, LC

  50

  

PRAKATA

  Puji syukur kepada Allah SWT atas berkat rahmat dan anugerahnya, sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsinya yang berjudul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Sel Kanker Payudara T47D”.

  Terselesaikannya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak. Oleh karena itu itu penulis ingin sekali mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

  2. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik, saran dan waktunya.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik, saran dan waktunya.

  4. Rita Suhadi, MSi, Apt selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  5. Mbak Yuli dan segenap teknisi Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT), Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan dengan baik.

  6. Ign. Y Kristyo B, M.Si. dan Romo Sunu, yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan serta dalam analisis statistik.

  8. Aa’ Inzi Almuntadzar atas perhatian, bantuan, dukungan dan kebersamaan selama ini.

  9. Mas Irfad dan Fadrian atas semua pelajaran, perhatian, semangat dan dukungan yang diberikan.

  10. Semua neritikcats atas kebahagiaan yang kalian berikan.

  11. Caca Lemek atas semua kebersamaan dan persahabatan yang indah.

  12. Eva, Meri, Nur, dan Sisca atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian.

  13. Mba Echa, Resti, Brian, mba Mimi, Septi, Iyast, Meri, dan teman-teman kost buat kebersamaannya selama ini.

  14. Dona, Dipta, Probo, Rike, Cendani, Evie, Selvi, Robby, Ine, Budiaji, Finza, Maria, Sisca, Robert, Resti, Chandy, teman- teman kelas C, dan teman-teman FST angkatan 2004 atas persahabatan yang indah.

  15. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

  Harapan penulis karya ini bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa angkatan berikutnya untuk berkarya lebih baik bagi kemajuan dunia farmasi di Indonesia. Oleh karena itu penulis menerima saran dan kritik yang membangun guna tercapainya kesempurnaan tulisan ini.

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................... .......... ii HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................... ......... iv HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...........................................................v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA....................................................... ......... vi

  INTISARI.............................................................................................................. vii ......................................................................................................... . viii

  ABSTRACT

  PRAKATA............................................................................................................. ix DAFTAR ISI............................................................................................................x DAFTAR TABEL..................................................................................................xv DAFTAR GAMBAR................................................................................... ....... .xvi DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii

  BAB I PENGANTAR........................................................................... ...................1 A. Latar Belakang.................................................................................... ........... 1

  1. Rumusan Masalah................................................................................. 2

  2. Keaslian karya............................................................................ ............3

  3. Manfaat penelitian...................................................................... ............3

  B. Tujuan Penelitian…............................................................................ ........... 3

  1. Tujuan umum……................................................................................. 3

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................4 A. Kanker dan Karsinogenesis............................................................................ 4 B. Kanker Payudara…………..............................................................................8 C. Kultur Sel…............................................................................................. ...... 8 D. Sel kanker T47D. ………............................................................................... 9 E. Sirih Merah......................................................................... ..........................10

  1. Keterangan Botani.....................................................................................10

  2. Morfologi tanaman....................................................................................10

  3. Khasiat dan kegunaan ...............................................................................11

  4. Penelitian tentang sirih merah...................................................................11

  5. Kandungan kimia ..................................................................................... 11

  F. Flavonoid ......................................................................................................11

  G. Teknik penyarian...........................................................................................12

  1. Ekstrak ......................................................................................................12

  2. Pelarut .......................................................................................................12

  3. Maserasi ....................................................................................................13

  H. Uji Sitotoksisitas ....................................................... .................................. 14

  I. Landasan Teori............................................................................................. 18 J. Hipotesis........................................................................................................18

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN...............................................................19 A. Jenis dan Rancangan Penelitian......................................................... ......... 19 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.................................. .............19

  2. Variabel tergantung................................................................ ..............19

  3. Variabel pengacau terkendali..................................................... ..........19

  4. Definisi operasional................................................................... ...........19

  C. Alat dan Bahan..............................................................................................20

  1. Alat ........................................................................................... .......... 20

  2. Bahan......................................................................................... ...........20

  D. Tata Cara Penelitian............................................................................ ......... 22

  1. Determinasi tanaman................................................................. .......... 22

  2. Pengumpulan daun sirih merah.......................................................... . 22

  3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah.................................. ....22

  4. Sterilisasi alat dan bahan ......................................... ........................... 23

  5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh .......... .............. 23

