ANALISIS FILOGENETIK MOLEKULER BEBERAPA ANGGOTA SUKU SOLANACEAE INDONESIA DAN Withania somnifera.

ABSTRAK

Beberapa tumbuhan yang termasuk ke dalam suku Solanaceae digunakan sebagai obat karena diketahui dapat menurunkan kadar toksisitas dalam tubuh hewan dan manusia. Withania somnifera merupakan salah satu tumbuhan Solanaceae dan dikenal memiliki banyak manfaat dalam bidang kesehatan, diantaranya adalah sebagai anti-stress, anti-oksidan, anti-inflamasi, anti-aging, kardioprotektif, agen immunoregulator, anti-tumor dan anti-kanker. Sayangnya tumbuhan ini hanya dapat ditemukan di India, Pakistan, Sri Lanka, dan Afganistan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh hubungan filogenetik antara W. somnifera dengan beberapa tumbuhan Solanaceae Indonesia dan memperoleh jenis yang berkerabat dekat dengan W. somnifera sehingga diduga memiliki manfaat yang sama besarnya. Sekuen DNA daerah Internal Transcribed Spacer (ITS) digunakan untuk menganalisis hubungan filogenetik dan metode maximum parsimony digunakan untuk membuat pohon filogenetik. Terdapat 19 tumbuhan yang digunakan, 17 jenis dari Solanaceae serta 2 jenis dari Convolvulaceae sebagai outgroup. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa suku Solanaceae merupakan kelompok monofiletik dan terbagi menjadi 7 kelompok berdasarkan supermarga. Physalis angulata, Physalis peruviana, dan W. somnifera merupakan kelompok monofiletik dengan dukungan nilai bootstrap 72%. Dengan demikian, P. angulata dan P. peruviana memiliki kekerabatan yang paling dekat dengan W. somnifera dan dapat dijadikan sebagai salah satu tumbuhan obat alternatif di Indonesia yang diduga memiliki manfaat yang sama. Kata kunci: Analisis filogenetik, daerah ITS, Solanaceae, Withania somnifera

ABSTRACT

Some plants which belong to the family of Solanaceae are frequently used as medicine due to their capability to decrease the toxicity level in animal and human body. Withania somnifera is one of member of Solanaceae which has many benefits for human health, such as stress, oxidant, inflammation, aging, cardioprotective, immunoregulatory agent and anti-cancer. However, unfortunately this plant can only be found in India, Pakistan, Sri Lanka, and Afganistan. The purpose of this research were (1) to construct phylogenetic relationship between W. somnifera and some Solanaceae frequently found in Indonesia and (2) to obtain a species closely related to W. somnifera. DNA sequences of Internal Transcribed Spacer (ITS) region were used to analyse the relationship and maximum parsimony was used to construct the phylogenetic tree. There was 19 plants used, consisting of 17 species of Solanaceae and 2 species of Convolvulaceae as outgroup. Phylogenetic analysis shows that Solanaceae is a monophyletic group and is divided into 7 groups which correspond to supragenera. Two species of Physalis we used are close relationship with W. somnifera (bootstrap values 72%). This indicates that Physalis angulata and Physalis peruviana can serve as one of alternative medicinal plants in Indonesia, expecting to have same benefits with that of W. somnifera.

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif. Data diperoleh dari sikuen DNA daerah ITS untuk merekonstruksi pohon filogenetik dalam menentukan kekerabatan antara tumbuhan-tumbuhan Solanaceae.

