PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM β -1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM
β-1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica

SKRIPSI

SITI MUNAWAROH WAIDAH

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

PEMURNIAN PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM
β-1,3-GLUKANASE DARI CAIRAN PENCERNAAN Achatina fulica

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh
Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia
Pada Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Airlangga

Disetujui oleh:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Afaf Baktir, M.S.

Dr. Purkan, M.Si.

NIP. 19561014 198303 2 001

NIP. 19721116 199702 1 001

ii
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

:Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim β-1,3-glukanase

Judul

Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica
Penyusun

: Siti Munawaroh Waidah

NIM

: 080810496

Pembimbing I

: Dr. Afaf Baktir, M.S.

Pembimbing II

: Dr. Purkan, M.Si.

Tanggal Ujian

: 6 Agustus 2012

Disetujui Oleh:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Afaf Baktir, M.S.

Dr. Purkan, M.Si.

NIP. 19561014 198303 2 001

NIP. 19721116 199702 1 001

Mengetahui,
Ketua Departemen Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA
NIP. 19671115 199102 2 001

iii
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam
lingkungan Universitas Airlangga, diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi
kepustakaan, tetapi pengutipan harus seizin penyusun dan harus menyebutkan

sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah. Dokumen skripsi ini merupakan hak milik
Universitas Airlangga.

iv
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “ Pemurnian Parsial dan
Karakterisasi Enzim β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina
fulica”.
Penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena

itu, dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Afaf Baktir, M.S. selaku dosen pembimbing I yang telah meluangkan
waktunya untuk memberikan saran, nasehat dan masukan dalam penyelesaian
proposal ini.
2. Bapak Dr. Purkan, M.Si. selaku dosen pembimbing II atas bimbingan dan
nasehatnya selama penyusunan proposal ini.
3. Ibu Aning, M.Si. selaku dosen wali atas motivasi dan dukungan yang telah
diberikan.
4. Keluarga, bapak, Ibunda, adikku Muhammad Saiful Mujad, bulek Suprihatin,
nenek, kakek dan Valihudddin Rizal tercinta atas dukungan dan semangat baik
moral maupun spiritual demi terselesaikannya proposal ini.
5. Teman-teman UKM Penalaran, Ditty, Muhaymin, aezzi dimitra, nararya, bima
fajar ,fajar shodiq, sobir, ratna, yanis, nimaz, nurul dan lain-lain, terimakasih
untuk kebersamaan dan perjuangan selama ini.
6. Buat Resti, Amel, Riza, Wike, Ve, Rista, Adel, Culan, Julie, Aya, luluk dan
teman-teman kimia lain, terimakasih untuk dukungan kalian.
7. Teman-teman kozt mulyorejo, mbak eka, mbak ida, mbak dinar, mbak finda,
mbak iin, mbak ayu, Cuwi, mbak dora, mbak dyan, terimakasih sudah
merawat, mendukung dan menemani saya selama 4 tahun ini.
8. Teman-teman KKN Tanjungharjo, Fariz, Fitra, Niniz, Ekki, Nikita dan lainlain terimakasih untuk kebersamaan kalian.

9. Terimakasih buat Plus Minus Digital yang telah memberikan banyak pelajaran
hidup padaku tentang bagaimana susahnya bekerja. Semoga suatu saat engkau
dapat menjadi besar dan bermanfaat bagi semua. Amien.
v
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

10. Terimakasih buat temen-temen Biokim blazt (Dita, Siska, Nadya, Rohiz, Mb
Kunsah, dan Ainur) atas bantuan dan kerjasamanya.
11. Terimakasih buat temen-temen PKL, Mbak Ade dan pembimbing di
Bioteknologi, LIPI, Bogor.

Skripsi ini disusun sebagai syarat tugas akhir yang harus diselesaikan dalam
meraih gelar sarjana S1. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini

masih banyak kekurangan, sehingga kritik dan saran yang membangun sangat
diharapkan demi kesempurnaan proposal ini.

Surabaya, Juli 2012
Penyusun,

Siti Munawaroh Waidah

vi
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Siti Munawaroh Waidah, 2012, Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica. Skripsi di bawah

bimbingan Dr. Afaf Baktir, M.S. dan Dr. Purkan, M.Si. Departemen Kimia,
Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

ABSTRAK
Enzim β-1,3-glukanase merupakan enzim yang dapat mendegradasi dinding sel
jamur yang tersusun atas β-1,3 glukan. Penelitian ini bertujuan untuk pemurnian
parsial dan karakterisasi enzim β-1,3-glukanase yang diisolasi dari cairan
pencernaan Achatina fulica. Pemurnian parsial enzim β-1,3-glukanase dengan
pelarut organik aseton dilakukan pada berbagai fraksi hingga mendapatkan fraksi
optimum yaitu fraksi dengan aktivitas spesifik terbesar. Hasil pemurnian parsial
enzim β-1,3-glukanase didapatkan aktivitas spesifik terbesar yaitu pada fraksi 4075%. Pada fraksi ini aktivitas spesifik sebesar 0,249 U/mg, sedangkan aktivitas
spesifik ekstrak kasar enzim sebesar 0,092 U/mg. Dengan demikian, kemurnian
enzim meningkat 1,81 kali dengan % yield sebesar 90,4 %. Fraksi 40-75% yang
merupakan fraksi dengan aktivitas spesifik terbesar ini kemudian dilakukan
karakterisasi suhu dan pH optimum. Dari penelitian didapatkan suhu optimum
aktivitas enzim β-1,3-glukanase pada 370C dan pH optimum aktivitas enzim β1,3-glukanase pada pH 6.
Kata Kunci : Karakterisasi, enzim β-1,3-glukanase, Achatina fulica

vii
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Siti Munawaroh Waidah, 2012, Partial purification and characterization of
β-1 ,3-glucanase enzyme from Achatina fulica Digestive fluids. Final project
under guidance Dr. Afaf Baktir, M.S. and Dr. Purkan, M.Si. Departement of
Chemistry, Faculty Science and Technology, Universitas Airlangga