  6. Pengaktifan dan panen sel T47D................................................... ...... 24

  7. Pembuatan larutan uji ......................………………………………….25

  8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah pada sel T47D..... 25

  E. Analisis Hasil..................................................................................... ...........27

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.................................................... ...........28 A. Determinasi Tanaman........................................................................ .......... 28 B. Pengumpulan daun sirih merah.....................................................................28 C. Sterilisasi alat dan bahan.............................................................................. 29 D. Maserasi..... .................................................................................................. 30 E. Uji Sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah pada sel T47D.............31

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................41 A. Kesimpulan........................................................................................ ...........41 B. Saran..............................................................................................................41 DAFTAR PUSTAKA................................................................................. ...........42 LAMPIRAN...........................................................................................................46 BIOGRAFI PENULIS................................................................................ ...........63

  

DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel T47D ....................... ......................................................36 Tabel II. Data log konsentrasi dan harga probit…………………………....38 Tabel III. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% ....56 Tabel IV. Harga probit sesuai dengan presentasenya……………………….58

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Morfologi sel T47D …………..…... .............................................31 Gambar 2. Reaksi pembentukan kristal formazan...………………………… 32 Gambar 3. Kristal Formazan............................................................................33 Gambar 4. Foto sel T47D pada haemocytometer............................................ 34 Gambar 5. Konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah vs persentase kematian sel T47D............................. ......................36 Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak sirih merah vs probit pada sel T47D pada replikasi 1...……………………… 37 Gambar 7. Grafik hubungan log kadar ekstrak sirih merah vs probit pada sel T47D pada replikasi 2...……………………… 38 Gambar 8. Grafik hubungan log kadar ekstrak sirih merah vs probit pada sel T47D pada replikasi 3.......................................38 Gambar 9. Foto tanaman sirih merah …………..............................................59 Gambar 10. Foto ELISA reader …………......................... .........................….60 Gambar 11. Foto Sentrifuge …………..............................................................60 Gambar 12. Foto 96 well-plate dan conical steril …………........................... ..60 Gambar 13.

  Laminar Air Flow...........................................................................

  61 Gambar 14. Haemocytometer dan cell counter..................................................61 Gambar 15. Microscope inverted.......................................................................61

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Data absorbansi sel dengan metode MTT................................. ....46 Lampiran 2. Perhitungan jumlah sel dengan menggunakan metode

  direct counting ............................................ ...................................46

  Lampiran 3. Perhitungan % Kematian Sel T47D ...............................................49 Lampiran 4. Perhitungan LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel

  T47D dengan menggunakan analisis probit ..................................52 Lampiran 5. Perhitungan nilai korelasi LC

  50 ekstrak etanolik daun sirih merah

  terhadap sel T47D pada taraf kepercayaan 95% ............................56 Lampiran 6. Tes distribusi normal dengan menggunakan metode Kolmogorov-

  Smirnov…………………………………....…… ..........................57 Lampiran 7. Perhitungan perbedaan mean pada kontrol dan perlakuan dengan menggunalan analisis statistik one-way ANOVA .............57 Lampiran 8. Harga Probit Sesuai dengan Prosentasenya ………………… ......58 Lampiran 9. Foto tanaman sirih merah………….………………......................59 Lampiran 10. Peralatan dan Bahan yang Digunakan dalam

  Penelitian.............................................. .........................................60 Lampiran 11. Surat Determinasi... .......................................................................62

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Di AS dan beberapa negara berkembang lainnya, kanker sekarang ini bertanggung jawab untuk sekitar 25% dari seluruh kematian (Anonim, 2005). Salah satu jenis penyakit kanker yang paling ditakuti kaum wanita adalah kanker

  payudara. Di Indonesia jumlah penderita kanker payudara menduduki tingkat kedua setelah kanker mulut rahim (Anonim, 2008a).

  Pengobatan kanker payudara dapat dilakukan dengan jalan operasi, kemoterapi, radiasi (penyinaran), dan haemopati (Yuliani, 2000). Obat-obat yang termasuk obat-obat sintetik memiliki toksisitas tinggi, selain itu obat sintetik juga memiliki efek samping yang tinggi pula. Oleh karena itu perlu dikembangkan obat antikanker dari bahan alami yang memiliki efek samping yang relatif kecil daripada obat antikanker sintetik (Mulyadi, 1996).

