PENGARUHLAJU ALIR DAN TEKANAN TERHADAP WAKTU RETENSI PADA HPLC

  PENGARUHLAJU ALIR DAN TEKANAN TERHADAP WAKTU RETENSI PADA HPLC Skripsi Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains Jurusan Fisika Oleh: Maria Fransiska Putriyani NIM : 073214002 PROGRAM STUDI FISIKA JURUSAN FISIKA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2011

  

THE INFLUENCE OFFLOW RATE ANDPRESSURE FORRETENTION

TIMEIN HPLC

A THESIS

Presented as Partial Fulfillment of the Requirement

to Obtain the Sarjana Science

in Physics Department

by:

Maria Fransiska Putriyani

  

NIM : 073214002

PHYSICS STUDY PROGRAM

PHYSICS DEPARTMENT

FACULTY OF SCIENCE DAN TECHNOLOGY

SANATA DHARMA UNIVERSITY

YOGYAKARTA

  

P esi m i st i s t a k l ebi h d a r i si k a p t a k a bu r m en d a h u l u i

n a si b.P a d a h a l k i t a t a k k a n p er n a h m en d a h u l u i n a si b.

  (A n d r ea H i r a t a – Sa n g P em i m p i )

  

Ev er y t h i n g i s si m p l er t h a n ca n be i m a gi n ed ,

y et m or e i n t r i ca t e t h a n ca n be com p r eh en d ed .

  (Goet h e, M a x i m en ) Sa y a p er sem ba h k a n k a r y a i n i k ep a d a : P a p a & M a m a k u t er ci n t a d a n

  A d i k k u t er sa y a n g

  

ABSTRAK

PENGARUH LAJU ALIR DAN TEKANAN TERHADAP WAKTU

RETENSI PADA HPLC

  HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan suatu teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan komponen tertentu dalam suatu campuran. Proses Pemisahan pada HPLC merupakan hasil dari interaksi molekul

• – molekul sampel dengan fase diam. Molekul – molekul yang terpisah dapat diidentifikasi berdasarkan waktu retensinya.

  Dalam penelitian ini, telah dilakukan pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dengan memvariasi laju alir dan tekanan. Nilai laju alir dan tekanan yang bervariasi mempengaruhi nilai waktu retensi yang dihasilkan.Semakin tinggi laju alir dan tekanannya, waktu retensinya semakin singkat. Pada kondisi laju alir, tekanan dan kolom yang sama, waktu retensi yang dihasilkan berbeda untuk tiap molekul. Waktu retensi yang berbeda menunjukkan bahwa Parasetamol dan Kafein terpisah.

  

ABSTRACT

THE INFLUENCE OF FLOW RATE ANDPRESSURE FOR RETENTION

TIME IN HPLC

  HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) is a chromatographic technique that can separate a mixture of compounds. Chromatographic separation in HPLC is the result of specific interactions between sample molecules with the stationary phase. Molecules that have been separated can be identified by their retention time.

  In this research, the retention time measurement of Paracetamol and Caffeine was conducted by varying the flow rate and pressure. The flow rate and pressure that have variation, influenced the retention time. When the flow rate and pressure get higher, the retention time will get shorter. At the same condition of flow rate, pressure, and column, the retention time is different for each molecule.

  The different retention time show that Paracetamol and Caffeine have been separated.

  

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL …………………………………………………………… i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………………………iii HALAMAN PENGESAHAN …………………………………………………...iv HALAMAN MOTTO …………………………………………………………… v HALAMAN PERSEMBAHAN ………………………………………………... vi HALAMAN PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………. vii LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

  ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS …………………………… viii ABSTRAK ……………………………………………………………………… ix ABSTRACT …………………………………………………………………….. x KATA PENGANTAR ………………………………………………………….. xi DAFTAR ISI …………………………………………………………………...xiii DAFTAR TABEL ……………………………………………………………....xvi DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………......xvii