ABSTRACT
β-1 ,3-glucanase are enzymes that can degrade the cell walls of the fungus
composed of β-1, 3 glucan. The aim of this study are to partial purification and
characterization of the enzyme β-1 ,3-glucanase isolated from the digestive fluids
of Achatina fulica. Partial purification of β-1 ,3-glucanase was done by organic
solvent (acetone) on the various factions to get the optimum fraction. The results
obtained specific activity of the largest faction is the fraction of 40-75%. In the
specific activity of this fraction is 0.249 U/mg, in the other hand the specific
activity of crude enzyme extract is 0.092 U/mg. Thus, the purity of the enzyme
increased 1.81 times with % yield is 90.4%. The fraction of 40-75% which is a
fraction with the greatest specific activity was then carried out the characterization
of temperature and pH optimum. The optimum temperature obtained from the
research activity of the enzyme β-1 ,3-glucanase at 370C and pH optimum enzyme
activity of β-1 ,3-glucanase at pH 6.
Key words: Characterization, the enzyme β-1 ,3-glucanase, Achatina fulica

viii
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

DAFTAR ISI

Halaman
HALAMAN JUDUL ...................................................................................
LEMBAR PERNYATAAN .............................................................................
LEMBAR PENGESAHAN .............................................................................
LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI .......................................
KATA PENGANTAR .....................................................................................
ABSTRAK .......................................................................................................
ABSTRACT .....................................................................................................
DAFTAR ISI ...................................................................................................
DAFTAR TABEL ...........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................
BAB I PENDAHULUAN ..............................................................................
1.1 Latar Belakang Masalah....................................................................
1.2 Rumusan Masalah .............................................................................
1.3 Tujuan Penelitian ..............................................................................
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................
2.1 Enzim ................................................................................................
2.1.1 Struktur enzim...........................................................................
2.1.2 Klasifikasi enzim ......................................................................
2.1.3 Mekanisme kerja enzim ............................................................
2.1.4 Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim .............................
2.2 Enzim β-1,3 Glukanase .....................................................................
2.3 β-1,3 Glukan......................................................................................
2.4 Achatina fulica ...................................................................................
2.4.1 Klasifikasi Achatina fulica........................................................
2.4.2 Karakteristik umum Achatina fulica .........................................
2.4.3 Sistem pencernaan Achatina fulica ...........................................
2.5 Pemurnian Enzim ...............................................................................
2.6 Fraksinasi Pelarut Organik .................................................................
BAB III METODE PENELITIAN ..................................................................
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ...........................................................
3.2 Alat dan bahan Penelitian .................................................................
3.2.1 Alat-alat penelitian ...................................................................
3.2.2 Bahan-bahan penelitian ............................................................
3.3 Diagram Alir Penelitian ....................................................................
3.4 Prosedur Penelitian............................................................................
3.4.1 Karantina Achatina fulica ........................................................
3.4.2 Panen ekstrak kasar enzim Achatina fulica ..............................
3.4.3 Uji aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase ...........................
3.4.4 Pembuatan kurva standar glukosa ............................................
3.4.5 Pemurnian parsial dengan fraksinasi aseton ............................

i
ii
iii
iv
v
vii
viii
ix
xi
xii
xiii
1
3
3
4
4
5
5
5
6
7
9
11
13
13
14
15
16
17
19
22
22
22
22
22
23
24
24
24
24
25
26

ix
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

3.4.6 Pembuatan kurva standar protein .............................................
3.4.7 Penentuan kadar protein ...........................................................
3.4.8 Karakterisasi Enzim Enzim β-1,3 glukanase
3.4.8.1 Penentuan suhu optimum enzim β-1,3 glukanase ........
3.4.8.2 Penentuan pH optimum enzim β-1,3 glukanase...........
3.4.9 Analisis Data ............................................................................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karantina Achatina fulica ...........................................................
4.2 Panen Ekstrak Enzim Kasar Achatina fulica ..............................
4.3 Uji Aktivitas Enzim ....................................................................
4.3.1 Pembuatan kurva standar glukosa ......................................
4.3.2 Pembuatan kurva progres enzim β-1,3 glukanase ..............
4.3.3 Penentuan aktivitas enzim β-1,3 glukanase .......................
4.4 Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Lowry .....................
4.5 Pemurnian Parsial Enzim Dengan Fraksinasi Aseton .................
4.6 Karakterisasi Enzim β-1,3 glukanase ..........................................
4.6.1 Penentuan suhu optimum enzim β-1,3 glukanase ..............
4.6.2 Penentuan pH optimum enzim β-1,3 glukanase.................
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan .................................................................................
5.2 Saran............................................................................................
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................
LAMPIRAN .....................................................................................................

26
27
27
27
28
30
30
31
31
32
33
35
36
41
41
43
45
45
46
50

x
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

DAFTAR TABEL

Nomor

Judul

4.1 Hasil Fraksinasi Aseton ke-1 ..................................................................... 38
4.2 Hasil Fraksinasi Aseton ke-2 ..................................................................... 39
4.3 Hasil Fraksinasi Aseton ke-3 ..................................................................... 39
4.4 Hasil Fraksinasi Aseton ke-4 ..................................................................... 40
4.5 Data Purifikasi Parsial Enzim β-1,3 glukanase .......................................... 41

xi
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

DAFTAR GAMBAR
Nomor
Judul Gambar
Halaman
2.1
Mekanisme kerja enzim model lock and key....................................... 8
2.2

Mekanisme kerja enzim model Induced fit ..........................................

