Gen LEA dari Jagung Landrace Vietnam yang Dapat Meningkatkan Toleransi Kekeringan Jagung dan Tembakau Transgenik

REVIEW JURNAL

  

Gen LEA dari Jagung Landrace Vietnam yang Dapat

Meningkatkan Toleransi Kekeringan Jagung dan Tembakau

Transgenik

  

Oleh :

Wandy Murti Prasetya

P051180031

  

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA

  

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2018

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

  Late Embryogenesis Abundant (LEA) atau Protein embriogenesis lambat, sebagian besar adalah protein hidrofilik, yang dapat mengurangi kerusakan yang disebabkan oleh kondisi lingkungan yang parah. Protein LEA dilaporkan berkontribusi pada berbagai proses perkembangan dan menumpuk sebagai respons terhadap kekeringan, suhu rendah, stres garam, atau pengobatan dengan phytohormon ABA. LEA pertama dilaporkan dalam biji kapas. Protein LEA terakumulasi selama tahap akhir embriogenesis dan berhubungan dengan pengeringan biji embrio. Anggota-anggota kelompok protein LEA juga diekspresikan selama defisit air pada bakteri (Escherichia coli) dan ragi (Saccharomyces cerevisiae), menunjukkan peran protektif yang ada di mana-mana dari protein ini terhadap tekanan osmotic.

  Mengikuti klasifikasi Battaglia, protein LEA dikategorikan ke dalam tujuh kelompok berbeda. Protein LEA dari gugus 1, 2, 3, 4, 6, dan 7 adalah protein LEA hidrofilik atau tipikal, yang memiliki proporsi residu sistein dan triptofan yang rendah, dan residu glisin, asam glutamat, lisin, dan treonin yang tinggi. Sebaliknya, protein LEA kelompok 5 memiliki kandungan residu hidrofobik yang tinggi. Berdasarkan urutan asam amino dan motif yang dikonservasi, grup 5 LEA protein diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaitu 5A, 5B, dan 5C. Subkelompok 5C LEA protein ditandai oleh indeks ketidakstabilan yang rendah, proporsi rendah polar (hidrofilik) dan residu kecil, proporsi residu non-polar yang lebih tinggi, dan konformasi panas-tidak stabil. Selain itu, protein LEA 5C terlipat secara intrinsik dan memiliki lebih banyak β-sheet daripada α-heliks, yang juga berbeda dari kelompok

  5A dan 5B. Perbedaan-perbedaan dalam proporsi residu dan karakteristik fisik kelompok 5C dari kelompok protein LEA lainnya dapat merujuk ke fungsi alternatif yang melibatkan toleransi stres. Baru-baru ini, karena pengembangan teknologi sekuensing baru, seluruh urutan genom tanaman berharga seperti beras (Oryza sativa L.), jagung (Zea mays L.), dan kapas diterbitkan dan disediakan untuk para peneliti.Berdasarkan domain protein LEA yang dikonservasi, kelompok protein LEA dapat diidentifikasi dan dikarakterisasi melalui pendekatan prediksi seluruh genom. Dalam beras, 34 gen kandidat LEA (OsLEA) diidentifikasi melalui pencarian HMMER (http: //hmmer.janelia. Org /). Dengan menggunakan metode yang serupa, 242, 136, dan 142 kandidat daerah DNA yang mengkodekan untuk protein LEA diidentifikasi dalam tiga kapas dataran tinggi masing-masing yaitu Gossypium

  

hirsutum, G. arboreum, dan G. raimondii. Profil protein LEA jagung juga dilaporkan

dengan 32 gen LEA didistribusikan secara non-acak di seluruh kromosom.

  Akumulasi profil LEA di berbagai pabrik memberikan pengetahuan dasar untuk analisis fungsional dan rekayasa gen LEA di masa depan.