B. Populasi dan Sampel

Populasi dalam penelitian ini adalah beberapa tumbuhan yang termasuk ke dalam suku Solanaceae dan Convolvulaceae yang diperoleh dari beberapa daerah di kota Bandung, sedangkan sampel yang digunakan adalah DNA dari 17 jenis tumbuhan Solanaceae dan 2 jenis tumbuhan Convolvulaceae (sebagai outgroup). Khusus untuk sekuen DNA daerah ITS species Withania somnifera dan Capsicum annuum diperoleh dari GeneBank NCBI yang dapat diakses di www.ncbi.nlm.nih.gov. Daftar tumbuhan yang digunakan sebagai sampel dapat dilihat pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Daftar sampel tumbuhan Solanaceae dan Convolvulaceae yang digunakan dalam penelitian

No. Sampel

Nama Tumbuhan Nama Daerah Suku

01 Physalis angulata Ciplukan Solanaceae

02 Solanum nigrum Leunca/ Ranti Solanaceae

03 Solanum wrightii Karundung Solanaceae

04 Solanum lycopersicum Tomat Solanaceae

05 Solanum torvum Terung liar Solanaceae

07 Nicotiana tabacum Tembakau Solanaceae No.

Sampel

Nama Tumbuhan Nama Daerah Suku

08 Brugmansia suaveolens Kecubung orange Solanaceae 09 Brugmansia candida Kecubung putih Solanaceae 10 Brunfelsia uniflora Melati mentomori Solanaceae 11 Cestrum nocturnum Arum dalu Solanaceae

12 Datura metel Kecubung ungu Solanaceae

13 Petunia grandiflora Petunia Solanaceae 14 Nicandra physalodes Nandina Solanaceae

15 Cestrum cultum - Solanaceae

16 Physalis peruviana Ciplukan Solanaceae

17 Solanum tuberosum Kentang Solanaceae

18 Ipomoea batatas Ubi jalar Convolvulaceae 19 Ipomoea cairica Ubi kates Convolvulaceae

C. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai dengan bulan Mei 2015, sedangkan untuk lokasinya dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Sekuensing produk hasil amplifikasi DNA daerah ITS dari seluruh sampel dilakukan di Macrogen, Seoul, Korea Selatan.

D. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian terdapat di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Daftar alat dan bahan tersebut tercantum dalam Lampiran 1.

E. Prosedur Penelitian 1. Tahap Persiapan

Alat-alat yang digunakan dicuci bersih terlebih dahulu dan dikeringkan untuk selanjutnya dibungkus dengan plastik tahan panas dan disterilisasi panas lembab menggunakan autoclave dengan suhu 1210C selama 15 menit.

2. Tahap Penelitian

a. Pengambilan Sampel

Sampel yang digunakan adalah daun muda dari 17 jenis tumbuhan Solanaceae dan 2 jenis tumbuhan Convolvulaceae. Daun-daun tersebut dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%, disimpan dalam plastic bag yang masing-masing sudah diberi label nama specimen, dan dimasukkan ke dalam coolbox berisi es batu untuk menjaga kesegaran sampel. Selanjutnya di dalam laboratorium, sampel disimpan pada suhu -200C hingga proses ekstraksi DNA.

b. Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA yang dilakukan menggunakan GeneJETTM Plant Genomic Purification Mini Kit dari Thermo Scientific dengan beberapa modifikasi. Komponen-komponen yang digunakan pada kit yaitu 0,7 ml RNase A, 25 ml Lysis Buffer A, 3 ml Lysis Buffer B, 8 ml Precipitation Solution, 24 ml Plant gDNA Binding Solution, 10 ml Wash Buffer I, 10 ml Wash Buffer II, 30 ml Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.5 mM EDTA), GeneJET Genomic DNA Purification Column pre-assembled with Collection Tubes, dan Collection Tube (2 ml). Sebelum digunakan, Wash Buffer I dan Wash Buffer II ditambahkan Ethanol 96% hingga volumenya 40 ml.

Daun muda dari setiap specimen ditimbang sebanyak 0,1 g untuk kemudian digerus menggunakan mortar dan alu steril dengan pemberian nitrogen cair secukupnya. Sementara itu, tabung mikro 1,5 ml steril diberi label sesuai kode sampel masing-masing dan diberi 350

µl Lysis Buffer A. Bubuk daun yang sudah halus selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung mikro menggunakan spatula steril, lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex selama 10-20 detik. Selanjutnya ke dalam tabung mikro ditambahkan 50 µl Lysis Buffer B dan 5 µl RNase A, dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung, lalu tabung-tabung mikro tersebut diinkubasi pada shaking water bath dengan suhu 650C selama 10 menit untuk mengoptimalkan proses lisisnya sel.