9

2.3

Aktivitas Enzim β-1,3-glukanase pada substrat β-1,3-glukan.............. 12

2.4

Struktur dinding sel C.albicans............................................................ 13

2.5

Anatomi Achatina fulica ...................................................................... 14

2.6

Agregasi protein karena interaksi antara air dan pelarut organik ......... 20

2.7

Denaturasi protein jika suhu pelarut organik lebih dari 0oC ................ 21

4.1

Kurva standar glukosa .......................................................................... 32

4.2

Kurva progress enzim β-1,3 glukanase ............................................... 32

4.3

Reaksi DNS dengan gula pereduksi ..................................................... 34

4.4

Kurva standar protein ........................................................................... 36

4.5

Kurva suhu optimum aktivitas enzim β-1,3 glukanase ........................ 42

4.6

Kurva pH optimum aktivitas enzim β-1,3 glukanase ........................... 43

xii
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor

Judul

1. Pembuatan reagen
2. Tabel penentuan kurva progress
3. Tabel penentuan kurva standar protein
4. Perhitungan aktivitas spesifik enzim
5. Data Karakterisasi enzim
6. Tabel fraksinasi aseton

xiii
Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

1

BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penerapan bioteknologi dalam beberapa bidang seperti bidang kesehatan,
kedokteran dan pertanian tidak lepas dari peranan enzim sebagai biokatalisator.
Hal ini dikarenakan penggunaan enzim sebagai biokatalisator memiliki beberapa
keuntungan, antara lain lebih efisien, ramah terhadap lingkungan, dan dapat
mengkatalis berbagai macam reaksi serta tidak menghasilkan produk samping.
Dalam fungsinya sebagai biokatalisator, enzim berikatan dengan substrat dan
membentuk kompleks enzim-substrat sehingga terjadi perubahan substrat menjadi
produk, reaksi tersebut berlangsung di daerah sisi katalitik atau sisi aktif (Dawn et
al., 2000)
Enzim dibedakan menjadi beberapa golongan berdasarkan reaksi yang
dikatalisis, salah satunya adalah enzim hidrolitik. β-1,3-glukanase merupakan
salah satu enzim hidrolitik. Enzim ini dapat ditemukan pada sebagian besar
bakteri, jamur, tanaman tingkat tinggi dan hewan invertebrata. Terdapat dua
jenis β-1,3-glukanase, yang pertama ekso-β-1,3-glukanase yang menghidrolisis
ikatan β-1,3-glukan secara berurutan, dari ujung non-reduksi suatu polimer atau
oligomers, sehingga dihasilkan monomer glukosa (Reese, 1977). Tipe β-1,3glukanase yang kedua adalah endo-β-1,3-glukanase, menghidrolisis ikatan β-1,3
pada sisi yang acak sepanjang rantai polisakarida, sehingga dihasilkan
oligosakarida (Reese & Mandels, 1959). Substrat spesifik bagi enzim ini adalah
polisakarida berikatan β-1,3-glukan yang dinamakan laminarin dan kebanyakan

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

2

ditemukan pada dinding sel jamur patogen (Adams, 2004). Oleh karena itu, enzim
β-1,3-glukanase dinyatakan sebagai komponen penting dalam mekanisme
pertahanan melawan patogen termasuk infeksi jamur (Ueda et al., 2011).
Ada berbagai macam jamur yang dapat menginfeksi manusia misalnya
Candida albicans. Jamur ini

bersifat patogen terutama pada tubuh yang

mengalami penurunan sistem imun. Candida albicans dapat membentuk biofilm
yang berupa campuran dari beberapa tipe sel, yaitu khamir, rizoid dan matriks
ekstraseluler yang melindungi sel-sel C.albicans (Jabra-Rizk et al., 2004).
Keberadaan biofilm menghalangi penetrasi obat ke dalam sel jamur. Biofilm
dapat dilisis dengan menguraikan penyusun utama biofilm yaitu β-1,3-glukan.
Komponen ini dapat dihidrolisis dengan enzim β-1,3-glukanase (Nett et al., 2007).
Gabriel dan Kopecka (1988) melakukan penelitian tentang pengaruh
konsorsium enzim dari kelenjar pencernaan bekicot (Achatina fulica) terhadap
regenerasi dinding sel dalam protoplas Schizosaccharomyces japonicus.
Dilaporkan bahwa, keberadaan konsorsium enzim dari kelenjar pencernaan
Achatina fulica mengakibatkan produksi dinding sel tidak lengkap. Hal ini karena
komponen

utama

penyusun

dinding

sel

yaitu

β-1,3-glukan

pada

Schizosaccharomyces japonicus terdegradasi oleh konsorsium enzim dari cairan
pencernaan Achatina fulica, yang diantaranya terdiri dari enzim β-1,3-glukanase
dan enzim β-1,4-glukanase.
Pada penelitian ini dilakukan isolasi enzim β-1,3-glukanase dari saluran
pencernaan Achatina fulica untuk dilakukan pemurnian parsial dan karakterisasi.
Pemurnian bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

3

protein lain sehingga aktivitas enzim dapat ditingkatkan. Pemurnian parsial enzim
dilakukan dengan fraksinasi pelarut organik karena memiliki efek presipitasi yang
bagus (Sopes, 1994). Selain itu, pelarut organik tidak memecahkan gugus
prostetik dari molekul protein seperti pada pengendapan dengan garam (Bintang,
2010). Pelarut organik yang digunakan adalah aseton karena aseton mudah
dipisahkan dengan protein yaitu dengan cara penguapan dan sentrifugasi.
1.2 Rumusan Masalah
1. Berapakah aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase dari cairan pencernaan
Achatina fulica sebelum dan sesudah pemurnian parsial melalui fraksinasi
aseton?
2. Pada fraksi aseton berapakah terdapat aktivitas spesifik terbesar enzim β1,3-glukanase yang diisolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica ?
3. Berapakah pH dan suhu optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase yang di
isolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Mengisolasi dan mengetahui aktivitas spesifik enzim β-1,3-glukanase dari
cairan pencernaan Achatina fulica.
2. Menentukan fraksi aseton yang menunjukkan keberadaan aktivitas spesifik
terbesar enzim