  Sejumlah kecil protein LEA grup 5C telah dikarakterisasi, tetapi karakteristik fisik dan fungsi biologis mereka sebagian besar tidak diketahui. Beberapa anggota kelompok 5C diidentifikasi pada tanaman lain seperti kapas LEA14A, kedelai D95- 4, tomat ER5, cabai CaLEA6, Arabidopsis AtLEA14A, kentang manis IbLEA14A, OSLEA5 beras, millet bulu rubah SiLEA14A, dan LEA kacang liar. Ekspresi protein LEA 5C diregulasi oleh ABA dan beberapa tekanan abiotik termasuk garam dan kekeringan. Studi fungsional protein kelompok 5C menunjukkan bahwa ekspresi berlebih dari protein CaLEA6, yang berasal dari cabai (Capsicum annuum), dapat meningkatkan kekeringan dan toleransi garam secara signifikan dalam tembakau. Selain itu, ekspresi berlebih dari gen LEA14A lainnya seperti IbLEA14A dan SiLEA14A secara luar biasa meningkatkan tingkat lignifikasi, prolin bebas, dan gula larut dalam kalus ubi transgenik (Ipomoea batatas), Arabidopsis, dan milltail rubah (Setaria italica). OsLEA5 rekombinasi dalam E. coli dapat melindungi dehydrogenase laktat dari kesalahan lipatan di bawah tekanan abiotik yang berbeda, menghasilkan toleransi stress.

  Jagung (Zea mays L.) adalah tanaman monokotil penting di seluruh dunia; produksinya lebih dari 1,06 miliar ton pada 2016. Kekeringan adalah faktor utama yang menyebabkan kerugian signifikan dalam produktivitas jagung. Pengurangan air sebesar 40% dapat menurunkan produksi jagung sebesar 39,3%. Baru-baru ini, kelompok protein LEA yang diprediksi pada jagung telah dilaporkan melalui pendekatan bioinformatik dan praktis. Gen LEA jagung diduga terletak di kromosom 8 yang mengandung domain Pfam LEA_2; Namun dijelaskan, fungsi gen ini dalam melindungi tanaman terhadap stres osmotik masih belum diketahui. Dalam penelitian ini, gen LEA diduga diisolasi dari landrace Tevang 1, yang ditunjuk sebagai ZmLEA14tv dan dikloning menjadi T-DNA untuk ekspresi pada tanaman. Pola ekspresi ZmLEA14tv transgenik dalam model tembakau dan jagung diselidiki untuk menentukan pentingnya gen ini dalam meningkatkan toleransi kekeringan pada tanaman tertentu. Berdasarkan uraian, artikel ini memuat tentang bagaimana meningkatkan toleransi tanaman jagung dan tembakau terhadap kekeringan menggunakan gen LEA.

  B. Rumusan Masalah

  Permasalahan yang dapat ditarik dari artikel ini adalah bagaimana respon tanaman jagung dan tembakau dalam mengekspresikan gen LEA (ZmLEA14tv) dalam kondisi kekeringan?

  C. Tujuan Penulisan

  Tujuan penulisan yang termuat dalam artikel adalah respon tanaman jagung dan tembakau dalam mengekspresikan gen LEA (ZmLEA14tv) dalam kondisi kekeringan.

II. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi dan Konstruksi Vektor Gen ZmLEA14tv

  Urutan pengkodean LEA diduga dari landrace jagung asli Tevang 1 (Z. mays cv. Tevang 1) diisolasi dan diberi nama ZmLEA14tv. ZmLEA14tv yang diisolasi memiliki ukuran 693 pasangan basa (bp) dengan kerangka pembacaan terbuka 459 bp dalam pengkodean panjang untuk protein 152 asam amino (aa) yang dideduksi. Analisis sekuens menunjukkan kemiripan tertinggi pada 99% dengan urutan pengkodean LEA14A Z. mays (nomor tambahan NM_001159174), diikuti oleh LEA14A dari Shorgum bicolor (XM_002454858.2) dan gen mirip S.Aalica dari LEA14A (93% dan 87%, masing-masing). Perbandingan dengan nomor urut referensi NM_001159174 di GenBank menunjukkan dua variasi, G381A dan C456T; Namun, urutan asam amino yang disimpulkan tidak berubah. Protein diduga diperkirakan pada 15,96 kDa dalam berat molekul dengan pI 6.08. Proteinnya kaya akan Val (12,6%), Leu (11,3%), dan Gly (9,2%), tetapi mengandung Trp dalam jumlah rendah (0,7%), Asn (1,3%), Cys (0,7%), dan Gln (1,3%). GRAVY dan indeks instabilitas ZMLEA14tv yang diduga masing-masing adalah 0,047 dan 16,01, menunjukkan stabilitas dan sifat hidrofobik. Motif “LEA_2” yang dikonservasi (PF03186), yang diklasifikasikan ke dalam subkelompok 5C menurut klasifikasi protein LEA Battaglia, ditemukan pada ZmLEA14tv melalui pencarian InterProScan. Analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa ZmLEA14tv mengandung persentase rendah asam amino polar (23,02%) dan residu hidrofobik yang tinggi (47,02%). Protein ZmLEA14tv menampilkan beragam homologi dengan protein LEA grup 5C lainnya dan secara luas mencocokkan segmen serupa dalam protein LEA terkait, menunjukkan hubungan evolusi yang erat antara protein-protein ini (Gambar

