Efektivitas Ekstrak Ascidian Didemnum molle untuk Pengobatan Udang Windu (Penaeus monodon) yang Terinfeksi Bakteri Vibrio harveyi.
59
Lampiran 1. Pembuatan Media Natrium Agar
Pembuatan Media Agar Natrium Agar (150 mL)
1. Siapkan gelas Erlenmeyer volume 250 ml dan air laut steril 150 mL.
2. Timbang natrium agar sebanyak 4,2 gram
3. Masukkan natrium agar ke dalam erlenmeyer lalu tuang air laut steril.
4. Panaskan media di atas hot plate hingga mendidih dan homogen.
5. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang telah dibungkus dengan kassa.
6. Sterilisasi media menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121 oC
7. Setelah di autoclave, media didinginkan hingga suhu 45 – 50oC
8. Tuangkan media tersebut ke dalam cawan petri yang sudah steril sebanyak
8 – 10 ml dan biarkan membeku dalam keadaan tertutup.
Pemanasan Nutrient Agar
Nutrient Agar
60
Lampiran 2. Pembuatan Kultur Bakteri Vibrio harveyi dengan Kepadatan
Sel 107 CFU/ml
1.
Larutan McFarland skala 0,5 dibuat dengan 0,05 mL BaCl2 1% dan 9,95 mL
H2SO4 1% ke dalam tabung reaksi kemudian diukur absorbansinya dengan
menggunkan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
2.
Isolat bakteri uji yang berada dalam cawan petri diambil dengan
menggunakan kawat ose sebanyak 2-3 ose kemudian dilarutkan ke dalam 10
mL air laut steril.
3.
Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan McFarland.
4.
Sebanyak 0,01 mL larutan bakteri dituang ke dalam media agar.
Larutan Vibrio harveyi dan Standar McFarland
Penuangan Larutan Bakteri dalam Media Agar
61
Lampiran 3. Koordinat dan Data Parameter Fisik dan Kimia Perairan
Lokasi Pengambilan Sampel
Koordinat Lokasi Pengambilan Sampel:
Area Perlindungan Laut (APL) : S 544’ 0,48” E 106 36’ 39,8”
Perairan Semak Daun (PSD) : S 544’ 04,9” E 106 36’ 39,6”
Perairan Panggang (PP) : S 544’ 00,5” E 106 34’ 05,7”
1. Suhu (°C)
Koordinat
APL
PSD
PP
I
29
28
30
Ulangan
II
29
29
29
III
29
29
29
Rata-rata
(°C)
29
28
29
I
28
28
26
Ulangan
II
29
30
27
III
29
30
27
Rata-rata
(‰)
28,6
29,3
26,6
I
100
100
100
Ulangan
II
100
100
100
III
100
100
100
2. Salinitas (‰)
Habitat
APL
PSD
PP
3. Kecerahan (%)
Habitat
APL
PSD
PP
Rata-rata (%)
100
100
100
4. Kecepatan arus (m/s)
Habitat
APL
PSD
PP
I
0,14
0,13
0,10
Ulangan
II
0,17
0,06
0,10
III
0,17
0,07
0,09
Rata-rata
(m/s)
0,16
0,08
0,09
62
Lampiran 4. Ekstraksi Ascidian Didemnum molle
Sampel Ascidian
Didemnum molle
Dikeringkan
Ascidian Didemnum molle
kering
Dihaluskan menggunakan blender
Serbuk Ascidian
Didemnum molle
Dimaserasi 1x24 jam dengan pelarut Metanol
Disaring
Ampas
Filtrat
Diuapkan dengan Rotary Evaporator
Ekstrak Pasta
Diagram Alir Ekstraksi Ascidian Didemnum molle
63
Lanjutan Lampiran 4
64
Lampiran 5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak
pada Saat In Vitro
Ascidian Didemnum molle
1 ppm = 1 mg/L
= 0,001 g/L
Larutan Stok 100.000 ppm dalam 10 mL
100.000 ppm = 0,001 g/L
=
0,001 g x 100.000
1000 mL
= 1 g/10 mL
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok
V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan
V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat
Konsentrasi 10.000 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10.000 ppm
V1
= 50000/100000
= 0,5 mL
0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,5 mL akuades
Konsentrasi 1.000 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 1.000 ppm
V1
= 5000/100000
= 0,05 mL
0,05 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,95 mL akuades
65
Lanjutan Lampiran 5.