  Salah satu tanaman yang diyakini memiliki kegunaan sebagai obat antikanker adalah daun sirih merah. Sirih merah selain bersifat antiseptik seperti halnya sirih hijau, sirih merah juga bisa dipakai mengobati diabetes, kanker, peradangan, hipertensi, hepatitis, dan ambeien. Jika dibuat teh herbal bisa mengobati asam urat, darah tinggi, kencing manis, maag, atau kelelahan (Waldan dan Sulistyati, 2001)

  Saat ini belum banyak publikasi penelitian tentang kemampuan daun sirih banyak digunakan sebagai obat tradisional, selain itu daun sirih merah telah diyakini dapat bermanfaat sebagai obat antikanker, terbukti dari cukup banyaknya penderita kanker yang sembuh setelah mengkonsumsi daun sirih merah dalam bentuk rebusan atau pun bentuk lainnya. Hal tersebutlah yang mendasari dilakukannya penelitian dengan cara melakukan ekstraksi daun sirih merah terhadap kultur sel T47D untuk mengetahui apakah daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik dan dapat berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

  Hasil yang didapatkan dari penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan tentang khasiat dan kegunaan daun sirih merah, juga untuk memberikan informasi sitotoksik dari daun sirih merah terhadap sel kanker.

  1. Rumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang dari penelitian timbul berbagai permasalahan, yaitu : a.

  Apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksisitas terhadap kultur sel T47D? b. Seberapa besar nilai LC

  50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap

  kultur sel T47D?

  2. Keaslian Karya

  Sejauh ini penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel T47D di Universitas Sanata Dharma dan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

3. Manfaat Penelitian a.

  Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat melengkapi dan memperkaya informasi yang telah ada mengenai khasiat, penggunaan dan efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel T47D.

  b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif untuk pengobatan kanker dengan menggunakan bahan dari alam.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik.

2. Tujuan khusus a.

  Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksisitas terhadap kultur sel T47D.

  b. Untuk mengetahu nilai LC

  50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap

  kultur sel T47D

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kanker dan Karsinogenesis Kanker merupakan suatu penyakit sel yang ditandai dengan hilangnya

  fungsi kontrol sel terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostatis sel pada organisme multiseluler. Kegagalan tersebut menyebabkan sel tidak dapat berproliferasi secara normal. Akibatnya, sel akan berproliferasi terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal (Lodish et al., 2000). Kanker dianggap suatu kelompok penyakit seluler dan genetik karena dimulai dari satu sel yang telah mengalami mutasi DNA sebagai komponen dasar gen. Sel-sel yang mengalami kerusakan genetik tidak peka lagi terhadap mekanisme regulasi siklus sel normal sehingga akan terus melakukan proliferasi tanpa kontrol. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel (pertumbuhan, kematian dan pemeliharaan sel) akan menyebabkan penyimpangan siklus sel, dan salah satu akibatnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis (Silalahi, 2006).

  Seiring dengan berkembangnya ilmu biologi molekuler, pengetahuan tentang mekanisme molekuler yang dapat mencetuskan terjadinya kanker dapat berkembang pula. Oleh karenanya dapat diketahui berbagai alternatif jalur yang dapat ditempuh untuk pengembangan obat untuk terapi kanker (Hanahan dan Weinberg, 2000). Sel kanker memiliki karakteristik sebagai berikut : a. Sel kanker mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri.

  Sinyal pertumbuhan diperlukan agar sel dapat terus membelah. Berbeda dari sel normal, sel kanker dapat tetap dan terus tumbuh.

  b. Tidak sensitif terhadap sinyal anti-pertumbuhan. Sel kanker tidak merespon adanya sinyal yang dapat menghentikan terjadinya pertumbuhan dan pembelahan sel, dengan demikian, sel kanker dapat terus membelah.

  c.

  Sel kanker mampu menghindar dari mekanisme apoptosis. Apoptosis merupakan program bunuh diri sel ketika sel tersebut mengalami kerusakan, baik struktural maupun fungsional, yang tidak dapat ditolerir lagi. Namun sel kanker dapat menghindar dari kematian dengan mengeblok jalur terjadinya apoptosis di dalam sel.

  d.