  1 A, B). Analisis filogenetik

  juga menunjukkan bahwa protein ZmLEA14tv memiliki hubungan paling dekat dengan protein LEA14A jagung (nomor tambahan NM_001159174), diikuti oleh protein mirip-LEA dari beras, yaitu Os01g0225600 (nomor tambahan NM_001048996), didukung oleh nilai bootstrap tinggi (99% dan 95%, masing- masing).

  Gambar 1. (A) Penyelarasan beberapa urutan ZmLEA14tv dengan homolognya (protein kelompok 5 LEA) dari berbagai spesies tanaman. Posisi yang dikonservasi ditandai sebagai bintang.

  

Gambar 1 (B).Pohon filogenetik yang bergabung dengan sejenis dari ZmLEA14tv dan homolognya. Clude ditandai dengan

monocot dan dicot. ZmLEA14tv di Z. mays cv. Cabang Tevang 1 diberi tanda lingkaran hitam tebal. Nomor aksesi GenBank

adalah sebagai berikut: SiLEA14 (S. italic, KJ767551), AtLEA14 (Arabidopsis thaliana, NM100029), Lea14-A (Z. mays,

NM001159174), D95-4 (Glycine max, U08108), IbLEA14 (Ipoma batata , GU369820), ER5 (Solanum lycopersicum, U77719),

Lemmi9 (S. lycopersicum, Z46654), CaLEA6 (Capsicum annuum, AF168168), OsLEA5 (Oryza sativa, JF776156), pcC27-45

(Craterostra) communis, AF386513), At1g01470 (A. thaliana, BT015111), D95-4 (G. maks, U08108), At2g46140 (A. thaliana,

NM130176), Os01g0225600 (O. sativa, NM001048996), LEA14-A-like (Brach distachyon, XM003567779), mirip BdLEA14

(B. distachyon, XM003567779), LOC100274480 (Z. mays, NM001148839), SORBIDRAFT (Sorghum bicolour,

  

XM002441543), protein seperti-LEA (Cench, Ojika, aga, aik, aga, Amerika) CM000130), Os05g0526700 (O. sativa,

NM001062639), Os05g0584300 (O. sativa, NM001062985), At2g44060 (A. thaliana, BT024723), LOC100285131 (Z. mays,

EU970969 dan um) M001155750).

  Ekspresi Gen ZmLEA14tv pada Resistensi Kekeringan untuk Tembakau B. Transgenik

  Untuk mengevaluasi fungsi struktur transgenik ZmLEA14tv dalam toleransi osmotik tanaman, tanaman tembakau transgenik yang mengekspresikan ZmLEA14tv di bawah kendali promotor CaMV 35S dipilih untuk analisis lebih lanjut (Gambar 3A). Tiga puluh tanaman transgenik diperoleh, dan tiga garis transgenik T3 homozigot (LEAtv-L1, LEAtv-L3, LEAtv-L7) dengan tingkat ekspresi ZmLEA14tv yang tinggi (Gambar

