Mekanisme penghambatan bakteri probiotik terhadap pertumbuhan Vibrio harveyi pada larva udang windu (Penaeus monodon)

MEKANISME PENGHAMBATAN BAKTERI PROBIOTIK
TERHADAP PERTUMBUHAN Vibrio lrnrveyi PADA LARVA
UDANG WINDU (Penneus monodon)

EVA AYUZAR

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008

PE

ATAAN MENGENAI TESIS DAIO
SUNUBER INFO
SI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Mekanisme Penghambatan
Bakteri Probiotik terhadap Pertumbuhan Vibrio harveyi pada larva udang windu
(Penaeus monodon) adalah benar hasil karya saya sendiri dan merupakan bagian
dari penelitian hibah bersaing dengan judul "Bakteri Probiotik dalam Budidaya
Udang: Seleksi, Mekanisme Aksi, Karakterisasi dan Aplikasinya sebagai Agen

Biokontrol". Sumber inforrnasi yang berasal atau d i t i p dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka dibagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2008

Eva Ayuz.ar
C151040171

ABSTRAK
EVA AWZAR. Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap
Pertumbuhan Vibrio harveyi pada Larva Udang Windu (Penaeus monodon).
Dibimbmg oleh S W N D A dan W I D A N M I .
Tiga bakteri probiotik yaitu lUb, SKT-b dan Ua memiliki aktivitas
penghambatan meneka pertumbuhan I? hnnwyi. Ketiga strain bi dimutasi
menjadi resisten rifampisin. Efek penghambatan dari lUb, SKT-b dan Ua
terhadap perturnbuhan V: harveyi diamati melalui pemberian secara bersamaan
dari kedua jenis bakteri tersebut dalam air pemeliharaan larva udang. Jumlah sel
I? harveyi, probiotik dan total bakteri baik pada larva mati, larva hidup dan air
pemeliharaan diamati dan kelangsungan hidup larva dihitung. Udang yang

diinokulasi probiotik secara signifikan memiliki kelangsungan hidup lebih tinggi
daripada kontrol (tanpa penambahan bakteri). Jumlah sel I? harveyi lebih tinggi
pada perlakuan tanpa penambahan probiotik, dibanding pada perlakuan dengan
penarnbahan probiotik baik pada larva mati, larva hidup maupun air media
pemeliharaan. Hal ini menunjukkan adanya kemungkinan kompetisi tempat
pelekatan atau nutrien antara V: harveyi dan probiotik. Hasil menunjukkan
untuk memonitor
resisten rifampisin dapat digunakan sebagai penanda
keberadaan bakteri yang diinokulasi, baik pada larva udang mati, udang hidup
maupun air media pemeliharaan. Hasil analisis sekuen sebagian gen 16-rRNA
menunjukkan bahwa isolat 1Ub termasuk spesies Pseudoalteromonas piscicida,
sedangkan SKT-b dan Ua tern~asukspesies Vibrio alginolyticus.

ABSTRACT
EVA AYUZAR. Inhibitory mechanism of probiotic bacteria on the growth of
Vibrio harveyi in tiger shrimp (Penaeus monodon) larvae. Under the guidance
of SUKENDA, and WIDANARNI.
Three probiotics named SKT-b, lUb, and Ua had inhibitory activity
against the growth of Vib~ioharveyi. These strains were mutated by rifaqpisin
resistant. The inhibitory effect of SKT-b, lUb, and Ua on the growth of V. harveyi

was investigated by concomitant incubation of the two bacteria in a culture shrimp
larvae. Colony forming unit of V. harveyi, probiotic and total of bacteria in dead,
live larvae and water culture was monitored, and survival rate of larvae was
investigated. Shrimp inoculated probiotic previously had survival rate higher than
control (without prohiotic). Number of V. harveyi in dead, live larvae and water
culture was lower in shrimp inoculated with probiotic than without probiotic. It
demonstrated possible competition for adherence sites or nutrition between V.
harveyi and probiotics. Result also showed rifampisin resistant could be used as a
marker of bacteria in order to detect their distribution in dead, live larvae and
water culture. Partial sequencing of 16s-rRNA gene showed that 1Ub was similar
to Pseudoalteromonas piscicida, SKT-b and Ua were similar to Vibrio
alginolyticus.

ME
ISME PENGWAMBATAN BAKTERI
N Vibrio harveyi
PROBIOTIK TERHADAP PERTUMB
PADA LARVA UDANG W I m U (Penaeus monodon)

EVA AUUZAR

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains padr Program Studi Ilmu Perairan

SEKOLAH PASGASARJANA
HNSTkTUT PERTANHAN BOGOR
2008

: Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap

Pertumbuhan Vibrio haweyi pada Larva Udang
Windu (Penaeus monodon)
Nama

: EVA AYUZAR

NRP

: C151040171

Program Studi

:

LLMU PERAIRAN

Disetujui,
Komisi Pembimbing

Dr. Widanarni
Anggota

Ketua Program Studi
Ilmu peraGan

$

Prof. Dr. Ir. Enang Harris, M

Tanggal Ujian: 21 November 2007

Dekan Sekolah Pascasariana
IPB
"