β-1,3-glukanase yang diisolasi dari cairan pencernaan

Achatina fulica.
3. Menentukan pH dan suhu optimum aktivitas enzim β-1,3-glukanase yang
diisolasi dari cairan pencernaan Achatina fulica.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

4

1.4 Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang pemurnian
parsial dan karakterisasi enzim β-1,3-glukanase yang dapat dimanfaatkan pada
beberapa bidang. Salah satunya untuk bidang kesehatan yaitu sebagai alternatif
pengobatan anti jamur yang lebih efektif.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

5

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Enzim
Enzim merupakan senyawa organik bermolekul besar yang berfungsi
untuk mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tanpa
mempengaruhi keseimbangan reaksi. Enzim berikatan dengan substrat dan
mengarahkannya dengan tepat untuk bereaksi. Substrat adalah substansi yang
mengalami perubahan kimia setelah bereaksi dengan enzim, sedangkan produk
adalah substansi baru yang terbentuk setelah setelah reaksi Masing-masing enzim
mengkatalisis suatu reaksi biokimia spesifik. Enzim hanya bereaksi dengan satu
substrat dan mengubah substrat tersebut menjadi suatu produk. Enzim secara
umum menghasilkan kecepatan, spesifitas, dan kendali pengaturan terhadap reaksi
yang berlangsung dalam tubuh. Hal ini disebabkan karena urutan asam amino
spesifik yang unik yang membentuk enzim serta mengikat dan mengaktifkan
molekul substrat (Voet and Voet, 2004).
2.1.1 Struktur enzim
Kebanyakan enzim merupakan protein globular yang memiliki struktur
tiga dimensi spesifik yang dibentuk oleh struktur primer, sekunder dan tersiernya.
Selain itu, enzim juga ada yang memiliki struktur kuartener karena tersusun atas
lebih dari satu rantai protein (McMurry and Marry, 1994).

Struktur primer

merupakan urutan linear asam amino yang disatukan oleh ikatan peptida. Struktur
sekunder terbentuk karena daerah di dalam rantai peptida dapat membentuk
struktur regular, berulang dan lokal yang terjadi akibat adanya ikatan hidrogen

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

6

antara atom-atom ikatan peptida. Ini berhubungan dengan pengaturan kedudukan
ruang residu asam amino yang berdekatan dengan urutan linear dan membentuk
struktur α heliks, β sheet dan loop. Konformasi tersier protein terdiri atas beberapa
jenis ikatan antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat diantara gugus R residu
asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion diantara gugus R yang
berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan
kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistein (Stryer, 2002).
2.1.2 Klasifikasi enzim
Berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis oleh enzim maka enzim dibagi
menjadi enam klasifikasi yaitu oksidoredutase, transferase, hidrolase, liase,
isomerase dan ligase (McMurry and Mary, 1994).
1. Oksidoreduktase
Enzim oksidoreduktase adalah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
oksidasi atau reduksi suatu bahan. Dalam golongan ini terdapat 2 jenis enzim
yang paling utama yaitu oksidase dan dehidrogenase.
a. Oksidase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi antara substrat dengan
molekul oksigen. Yang termasuk enzim oksidase adalah katalase, peroksidase,
tirosinase, dan asam askorbat oksidase.
b. Dehidrogenase adalah enzim yang aktif dalam pengambilan atom hidrogen dari
substrat. Contohnya yaitu suksinat dehidrogenase, glutamat dehidrogenase, dan
laktat dehidrogenase.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

7

2. Transferase
Enzim transferase adalah enzim yang ikut serta dalam reaksi pemindahan
(transfer) suatu radikal atau gugus. Enzim yang termasuk dalam golongan ini
adalah transglikosidase, transfosforilase, transaminase, dan transasetilase.
3. Hidrolase
Enzim hidrolase merupakan enzim yang sangat penting dalam pengolahan
pangan,

yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis suatu substrat atau

pemecahan substrat dengan pertolongan molekul air.
4. Liase
Enzim liase adalah enzim yang aktif dalam pemecahan ikatan C-C dan
ikatan C-O

dengan tidak menggunakan melekul air. Yang termasuk dalam

golongan enzim ini adalah enzim dekarboksilase.
5. Isomerase
Enzim isomerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi perubahan
konfigurasi molekul substrat, sehingga dihasilkan molekul baru yang merupakan
isomer dari substrat, atau dengan perubahan isomer posisi. Yang termasuk dalam
golongan ini adalah enzim fosfoheksosa isomerise atau fosfomanosa isomerase.
6. Ligase
Enzim ligase adalah golongan enzim yang mengkatalis terjadinya ikatan
bersama atau penggabungan dua molekul substrat dengan partisipasi dari ATP.
2.1.3 Mekanisme kerja enzim
Enzim bekerja secara spesifik dalam mengkatalisis suatu reaksi. Hanya
jenis reaksi tertentu yang dapat dikatalisis oleh enzim tertentu dan hanya substrat

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

8

tertentu yang dapat dikatalisis. Enzim mempunyai sisi aktif, yaitu sisi yang ada
pada enzim yang dapat melakukan fungsi pengarahan, pengikatan, dan katalisis,
yang tidak terdapat pada protein pada umumnya. Sisi aktif enzim pada umunya
berbentuk celah, yang tersusun atas sisa asam amino bagian rantai polipeptida
enzim. Substrat enzim sebelum diurai atau digandengkan harus masuk dulu ke
dalam celah. Dalam hal ini substrat yang masuk ke dalam celah harus memenuhi
beberapa syarat yaitu, komplementer dengan celah dan harus ada bagian yang
labil agar bisa digandengkan atau diurai (Martoharsono, 2006)
Sifat komplementer enzim dan substrat dikemukakan dengan teori
pemodelan “lock and key “ dan “induced fit”. Pada pemodelan lock and key sisi
aktif enzim memiliki kesesuaian hanya dengan satu macam substrat saja, sama
seperti dengan kunci yang dapat masuk dengan tepat ke dalam gembok.