  Sel kanker memiliki potensi tak terbatas untuk mengadakan replikasi.

  e. Sel kanker mampu menginduksi angiogenesis untuk mencukupi kebutuhannya akan oksigen dan nutrisi. Akan terbentuk cabang baru pada pembuluh darah yang menuju sel kanker yang kemudian akan mensuplai kebutuhan nutrisi dan oksigen dari sel kanker.

  f.

  Sel kanker mampu menginvasi jaringan di sekitarnya dan membentuk anak sebar. (Hanahan dan Weinberg, 2000) Pertumbuhan kanker merupakan sebuah proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung selama beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis. Usaha penyembuhan penyakit kanker

  (Albert et al., 1994). Proses karsinogenesis melalui beberapa fase, yang meliputi fase inisiasi, fase promosi, fase progresi, dan metastasis. Inisiasi merupakan fase pertama dan merupakan hasil dari adanya perubahan genetik yang menyebabkan terjadinya proliferasi abnormal dari satu sel. Pada fase inisiasi terjadi interaksi kovalen antara spesies reaktif (metabolit dari senyawa karsinogen dengan molekul DNA sebagai sel target selanjutnya merusak struktural DNA). Promosi merupakan kelanjutan inisiasi di mana sel mendapatkan pacuan dari tumor

  

promoting factor yang menyebabkan pertumbuhan yang cepat dan pembentukan

  tumor benign. Pada fase progresi, perubahan genetik semakin bertambah banyak sehingga akan menambah koloni sel tumor dengan peningkatan kemampuan tumbuh dan munculnya keistimewaan-keistimewaan yag lain, seperti peningkatan mobilitas dan angiogenesis. Fase berikutnya adalah metastasis, yaitu perkembangan tumor yang bersifat malignant dan terjadinya pelepasan sel-sel tumor ganas dari koloni primernya. Sel-sel tumor ganas ini dapat merusak saluran limfatik sehingga dapat menyebar ke seluruh tubuh dan berkembang di tempat yang jauh (Schneider, 1997)

  Ada tiga cara atau faktor penting dalam proses terjadinya mutasi gen yaitu : (1) faktor lingkungan yang meliputi nutrisi, agen infektor, gaya hidup; (2) faktor kebetulan, dan (3) faktor keturunan atau bawaan. Faktor lingkungan seperti gaya hidup dan pola makan berkorelasi dengan insiden kanker; misalnya paparan sinar ultraviolet dengan kanker kulit, merokok dengan kanker paru-paru. Tetapi tidak semua perokok akan mengidap kanker paru-paru atau berjemur akan selalu menderita kanker kulit; berarti ada faktor lain di luar faktor lingkungan yakni kesalahan replikasi DNA dan bawaan (Silalahi, 2006).

  Kanker dapat terjadi akibat akumulasi DNA termutasi dalam gen terutama yang mengatur proses siklus dan pertumbuhan sel. Mekanisme ketiga cara terjadinya mutasi DNA adalah melalui faktor keturunan atau bawaan, yang menyebabkan 5-10% kanker. Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel akan mengakibatkan penyimpangan, dan salah satu dampak negatifnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis. Ada tiga kelompok utama gen yang terlibat dalam regulasi pertumbuhan sel, yaitu proto-onkogen, gen penekan tumor (tumor suppresor gene = TSG) dan gen gatekeeper. Proto-

  

onkogen menstimulasi dan meregulasi pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen

  penekan tumor biasanya menghambat pertumbuhan sel atau menginduksi apoptosis (kematian sel terprogram). Kelompok gen ini dikenal sebagai anti- onkogen, karena berfungsi melakukan kontrol negatif (penekanan) pada pertumbuhan sel. Gen gatekeeper berfungsi mempertahankan integritas genomik dengan mendeteksi kesalahan pada genom dan memperbaikinya. Mutasi pada gen-gen ini karena berbagai faktor membuka peluang terbentuknya kanker. Pada keadaan normal, pertumbuhan sel akan terjadi sesuai dengan kebutuhan melalui siklus sel normal yang dikendalikan secara terpadu oleh fungsi ketiga gen: proto-

  , gen tumor supressor dan gen gatekeeper secara seimbang. Jika terjadi

  onkogen

  ketidakseimbangan fungsi ketiga gen ini, atau salah satu tidak berfungsi dengan baik karena mutasi, maka keadaan ini akan menyebabkan penyimpangan siklus sel

  B.