I
airil Anwar Notodiputro, MS

~ a n g g a t ~ ~1l8~J ~A N: i0Oa

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena hanya atas
rahmat dan karunia serta ridho-Nyalah tesis yang berjudul "Mekanisme
Penghambatan Bakteri Probiotik terhadap Pertunbuhan Vibrio haweyi pada
Larva Udang Windu (Penaeus monodon)" dapat diselesaikan.
Pelaksanaan penelitian dan penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan
dan bimbimgan berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Dr. Sukenda dan Ibu Dr. Widanani selaku komisi pembimbing atas

pengarahan dan bimbingan yang telah diberikan selama penelitian d m
penulisan tesis ini sehingga dapat penulis selesaikan dengan baik.
2. Bapak Rektor Universitas Mallikusaleh, Bapak Dekan Fakultas Pertanian
beserta jajarannya, Bapak Ketua Jurusan Budidaya Perairan, yang telah
memberikan kesempatan dan mengijinkan penulis untuk mengikuti program
pascasarjana di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

3. Ketua Program Studi Ilmu Perairan, Ketua d m Staf Laboratorium Kesehatan
Ikan dan Laboratorium Lingkungan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor yang telah membantu dalam
penyediakan fasilitas hingga terlaksananya penelitian ini.
4. Ayahanda Azarman Arief dan Ibunda Zuraida 2, Mertua Cut Nursinah serta
semua adik-adikku yang telah banyak memberikan bantuan baik materi
maupun moral serta suami Dedi Nurdiansyah dan anakku Salsa Zurdiva h

a

tercinta yang selama ini telah banyak berkorban dan bersabar, hingga penulis
mampu menyelesaikan studi ini dengan baik.
5. Rekan-rekan angkatan 2004,2005 dan 2006 Program Studi Ilmu Perairan dan

Staf Perpustakaan Budidaya Perairan atas segala bantuan dan kerjasamanya.
Akhirnya semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi semuanya. Amin .
Bogor, Januari 2008
Penulis

RIWAYAT NIDUP
Penulis dilahirkan di Kutacane, Aceh Tenggara pada tanggal 23 Juli 1980
dari ayah Azarman Arief dan ibu Zuraida Z. Penulis merupakan anak pertama dari
lima bersaudara. Sejak tahun 2006 penulis telah berkeluarga dengan suami
bemama Dedi Nurdiansyah dan dikaruniai seorang anak beinama Salsa Zurdiva
h a .
Penulis lulus SMA pada tahun 1998 dan melanjutkan program sarjana (Sl)
di Universitas Riau, selesai pada tahun 2003. Pada bulan Agustus 2004, penulis
melanjutkan kuliah ke sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program
Studi Ilmu Perairan.

Tahun 2006 penulis diangkat sebagai tenaga pengajar di Jurusan Budidaya
Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Malikullsaleh, Lhokseurnawe.

DAFTAR IS1
Walaman

DAFTBR IS1 ..................................................................................................
AR .....................................................................................
DAFTAR G
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
PENDAWULUAN...........................................................................................
Latar Belakang .....................................................................................
Tujuan ..................................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................
Bakteri Vibrio haweyi dan Penyakit Udang Berpendar .......................
Bakteri Probiotik sebagai Biokontrol pada Larva Udang ....................
Mekanisme Kerja dan Seleksi Bakteri Probiotik .................................
. . . t~k
Resistensi A n t ~ b ~ o............................................................................

.i.
...

11

III

1
1
2
3
3
4
6

7

lllETODE PENELITIAN ..............................................................................
Waktu dan Tempat ...............................................................................
Metode dan Disain Penelitian ..............................................................
Sumber Isolat Bakteri Probiotik ...........................................................
Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang .................................
Pembuatan Mutan Bakteri Probiotik. Resisten Rifampisin @@).........

Pertumbuhan Bakteri Probiotik RfR .....................................................
Daya Hambat Bakteri Probiotik Rf?erhadap V: haweyi pada
Larva Udang .........................................................................................
Identifikasi Isolat Probiotik ..................................................................
Parameter yang Diamati .......................................................................
a.Tingkat Kelangsungan Hidup Larva Udang ................................
b.Pertumbuhan Larva Udang ..........................................................
c.Populasi Bakteri ...........................................................................
. . Statlstlk
. .
Anal~s~s
...................................................................................
WASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 13
Sumber Isolat Bakteri Probiotik ........................................................... 13
Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang ................................. 15
penggunaan ~enandaRfR pads ~ a k t e rProbiotik
i
................................ 18
Pertun~buhanBakteri Probiotik RfR .................................................. 18
Daya Hambat Bakteri Probiotik RfR terhadap V. haweyi pada
Larva Udang ................................................................................... 20
Identifikasi Isolat Probiotik .................................................................. 26

DAFTAR PUST

.....................................................................................