Gambar 2.1 Mekanisme kerja enzim model lock and key (Stryer et al., 2002)
Sedangkan melalui penjelasan pemodelan induced-fit, kinerja enzim yang
spesifik dapat dijelaskan dengan lebih luas. Pada induced fit dijelaskan bahwa
beberapa enzim cukup fleksibel dalam mengubah bentuk dan ukuran sisi aktif
mereka untuk disesuaikan dengan ruang yang diperlukan oleh substrat yang
berbeda. Dengan demikian enzim dan substrat dapat bergabung dan interaksi
mereka menyebabkan kesesuaian yang tepat ( McMurry and Marry, 1994)

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

9

Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim model induced fit (Stryer et al., 2002)
Selain bekerja secara spesifik, enzim juga bekerja dengan mempercepat
terjadinya suatu reaksi. Hal ini karena dalam suatu reaksi enzim bekerja dengan
menurunkan energi aktivasi, yaitu jumah energi dalam kalori yang diperlukan
untuk membawa semua molekul pada 1 mol senyawa pada suhu tertentu menuju
tingkat transisi pada puncak batas energi. Enzim juga mempunyai suatu afinitas
yang tinggi terhadap substrat dan mempunyai kemampuan mengikatnya walaupun
bersifat sementara.
2.1.4 Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim
1. Konsentrasi Substrat
Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi suatu enzim.
Konsentrasi yang tinggi dapat memperbesar laju reaksi. Tapi jika konsentrasi
substrat diperbesar maka tidak akan ada lagi penambahan laju reaksi (Stryer,
2002). Keadaan ini telah dijelaskan oleh Michealis – Menten dengan hipotesis
mereka tentang terjadinya kompleks enzim substrat. Untuk dapat terjadi kompleks
enzim substrat, perlu adanya kontak antara enzim dengan substrat.
Kontak ini terjadi pada suatu tempat atau bagian enzim yang disebut
bagian aktif. Pada konsentrasi substrat rendah, bagian aktif enzim ini hanya
menampung substrat sedikit. Bila konsentrasi substrat diperbesar,makin banyak

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

10

substrat yang berhubungan dengan enzim pada bagian aktif tersebut. Dengan
demikian konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar dan hal ini
menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Pada suatu batas konsentrasi
substrat tertentu, semua bagian aktif telah dipenuhi oleh substrat atau telah jenuh
dengan substrat. Dalam hal ini, bertambahnya konsentrasi substrat tidak
menyebabkan bertambah besarnya konsentrasi kompleks enzim substrat, sehingga
jumlah hasil reaksi pun tidak bertambah besar.
2. Suhu
Pada suhu rendah reaksi berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang
tinggi reaksi berlangsung cepat. Disamping itu, karena enzim adalah suatu
protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi.
Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan
dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan
reaksinya pun akan menurun.
3. pH
Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH
lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan
ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan
berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks
enzim substrat. Di samping pengaruh terhadap struktur ion pada enzim, pH rendah
atau pH tinggi dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan
mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

11

4. Inhibitor
Hambatan atau inhibisi pada suatu reaksi yang menggunakan enzim
sebagai katalis dapat terjadi apabila penggabungan substrat pada bagian aktif
enzim mengalami hambatan. Molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi
tersebut dinamakan inhibitor. Hambatan yang dilakukan inhibitor dapat berupa
hambatan tidak reversibel atau hambatan reversibel. Hambatan tidak reversibel
pada umumnya disebabkan oleh terjadinya modifikasi sebuah gugus fungsi atau
lebih yang terdapat pada molekul enzim. Hambatan reversibel dapat berupa
hambatan bersaing atau hambatan tidak bersaing.
5. Ko-enzim dan aktivator
Enzim sering kali memerlukan bantuan substansi lain agar berfungsi
secara efektif. Ko-enzim adalah substansi bukan protein yang mengaktifkan
enzim.
2.2 Enzim β-1,3-glukanase
Enzim β-1,3-glukanase secara luas ditemukan pada sebagian besar bakteri,
jamur, tanaman tingkat tinggi dan hewan invertebrata. Enzim β-1,3-glukanase
diklasifikasikan sebagai enzim hidrolisis oleh International Union Biokimia dan
Biologi molekuler (IUBMB, 1992) berkaitan dengan aktivitas hirolisisnya pada
substrat. Berdasarkan aktivitas hidrolitiknya terdapat dua jenis β-1,3-glukanase,
yang pertama ekso-β-1,3-glukanase yang menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan
secara berurutan, dari ujung non-reduksi suatu polimer atau oligomers, sehingga
dihasilkan monomer glukosa (Reese, 1977). Tipe β-1,3-glukanase yang kedua
adalah endo-β-1,3-glukanase, menghidrolisis ikatan β-1,3 pada sisi yang acak