Selanjutnya dilakukan proses presipitasi DNA dengan cara ditambahkan 130 µl Precipitation Solution dan dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung sebanyak 3 kali. Selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 40C selama 5 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Untuk mengoptimalkan proses presipitasi DNA, supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru sebanyak 450-500 µl serta ditambahkan 400 µl Plant gDNA Binding Solution dan 400 µl Ethanol 96%, lalu dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tabung sebanyak 10 kali.

Langkah berikutnya adalah memindahkan 600-700 µl larutan tersebut ke dalam Collection Tube yang sudah dipasangi Column Tube, dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit untuk memerangkap DNA dalam membran silica pada Column Tube. Supernatan yang berada pada Collection Tube dibuang, dan langkah ini dilakukan kembali untuk 600-700 µl larutan yang tersisa.

Kemudian ditambahkan 500 µl Wash Buffer I ke dalam Column Tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang berada pada Collection Tube dibuang. Selanjutnya ditambahkan 500 µl Wash Buffer II ke dalam Column Tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Supernatan dibuang dan tabung kembali disentrifugasi dengan

kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit untuk mengoptimalkan pemisahan debris dari DNA.

Selanjutnya supernatant dan Collection Tube dibuang dan Column Tube dipindahkan ke tabung mikro baru. Elution Buffer sebanyak 50 µl ditambahkan ke bagian tengah membran column dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Terakhir, ke dalam tabung kembali ditambahkan 50 µl Elution Buffer dan disentrifugasi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Elution Buffer memiliki kondisi ionik yang rendah sehingga dapat menjaga kualitas DNA genom, namun jika sampel DNA tidak langsung digunakan, dapat disimpan pada suhu -200C untuk menjaga kualitas DNA tetap dalam kondisi baik. Sampel selanjutnya siap digunakan untuk masuk ke tahap uji kuantitatif dan kualitatif DNA. Secara singkat langkah kerja ekstraksi DNA tersebut dapat dilihat pada Gambar 3.1.

Gambar 3.1 Skema Langkah Kerja Ekstraksi DNA Tumbuhan Menggunakan GeneJETTM Plant Genomic Purification Mini Kit Thermo Scientific. c. Mengukur Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Uji kuantitatif DNA dilakukan dengan cara mengukur kemurnian dan konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer. Komposisi larutan yang digunakan adalah 500 kali pengenceran, yaitu dengan melarutkan 1 µl sampel dalam 499 µl ddH2O steril. Larutan tersebut

sebelumnya dihomogenkan terlebih menggunakan vortex baru selanjutnya dimasukkan ke dalam kuvet spektrofotometer.

Nilai kemurnian DNA diperoleh dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm yang dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm. DNA murni umumnya memiliki nilai kemurnian berkisar antara 1.8-2.0. Sedangkan nilai konsentrasi DNA dapat diperoleh dengan menggunakan rumus :

[DNA] = Å260 x 50 x Faktor Pengenceran Keterangan :

Å260 : Nilai absorbansi pada 260 nm d. Elektroforesis Sampel Hasil Ekstraksi DNA

Uji kualitatif DNA dilakukan untuk mengetahui kemurnian DNA menggunakan alat elektroforesis. Sampel hasil ekstraksi dielektroforesis untuk diketahui keberadaan DNAnya. Proses elektroforesis dilakukan dengan pembuatan gel agarose terlebih dahulu. Konsentrasi gel agarose yang digunakan adalah 1%, yaitu dengan melarutkan 0,25 g agarose ke dalam 25 ml TAE 1x.