29

DAFTAR G

AR
Nalaman

Penampilan koloni isolat 1Ub pada media SWC ..........................................
Penampilan koloni isolat SKT-b pada media TCBS (A)dan SWC (B) ........
Penampitan kokcni isolat Ua pada me&a TCBS (A)dm SWC (9)..............
Penampilan koloni isolat V. harveyi pada media TCBS diruang terang (A)
d i g gelap (B)...........................................................................................
5. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik..
6. Pertumbuhan panjang larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik
7 Pertumbuhan bobot larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik ...
8. Perbandingan pertumbuhan bakteri probiotik mutan dengan tipe liarnya ....
9. Kelangsungan hidup larva udang pada uji daya hambat bakteri
probiotik terhadap i? harveyi ......................................................................
10. Populasi bakteri probiotik, V. harveyi, dan total bakteri pada larva udang
mati pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi .................
11. Populasi bakteri probiotik, V. harveyi, dan total bakteri pada larva udang
hidup pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi ..............
12. Populasi bakteri probiotik, i? harveyi, dan total bakteri pada air
pemeliharam pada uji daya hambat bakteri probiotik terhadap V. harveyi ..
13. Perhmbuhan panjang larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik
terhadap K harveyi .......................................................................................
14. Perhmbuhan bobot larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik
terhadap V. harveyi ........................................................................................

1.
2.
3.
4.

DAFTAR LMPIRAN

1. Komposisi media SWC-agar (Seawater Complete agar), SWC-cair dan
TCBS-agar (Thiosulphate Cihate Bile-Salt sucrose agar) .............................
2. Peclbuatu: larutu: Stck Sfampisin ...............................................................
3. Kelangs~mganhidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri Probiotik...
4. Pertumbuhan panjang larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik.
5. Pertumbuhan bobot larva udang windu pada uji in vivo bakteri probiotik ....
6. Kelangsungan hidup larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik
terhadap V. haweyi .........................................................................................
7 . Pertumbuhan panjang larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik
terhadap V. haweyi .........................................................................................
8. Pertumbuhan bobot larva udang pada uji daya hambat bakteri probiotik
terhadap V. harveyi .........................................................................................

PEND

UAN

Latar Belakang
Serangan penyakit dan penurunan kualitas lingkungan budidaya
merupakan masalah yang timbul dalam usaha pembenihan udang. Salah satu
penyakit udang yang membahayakan adalah penyakit udang berpendar atau

luminescent vibriosis yang disebabkan oleh Ebrio harveyi. V. harveyi dapat
menyerang udang pada berbagai stadia mulai dari nauplius, zoea, mysis dan post
larva di pembenihan hingga udang dewasa di tambak pembesaran (Saulnier et al.
2000).
Salah satu alternatif untuk menanggulangi permasalahan penyakit vibriosis
adalah dengan menggunakan bakteri probiotik sebagai biokontrol yang dapat
menghambat pertumbuhan V. harveyi. Bakteri probiotik yang digunakan sebagai
biokontrol dapat diisolasi dari tambak atau pembenihan udang (Tjahjadi et al.

1994; Hary'anti et al. 2000), air dan sediien laut (Muliani et al. 2003) atau
invertebrata laut seperti sponge (Suryati et al. 2004) serta terumbu karang
(Proksch, 2000).
Tiga isolat bakteri kandidat probiotik koleksi Laboratorium Kesel~atan
Ikan, Departemen Budidaya Perairan, IPB yakni 1Ub (Tepu, 2006), SKT-b
(Widanami et al. 2003) dan Ua (Rajab, 2006) telah diuji mampu menghambat
pertumbuhan V. harveyi secara in vitro dan dapat meningkatkan kelangsungan
hidup larva udang pada uji in vivo.
Untuk mempelajari mekanisme aksi bakteri probiotik tersebut dalam
menghambat pertumbuhan V. harveyi pada larva udang dilakukan dengan
memberikan penanda molekuler pada bakteri probiotik dan patogen, sehingga
keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dapat diamati. Penanda resistensi
terhadap antibiotik rifampisin

(RfR)

merupakan suatu pilihan karena bakteri asal

laut pada umumnya sensitif terhadap rifampisin (Tjahjadi et al. 1994). Selain itu
mutan spontan resisten rifampisin bersifat stabil pada media tanpa penambahan
antibiotik (Hala et al. 2002) sehingga dapat digunakan 14i tantang pada jangka
waktu lama. Dengan penanda molekuler tersebut, bakteri i ~ jjuga
i dapat dibedakan

dari bakteri lain yang sebelumnya telah terdapat pada larva udang atau air media
pemeliharaannya.

Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari mekanisme penghambatan
bakteri probiotik terhadap pertumbuhan V. hurveyi pada larva udang windu
(Penaeus monodon).

TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Vibrio Itarveyi dan penyakit udang berpendar

V. h a m y i pada umumya bersifat patogen oportunistik, yaitu organisme
yang dalam keadaan normal ada dalam lingkungan pemeliharaan dan berkembang
dari sifat saprofitik menjadi patogenik apabila kondisi lingkungan dan inang
memburuk. Pada saat terjadinya wabah, populasi bakteri ini dapat m e ~ n g k a t
menjadi ribuan kali dalam wadahhak pemeliharaan larva, dan ha1 ini terjadi
setelah usaha budidaya udang windu berkembang secara intensif (Lavilla-Pitogo

et al. 1990). Menurut Saulnier et al. (2000) beberapa galur V. harveyi merupakan
patogen dan penyebab utama penyakit vibriosis pada udang windu. Kesimpulan
tersebut diambil berdasarkan studi virulensi dari beberapa galur V. harveyi yang
diisolasi dari larva sekarat dan diinfeksi kembali pada udang sehat. Beberapa dari
galur tersebut dapat menyebabkan kematian total larva udang dengan dosis yang
sangat rendah (10 CFUIml).
Pada sistem budidaya udang, V. harveyi dapat ditemukan di hatchery,
dapat diisolasi dari air laut yang masuk, induk, larva dan air tanki pembesaran
larva (Otta et al. 2001; Prayitno et al. 1995). V. harveyi juga dapat diisolasi dari
tambak pembesaran udang (Karunasagar et al. 1994).
Ciri-ciri morfologi clan fisiologi I.: harveyi pada medium nutrien agar
dengan NaCl 1.5% dan seawater complete-agar (SWC-agar) adalah: bentuk
koloni bulat dengan elevasi cembung, berwarna krem, berdiameter 2-3 mm
setelah inbubasi 24 jam pada suhu 2 8 ' ~ . Pada medium selektif untuk genus

Vibrio, yaitu TCBS-agar (Tiosu&te Citrate Bile-Salt Sucrose), koloni V. harveyi
benvama hijau dan berpendar bila diamati di ruang gelap (Lavilla-Pitogo et al.
1990).
Kemampuan berpendar atau lztminescent merupakan hasil aktivitas enzim
luciferase yang dapat berfimgsi sebagai katalisator dalam proses oksidasi reduksi.
Proses oksidasi melibatkan flavin mononukleotida dan aldehid alifatik rantai
panjang sebagai substratnya. Senyawa-senyawa tersebut masing-masing diubah
menjadi flavin mononukleotida dan asam lemak disertai dengan pelepasan emisi
cahaya dengan panjang gelombang sekitar 490 nm. Gen-gen yang mengkodekan

fungsi perpendaran ini disandikan dalam suatu operon yang disebut dengan
operon lux (Meighen, 1991; Ruby, 1996). V. harveyi juga diietahui memiliki
aktivitas enzim kitinase, protease, dan lipase (Baumann et al. 1994). Enzim
kitinase memungkinkan V. harveyi untuk menguraikan kitin dan berkolonisasi di
dalam tubuh larva udang windu.
Kematian yang disebabkan vibriosis terjadi apabila udang mengalami stres
akibat kualitas air buruk, kepadatan tinggi, temperatur tinggi dan pergantian air
yang rendah (Brock and Lightner 1990). Berdasarkan hasil penelitian LavillaPitago (1990), kematian larva terjadi setelah 48 jam pasca infeksi bakteri V.

haweyi dan V. splendidus.
Jenis Vibrio lain yang menyebabkan vibriosis adalah Vibrio vulnificus,

Vibrio parahaemalyticus ( Nash et al. 1992 dan Lavilla-Pitogo et al. 1990), V.
anguillarum, V. campbelli, dan V. splendidus (Chen, 1992). Akibat meningkatnya
jurnlah kasus vibriosis yang terjadi, maka diperlukan serangkaian penelitian untuk
mengetahui sifat virulensi dari V. harveyi agar penyakit ini dapat diatasi (Austin et

al. 2003).
Bakteri Probiotik sebagai Biokontrol pada Larva Udang

Menurut Fuller (1992), probiotik adalah mikrob hidup yang ditambahkan
ke dalam pakan yang dapat memberi pengaruh mengmtungkan bagi hewan inang
dengan cara memperbaiki keseimbangan mikrob ususnya. Pada hewan akuatik,
selain saluran pencemaan, air di sekeliling organisme tersebut juga memegang
peranan penting. Sehingga probiotik untuk hewan akuatik adalah agen mikrob

hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan
memodifikasi komonitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, menjamin
perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nilai nutrisinya,
meinperbaiki respon inang terhadap penyakit, atau memperbaiki kualitas
lingkungan ambangnya (Verschuere et al. 2000).
Biokontrol menurut Gomez-Gil et al. (2000) adalah penggunaan musuh
alamiah untuk mengurangi kemsakan yang disebabkan oleh organisme berbahaya
sampai tingkat yang dapat ditolerir, atau lebih tepat lagi pengaturan populasi
penyakit oleh musuh alamiahnya. Lebih lanjut ditambahkan baliwa komunitas