  BAB I PENDAHULUAN ………………………………………………………...1 A. Latar Belakang …………………………………………………………....1 B. Rumusan Masalah ……………………………………………………….. 4 C. Batasan Masalah ………………………………………………………….4 D. Tujuan Penelitian …………………………………………………………4 E. Manfaat Penelitian ………………………………………………………. 4 F. Sistematika Penulisan …………………………………………………….5 BAB II DASAR TEORI ………………………………………………………….6 A. Pengukuran ……………………………………………………………….6 B. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) …………………………8 BAB III EKSPERIMEN ………………………………………………………...15 A. Tempat Penelitian ……………………………………………………….15 B. Alat dan Bahan …………………………………………………………. 15

  1. Alat – alat ……………………………………………………………15

  2. Bahan ………………………………………………………………..17

  C. Metode Eksperimen ……………………………………………………..18

  1. Penyiapan fase gerak ………………………………………………...18

  2. Penyiapan sampel ……………………………………………………18

  3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul ……………19

  4. Pengukuran waktu retensimolekulParasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu………………………………..20

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………..21 A. Hasil ……………………………………………………………………. 21

  1. Penyiapan fase gerak ……………………………………………….. 23

  2. Penyiapan sampel ……………………………………………………23

  3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul…………….24

  4. Pengukuran waktu retensimolekulParasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu……………………………......27

  B. Pembahasan …………………………………………………………….. 34

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………… 46 A. Kesimpulan ……………………………………………………………...46 B. Saran ……………………………………………………………………. 46 DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………………...47 LAMPIRAN ……………………………………………………………………. 48

  

DAFTAR TABEL

  Halaman

Tabel 4.1 :Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk laju alir yang bervariasi pada tekanan sebesar 100 bar……………………………..30Tabel 4.2 : Nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein untuk tekanan yang bervariasi pada laju alir sebesar 1,45 ml/min………………………...31Tabel 4.3 : Tabel hubungan nilai waktu retensi (menit) Parasetamol terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar)…………………………...41Tabel 4.4 : Tabel hubungan nilai waktu retensi (menit) Kafein terhadap laju alir fase gerak (ml/min) dan tekanan (bar)………………………….........41

  

DAFTAR GAMBAR

  Halaman

Gambar 2.1. Skema HPLC………………...…………………………………….9Gambar 2.2. Proses pemisahan pada kolom…………………………………...10Gambar 2.3. Grafik pemisahan ………………………………………………..11Gambar 3.1. Skema rangkaian alat yang digunakan dalam eksperimen……….17Gambar 4.1. Grafik waktu retensi Parasetamol………………………………..26Gambar 4.2. Grafik waktu retensi Kafein……………………………………...26Gambar 4.3. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada laju alir 1 ml/min dan tekanan 100 bar……………………………………28Gambar 4.4. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada laju alir

  1,9 ml/min dan tekanan100 bar…………………………………..29

Gambar 4.5. Grafik hubungan antara t dan 1 / v pada tekanan 100 bar………32

  

R

Gambar 4.6. Grafik hubungan antara t dan P pada laju alir 1,45 ml/min…….33

  

R

Gambar 4.7. Grafik hubungan waktu retensi (menit) terhadap laju alir fase gerak

  (ml/min) dan tekanan (bar) untuk pengukuran Parasetamol pada panjang gelombang 263 nm dengan menggunakan kolom C-18 yang berukuran panjang 100mm diameter 4,6mm………………43

Gambar 4.8. Grafik hubungan waktu retensi (menit) terhadap laju alir fase gerak

  (ml/min) dan tekanan (bar) untuk pengukuran Parasetamol pada panjang gelombang 263 nm dengan menggunakan kolom C-18 yang berukuran panjang 100mm diameter 4,6mm………………43

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Dewasa ini teknologi semakin berkembang pesat. Seiring dengan

  perkembangannya, teknik – teknik yang digunakan dalam suatu penelitian juga mengalami perubahan pesat. Dalam suatu penelitian, seseorang harus memiliki pemahaman yang mendalam tentang prinsip – prinsip dan variabel - variabel fisika pada instrumen yang digunakan. Karena prinsip – prinsip dan variabel – variabel tersebut akan mempengaruhi hasil eksperimen. Sehingga untuk dapat melaksanakan suatu eksperimen dengan berhasil diperlukan pengetahuan tentang berbagai prinsip pengukuran dan instrumentasi [Holman dan Jasjfi, 1984].