Selanjutnya, sebanyak 5 µl sampel dicampurkan dengan 2 µl Loading Dye dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel agarose. Gel agarose yang sudah berisi sampel DNA dielektroforesis menggunakan TAE 1x dengan arus 100 V selama 90 menit. Gel selanjutnya diwarnai menggunakan larutan EtBr dan DNA hasil elektroforesis diamati dibawah UV transluminator serta didokumentasikan menggunakan kamera digital.

e. Amplifikasi DNA dengan Metode PCR

Amplifikasi DNA daerah ITS dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Thermal cycler Gene Amplified PCR System 9700. Proses amplifikasi tersebut mengacu pada Hidayat dan Pancoro (2008, hlm.

17) dengan menggunakan satu pasang primer, yaitu ITS5 (5’-

TAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAA- 3’) sebagai primer forward

dan ITS4 (5’- CCCGCCTGACCTGGGGTCGC- 3’) sebagai primer

reverse. Dengan menggunakan DreamTaq Green PCR Master Mix 2x (Thermoscientific), amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 950C selama 2 menit (1 siklus), dilanjutkan dengan 35 siklus yang

terdiri dari denaturasi pada suhu 950C selama 30 detik, annealing pada suhu 570C selama 2 menit, dan ekstensi pada suhu 720C selama 2 menit. Amplifikasi diakhiri dengan 1 siklus untuk melengkapi proses pemanjangan (final extension) pada suhu 720C selama 10 menit (Hidayat et al., 2008, hlm. 17).

Pencampuran komponen reaksi PCR dilakukan secara cepat, steril, teliti, dan dilakukan di dalam coolbox untuk menjaga komponen-komponen PCR tidak rusak. Setiap tabung PCR berisi 25 µl komposisi reaksi PCR yang dapat dilihat pada Tabel 3.2.

Tabel 3.2. Komposisi Reaksi PCR Menggunakan DreamTaq Green DNA Polymerase Thermoscientific

Komponen Volume (50 µl reaksi)

Konsentrasi akhir

Volume akhir (25 µl reaksi) DreamTaq Green

PCR Master Mix 2x

25 µl 1x 12.5 µl

ITS 5 0.1-1.0 µM 0.5 µM 1 µl

ITS 4 0.1-1.0 µM 0.5 µM 1 µl

Sample DNA 10 pg- 1 µg 2 µl

Nuclease-free water sampai 50 µl Sampai 25 µl

Jumlah 50 µl 25 µl

f. Elektroforesis Sampel Hasil PCR

Sampel DNA hasil amplifikasi (amplikon) selanjutnya diuji secara kualitatif dengan menggunakan alat elektroforesis untuk diketahui ukuran panjang basanya. Konsentrasi gel agarose yang digunakan yaitu 1%. Sebanyak 2 µl amplikon dicampukan dengan 2 µl Loading Dye dan 1 µl ddH2O steril lalu dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Proses

elektroforesis dilakukan dengan memberikan arus sebesar 100 V selama 120 menit menggunakan TAE 1x. Marker DNA yang digunakan adalah GeneRuler 1 Kb DNA Ladder dari Thermoscientific.

Gel agarose selanjutnya diwarnai dengan larutan EtBr selama 5 menit dan dibilas dengan aquades selama 3 menit. Hasil pewarnaan dilihat di bawah UV transluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital.

g. Sekuensing DNA

Sekuensing atau penentuan urutan basa DNA dari 19 produk amplifikasi dilakukan di Macrogen, Korea Selatan. Penentuan urutan basa tersebut dilakukan secara dua arah dengan menggunakan pasangan primer ITS5 dan ITS4.