  2 B) dipilih untuk penyelidikan lebih

  lanjut.Untuk menyelidiki toleransi kekeringan tembakau transgenik, bibit kembali dan ditanam selama tiga hari. Dalam kondisi normal dan kekeringan, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam fitur morfologi seperti tinggi, berat, dan permukaan daun antara tanaman transgenik dan non-transgenik tipe liar (WT). Daun tanaman transgenik dan kontrol menjadi melengkung dan layu setelah 15 hari kekeringan. Namun, 100% tembakau transgenik dipulihkan setelah penyiraman ulang selama tiga hari, tidak seperti pada kontrol (Gambar

  2 C).

  Pemulihan tercepat diamati pada LEAtv-L1, yang juga menyatakan level tertinggi dari transgen ZmLEA14tv. Hasil ini menunjukkan korelasi antara ekspresi ZmLEA14tv dan kemampuan pemulihan tanaman setelah kondisi kekeringan.

  

Gambar 2. Ekspresi ZmLEA14tv dalam tembakau (Nicotiana tabacum). (A) Skema

  deskripsi T-DNA dalam plasmid pCAMBIA1300/ZmLEA14tv untuk ekspresi ZmLEA14tv

  

pada tanaman. LB: batas T-DNA kiri; RB: batas T-DNA kanan; HygR: gen yang tahan

terhadap Hygromycin; CaMV35S pro: Promotor kembang kol mosaik virus 35S; 35S ter:

terminator 35S; ZmLEA14A: wilayah pengkodean gen ZmLEA14tv; NcoI, NotI, dan HindIII:

masing-masing situs pembatasan NcoI, NotI và HindIII. (B) Analisis RT-PCR dari

ZmLEA14tv dalam jalur tembakau transgenik (LEAtv-L1, LEAtv-L3, LEAtv-L7). WT: tipe

liar digunakan sebagai kontrol. (C) Fenotipe eksplan tembakau transgenik dan WT dalam

kondisi tekanan normal dan kekeringan .

C. Jagung Transgenik dengan gen ZmLEA14tv dalam Toleransi Kekeringan

  Integrasi ZmLEA14tv dikonfirmasi oleh PCR genomik menggunakan pasangan set primer khusus untuk daerah promotor Hpt dan 35S, masing-masing. RT-PCR dan qRT-PCR dari ZmLEA14tv dilakukan untuk memvalidasi ekspresi struktur transgenik dari garis jagung transgenik T2. Tiga baris T2, yaitu L1453, L1482, dan L1510, menunjukkan tingkat ekspresi tertinggi (2,7-, 9,2-, dan 5,8 kali lipat lebih tinggi daripada kontrol, masing-masing) dan biji T2 dari jalur yang disiram ulang ini digunakan untuk analisis lebih lanjut (Gambar 3A, B).

  Toleransi kekeringan benih jagung transgenik selama perkecambahan diperiksa. Ketika berkecambah dalam air selama delapan hari, garis transgenik sebagai bahan regenerasi. Dalam kondisi normal (H O), tidak ada perbedaan

  2 signifikan dalam tinggi tunas yang diamati antara garis transgenik dan yang WT.

  Namun, panjang akar dari garis L1510 dan L1482, yang memiliki akumulasi ZmLEA14tv lebih tinggi, secara signifikan lebih tinggi daripada tipe liar. Dibandingkan dengan kelompok kontrol dalam air, perkecambahan WT dan garis transgenik sangat ditekan di bawah tekanan PEG 10% dan 20% (Gambar 3C). Tidak ada benih percobaan yang bisa berkecambah dalam 20% PEG. Namun, perkecambahan yang lebih baik dan perkembangan selanjutnya diamati dengan biji L1510 dan L1482, yang memiliki ekspresi ZmLEA14tv yang lebih tinggi pada PEG 10% daripada jenis liar (Gambar 3D)

  

Gambar 3. Ekspresi ZmLEA14tv di jagung (Z. mays). (A,B) Ekspresi ZmLEA14tv dalam tiga baris jagung

transgenik T2 (L1453, L1482, dan L1510) ditentukan oleh RT-PCR (A) dan qRT-PCR (B). (B) menunjukkan

kesalahan rata-rata dan standar untuk tiga ulangan biologis. (C) Fenotip jagung transgenik dan WT di bawah

berbagai perlakuan stres abiotik selama tahap perkecambahan. T2 dari benih transgenik direndam dalam air