mikrob di dalam saluran pencemaan hewan sampai batas tertentu memberi
ketahanan atau perlindungan terhadap penyakit. Demikian pula pada populasi
alamiah hewan akuatik, mikrobiota di dalam saluran pencernaan dapat
mencerminkan lingkungan akuatik tersebut. Namun demikian, pada pemeliharaan
larva dengan kepadatan tinggi di dalam wadah budidaya, keseimbangan dapat
berubah karena penggunaan air yang sudall didesinfeksi, mikroalga, nauplii,
artemia, rotifer dan berbagai antibiotik pembunuh bakteri. Akibatnya, komunitas
mikrob pelindung tidak dapat berkembang baik di lingkungannya maupun di
dalam sistem saluran pencemaan larva. Pascalarva yang dipelihara di dalam
lingkungan yang relatif steril di suatu pembenihan tidak dapat tumbuh dengau
baik dan memperlihatkan daya hidup yang rendah bila terpapar pada kompleks
populasi mikrob di petak pendederan atau pembesaran. Pascalarva tersebut &an
mudah terserang penyakit bila terkena stress lingkungan atau terinfeksi oleh
bakteri yang potensial bersifat patogen. Menumt Gomez-Gil et al. (2000), konsep
probiotik sebagai biokontrol, yaih pemanfaatan organisme yang antagonis dalam
membatasi atau menyerangi hana pada budidaya. Dalam hal ini mikroorganisme
probiotik tidak hanya sebagai nlusuh alami patogen, tetapi juga dengan
mengurangi kerusakan yang disebabkan oleh patogen, umumnya dengan
kompetisi, yang paling banyak dengan menghasilkan substansi yang menghambat
perttunbuhan mikroorganisme yang paling berbahaya.
Pemanfaatan beberapa bakteri yang berada dalam wadah budidaya dan
tubuh organisme seperti udang maupun ikan sebagai probiotik telah dilakukan dan
mampu menunjukkan pengaruh positif terhadap pertumbuhan dan kesehatan
melalui peningkatan keseimbangan mikrobial dalam tubuh (Gullian et al. 2004;
Villamil et al. 2003; Vine et al. 2004).
Pemberian probiotik pada usaha budidaya udang windu dapat
meningkatkan kelangsungan hidup dan dapat menekan pertumbuhan bakteri
patogen sehingga didapat kualitas dan produksi udang windu yang lebih baik
(Haryanti et al. 2000; Haryanti dan Sugama, 2002; Moriarty, 1999 dan Rengpipat

et al. 1998a).

Mekanisme Kerja dan Seleksi Bakteri Probiotik
Menurut Verschuere et al. (2000), mekanisme kerja probiotik dapat dibagi
menjadi beberapa cara, yaitu: (1) memproduksi senyawa inhibitor seperti
antibiotik, bacteriocins, siderophores, lysozymes, proteases, hidrogen peroksida
ataupun asam organik yang dapat merubah pH, (2) kompetisi terhadap senyawa
kimia atau sumber energi (n~ttrisi),seperti besi ataupun nutrien yang diambil dari
inang; (3) kompetisi terhadap tempat pelekatan pada tubuh inang; (4)
meningkatkan respon imun (kekebalan) pada inang; (5) memperbaiki kualitas air;

(6) interaksi dengan fitoplankton.
Probiotik yang bekerja di dalam tubuh inang l-iarus mampu bertahan hidup
dalam mukosa usus inang dan berkembang biak dengan cepat agar tidak terbawa
keluar bersama sisa metabolisme inang (Vine et al. 2004). Meskipun secara in

vitro probiotik terbukti mampu menekan atau menghambat perttunbuhan bakteri
patogen, namm apabila probiotik tersebut tidak dapat bertahan hidup dalam
mukosa usus kemungkinan besar probiotik yang menghambat perttunbuhan
b'akteri patogen tidak ditemukan pada uji in vivo (Vine et al. 2004).
Menurut Gomnez-Gil et al. (2000), seleksi bakteri probiotik biasanya
merupakan proses empiris didasarkan pada sediiit bukti ilmiah. Banyak
kegagalan dalam penelitian bakteri probiotik yang terjadi karena salah memilih
mikroorganisme. Tahapan seleksi memang sudah ditentukan, akan tetapi tahapan
ini masih perlu disesuaikan berdasarkan spesies inang dan lingkungan, sehingga
perlu pemahaman mekanisme kerja probiotik dalam menentukan kriteria seleksi
bakteri probiotik potensial.
Menurut Gomez-Gil et al. (2000), metode seleksi bakteri probiotik untuk
kegiatan pemeliharaan larva hewan akuatik dapat mencakup beberapa tahap
berikut: (1) pengumpulan informasi dasar yang didapat dari studi pustaka maupun
di lapangan, meliputi infomasi tentang mikroba serta hubungan antara inang
dengan lingkungannya; (2) penapisan mikroba, yaitu proses pemisahan mikroba
dari campnrannya berdasarkan kriteria tertentu seperti bakteri probiotik hams
menguntungkan inangnya, mampu bertahan hidup dalam usus, dapat disiapkan
sebagai produk sel hidup pada skala industri, dan dapat terjaga stabilitas serta
sintasan untuk waktu yang lama pada penyimpanan maupun di lapangan; (3)

pengujian isolat dalam menghambat mikroba patogen secara in vitro dan in vivo;
(4) pengujian patogenitas isolat terhadap inang; (5) pengujian skala laboratorium