Konsentrasi 100 ppm
V1 x M1
=V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 100 ppm
V1
= 500/100000
V1
= 0,005 mL
0,005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,995 mL akuades
Konsentrasi 10 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10 ppm
V1
= 500/100000
= 0,0005 mL
0,0005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,9995 mL akuades
Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang
digunakan pada Uji Aktivitas Antibakteri
66
Lampiran 6. Diameter Zona Hambat Ekstrak Didemnum molle Terhadap
Bakteri Vibrio harveyi
67
Lampiran 7. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle
pada Uji LC50
Konsentrasi larutan stok yang digunakan adalah 10.000 ppm dalam volum 500
mL
10.000 ppm = 10 g/L
=
10 g
1L
×
1L
1000
×500 mL
=5
Untuk mendapatkan konsentrasi 10.000 ppm dilarutkan 5 gram ekstrak dalam 500
mL akuades.
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok
V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan
V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat
Konsentrasi 1000 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 1.000 ppm
V1
= 500.000/10.000
= 50 mL
50 mL dari larutan stok ditambah dengan 450 mL akuades
Konsentrasi 100 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 100 ppm
V1
= 50.000/10.000
= 5 mL
5 mL dari larutan stok ditambah dengan 495 mL akuades
68
Lanjutan Lampiran 7
Konsentrasi 10 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 10 ppm
V1
= 5.000/10.000
= 0,5 mL
0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 499,5 mL akuades
Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang
Digunakan pada Uji LC50
69
Lampiran 8. Data Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Uji LC 50
Selama 48 jam
Lama
Perendaman
15 menit
30 menit
1 jam
2 jam
4 jam
6 jam
8 jam
16 jam
24 jam
48 jam
Total
I
0
Jumlah Udang yang Mati pada Konsentrasi (ppm)
0
10
100
1000
10000
II
I
II
I
II
I
II
I
II
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
2
2
2
1
0
0
0
0
1
4
6
6
6
70
Lampiran 9. Hasil Perhitungan LC50 dengan Menggunakan EPA Probit
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
LC50 Didemnum molle
Conc.
Number
Exposed
10
100
1000
10000
12
12
12
12
Number
Responding
Observation
Proportion
Responding
0
1
10
12
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
0,0000
0,0833
0,8333
1,0000
Proportion
Predicted
Responding
Proportion
Adjused for Responding
Controls
0,0000
0,0001
0,0833
0,0822
0,8333
0,8352
1,0000
0,9996
= 0.007
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
Mu
Sigma
=
=
= 5.991
2.587787
0.422818
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-1.120327 1.729846 ( -4.510825, 2.270170)
Slope
2.365082 0.652672 ( 1.085844, 3.644320)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
95% Confidence Limits
Conc.
Lower
Uper
LC/EC 1.00
40.196
2.304
104.992
LC/EC 5.00
78.036
9.253
170.563
LC/EC 10.00
111.148
19.080
224.825
LC/EC 15.00
141.116
30.726
274.165
LC/EC 50.00
387.067
180.124
810.578
LC/EC 85.00
1061.685
551.051
4592.272
LC/EC 90.00
1347.940
674.208
7370.954
LC/EC 95.00
1919.908
891.534
15151.202
LC/EC 99.00
3727.254
1452.826
60656.582
71
Lampiran 10. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle
pada Uji Tantang
1 ppm = 0,001 g/L
Ekstrak dibuat dalam 1 liter air laut.
Perlakuan B (96,75 ppm)
96,75 ppm = 0,001 g/L
= 0,001 x 96,75
= 0,09675 g/L
Perlakuan C (193,5 ppm)
193,5 ppm = 0,001 g/L
= 0,001 x 193,5
= 0,1935 g/L
Perlakuan D (96,75 ppm)
290,25 ppm = 0,001 g/L
= 0,001 x 290,25
= 0,29025 g/L
Perlakuan E (387 ppm)
387 ppm
= 0,001 g/L
= 0,001 x 387
= 0,387 g/L
Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang
Digunakan pada Uji Tantang
72
Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian
Salah Satu Lokasi Pengambilan Sampel
Pengukuran Diameter Zona Hambat Menggunakan Jangka Sorong
Bakteri Vibrio harveyi yang Digunakan dalam Penelitian
73
Lanjutan Lampiran 11
Media Pemeliharaan Selama Penelitian
Benih Udang Windu yang Mati
Lampiran 1. Pembuatan Media Natrium Agar
Pembuatan Media Agar Natrium Agar (150 mL)
1. Siapkan gelas Erlenmeyer volume 250 ml dan air laut steril 150 mL.
2. Timbang natrium agar sebanyak 4,2 gram
3. Masukkan natrium agar ke dalam erlenmeyer lalu tuang air laut steril.
4. Panaskan media di atas hot plate hingga mendidih dan homogen.
5. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang telah dibungkus dengan kassa.