(sebagai kontrol) atau dalam 10% PEG, solusi PEG 20% untuk simulasi kekeringan selama satu hari pada suhu

_o

  

30 C dan kemudian ditempatkan pada kertas saring dalam kotak plastik yang dibasahi dengan solusi yang sama

yang disebutkan di atas untuk delapan hari. Setiap percobaan diulang tiga kali. (D,E) Panjang akar dan pucuk

jagung transgenik dan tipe liar berkecambah di bawah kontrol (H ^{2 O) dan kondisi simulasi kekeringan (10% PEG} dan 20% PEG). Signifikansi statistik ditentukan oleh uji-t Student. * p <0,05; ** p <0,01.

  Selanjutnya, toleransi kekeringan bibit jagung transgenik di tanah diperiksa (Gambar 4B-E). Tidak ada perbedaan signifikan dalam tingkat kelangsungan hidup dan berat segar yang diamati antara tanaman transgenik dan WT di bawah kondisi air yang baik (H O Namun, setelah stres kekeringan selama 14 hari dan penyiraman 2 ). kembali, hanya 40% bibit WT dapat dipulihkan, sementara rasio ini dalam garis transgenik (LEAtv-L1 dan LEAtv-L2) hampir dua kali lipat (masing-masing 87% dan 80%) (Gambar 4C). Selain itu, bobot batang segar dan bobot akar segar dari garis transgenik secara signifikan lebih tinggi daripada tipe liar K7, menunjukkan tingkat pertumbuhan yang lebih baik dari garis ini dalam kondisi kekeringan

  (Gambar 4D, E). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa gen ZmLEA14tv menunjukkan peningkatan ketahanan terhadap kekeringan pada jagung transgenik.

  

Gambar 4. Toleransi kekeringan bibit jagung yang diekspresikan secara berlebihan

ZmLEA14tv. (A) Analisis RT-PCR dari ekspresi ZmLEA14tv dalam garis jagung

transgenik (LEAtv-L1, LEAtv-L2). (B) Fenotip benih jagung transgenik dan WT dalam

kondisi cekaman kekeringan dan penyiraman ulang. Bibit jagung lima daun tahap

penyiraman ditahan selama 14 hari, diikuti oleh penyiraman ulang tiga hari. Setidaknya

lima bibit ditanam di setiap plot dan percobaan direplikasi tiga kali. WT: tipe liar. (C-E)

Tingkat kelangsungan hidup, berat batang segar, dan bobot akar segar dari WT dan

semai jagung transgenik setelah kekeringan dan penyiraman ulang. Setiap percobaan

diulang tiga kali. Signifikansi statistik ditentukan oleh uji-t Student. * p <0,05, ** p

<0,01, *** p <0,001.

D. Hasil Diskusi

  Identifikasi dan karakterisasi ZmLEA14tv, anggota LEA atipikal yang diduga kelompok 5C dari kultivar jagung Tevang 1, dilaporkan dalam penelitian ini. Urutan asam amino yang disimpulkan dari ZmLEA14tv memiliki karakteristik protein LEA

  5C yang mengandung domain "LEA_2" (Pfam cluster PF03168). Protein LEA kandungan glisin (Gly) lebih dari 6%. Protein LEA tipikal dapat menahan air. dan melindungi protein larut lainnya dari agregasi karena sifat hidrofiliknya yang sangat tinggi. Protein LEA Grup 5C memiliki proporsi residu hidrofobik yang lebih tinggi daripada protein LEA tipikal; Namun, mereka juga terlibat dalam berbagai jenis toleransi stres. Perkiraan indeks GRAVY ZmLEA14tv adalah 0,047, jauh lebih rendah dari protein LEA tipikal. Urutan protein ZmLEA14tv yang disimpulkan dari DNA yang diisolasi menunjukkan domain "LEA_2" yang merupakan karakteristik protein LEA 5C dan tingkat homologi yang tinggi dengan anggota 5C lainnya.