termasuk melihat pengaruh kandidat probiotik secara in vivo terhadap variabel
imonologi, dan uji tantang dengan patogen; (6) analisa ekonomi biaya-laba.
Resistensi Antibiotik
Sifat resistansi terhadap antibiotik diperlukan oleh suatu mikroorganisme
untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya di alam. Sifat resistensi terhadap
suatu jenis antibiotik dari suatu bakteri perlu diketahui sebelum ditetapkan jenis
antibiotik yang akan digunakan sebagai penanda terhadap bakteri tersebut. Hal ini
akan memudahkan untuk menyeleksi bakteri tersebut dari bakteri yang secara
alami sensitif terhadap antibiotik yang digunakan.
Menurut Chythanya et al. (1999) beberapa organisme secara alami resisten
terhadap beberapa antibiotik. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain:
(1) organisme tidak mempunyai dinding sel sehingga &an resisten terhadap jenis
antibiotik yang merusak pada dinding sel seperti kelompok penisilin; (2)
organisme mungkin tidak permeabel terhadap

beberapa antibiotik; (3)

rnikroorganisme mempunyai kemampuan untuk menginaktifkan beberapa
antibiotik; (4) mikroorganisme mempunyai sistem metabolisme yang dapat
memblokir antibiotik tertentu sehingga resisten terhadap antibiotik tersebut; (5)
mikroorganisme mempunyai kemampuan unhk memompa antibiotik tertentu
keluar dari dinding sel sehingga resisten terhadap antibiotik tersebut.
Rifampisin

merupakan antibiotik bakterisidal yang dapat mematilcan

kebanyakan gram positif dan beberapa jenis bakteri gram negatif. Antibiotik ini
bekerja dengan menghambat sintesa RNA polimerase dari bakteri (Madigan et al.
1997).

V. harveyi dan bakteri-bakteri alami lainnya pada umurnnya telah resisten
terhadap amoksilin (200 pglml), tetrasiMin (5 pdml), ampisilin (50 pg/ml), dan
kanamisin (50 pdml). Meskipun demikian, V: harveyi dan bakteri laut umumnya
sensitif terhadap antibiotik rifampisin (Tjahyadi 1994). Oleh karena itu penanda
resistensi rifampisin dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk

membedakan bakteri yang diinokulasi dengan bakteri yang sebelumnya telah ada
pada larva udang.
Untuk memperoleh V. harveyi yang resisten rifampisin dilakukan dengan
cara menyebarkan suspensi biakan V. harveyi pada media SWC yang diberi
rifampisin (50 pglml). Koloni yang turnbull kemudian disubkulturkan untuk
mendapatkan isolat murni T.: harveyi yang resistensi terl~adaprifampisin.

RlETODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen
Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian
Bogor. Peneiitian beriangsung selama 6 buian muiai dari buian Januari sampai
Juli 2007.
Metode dan Disain Penelitian

Penelitian dilakukan menggunakan metode eksperimental laboratorium.
Ada lima tahapan yang dilakukan, yaitu tahap pertarna: Uji in vivo bakteri
probiotik pada larva udang. Tahap kedua: Pembuatan mutan bakteri probiotik
resisten rifampisin @).Tahap ketiga: Pertumbuhan bakteri probiotik @.Tahap
Keempat: Uji daya hambat bakteri probiotik

RfR terhadap

V. harveyi pada larva

udang. Tahap kelima: Identifikasi bakteri probiotik. Penelitian dirancang
menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 3 ulangan dan dianalisis
keragamannya menggunakan ANOVA.
Sumber Isolat Bakteri Probiotik

Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah IUb (Tepu, 2006), Ua
(Rajab, 2006) dan SKT-b (Widanarni et al. 2003). Ketiga isolat tersebut telah diuji
mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen pada uji in vitro serta dapat
meningkatkan kelangsungan hidup larva udang windu.
Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang

Tiga isolat bakteri probiotik dengan konsentrasi akhir lo6 CFUIml
dimasukkan dalam wadah pemeliharaan udang sehari setelall larva ~tdang
dimasukkan. Larva udang dipelihara dalam toples yang diisi air laut steril 2 liter
dengan kepadatan 10 ekorll. Setelah kokuitivasi dengan larva udang selama 6
jam, V. hnrveyi MR5339 @ biroasukken dengan konsentxasi lo6 CFUIml.
Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol positif (V. harveyi
sendiri tanpa isolat probiotik) dan kontrol negatif (tanpa pemberian V: harveyi

MR5339 RfR maupun isolat probiotik). Pergantian air dan penyiponan dilakukan
setiap hari sebanyak 10% dari volume total wadah pemeliiaraan. Pengamatan
dilakukan selama 10 hari, dan larva yang mati d i t u n g setiap hari. Pada akhir
percobaan dihitung tingkat kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva.
Pernbuatan Mutan Bakteri Probiotik Resisten Efampisin (@)
Isolat bakteri probiotik diuji sensitivitasnya terhadap antibiotik rifampisin
dengan cara menumbuhkan isolat tersebut pada media agar seawater complete
(SWC) (Lampiran 1) dengan suplementasi rifampisin 50 pg/ml (SWC

+ RQ

(Lampiran 2). Setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam, respon
resistensi dietahui dengan mengamati tumbuhnya koloni pada media tersebut.
Pembuatan bakteri probiotik