3. Analisis Data

Setelah hasil sekuensing DNA diperoleh, sekuen DNA daerah ITS berdasarkan primer ITS5 dan ITS4 kemudian dicontig menggunakan program CodonCode untuk diperoleh sekuen yang utuh. Sekuen DNA tersebut selanjutnya diblast dengan data DNA yang ada di GeneBank NCBI untuk memperoleh kepastian jenis spesimen dan untuk mengetahui letak sekuen DNA yang diinginkan, yang dapat diakses di blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sekuen-sekuen DNA dari seluruh sampel selanjutnya dibuat fasta format dan dialignment dengan menggunakan program komputer ClustalX. Program ClustalX termasuk ke dalam program yang mengikutsertakan gap diantara sekuen untuk dianalisis. Selanjutnya analisis filogenetik berdasarkan metode Maksimum Parsimony dilakukan dengan menggunakan program MEGA v.4. Pohon filogenetik yang terbentuk disimpan dan evaluasi pohon dilakukan dengan menggunakan program Treeview untuk membentuk pohon filogenetik bersama dengan outgroup (Hidayat et al., 2008, hlm. 18).

F. Alur Penelitian

Pencuplikan Tumbuhan

Solanaceae dan outgroup

Ekstraksi DNA Genom Tumbuhan Uji Kuantitatif Hasil Ekstraksi DNA (kemurnian

dan konsentrasi DNA)

Sekuensing DNA

Analisis Data Pembuatan Laporan Penelitian atau Skripsi

Persiapan penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian

disiapkan dan disterilisasi

Studi pustaka awal dan penyusunan proposal

Amplifikasi DNA daerah ITS (Internal Transcribed Spacer)

Alignment sekuen DNA menggunakan program ClustalX Pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan program MEGA

Identifikasi morfologi dan dokumentasi

Alat dan bahan yang diperlukan untuk pengambilan

sampel disiapkan

Uji Kualitatif Hasil Ekstraksi DNA (elektroforesis)

Uji Kualitatif Hasil Amplifikasi DNA (elektroforesis)

Tahap penelitian

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Sekuen DNA daerah ITS telah berhasil menunjukkan hubungan kekerabatan diantara marga-marga pada suku Solanaceae. Pohon filogenetik yang dibentuk oleh klaster maksimum parsimony membagi 17 sampel Solanaceae menjadi 7 kelompok berdasarkan supermarga. Adapun hubungan kekerabatan marga-marga Solanaceae dengan outgroup memiliki nilai dukungan bootstrap 100% sehingga dapat membuktikan bahwa Convolvulaceae merupakan sistergroup dari Solanaceae.

Physalis angulata dan Physalis peruviana memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan Withania somnifera. Hubungan kekerabatan tersebut didukung oleh beberapa penelitian sebelumnya berdasarkan sekuen DNA maupun ciri morfologi yang menunjukkan bahwa keduanya memiliki karakter serupa, yaitu kaliksnya yang persisten dan tumbuh membesar serta membungkus buah setelah terjadi fertilisasi. Hasil penelitian ini dapat dijadikan landasan awal untuk menjadikan P. angulata dan P. peruviana sebagai alternatif tumbuhan obat baru yang dapat diperoleh di Indonesia. B. Saran

Untuk penelitian selanjutnya diperlukan analisis yang melibatkan lebih banyak sampel, karena semakin banyak sampelnya, semakin besar pula peluang untuk memperoleh jenis-jenis tumbuhan yang benar-benar berkerabat dekat dengan nilai bootstrap yang tinggi. Selain itu, diperlukan analisis yang lebih mendalam mengenai kandungan senyawa pada P. angulata, P. peruviana, dan W. somnifera serta membandingkannya agar dapat digunakan

untuk mendukung hasil penelitian yang menjadikan Physalis sebagai alternatif tumbuhan obat selain W. somnifera.

Putri Yunitha Wardiny, 2015

ANALISIS FILOGENETIK MOLEKULER BEBERAPA ANGGOTA SUKU SOLANACEAE INDONESIA DAN [DNA] = Å260 x 50 x Faktor Pengenceran

Keterangan :

Å260 : Nilai absorbansi pada 260 nm d. Elektroforesis Sampel Hasil Ekstraksi DNA

Uji kualitatif DNA dilakukan untuk mengetahui kemurnian DNA menggunakan alat elektroforesis. Sampel hasil ekstraksi dielektroforesis untuk diketahui keberadaan DNAnya. Proses elektroforesis dilakukan dengan pembuatan gel agarose terlebih dahulu. Konsentrasi gel agarose yang digunakan adalah 1%, yaitu dengan melarutkan 0,25 g agarose ke dalam 25 ml TAE 1x.