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

12

sepanjang rantai polisakarida, sehingga dihasilkan oligosakarida (Reese &
Mandels, 1959).
Substrat spesifik bagi enzim ini adalah polisakarida berikatan β-1,3-glukan
yang dinamakan laminarin dan banyak ditemukan pada dinding sel jamur patogen
(Adams, 2004). Salah satu jamur patogen yang dapat menginfeksi manusia yaitu
C.albicans. Jamur ini merupakan jamur patogen penyebab kandiasis dalam tubuh.
Percobaan yang dilakukan oleh Nett et al. (2007) menunjukkan bahwa kandungan
β-1,3 glukan meningkat pada dinding sel C.albicans dalam bentuk biofilm
dibandingkan dengan sel bebas. Dinding sel C.albicans itu sendiri terdiri dari
struktur lapisan multilayer diluar lapisan membran plasma. Struktur multilayer
inilah yang merupakan struktur yang sangat penting bagi fungsi biologik jamur
yaitu mempertahankan bentuk jamur, sebagai barrier permeabilitas dan pelindung
bagi membran dan sitoplasma didalamnya. Oleh karena itu, untuk menghambat
pertumbuhan C. albicans dengan menghidrolisis β-1,3 glukan pada dinding sel
dengan enzim β-1,3 glukanase. Enzim β-1,3-glukanase melakukan penyerangan
subsrat β-1,3-glukan pada sisi ikatan 1,3.

Gambar 2.3 Aktivitas enzim β-1,3-glukanase terhadap substrat β-1,3-glukan
(Kirstee et al, 2005). Tanda panah menunjukkan sisi pemotongan enzim terhadap
substrat.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

13

2.3 β-1,3-glukan
β-1,3-glukan adalah komponen struktur utama dinding sel dari banyak
jamur patogenik khususnya C.albicans. Strukturnya terdiri dari 1.500

residu

glukosa yang bergabung dalam konfigurasi ikatan β-glikosidik (Kirstee et al.,
2005). Ikatan glikosidik adalah ikatan antara dua molekul monosakarida. Ikatan
ini terbentuk antara gugus hidroksil dari atom C nomor satu yang juga disebut
karbon anomerik dengan gugus hidroksil dan atom C pada molekul gula yang
lain.
Komposisi β-glukan dalam dinding sel C.albicans adalah 47 - 60%.
Polimer ini menyajikan struktur mikrofibrillar yang memberikan elastisitas dan
kekuatan tarik ke dinding sel jamur (de Nobel et al, 2001). Dinding sel Candida
albicans juga tersusun dari mannoprotein, β-glukan, kitin, komponen protein, dan
lipid ( Bernadus, 2007). Sehingga untuk menekan pertumbuhan dinding sel jamur
yaitu dengan menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan menggunakan enzim β-1,3glukanase yang diisolasi dari Achatina fulica.

Mannoprotein
β-glukan
β-glukan-kitin
Mannoprotein
Membran plasma
Gambar 2.4 Struktur dinding sel C.albicans dengan komponen utama βglukan.
2.4 Achatina fulica
Bekicot (Achatina fulica) merupakan Gastropoda paling besar, berasal dari
Mauritrius dan mungkin juga Afrika timur. Pada tahun 1847 seorang kolektor

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

14

concha yang mengunjungi Mauritrius membawa beberapa specimen hidup ke
Calcutta. Di situ Achatina fulica berkembang baik dan tersebar luas tanpa ada
musuhnya. Di Sumatra dan Jawa hewan ini telah merusak perkebunan karet. Pada
tahun itu juga telah mencapai Taiwan dan disambut hangat orang-orang jepang
sebagai makanan menarik dan berkhasiat sebagai obat (Radiopoetro, 1988)
2.4.1 Klasifikasi Achatina fulica
Klasifikasi Achatina fulica menurut Malek (1980) adalah sebagai berikut :
Subkingdom

: Metazoa

Phyllum

: Mollusca

Kelas

: Gastropoda

Subkelas

: Pulmonata

Ordo

: Styllomotophora

Famili

: Achatinidae

Genus

: Achatina

Species

: Achatina fulica

Kelamin

Mata

Saluran
Pencernaan
Perut
Ginjal

Insang

Tentakel

Hati
Mulut

Ganglia otak
Tembolok

Tali saraf

Kaki

Gambar 2.5 Anatomi Achatina fulica

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

15

2.4.2 Karakteristik umum Achatina fulica
Bekicot (Achatina fulica) merupakan salah satu jenis molusca dengan ciriciri umum bertubuh lunak dan terbungkus dalam rumah berkapur yang berasal
dari sekretnya sendiri. Rumah berkapur atau biasa disebut dengan cangkang ini
berfungi sebagai pelindung badan untuk mempertahankan diri dari musuh
(Santoso, 1989). Pada bagian kepala terdapat dua tentakel sebagai alat peraba
(perasa). Tentakel ini berguna untuk merasakan perubahan suhu, sebagai
penunjuk jalan dan sebagai penunjuk adanya makanan.
Dalam mulut terdapat radula (semacam lidah) untuk memarut daun.
Bagian bawah kaki terdapat kelenjar yang dapat mengeluarkan lendir pada saat
berjalan. Achatina fulica aktif di waktu malam dan bergerak maju, dengan
gelombang aksi otot-otot pada sisi ventral kaki, di atas bekas lendir yang dibuat
oleh kelenjar kaki di bawah mulut. Dengan radula, tanaman hijau yang lunak dan
tidak berbulu dipegang oleh rahang lalu diparut dengan radula (Radiopoetro,
1988).
Tempat yang disukai Achatina fulica adalah tempat yang menyediakan
makanan, temperatur rendah, dan terlindung dari sinar matahari. Faktor-faktor
yang mempengaruhi habitatnya adalah temperatur, persediaan kalsium, pH tanah,
kelembaban dan persediaaan makanan. Achatina fulica mempunyai ketahanan
fisik dan ketahanan hidup yang tinggi serta mudah berkembang biak di daerah
tropis (Radiopoetro, 1988). Achatina fulica merupakan hewan hermaprodit, akan
tetapi tetap melakukan perkawinan dengan pasangannya (Malek, 1980). Achatina