  Dalam suatu pengukuran ada dua buah hal yang penting yaitu input dan output. Input dibedakan menjadi tiga bagian yang meliputi input yang diinginkan, input pengubah dan input pengganggu, sedangkan output dibedakan menjadi output pengganggu dan output yang diinginkan [Doebelin, 2004]. Nilai input akan berpengaruh terhadap hasil keluaran outputnya.

  Suatu pengukuran dikatakan baik jika tidak merubah medium yang diukur. Suatu medium yang berubah akan menyebabkan perubahan nilai besaran yang diukur dari nilai sebenarnya [Doebelin, 2004]. Selain perubahan medium yang diukur, munculnya gangguan pada instrumen pada saat pengukuran dapat membuat hasil pengukuran menjadi tidak akurat.

  Dalam suatu pengukuran dibutuhkan suatu instrumen atau alat ukur. Masing - masing instrumen memiliki karakteristik tersendiri. Oleh karena itu dalam suatu pengukuran, instrumen akan diperlakukan sedemikan rupa sehingga dapat menghasilkan pengukuran yang akurat.

  Instrumen yang digunakan dalam suatu pengukuran harus memenuhi persyaratan tertentu. Persyaratan tersebut adalah: sensitif, selektif, tidak mengganggu sampel yang diukur dan memiliki waktu tanggap cepat. Sensitif menunjukkan bahwa instrumen tersebut mampu mengukur input yang ada.

  Selektif menunjukkan bahwa instrumen tersebut mampu membedakan antara input yang satu dengan yang lain. Sedangkan tidak mengganggu sampel yang diukur berarti bahwa pengukuran yang dilakukan tidak merubah sampel dan waktu tanggap yang cepat berarti bahwa pengukuran langsung terjadi saat instrumen bersentuhan dengan sampel.

  Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran dua buah molekul tertentu. Dua buah molekul tersebut terkandung di dalam sebuah sampel. Sehingga untuk mengukur kedua buah molekul tersebut dibutuhkan suatu alat ukur yang mampu mengidentifikasi molekul – molekul yang terdapat dalam sebuah sampel. Mampu mengidentifikasi berarti mampu membedakan antara molekul yang satu dengan yang lain. Dengan kata lain, alat yang digunakan haruslah memiliki selektivitas tinggi. Ada beberapa alat yang memenuhi kriteria di atas, contohnya GC (GasChromatography), AAS (Atomic Absorption Spectrofotometer), HPLC (High

  ), dll. GC digunakan untuk mengidentifikasi zat

  Pressure Liquid Chromatography

• – zat yang mudah menguap, AAS digunakan untuk mengidentifikasi unsur –

unsur logam sedangkan HPLC digunakan untuk mengidentifikasi zat – zat secara luas serta zat – zat yang tidak mudah menguap. Jangkauan pengidentifikasian HPLC lebih luas dibandingkan dengan GC, karena GC hanya untuk zat – zat yang mudah menguap. Sehingga dalam penelitian ini dipilih HPLC sebagai alat ukur yang digunakan.

  HPLC merupakan kepanjangan dari High Pressure Liquid HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase Chromatography. geraknya dialirkan dengan cepat menggunakan bantuan tekanan dan hasilnya dideteksi oleh detektor [Willard, et. al., 1988]. Kromatografi merupakan teknik pemisahan, jadi HPLC berfungsi untuk memisahkan komponen – komponen tertentu yang terdapat dalam suatu campuran. Hasil dari pemisahan yang terjadi ditunjukkan berupa grafik puncak – puncak. Puncak – puncak tersebut menunjukkan molekul – molekul yang telah berhasil terpisah.