6. Sterilisasi media menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121 oC
7. Setelah di autoclave, media didinginkan hingga suhu 45 – 50oC
8. Tuangkan media tersebut ke dalam cawan petri yang sudah steril sebanyak
8 – 10 ml dan biarkan membeku dalam keadaan tertutup.
Pemanasan Nutrient Agar
Nutrient Agar
60
Lampiran 2. Pembuatan Kultur Bakteri Vibrio harveyi dengan Kepadatan
Sel 107 CFU/ml
1.
Larutan McFarland skala 0,5 dibuat dengan 0,05 mL BaCl2 1% dan 9,95 mL
H2SO4 1% ke dalam tabung reaksi kemudian diukur absorbansinya dengan
menggunkan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
2.
Isolat bakteri uji yang berada dalam cawan petri diambil dengan
menggunakan kawat ose sebanyak 2-3 ose kemudian dilarutkan ke dalam 10
mL air laut steril.
3.
Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan McFarland.
4.
Sebanyak 0,01 mL larutan bakteri dituang ke dalam media agar.
Larutan Vibrio harveyi dan Standar McFarland
Penuangan Larutan Bakteri dalam Media Agar
61
Lampiran 3. Koordinat dan Data Parameter Fisik dan Kimia Perairan
Lokasi Pengambilan Sampel
Koordinat Lokasi Pengambilan Sampel:
Area Perlindungan Laut (APL) : S 544’ 0,48” E 106 36’ 39,8”
Perairan Semak Daun (PSD) : S 544’ 04,9” E 106 36’ 39,6”
Perairan Panggang (PP) : S 544’ 00,5” E 106 34’ 05,7”
1. Suhu (°C)
Koordinat
APL
PSD
PP
I
29
28
30
Ulangan
II
29
29
29
III
29
29
29
Rata-rata
(°C)
29
28
29
I
28
28
26
Ulangan
II
29
30
27
III
29
30
27
Rata-rata
(‰)
28,6
29,3
26,6
I
100
100
100
Ulangan
II
100
100
100
III
100
100
100
2. Salinitas (‰)
Habitat
APL
PSD
PP
3. Kecerahan (%)
Habitat
APL
PSD
PP
Rata-rata (%)
100
100
100
4. Kecepatan arus (m/s)
Habitat
APL
PSD
PP
I
0,14
0,13
0,10
Ulangan
II
0,17
0,06
0,10
III
0,17
0,07
0,09
Rata-rata
(m/s)
0,16
0,08
0,09
62
Lampiran 4. Ekstraksi Ascidian Didemnum molle
Sampel Ascidian
Didemnum molle
Dikeringkan
Ascidian Didemnum molle
kering
Dihaluskan menggunakan blender
Serbuk Ascidian
Didemnum molle
Dimaserasi 1x24 jam dengan pelarut Metanol
Disaring
Ampas
Filtrat
Diuapkan dengan Rotary Evaporator
Ekstrak Pasta
Diagram Alir Ekstraksi Ascidian Didemnum molle
63
Lanjutan Lampiran 4
64
Lampiran 5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak
pada Saat In Vitro
Ascidian Didemnum molle
1 ppm = 1 mg/L
= 0,001 g/L
Larutan Stok 100.000 ppm dalam 10 mL
100.000 ppm = 0,001 g/L
=
0,001 g x 100.000
1000 mL
= 1 g/10 mL
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok
V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan
V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat
Konsentrasi 10.000 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10.000 ppm
V1
= 50000/100000
= 0,5 mL
0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,5 mL akuades
Konsentrasi 1.000 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 1.000 ppm
V1
= 5000/100000
= 0,05 mL
0,05 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,95 mL akuades
65
Lanjutan Lampiran 5.