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

16

fulica mempunyai sistem reproduksi, respirasi, ekskresi, dan digesti (pencernaan)
yang kompleks.
2.4.3 Sistem pencernaan Achatina fulica
Sistem pencernaan Achatina fulica terdiri dari rongga mulut dilanjutkan
kedalam esophagus yang sempit, yang kemudian melebar membentuk ingluvies.
Ingluvies berupa sebuah kantong besar dengan deretan glandulae salivales dalam
sepanjang dindingnya dan saluran- salurannya bermuara di ujung anterior
esophagus. Glandulae salivales menghasilkan lendir berair yang berisi enzim –
enzim diastase, yaitu yang menguraikan hidrat arang. Ingluvies juga berisi cairan
yang berasal dari glandulae digestoriae yang mengalir dari tempat keluarnya
kedalam ventriculus, cairan ini berisi enzim – enzim dan termasuk juga
didalamnya enzim cytase yang mencerna seluosa, seperti halnya pada Helix, yaitu
sejenis siput darat yang ada di Amerika (Radiopoetro, 1988).
Enzim cytase tersebut berasal dari bakteri hidup di dalam intestinum dan
ingluives. Enzim ini menghancurkan dinding sel tumbuh- tumbuhan sehingga isi
sel dapat dilepaskan keluar. Bagian berikutnya setelah ingluives adalah
ventriculus yang berupa kantong yang cukup luas tetapi sederhana,dilingkupi oleh
glandulae digestoriae yang menggerombol di sekeliling kebanyakan alat – alat
dalam. Glandulae digestoriae terdiri dari kumpulan tubuli yang bercabang –
cabang dan berakhir buntu pada gerombolan sel – sel. Dikenal ada tiga macam
sel, yaitu:
1) Sel yang menghasilkan enzim- enzim untuk pencernaan ekstraseluler.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

17

2) Sel yang menyerap partikel- partikel makanan dan mencernakannya intraseluler, juga menyerap hasil –hasil pencernaan di luar sel.
3) Sel yang mengasilkan CaCO3, fungsinya terutama ialah untuk membentuk
concha. Lanjutan ventriculus ialah intestinum yang berjalan berkelok – kelok yang
berakhir pada rektum yang bermuara keluar melalui anus. Penyerapan hasil – hasil
pencernaan terutama berlangsung di dalam intestinum (Radiopoetro, 1995).
Selain itu, Weel (1961) menyatakan bahwa ekstrak kelenjar saluran
pencernaan (digestive gland) Achatina fulica memiliki campuran enzim
carbohydrase yaitu berupa enzim kitinase, xilase, cellulase, lichenase, inulase,
hemiselulase, amilase, maltase, dan sukrase. Disamping itu, dygestive gland siput
mengandung enzim protease, dan polypeptidase. Selain itu juga mengandung
enzim hidrolitik yang

terdiri dari enzim β-1,3-glukanase dan enzim β-1,4-

glukanase (Gabriel and Kopecka, 1987). Enzim β-1,3-glukanase merupakan
enzim yang menghidrolisis ikatan β-1,3-glukan pada dinding sel jamur patogen
salah satunya C. albicans.
2.5 Pemurnian Enzim
Tujuan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi
enzim spesifik dari senyawa lain yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian
tergantung tujuan akhir, apakah untuk tujuan komersial sebagai enzim industri
atau tujuan riset. Untuk kepentingan riset, biasanya enzim perlu dimurnikan
beberapa tahap dengan resiko terjadi kehilangan yang cukup besar (hingga 90%).
Enzim untuk kepentingan industri sedapat mungkin dicegah dari kehilangan,
sehingga sesedikit mungkin tahapan pemurnian yang dilakukan, hanya untuk

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

18

menghilangkan senyawa yang mengganggu proses. Pemurnian protein dilakukan
berdasarkan sifat kelarutan, ukuran, muatan afinitas pengikatan protein itu sendiri.
Oleh karena itu campuran protein selanjutnya dipisahkan dengan berbagai seri
pemisahan.
Permasalahan dalam pemurnian protein atau enzim adalah memisahkan
enzim yang dikehendaki dari ratusan protein yang mempunyai stuktur kimia dan
fisika yang serupa. Semua langkah pemurnian menggunakan larutan penyangga
dengan pH tertentu. Larutan penyangga yang digunakan mempengaruhi sifat
biofisika protein. Jumlah protein enzim diakhir proses pemurnian tidak hanya
bergantung pada material awal tetapi juga bergantung pada proses. Ada protein
yang hilang pada setiap pemurnian, oleh karena itu perlu memaksimalkan langkah
kerja sehingga dapat memperoleh enzim yang optimal (Harris dan Angal, 1989)
Harris (1989) menyebutkan ada tiga faktor yang harus diperhatikan dalam
pemurnian enzim yaitu faktor kualitas, kuantitas dan ekonomis. Faktor kualitas
yaitu perlu tindakan untuk mempertahankan aktivitas protein dengan cara
mengurangi proteolisis dan denaturasi. Faktor kuantitas yaitu pemakaian akhir
dari protein murni akan menentukan kualitas enzim yang diperlukan sedangkan
ekonomis merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam industri atau
diterapkan dalam skala laboratorium.
Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain dengan
cara pengendapan dalam garam ammonium sulfat (salting out) atau pelarut
organik aseton, dan melalui membran ultrafiltrasi.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