Selanjutnya, sebanyak 5 µl sampel dicampurkan dengan 2 µl Loading Dye dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel agarose. Gel agarose yang sudah berisi sampel DNA dielektroforesis menggunakan TAE 1x dengan arus 100 V selama 90 menit. Gel selanjutnya diwarnai menggunakan larutan EtBr dan DNA hasil elektroforesis diamati dibawah UV transluminator serta didokumentasikan menggunakan kamera digital.

e. Amplifikasi DNA dengan Metode PCR

Amplifikasi DNA daerah ITS dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Thermal cycler Gene Amplified PCR System 9700. Proses amplifikasi tersebut mengacu pada Hidayat dan Pancoro (2008, hlm. 17) dengan menggunakan satu pasang primer, yaitu ITS5 (5’ -TAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAA- 3’) sebagai primer forward dan ITS4 (5’- CCCGCCTGACCTGGGGTCGC- 3’) sebagai primer reverse. Dengan menggunakan DreamTaq Green PCR Master Mix 2x (Thermoscientific), amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 950C selama 2 menit (1 siklus), dilanjutkan dengan 35 siklus yang

terdiri dari denaturasi pada suhu 950C selama 30 detik, annealing pada suhu 570C selama 2 menit, dan ekstensi pada suhu 720C selama 2 menit. Amplifikasi diakhiri dengan 1 siklus untuk melengkapi proses pemanjangan (final extension) pada suhu 720C selama 10 menit (Hidayat et al., 2008, hlm. 17).

Pencampuran komponen reaksi PCR dilakukan secara cepat, steril, teliti, dan dilakukan di dalam coolbox untuk menjaga komponen-komponen PCR tidak rusak. Setiap tabung PCR berisi 25 µl komposisi reaksi PCR yang dapat dilihat pada Tabel 3.2.

Tabel 3.2. Komposisi Reaksi PCR Menggunakan DreamTaq Green DNA Polymerase Thermoscientific

Komponen Volume (50 µl reaksi)

Konsentrasi akhir

Volume akhir (25 µl reaksi) DreamTaq Green

PCR Master Mix 2x

25 µl 1x 12.5 µl

ITS 5 0.1-1.0 µM 0.5 µM 1 µl

ITS 4 0.1-1.0 µM 0.5 µM 1 µl

Sample DNA 10 pg- 1 µg 2 µl

Nuclease-free water sampai 50 µl Sampai 25 µl

Jumlah 50 µl 25 µl

f. Elektroforesis Sampel Hasil PCR

Sampel DNA hasil amplifikasi (amplikon) selanjutnya diuji secara kualitatif dengan menggunakan alat elektroforesis untuk diketahui ukuran panjang basanya. Konsentrasi gel agarose yang digunakan yaitu 1%. Sebanyak 2 µl amplikon dicampukan dengan 2 µl Loading Dye dan 1 µl ddH2O steril lalu dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Proses

elektroforesis dilakukan dengan memberikan arus sebesar 100 V selama 120 menit menggunakan TAE 1x. Marker DNA yang digunakan adalah

Putri Yunitha Wardiny, 2015

ANALISIS FILOGENETIK MOLEKULER BEBERAPA ANGGOTA SUKU SOLANACEAE INDONESIA DAN Gel agarose selanjutnya diwarnai dengan larutan EtBr selama 5 menit dan dibilas dengan aquades selama 3 menit. Hasil pewarnaan dilihat di bawah UV transluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital.

g. Sekuensing DNA

Sekuensing atau penentuan urutan basa DNA dari 19 produk amplifikasi dilakukan di Macrogen, Korea Selatan. Penentuan urutan basa tersebut dilakukan secara dua arah dengan menggunakan pasangan primer ITS5 dan ITS4.