  

Kanker Payudara

  Jaringan payudara merupakan jaringan yang sensitif terhadap tumbuhnya kanker. Kanker umumnya terjadi pada jaringan yang sel-selnya aktif membelah, salah satunya adalah payudara. Pembelahan sel payudara dipacu oleh adanya hormon estrogen. Pembelahan ini dapat meningkatakan resiko terjadinya kerusakan permanen pada DNA. Sel payudara yang belum mengalami pematangan secara sempurna lebih kuat mengikat karsinogen dan tidak dapat mengatasi kerusakan DNA secara efisien seperti pada sel yang telah matang sepenuhnya (Clark et al, 1997)

  Kanker payudara adalah suatu penyakit terjadinya pertumbuhan berlebihan atau perkembangan tidak terkontrol dari sel-sel (jaringan) payudara (Khomsah, 2008). Jenis kanker payudara yang paling umum adalah berasal dari saluran air susu (ductal carcinoma), dan kelenjar air susu (lobular carcinoma)

  Kanker payudara biasanya didiagnosis dengan adanya benjolan kecil berukuran kurang dari 2 cm. Pada tumor yang ganas, benjolan ini bersifat soliter, unilateral, solid, keras, tidak beraturan, dan non-mobile. Tanda yang kurang umum adalah adanya abnormalitas pada puting dan retraksi. Pada kasus yang lebih berat dapat terjadi edema kulit, kemerahan, dan rasa panas pada jaringan payudara (Dipiro, et al, 2005)

  C.

  

Kultur Sel

  Kultur sel merupakan proses dimana suatu sel berada dalam kondisi yang maupun organ aslinya kemudian ditumbuhkan dalam kultur media secara invitro dan dikondisikan sama seperti pada saat sel masih berada dalam jaringan aslinya.

  Pemindahan sel ke dalam flask baru dengan medium yang baru disebut dengan subkultur, hal ini memungkinkan suatu bentuk perluasan kultur dan dikenal sebagai cell line (Freshney, 2000).

  Penggunaan kultur sel sebagai subyek uji dikarenakan selain banyaknya tekanan publik untuk mengurangi bahkan tidak menggunakan hewan sebagai subyek uji dalam percobaan mengingat segi moral. Alasan lain tidak menggunakan hewan percobaan ialah untuk menghemat biaya yang besar apabila menggunakan hewan percobaan dan juga rendahnya nilai korelasi antara hasil yang diperoleh dengan penelitian menggunakan hewan jika dikorelasikan dengan manusia. Dengan menggunakan kultur sel sebagai alternatif subyek dalam pengujian toksikologi, maka mekanisme toksisitas biokimia dapat dikerjakan dengan lebih efektif. Hal ini dikarenakan kondisi dari sel dapat dikontrol dan dimodifikasi (Wallin, 1998).

  D.

  

Sel Kanker T47D

  Sel T47D merupakan suatu sel yang morfologinya seperti sel epitel yang diambil dari jaringan payudara seorang wanita berumur 54 tahun. Sel ini dapat ditumbuhkan dengan media penumbuh RPMI 1640 dengan FBS 10% dan

  o

  antibiotic bebas pada suhu 37 C dan dapat tumbuh secara kontinyu dan menempel pada flask. Sel T47D merupakan sel kanker payudara ER-positif yang dibuktikan dengan adanya respon peningkatan proliferasi sebagai akibat kemampuan 17-

  E.

  

Sirih Merah

  1. Keterangan Botani

  Tanaman sirih merah termasuk ke dalam fam, genus Piper, spesies Piper crocatum Ruiz & Pav, sinonim Piper ornatum (Anonim, 2007).

  2. Morfologi tanaman Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.

  Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15 sampai dengan 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu– abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5–10 cm, di setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).

  3. Khasiat dan kegunaan

  Zat yang terkandung dalam sirih merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir. Disamping itu memiliki efek pencegah ejakulasi dini antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, antidiabetes, pelindung hati, antidiare, mempertahankan kekebalan tubuh dan penghilang bengkak, mengatasi radang pada paru, radang pada tenggorok, radang pada gusi, radang pada payudara, hidung berdarah dan batuk berdarah (Sudewo, 2005).