19

Penggunaan amonium sulfat untuk salting out memiliki keuntungan, antara
lain harga relatif murah, kelarutannya tinggi, pH larutan tidak berubah secara
ekstrem, dan tidak bersifat toksik. Kerugiannya ialah konsentrasi garam yang
tertinggal dalam produk tinggi sehingga kurang efisien dalam menghilangkan
pengotor. Pengendapan protein dengan pelarut organik seperti aseton lebih mudah
dilakukan karena penghilangan sisa aseton dapat dilakukan dengan sentrifugasi
dan penguapan.
2.6 Fraksinasi Pelarut Organik
Fraksinasi dengan pelarut organik dapat menggunakan aseton dan etanol.
Namun, untuk pemurnian protein lebih mudah menggunakan aseton karena aseton
tidak memilik efek azeotrop seperti etanol. Prinsip kerja dari fraksinasi dengan
pelarut aseton yaitu teknik pengendapan untuk meniadakan efek perlindungan
molekul air di sekitar permukaan molekul-molekul protein, akibatnya molekulmolekul protein akan beragregasi sesamanya kemudian mengendap. Pengendapan
protein dengan pelarut organik aseton didasarkan pada sifat yang tidak saling larut
antara aseton (non-polar) dan molekul air (polar).
Penambahan aseton ke dalam larutan protein akan menurunkan konstanta
dielektrikum pelarut air dan mengurangi solvasi air terhadap residu hirofilik
enzim. Posisi air di sekitar daerah hidrofobik dari permukaan protein akan
digantikan oeh pelarut aseton dan segera terjadi interaksi hidrofobik.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

20

Bagian hidrofobik
Pelarut organik

Gambar 2.6 Agregasi protein karena interaksi antara air dan pelarut
organik (Scopes, 1994).
Pada pengendapan dengan aseton, efek hidrofobisitas mempunyai
pengaruh yang kecil. Pengendapan justru terjadi karena adanya interaksi
elektrostatik antara muatan yang berlawanan pada permukaan protein. Interaksi
tersebut mengakibatkan protein berada pada kondisi isoelektrik, kemudian
beragregasi dan akhirnya mengendap. Pengendapan dengan aseton baik dilakukan
untuk mengisolasi protein-protein kaya akan residu hidrofobik yang lokasinya
disekitar membran (Scopes, 1994). Prosedur fraksinasi pelarut organik aseton
dilakukan pada suhu dibawah 00C. Pada suhu diatas 100C,

akan terjadi

denaturasi.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

21

Perubahan
struktur

Interaksi internal
hidrofobik
Molekul pelarut organik
berinteraki dengan
residu hidrofobik

Pemecahan interaksi
internal hidrofobik

Denaturasi

Gambar 2.7 Proses denaturasi protein jika suhu pelarut organik lebih dari
0oC (Scopes, 1994)
Pada proses denaturasi, konformasi protein akan segera berubah yang
memungkinkan molekul-molekul pelarut organik mendapatkan jalan masuk
kebagian dalam struktur protein, kemudian merusak interaksi hidrofobik (Harris
1989, Scopes 1994).

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

22

BAB III
METODE PENELITIAN

3. 1 Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini di kerjakan di laboratorium Biokimia Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga pada bulan Februari 2012 Juli 2012.
3.2 Alat dan bahan penelitian
3.2.1 Bahan penelitian
Bahan-bahan yang digunakan adalah Achatina fulica yang didapatkan dari
kota Kediri, substrat laminarin, garam Rochelle, fenol, asam 3,5-dinitrosalisilat,
glukosa anhidrat, aseton, buffer fosfat, asam sitrat, buffer sitrat, reagen Lowry C,
akuades, dan kertas saring.
3.2.2 Peralatan penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat
gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia seperti gelas ukur, gelas arloji,
pipet tetes, pipet volume dll. Alat-alat yang digunakan adalah sentrifugator
(Centrific-228), inkubator (Memmert), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu),
blender (Philip), neraca analitik (Kern 870), timbangan (Kern 444-45), water bath,
pHmeter (Orion-420A), magnetic stirer (Thermolyne Cimarec), kulkas (Sharp),
tabung falcon, botol semprot, pisau stainlesssteel dan alat-alat gelas.

Skripsi

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

23

3.3 Diagram alir peneiltian
Achatina fulica
Karantina Achatina fulica

Cairan Pencernaan
Preparasi ekstrak kasar enzim cairan
pencernaan Achatina fulica

Uji
aktivitas
spesifik β1,3glukanase

Ekstrak kasar enzim
Cairan pencernaan
Achatina fulica
Pemurnian
parsial
dengan
Fraksinasi
aseton

Data aktivitas
spesifik β-1,3glukanase
Uji
aktivitas
spesifik β1,3glukanase
Data aktivitas
spesifik β-1,3glukanase

Data kadar
protein

Enzim β-1,3-glukanase
Hasil pemurnian parsial

Penentuan
kadar
Karakterisasi protein
Enzim
Data kadar
protein

Penentuan
pH
optimum

pH Optimum

Skripsi

Penentuan
kadar
protein

Penentuan
suhu
optimum

Suhu optimum

Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Enzim
β-1,3-glukanase Dari Cairan Pencernaan Achatina fulica

Siti Munawaroh Waidah

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

24

3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Karantina Achatina fulica
Sejumlah Achatina fulica dikarantina selama 1 minggu dalam sebuah
kandang tertutup dengan beberapa ventilasi. Kandang dibuat lembab sesuai
dengan habitat asli Achatina fulica. Proses karantina bertujuan agar Achatina
fulica tersebut berada pada kondisi nutrisi yang sama dengan pemberian sumber
makanan berupa serat seperti kubis, daun singkong dll sehingga kandungan enzim
hidrolase dalam cairan pencernaan Achatina fulica maksimal serta lebih homogen.
3.4.2 Panen ekstrak kasar e