  Analisis fungsional protein 5C LEA menunjukkan bahwa mekanisme molekuler dari kemampuan perlindungan terhadap stres pengeringan sangat beragam. Ekspresi berlebih dari AdLEA, protein LEC 5C dari kacang tanah, dapat membantu menjaga efisiensi fotosintesis, mengurangi tingkat ROS, dan menginduksi ekspresi beberapa gen yang responsif kekeringan pada tembakau transgenik .

III. PENUTUP A. Kesimpulan

  Berdasarkan hasil dan pembahasan tersebut di atas, dapat disimpulkan bahwa: Secara ringkas, wilayah pengkodean ZmLEA14tv diisolasi dari Z. mays cv. Tevang 1 dan kemudian dikloning secara berlebih ke dalam casette. Gen ini mengkodekan protein tereduksi hidrofobik yang memiliki kesamaan tinggi dalam struktur dan hubungan yang erat dengan protein LEA 5C lainnya. Selain itu, ekspresi ZmLEA14tv pada tanaman model dikotil seperti tembakau secara signifikan meningkatkan kemampuan pemulihan, sedangkan peningkatan jagung transgenik ZmLEA14tv menunjukkan perkecambahan dan pertumbuhan yang lebih baik dalam kondisi simulasi kekeringan. Hasil ini menunjukkan bahwa ZmLEA14tv dapat bertindak sebagai kandidat potensial untuk rekayasa genetika untuk meningkatkan kekeringan dan toleransi stres osmotik lainnya.

B. Saran

  Penulis berharap makalah ini dapat dijadikan sebagai bahan pembelajaran serta dapat menambahwawasan setiap pembaca mengenai metabolit sekunder tanaman khusunsnya terpenoid.

DAFTAR PUSTAKA

  

Kontribusi Penulis: NVH dan HTTH menyusun dan merancang eksperimen; BMM, NTL,

  HHH, dan NXT melakukan percobaan; BMM, LTTH, dan HTTH menganalisis data; BMM, NVH, dan HTTH menyiapkan naskah itu.

  

Pendanaan: Penelitian ini didanai oleh Kementerian Pertanian dan Pembangunan Pedesaan

(MARD) Vietnam nomor 16HĐ / KHCN-VP untuk periode 2014–2018.

Ucapan Terima Kasih: Penulis berterima kasih kepada Doan Thi Bich Thao dan Nguyen

Thu Hoai karena berpartisipasi dalam beberapa percobaan rumah kaca.

  Konflik Kepentingan: Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

  1. Chandler, P.M.; Robertson, M. Gene expression regulated by abscisic acid and its relation to stress tolerance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994, 45, 113– 141. [CrossRef]

  2. Li, X.; Cao, J. Late Embryogenesis Abundant (LEA) gene family in maize: Identification, evolution, and expression profiles. Plant Mol. Biol. Rep. 2016, 34, 15– 28. [CrossRef]

  3. Galau, G.A.; Wang, H.Y.; Hughes, D.W. Cotton Lea5 and Lea14 encode atypical late embryogenesis-abundant proteins. Plant Physiol. 1993, 101, 695–696. [CrossRef]

  4. Maitra, N.; Cushman, J.C. Isolation and characterization of a drought-induced soybean cDNA encoding a D95 family late-embryogenesis-abundant protein. Plant Physiol. 1994, 106, 805–806. [CrossRef] [PubMed]

  5. Zegzouti, H.; Jones, B.; Marty, C.; Lelievre, J.M.; Latche, A.; Pech, J.C.; Bouzayen, M. ER5, a tomato Dja encoding an ethylene-responsive LEA-like protein: Characterization and expression in response to drought,ABA and wounding. Plant Mol. Biol. 1997, 35, 847–854. [CrossRef] [PubMed]

  6. Hong-Bo, S.; Zong-Suo, L.; Ming-An, S. LEA proteins in higher plants: Structure, function, gene expressionand regulation. Colloids Surf. B Biointerfaces 2005, 45, 131–135. [CrossRef] [PubMed]

  7. Kimura, M.; Yamamoto Yoshiharu, Y.; Seki, M.; Sakurai, T.; Sato, M.; Abe, T.; Yoshida, S.; Manabe, K.; Shinozaki, K.; Matsui, M. Identification of arabidopsis genes regulated by high light–stress using Dja microarray. Photochem. Photobiol.