Konsentrasi 100 ppm
V1 x M1
=V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 100 ppm
V1
= 500/100000
V1
= 0,005 mL
0,005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,995 mL akuades
Konsentrasi 10 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 100.000 ppm = 5 mL x 10 ppm
V1
= 500/100000
= 0,0005 mL
0,0005 mL dari larutan stok ditambah dengan 4,9995 mL akuades
Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang
digunakan pada Uji Aktivitas Antibakteri
66
Lampiran 6. Diameter Zona Hambat Ekstrak Didemnum molle Terhadap
Bakteri Vibrio harveyi
67
Lampiran 7. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle
pada Uji LC50
Konsentrasi larutan stok yang digunakan adalah 10.000 ppm dalam volum 500
mL
10.000 ppm = 10 g/L
=
10 g
1L
×
1L
1000
×500 mL
=5
Untuk mendapatkan konsentrasi 10.000 ppm dilarutkan 5 gram ekstrak dalam 500
mL akuades.
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok
V1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan
V2 = Volum pengenceran yang akan dibuat
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat
Konsentrasi 1000 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 1.000 ppm
V1
= 500.000/10.000
= 50 mL
50 mL dari larutan stok ditambah dengan 450 mL akuades
Konsentrasi 100 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 100 ppm
V1
= 50.000/10.000
= 5 mL
5 mL dari larutan stok ditambah dengan 495 mL akuades
68
Lanjutan Lampiran 7
Konsentrasi 10 ppm
V1 x M1
= V2 x M2
V1 x 10.000 ppm = 500 mL x 10 ppm
V1
= 5.000/10.000
= 0,5 mL
0,5 mL dari larutan stok ditambah dengan 499,5 mL akuades
Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang
Digunakan pada Uji LC50
69
Lampiran 8. Data Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Uji LC 50
Selama 48 jam
Lama
Perendaman
15 menit
30 menit
1 jam
2 jam
4 jam
6 jam
8 jam
16 jam
24 jam
48 jam
Total
I
0
Jumlah Udang yang Mati pada Konsentrasi (ppm)
0
10
100
1000
10000
II
I
II
I
II
I
II
I
II
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
2
2
2
1
0
0
0
0
1
4
6
6
6
70
Lampiran 9. Hasil Perhitungan LC50 dengan Menggunakan EPA Probit
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
LC50 Didemnum molle
Conc.
Number
Exposed
10
100
1000
10000
12
12
12
12
Number
Responding
Observation
Proportion
Responding
0
1
10
12
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
0,0000
0,0833
0,8333
1,0000
Proportion
Predicted
Responding
Proportion
Adjused for Responding
Controls
0,0000
0,0001
0,0833
0,0822
0,8333
0,8352
1,0000
0,9996
= 0.007
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
Mu
Sigma
=
=
= 5.991
2.587787
0.422818
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-1.120327 1.729846 ( -4.510825, 2.270170)
Slope
2.365082 0.652672 ( 1.085844, 3.644320)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
95% Confidence Limits
Conc.
Lower
Uper
LC/EC 1.00
40.196
2.304
104.992
LC/EC 5.00
78.036
9.253
170.563
LC/EC 10.00
111.148
19.080
224.825
LC/EC 15.00
141.116
30.726
274.165
LC/EC 50.00
387.067
180.124
810.578
LC/EC 85.00
1061.685
551.051
4592.272
LC/EC 90.00
1347.940
674.208
7370.954
LC/EC 95.00
1919.908
891.534
15151.202
LC/EC 99.00
3727.254
1452.826
60656.582
71
Lampiran 10. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle
pada Uji Tantang
1 ppm = 0,001 g/L
Ekstrak dibuat dalam 1 liter air laut.
Perlakuan B (96,75 ppm)
96,75 ppm = 0,001 g/L
= 0,001 x 96,75
= 0,09675 g/L
Perlakuan C (193,5 ppm)
193,5 ppm = 0,001 g/L
= 0,001 x 193,5
= 0,1935 g/L
Perlakuan D (96,75 ppm)
290,25 ppm = 0,001 g/L
= 0,001 x 290,25
= 0,29025 g/L
Perlakuan E (387 ppm)
387 ppm
= 0,001 g/L
= 0,001 x 387
= 0,387 g/L
Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang
Digunakan pada Uji Tantang
72
Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian
Salah Satu Lokasi Pengambilan Sampel
Pengukuran Diameter Zona Hambat Menggunakan Jangka Sorong
Bakteri Vibrio harveyi yang Digunakan dalam Penelitian
73
Lanjutan Lampiran 11
Media Pemeliharaan Selama Penelitian
Benih Udang Windu yang Mati