3. Analisis Data

Setelah hasil sekuensing DNA diperoleh, sekuen DNA daerah ITS berdasarkan primer ITS5 dan ITS4 kemudian dicontig menggunakan program CodonCode untuk diperoleh sekuen yang utuh. Sekuen DNA tersebut selanjutnya diblast dengan data DNA yang ada di GeneBank NCBI untuk memperoleh kepastian jenis spesimen dan untuk mengetahui letak sekuen DNA yang diinginkan, yang dapat diakses di blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sekuen-sekuen DNA dari seluruh sampel selanjutnya dibuat fasta format dan dialignment dengan menggunakan program komputer ClustalX. Program ClustalX termasuk ke dalam program yang mengikutsertakan gap diantara sekuen untuk dianalisis. Selanjutnya analisis filogenetik berdasarkan metode Maksimum Parsimony dilakukan dengan menggunakan program MEGA v.4. Pohon filogenetik yang terbentuk disimpan dan evaluasi pohon dilakukan dengan menggunakan program Treeview untuk membentuk pohon filogenetik bersama dengan outgroup (Hidayat et al., 2008, hlm. 18).

F. Alur Penelitian

Pencuplikan Tumbuhan Solanaceae dan outgroup Ekstraksi DNA Genom

Tumbuhan Uji Kuantitatif Hasil Ekstraksi DNA (kemurnian

dan konsentrasi DNA)

Sekuensing DNA

Analisis Data Pembuatan Laporan Penelitian atau Skripsi

Persiapan penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian

disiapkan dan disterilisasi Studi pustaka awal dan

penyusunan proposal

Amplifikasi DNA daerah ITS (Internal Transcribed Spacer)

Alignment sekuen DNA menggunakan program ClustalX Pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan program MEGA

Identifikasi morfologi dan dokumentasi

Alat dan bahan yang diperlukan untuk pengambilan

sampel disiapkan

Uji Kualitatif Hasil Ekstraksi DNA (elektroforesis)

Uji Kualitatif Hasil Amplifikasi DNA (elektroforesis) Tahap penelitian

Putri Yunitha Wardiny, 2015

ANALISIS FILOGENETIK MOLEKULER BEBERAPA ANGGOTA SUKU SOLANACEAE INDONESIA DAN BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Sekuen DNA daerah ITS telah berhasil menunjukkan hubungan kekerabatan diantara marga-marga pada suku Solanaceae. Pohon filogenetik yang dibentuk oleh klaster maksimum parsimony membagi 17 sampel Solanaceae menjadi 7 kelompok berdasarkan supermarga. Adapun hubungan kekerabatan marga-marga Solanaceae dengan outgroup memiliki nilai dukungan bootstrap 100% sehingga dapat membuktikan bahwa Convolvulaceae merupakan sistergroup dari Solanaceae.

Physalis angulata dan Physalis peruviana memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan Withania somnifera. Hubungan kekerabatan tersebut didukung oleh beberapa penelitian sebelumnya berdasarkan sekuen DNA maupun ciri morfologi yang menunjukkan bahwa keduanya memiliki karakter serupa, yaitu kaliksnya yang persisten dan tumbuh membesar serta membungkus buah setelah terjadi fertilisasi. Hasil penelitian ini dapat dijadikan landasan awal untuk menjadikan P. angulata dan P. peruviana sebagai alternatif tumbuhan obat baru yang dapat diperoleh di Indonesia. B. Saran

Untuk penelitian selanjutnya diperlukan analisis yang melibatkan lebih banyak sampel, karena semakin banyak sampelnya, semakin besar pula peluang untuk memperoleh jenis-jenis tumbuhan yang benar-benar berkerabat dekat dengan nilai bootstrap yang tinggi. Selain itu, diperlukan analisis yang lebih mendalam mengenai kandungan senyawa pada P. angulata, P. peruviana, dan W. somnifera serta membandingkannya agar dapat digunakan

untuk mendukung hasil penelitian yang menjadikan Physalis sebagai alternatif tumbuhan obat selain W. somnifera.