  Dalam penggunaan secara empiris ekstrak daun sirih merah pada pemakaian tunggal atau dikombinasikan dengan tanaman obat lainnya mampu tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi dan asam urat (Sudewo, 2005).

  4. Penelitian tentang sirih merah

  Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya adalah penelitian pemeriksaan skrining fitokimia daun sirih merah, dan hasilnya menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tannin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005)

  5. Kandungan kimia

  Sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

F. Flavonoid

  Flavonoid telah menunjukkan peran umumnya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator. Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan oksidatif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1996). Tiga senyawa flavonoid alam telah diisolasi menggunakan etil asetat, yang berasal dari fraksinasi S. feruginosa, yaitu kuersetin, kuersetrin, dan flavonol glikosida 4-O-asetl kuersetrin memiliki daya sitotoksik pada kultur jaringan kanker glioblastoma manusia (LeDévéhat, et

  2002). Banyak penelitian menyebutkan bahwa interaksi flavonoid dengan al. komponen sel diimplikasikan pada patologi saraf dan kanker. Hampir semua jenis flavonoid menunjukkan aktivitas biologis, dengan sebagian besar dihubungkan

  Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak tersubstitusi, atau suatu gula. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan air (Markham, 1988).

G. Teknik Penyarian

  Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986).

  1. Ekstrak

  Ekstrak adalah sediaan yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).

  2. Pelarut

  Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif yang berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa lainnya dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa berkhasiat yang diinginkan (Anonim, 2000).

  Etanol meskipun harganya cukup mahal, tetapi dipertimbangkan sebagai etanol di atas 20%), tidak beracun, netral, absorbsinya baik, dapat bercampur air pada segala perbandingan, dan pengeringan diperlukan waktu sebentar. Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

3. Maserasi Maserasi adalah cara ekstraksi yang paling sederhana (Voight, 1971).

  Maserasi dilakukan dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak, dll. Kerusakan senyawa yang tidak tahan panas dapat dihindari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, etanol–air atau pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang dapat ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal penyarian (Hargono et al, 1986).

  Selama proses maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel, maka larutan yang lebih pekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel, dan proses difusi berakhir (Hargono et al, 1986).

  Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang dapat ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal penyarian. Keuntungan cara ekstraksi dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan, sedangkan kerugiaannya adalah cara pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna (Hargono et al , 1986).

  Maserasi pada umumnya dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selam 5 hari terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 5 hari, sari diserkai, ampas diperas, ampas ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3 x sehari). Melalui upaya ini dapat dijamin keseimbangan konsentrasi bahan ekstraktif yang lebih cepat di dalam cairan.

  Keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif (Hargono et al, 1986). Secara teori, pada suatu maserasi tidak memungkinkan terjadinya ekstrak absolute. Semakin besar perbedaan simplisia terhadap cairan pengekstrak/penyari, akan semakin banyak hasil yang diperoleh (Voight, 1971).

  H.

  

Uji Sitotoksisitas

  Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro untuk menentukan potensi sitotoksik senyawa-senyawa seperti produk-produk farmasi, kosmetik, dan obat- obatan antikanker. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle and Griffiths, 2000)

  Sitotoksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo, di mana terjadi kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik atau karena efek-efek fisiologi seperti efek inflamasi, neurotoksisitas, dan juga efek-efek sistemik. Uji secara in vitro harus dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Respon sel terhadap agen-agen sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel (Freshney, 2000) Metode in vitro menawarkan beberapa keuntungan, antara lain :

  a) Dapat digunakan sebagai tahap atau langkah awal dalam penelitian,

  b) Untuk berbagai tujuan penggunaan kultur pengembangan suatu obat,

  c) Hanya diperlukan sedikit senyawa uji dalam pengujian,

  d) Secara drastis mengurangi jumlah hewan yang dikorbankan untuk pengambilan berbagai organ target (liver, ginjal, paru, kulit, sistem saraf, dsb), dan

  e) Dapat memberikan informasi secara langsung tentang potensi efek obat pada sel target manusia yang secara alamiah memberikan hasil yang lebih valid.

  Uji sitotoksisitas merupakan perkembangan untuk mengidentifikasi obat sitotoksisitas baru atau deteksi obat dengan aktivitas antitumor. Sistem penetapan aktivitas biologis akan menghasilkan kurva dosis respon, dan kriteria respon seharusnya menunjukkan hubungan lurus dengan jumlah sel. Informasi yang didapat dari kurva seharusnya berhubungan dengan efek in vivo dari obat sitotoksisitas. Sitotoksisitas senyawa merupakan syarat aktivitas antikanker (Burger, 1982).