RfR

dilakukan melalui mutasi spontan dengan

menyebar 1 ml suspensi bakteri probiotik sensitif rifampisin pada media SWC
yang mengandung rifampisin 50 pg/ml. Koloni yang tumbuh pada media tersebut
merupakan mutan bakteri probiotik RfR.
P e h m b u h a n Bakieri Probiotik RfR
BaMeli probiotik tipe liar dan mutannya masing-masing d i t u m b ~ ~ a n
pada media SWC-cair dalam shaker bergoyang pada suhu ruang. Konsentrasi
setiap biakan diperoleh dengan mengukur kekeruhan suspensi biakan dengan
metode turbidimetrik. Pengamatan dilakukan setiap jam selama 24 jam dan
dibandingkan antara tipe liar dengan mutannya.
Daya Narnbat Bakteri Probiotik @ terhadap V. harveyi pada Larva Udang
Tiga isolat mutan bakteri probiotik RfR diuji kembali efektivitasnya daliun
menghambat pertumbuhan I/: hatveyi patogen pada larva udang. Pengujian
dilakukan sama seperti tipe liarnya, namun selain terhadap kelangsungan hidup
dan pertumbuhan, pengamatan juga dilakukan terhadap populasi baMeri probiotik
dan I/: harveyi serta total bakteri baik pada air pemeliharaan maupun larva udang.
Pengamatan dilakukan menggunakan media TCBS + Rf untuk isolat Vibrio dan
SWC + Rf untuk isolat non Vibrio. Pengujian dilakukan selama 12 liari, dengan
kepadatan larva 10 ekortl. Selama pengujian, udang diberi pakan berupa Nauplii

Artemia dengan frekuensi pemberian pakan 5 kali sehari, yaitu setiap puku106.00,

10.00, 14.00, 18.00, dan 21.00.
Identifikasi Isolat Probiotik
Untuk menentukan identitas isolat probiotik, dilakukan analisis sekuens
gen 16s-rlWA yang meliputi beherapa tahapan sesuai dengan metoda yang
diiemukakan oleh Marchesi et al. (1998) dan telalx dimodifikasi oleh Suwanto et
al. (2002) yaitu meliputi ekstraksi DNA, arnplikasi gen 16s-rRNA dengan PCR,

dan sekuensing dengan mesin sequenser.
Parameter yang Diamati
a. Tingkat Kelangsungan Hidup Lawa Udang
Tingkat kelangsungan hidup larva ~ ~ d a ndihitung
g,
dengan menggunakan

Keterangan :
SR = Tigkat kelangsungan hidup (%)
Nt = Jumlah udang yang hidup pada akhir pengarnatan (ekor)
No = Jumlah udang pada awal percobaan (ekor)

b. Perturnbuhan Larva Udang
Pertumbuhan bobot d a i panjang total diarnati pada awal dan akhir
percobaan. Pertumbuhan larva udang windu dihitung berdasarkan pertambahan
bobot dan panjang, dengan nunus berikut:

a=

{I!

- l)i4 OO%} dan a =

{I!

-lIXlOO%}

Keterangan:

a
t

Wt
Wo
Lt
Lo

: Laju pelhunbuhan udang (%)
:Lama waktu pemeliharaan udang (hari)
: Bobot rata-rata akhir udang (ing)

: Bobot rata-rata awal udang (mg)
:Panjang rata-rata akhir udang (mm)
: Panjang rata-rata awal udang (mm)

c. Populasi Bakteri
Populasi bakteri yang d i t u n g meliputi jumlah bakteri V. harveyi, bakteri
probiotik dan total baktei-i baik pada air pemeliharaan, udang hidup maupun
udang mati. Pengamatan populasi bakteri baik pada air pemeliiaan maupun
pada larva udang hidup dilakukan setiap 2 hari sekali selama pengarnatan,
sedangkan untuk pengamatan udang mati diiakukan setiap 6 jam sekaii. Jumiah
bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh dikalikan
dengan faktor pengenceran.
Analisis Statistik
Desain dari percobaan ini m e ~ p a h nmodel eksperimen laboratorium
dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari 5
perlakuan dan 3 ulangan baik pada percobaan menggunakan bakteri liar, maupun
bakteri mutan.
Bakteri tipe liar :
Perlakuan A : V. haweyi MR 5339 RfR

+ Ua

Perlakuan B : V. hmveyi MR 5339 fli1Ub

RfR+ SKT-b
Perlakuan D : V. haweyi M R 5339 RfR
Perlakuan C : V. harveyi MR 5339
Perlakuan E : Kontrol
Balkteri mutan :
Perlakuan A : V. harveyi MR 5339 RfR

+ U, RfR

Perlakuan B : V. haweyi MR 5339 fl+ 1Ub RfR
Perlakuan C : V. harveyi M R 5339 fl + SKT-b R ~ R
Perlakuan D : V. harveyi MR 5339 RfR
Perlakuan E : Kontrol

HASIL DAN PEMBAHASAN
Sumber Isolat Bakteri Probiotik

Isolat probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah lUb, SKT-b,
dan Ua. Isolat 1Ub diisolasi dari nauplius udang vaname di hatchery PT Biru Laut
Khatulistiwa (BLK), Kalianda, Lampung Selatan, Lampung. Isolat tersebut
merupakan isolat terbaik yang dapat menekan pertumbuhan V. harveyi pada uji in
viho dengan metode kultur bersama (Tepu, 2006) . Penampilan koloni isolat 1Ub
pada media SWC benvarna orange cerah (Gambar I), sedangkan pada media
TCBS (media selektif untuk Vibrio) tidak tumbuh sehingga termasuk kelompok
bakteri non-Vibrio.