  2007, 77, 226–233.

  8. Tunnacliffe, A.; Wise, M.J. The continuing conundrum of the LEA proteins.

  Naturwissenschaften 2007, 94, 791–812. [CrossRef]

  9. Baker, J.; Van Dennsteele, C.; Dure, L. Sequence and characterization of 6 LEA proteins and their genes krom cotton. Plant Mol. Biol. 1988, 11, 277–291. [CrossRef] [PubMed]

  10. Dure, L.; Galau, G.A. Developmental Biochemistry of Cottonseed Embryogenesis and Germination. Plant Physiol. 1981, 68, 187–194. [CrossRef] [PubMed]

  11. Oliveira, E.; Amara, I.; Bellido, D.; Odena, M.A.; Dominguez, E.; Pages, M.; Goday,

  A. LC-MSMS identification of Arabidopsis thaliana heat-stable seed proteins: Enriching for LEA-type proteins by Acid treatment. J. Mass Spectrom. 2007, 42, 1485–1495. [CrossRef] [PubMed]

  12. Hundertmark, M.; Hincha, D.K. LEA (Late Embryogenesis Abundant) proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana. BMC Genom. 2008, 9, 118–139.

  [CrossRef] [PubMed] 13. Garay-Arroyo, A.; Colmenero-Flores, J.M.; Garciarrubio, A.; Covarrubias, A.A. Highly hydrophilic protein in prokaryotes and eukaryotes are common during conditions of water deficit. J. Biol. Chem. 2000, 275, 5668–5674. [CrossRef] [PubMed]

  14. Yale, J.; Bohnert, H.J. Transcript expression in Saccharomyces cerevisiae at high salinity. J. Biol. Chem. 2001, 276, 15996–16007. [CrossRef]

  15. Battaglia, M.; Olvera-Carrillo, Y.; Garciarrubio, A.; Campos, F.; Covarrubias, A.A.

  The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 2008, 148, 6–24. [CrossRef] [PubMed]

  16. Wolkers, W.F.; McCready, S.; Brandt, W.F.; Lindsey, G.G.; Hoekstra, F.A. Isolation and characterization of a D-7 LEA protein from pollen that stabilizes glasses in vitro.

  Biochim. Biophys. Acta Protein Struct. Mol. Enzymol. 2001, 1544, 196–206. [CrossRef]

  17. Wang, M.; Li, P.; Li, C.; Pan, Y.; Jiang, X.; Zhu, D.; Zhao, Q.; Yu, J. SiLEA14, a novel atypical LEA protein, confers abiotic stress resistance in foxtail millet. BMC Plant Biol. 2014, 14, 290–305. [CrossRef] [PubMed] 18. Li, X.; Wu, L.; Wang, J.; Sun, J.; Xia, X.; Geng, X.; Wang, X.; Xu, Z.; Xu, Q.

  Genome sequencing of Ice subspecies and genetic analysis of recombinant lines reveals regional yield- and quality-associated loci. BMC Biol. 2018, 16, 102. [CrossRef] [PubMed]

  19. Hirsch, C.N.; Hirsch, C.D.; Brohammer, A.B.; Bowman, M.J.; Soifer, I.; Barad, O.; Shem-Tov, D.; Baruch, K.; Lu, F.; Hernandez, A.G.; et al. Draft assembly of elite inbred line ph207 provides insights into genomic and transcriptome diversity in maize. Plant Cell 2016, 28, 2700–2714. [CrossRef] [PubMed]

  20. Li, F.; Fan, G.; Lu, C.; Xiao, G.; Zou, C.; Kohel, R.J.; Ma, Z.; Shang, H.; Ma, X.; Wu, J.; et al. Genome sequence of cultivated Upland cotton (Gossypium hirsutum TM-1) provides insights into genome evolution. Nat. Biotechnol. 2015, 33, 524–530. [CrossRef] [PubMed]

  21. Wang, X.S.; Zhu, H.B.; Jin, G.L.; Liu, H.L.; Wu, W.R.; Zhu, J. Genome-scale identification and analysis of LEA genes in rice (Oryza sativa L.). Plant Sci. 2007, 172, 414–420. [CrossRef]

  22. Magwanga, R.O.; Lu, P.; Kirungu, J.N.; Lu, H.; Wang, X.; Cai, X.; Zhou, Z.; Zhang, Z.; Salih, H.; Wang, K.; et al. Characterization of the late embryogenesis abundant (LEA) proteins family and their role in drought stress tolerance in upland cotton.