  Uji sitotoksisitas ialah suatu uji yang secara in vitro menggunakan kultur sel dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun bahan-bahan kimia lainnya (Freshney, 2000).

  Uji sitotoksisitas ini merupakan suatu uji yang cepat, terstandarisasi, sensitif dan tidak terlalu mahal, dengan kepentingan untuk menentukan apakah suatu material mengandung bahan yang berbahaya (toksis) secara biologik dalam jumlah yang signifikan. Sensitivitas yang tinggi dari uji ini karena adanya sel uji yang terisolasi dalam kultur dan tidak adanya mekanisme protektif tubuh yang mempengaruhi sel uji (Wallin, 1998).

  Penetapan jumlah sel yang bertahan hidup pada uji sitotoksisitas dapat dilakukan dengan berbagai cara. Penetapan dapat dilakukan berdasarkan pada parameter kerusakan membran, gangguan sisntesis, dan degradasi makromolekul, modifikasi kapasitas metabolisme, serta perubahan morfologi sel. Petunjuk toksisitas berdasarkan adanya kerusakan membran, meliputi penghitungan sel mengambil (up take) atau tidak bahan pewarna seperti biru tripan. Sedangkan perubahan morfologi dapat diketahui dengan mikroskop elektron (Snell and Mullock, 1987 cit Hussana, 1997).

  Ada beberapa metode untuk mengetahui hasil uji sitotoksisitas, yaitu metode Trypan Blue Staining, Tritium-labeled Thymidine dan MTT. Trypan Blue

  

Staining adalah cara sederhana untuk mengevaluasi integritas dari membran sel,

yang kemudian dari hasilnya dapat menunjukkan kematian atau proliferasi sel.

  Namun metode ini kurang sensitif. Metode kedua yaitu Tritium-labeled Thymidine adalah metode yang menggunakan senyawa radioaktif tritium yang dilabelkan pada timidin. Pengukuran jumlah bahan radioaktif yang terambil oleh sel ini sangat akurat namun metode ini memerlukan waktu yang lebih lama. Sedangkan metode MTT adalah metode kolorimetrik yang mengukur hasil reduksi dengan garam tetrazolium menjadi kristal formazan yang berwarna ungu oleh mitokondria sel hidup melalui metabolismenya. Kemudian warna ungu yang dibentuk diukur dengan pembacaan ELISA plate reader. Jumlah warna yang dibentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup. Metode MTT bersifat kuantitatif dan lebih sensitif bila dibandingkan dengan metode Trypan Blue Staining karena adanya hubungan yang linear antara keaktifan sel dan absorbansi, jumlah sel yang tumbuh maupun mati dapat diukur. Sedangkan Trypan Blue Staining bersifat kualitatif dan hanya mengindikasikan sel yang masih hidup (Anonim, 2006a). Penggunaan haemocytometer sangat umum dan sering dipakai dalam penghitungan sel karena keefisienan dan keakuratannya. Digunakan suatu

  

chamber hitung yang kaku berbentuk kotak dan memiliki kedalaman 0,1 mm. mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik yang dipilih. Dari perhitungan yang dilakukan, dapat ditentukan jumlah sel per ml dari suspensi. Untuk mengetahui sel yang hidup dan yang mati dapat digunakan zat penanda seperti trypan blue (Doyle, 2000).

I. Landasan Teori

  Sirih merah diketahui mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri. Flavanoid mempunyai aktivitas anti-kanker, yakni sebagai antioksidan yang akan mereduksi spesies oksigen (Grotewold, 2006). Flavonoid umumnya cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan air (Markham, 1988). Saat ini belum terdapat publikasi penelitian mengenai efek sitotoksisitas ekstrak daun sirih merah, oleh karenanya penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak daun sirih merah berpotensi sebagai antikanker.

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik untuk dikembangkan ke depannya sebagai senyawa antikanker.

  

J. Hipotesis

  Ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum) memiliki potensi sitotoksik terhadap Kultur Sel T47D.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

  (Piper crocatum) terhadap kultur sel T47D ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

  B.