Gambar 1. Penampilan koloni isolat 1Ub pada media SWC
Isolat SKT-b diisolasi dari fitoplankton Skeletonema @akan alami udang
windu) di hatchery Proyek Udang Nasional (PUN), Labuan, Banten. Isolat
tersebut merupakan isolat terbaik yang dapat menekan pertumbuhan V. harveyi
pada uji in vitro dengan metode kultur bersama (Widanarni et al. 2003).
Penampilan koloni isolat SKT-b benvarna putih kektmingan dan bersifat
menyebar pada media SWC serta benvarna kuning pada media TCBS (Gambar 2),
sehingga termasuk kelompok bakteri Vibrio.

A

B

Gambar 2. Penampilan koloni isolat SKT-b pada media TCBS (A) dan SWC (B)
Isolat Ua diisolasi dari saluran pencemaan udang vaname di tambak
intensif Pinang Gading, Bakauheni, Lampung Selatan, Lampung. Isolat tersebut
merupakan isolat terbaik yang dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi pada
uji in vitro dengan metode Kirby Baeuer, yakni dengan mengukur zona hambat
yang dihasilkannya (Rajab, 2006). Penampilan koloni isolat Ua berwarna putih
kekuningan pada media SWC dan benvama kuning pada media TCBS (Gambar
3), sehingga termasuk kelompok bakteri Vibrio.

A

B

Gambar 3. Penan~pilankoloni isolat Ua pada media TCBS (A) dan SWC (B)

V. harveyi yang digunakan dalam penelitian ini adalah V. harveyi MR5339
yang berasal dari Balai Penelitian Perikanan Pantai, Maros, Sulawesi Selatan dan
telah diuji bersifat patogen pada larva udang windu. Penampilan koloni V. harveyi
MR5339 pada media TCBS b e m a hijau (Gambar 4A), serta berpendar jika
diamati di ruang gelap (Gambar 4B).

Gambar 4. Penampilan koloni isolat V. harveyi pada media TCBS di ruang terang
(A) di mang gelap (B)
Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada Larva Udang

Ketiga isolat bakteri probiotik telah diuji efektivitasnya dalam
meningkatkan kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva udang windu. Hasil uji
tersebut menunjukkan bahwa kelangsungan hidup larva yang diberi bakteri
probiotik lUb, SKT-b dan Ua secara berturut-turut adalah 88,33%, 83,33%, dan
81,67% pasca uji tantang dengan V. harveyi. Sedangkan perlakuan kontrol positif
dengan inokulasi V: harveyi saja sebesar 41,67% dan kontrol negatif tanpa bakteri
sebesar 68,33% (Gambar 5) dan Lampiran 3. Peningkatan nilai kelangsungan
hidup larva udang diduga karena adanya penghanlbatan pertumbuhan V. harveyi
pada larva udang oleh bakteri probiotik. Isolat-isolat tersebut diduga juga dapat
meningkatkan kebugaran larva udang. Hal ini terlihat dari nilai kelangsungan
hidup larva pada kontrol negatif (tanpa inokulasi bakteri probiotik maupun V.
harveyi) lebih rendah dibanding pada perlakuan dengan penambahan probiotik.

A

B

C

D

E

Perlakuan

Keterangan :
A = 1 ~ +bMR 5339 RfR
B=SKT-b+MR5339RP
C=Ua+MR5339RP
D = Kontrol positif (MR 5339 RP) E = Kontrol negatif (tanpa penambahan bakteri)

Gambar 5. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji in vivo bakteri
probiotik
Haryanti et al. (2000) melaporkan bahwa penambahan bakteri strain BY-9
dengan kosentrasi lo6 CFUIm! pada air pemeliharaan ! m a udang windu
menghasilkan tingkat kelangsungan hidup 59,3%, sedangkan pada kontrol 14,7%.
Rengpipat et al. (1998b) menggunakan probiotik Bacillus S11 ~nenunjukkan
bal~wasetelah diberi perlakuan probiotik selama 100 hari dan kemudian diuji
tantang dengan K harveyi selama 10 hari, nilai kelangsungan hidup udang windu
mencapai 100% sedangkan pada kontrol26%.
Untuk mengetahui pertumbuhan larva udang windu selama penelitian,
maka dilakukan pengukuran panjang dan bobot larva pada awal dan akhir
penelitian (Lampiran 4 dan 5). Berdasarkan analisis ragarn, tidak terdapat
perbedaan yang nyata antar perlakuan, tetapi secara signifikan semua perlakuan
berbeda nyata dengan kontrol (p