  BMC Genet. 2018, 19, 6–37. [CrossRef] [PubMed]

  23. Kim, H.S.; Lee, J.H.; Kim, J.J.; Kim, C.H.; Jun, S.S.; Hong, Y.N. Molecular and functional characterization ofCaLEA6, the gene for a hydrophobic LEA protein from Capsicum annuum. Gene 2005, 344, 115–123. [CrossRef][PubMed] 24. Park, S.C.; Kim, Y.H.; Jeong, J.C.; Kim, C.Y.; Lee, H.S.; Bang, J.W.; Kwak, S.S.

  Sweetpotato late embryogenesisabundant 14 (IbLEA14) gene influences lignification and increases osmotic- and salt stress-tolerance oftransgenic calli. Planta 2011, 233, 621–634. [CrossRef] [PubMed]

  25. He, S.; Tan, L.; Hu, Z.; Chen, G.; Wang, G.; Hu, T. Molecular characterization and functional analysis byheterologous expression in E. coli under diverse abiotic stresses for OsLEA5, the atypical hydrophobic LEAprotein from Oryza sativa L. Mol. Genet. Genom. 2012, 287, 39–54. [CrossRef]

  26. Sharma, A.; Kumar, D.; Kumar, S.; Rampuria, S.; Reddy, A.R.; Kirti, P.B. Ectopic expression of an atypicalhydrophobic group 5 LEA protein from wild peanut, Arachis diogoi confers abiotic stress tolerance in tobacco.PLoS ONE 2016, 11, e0150609. [CrossRef]

  27. FAOSTAT. 2017. Available online:http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC(accessed on 6 December 2018).

  28. Daryanto, S.; Wang, L.; Jacinthe, P.A. Global synthesis of drought effects on maize and wheat production.PLoS ONE 2016, 11, e0156362. [CrossRef] [PubMed]

  29. Liu, Y.; Wang, L.; Xing, X.; Sun, L.; Pan, J.; Kong, X.; Zhang, M.; Li, D. ZmLEA3, a multifunctional group 3LEA protein from maize (Zea mays L.), is involved in biotic and abiotic stresses. Plant Cell Physiol. 2013, 54,944–959. [CrossRef]

  30. Topping, J.F. Tobacco transformation. In Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance;Foster, G.D., Taylor, S.C., Eds.; Humana Press: Totowa, NJ, USA, 1998; pp. 365–372.

  31. Frame, B.; Main, M.; Schick, R.; Wang, K. Genetic transformation using maize immature zygotic embryos.In Plant Embryo Culture: Methods and Protocols; Thorpe, T.A., Yeung, E.C., Eds.; Humana Press: Totowa, NJ,USA, 2011; pp. 327–341. Agronomi 2019, 9, 62

  11 dari 12

  32. Tamura, K.; Filipski, A.; Peterson, D.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2725–2729.

  [CrossRef]

  33. Goyal, K.; Walton, L.J.; Tunnacliffe, A. LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress.Biochem. J. 2005, 388, 151–157. [CrossRef]

  34. Kumar, M.; Choi, J.; An, G.; Kim, S.R. Ectopic expression of OsSta2 enhances salt stress tolerance in rice.Front. Plant Sci. 2017, 8, 316. [CrossRef] [PubMed]

  35. Kumar, M.; Lee, S.C.; Kim, J.Y.; Kim, S.J.; Aye, S.S.; Kim, S.R. Over-expression of dehydrin gene,OsDhn1, improves drought and salt stress tolerance through scavenging of reactive oxygen species inrice (Oryza sativa L.). J. Plant Biol. 2014, 57, 383–393. [CrossRef]