  Suatu proses pemisahan dikatakan baik jika waktu analisis yang dibutuhkan singkat serta daya pisahnya tinggi [Gritter, et. al., 1991]. Agar mendapatkan kondisi yang sensitif dan selektif dalam pemisahan maka faktor - faktor yang mempengaruhi pemisahan diteliti satu per satu. Contoh beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan yaitu laju alir fase gerak, tekanan, jenis fase gerak, parameter kolom, dll.

  Tulisan ini berisi tentang teori pengukuran, teori yang terkait dengan prinsip kerja HPLC, metode eksperimen, hasil eksperimen, analisa data dan kesimpulan. Juga disertakan lampiran untuk melengkapi semua uraian yang telah dituliskan.

  B. Rumusan Masalah

  Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, pokok permasalahan yang diangkat dalam skripsi ini dapat dirumuskan sebagai berikut :

  1. Bagaimana cara kerja HPLC dalam memisahkan molekul – molekul tertentu.

  2. Bagaimana hubungan antara laju alir fase gerak dan tekanan terhadap waktu retensi pada pemisahan molekul – molekul tertentu dalam suatu campuran.

  C. Batasan Masalah

  1. Pemisahan molekul Parasetamol dan Kafeindengan fase gerak Methanol menggunakan HPLC yang terdapat di Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, Universitas Sanata Dharma.

  D. Tujuan Penelitian 1. Dapat memahami cara kerja HPLC dalam memisahkan molekul – molekul.

  2. Mendapatkan hubungan antara laju alir, tekanan dan waktu retensi dalam proses pemisahan menggunakan HPLC untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik.

  E. Manfaat Penelitian

  1. Memberikan informasi mengenai penggunaan sistem HPLC dalam memisahkan molekul –molekul.

  2. Memberikan informasi tentang hubungan laju alir,tekanan dan waktu retensi dalam proses pemisahan menggunakan HPLC.

F. Sistematika Penulisan

  Penelitian ini akan dituliskan dengan sistematika sebagai berikut :

  BAB I Pendahuluan Bab ini berisi uraian tentang latar belakang masalah, rumusan masalah, batasan masalah, tujuan penelitian, manfaat penelitian, dan sistematika penulisan.

  BAB II Dasar Teori Bab ini berisi uraian tentang teori kromatografi, serta teori yang terkait dengan prinsip kerja HPLC secara keseluruhan yang berguna dalam penelitian yang dilakukan.

  BAB III Eksperimen Bab ini berisi uraian tentang tempat pelaksanaan penelitian, alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian, dan prosedur penelitian.

  BAB IV Hasil dan Pembahasan Bab ini berisi uraian tentang hasil dan pembahasan dari penelitian yang telah dilakukan. Bab V Penutup Bab ini berisi kesimpulan dan saran.

BAB II DASAR TEORI A. Pengukuran Pengukuran merupakan suatu kegiatan yang sering dilakukan sehari –

  hari.Pengukuran dilakukan untuk memberikan informasi dari suatu hal yang diukur dengan menggunakan sejumlah angka [Rangan, et. al., 1985].Angka tersebut menunjukkan nilai dari sesuatu yang diukur. Proses suatu pengukuran dapat dibedakan menjadi tiga bagian, yaitu memonitoring, mengkontrol, dan menganalisis [Doebelin, 2004]. Memonitoring meliputi mencatat atau merekam data, mengkontrol meliputi mengatur beberapa variabel yang berhubungan dengan pengukuran yang dilakukan, menganalisis meliputi menganalisa data yang telah didapatkan.

  Dalam suatu pengukuran terdapat dua hal yang penting, yaitu input dan output. Input dibedakan menjadi tiga bagian, yaitu input yang diinginkan, input pengubah, dan input pengganggu [Doebelin, 2004]. Input yang diinginkan merupakan masukan yang ingin diukur. Input pengubah merupakan masukan yang bisa menyebabkan perubahan dalam hubungan antara input dan output. Sedangkan input pengganggu merupakan masukan yang dapat mengganggu pengukuran.

  Pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat ukur atau karena itu dalam pengukuran setiap instrumen memiliki perlakuan yang berbeda – beda. Salah satu hal yang dapat menyebabkan pengukuran menjadi tidak akurat adalah kurangnya sensitivitas suatu instrumen. Sehingga untuk menghindari terjadinya pengukuran yang tidak akurat, ada beberapa persyaratan tentang instrumen yang akan digunakan. Instrumen yang akan digunakan sebaiknya memiliki persyaratan: sensitif, selektif, tidak mengganggu sampel yang diukur, dan waktu tanggap cepat.

  Suatu pengukuran dikatakan ideal bila tidak mengubah kondisi sampel yang diukur. Pengubahan kondisi sampel akan menyebabkan perubahan nilai besaran yang diukur dari nilai sebenarnya. Munculnya gangguan pada instrumen dan masukan yang mengganggu saat pengukuran, dapat membuat hasil pengukuran tidak akurat dan mengakibatkan timbulnya kesalahan. Untuk menghindari hal tersebut, gangguan harus dieliminasi [Doebelin,2004].

  Kesalahan yang terjadi dalam pengukuran bisa dibedakan menjadi dua, yaitu kesalahan sistematik dan kesalahan acak [Morris, 1996]. Kesalahan sistematik merupakan kesalahan yang terjadi secara tetap pada bagian yang sama, misalnya selalu menghasilkan nilai kesalahan yang sama. Kesalahan ini terjadi biasanya disebabkan oleh perubahan karakteristik instrumen. Sedangkan kesalahan acak merupakan kesalahan yang terjadi secara acak tidak menentu.

  Kesalahan ini biasanya terjadi karena adanya gangguan yang berasal dari luar.

  Salah satu usaha agar mendapatkan pengukuran yang akurat adalah dengan melakukan kalibrasi instrumen [Holman dan Jasjfi, 1984]. Kalibrasi merupakan suatu cara untuk mendapatkan hubungan antara input dan output dengan cara memvariasikan input yang akan diukur sedangkan input yang lain dibuat tetap. Instrumen juga berperan penting dalam usaha mendapatkan pengukuran yang akurat. Syarat suatu instrumen yang baik yaitu: sensitif, selektif, tidak mengganggu sampel yang diukur dan memiliki waktu tanggap cepat. Selektif berarti instrumen tersebut mampu mengidentifikasikan antara komponen yang satu dengan yang lain. Salah satu alat yang memiliki kriteria tersebut adalah HPLC.

B. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

  HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan dengan cepat menggunakan bantuan tekanan dan hasilnya dideteksi oleh detektor [Willard, et. al., 1988]. Secara umum HPLC digunakan untuk mencari besar konsentrasisuatu zat di dalam sampel. Disebut sebagai High karena pada HPLC digunakan tekanan tinggi

  Pressure Liquid Chromatography untuk memaksimalkan pemisahan antar molekul.

  Mekanisme pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam [Kuwana, 1980]. Molekul yang terlarut dalam fase gerak akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibandingkan molekul yang berikatan lemah. Oleh karena itu, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan dengan didasarkan pergerakan

  HPLC bekerja sebagai sebuah sistem yang terdiri dari beberapa komponen.Komponen – komponen dari HPLC ditunjukkan pada gambar (2.1), yang terdiri dari wadah fase gerak, pompa, tempat memasukkan sampel (injector port ), kolom, detektor, perekam dan penampil data.

  Perekam & penampil data injektor Pompa detektor kolom Fase gerak Penyuntikan sampel wadah pembuangan

Gambar 2.1. Skema HPLC

  Pada awalnya fase gerak dipompa masuk oleh pompa, melewati injector port, lalu dibawa menuju ke kolom kemudian diteruskan menuju detektor. Sampel disuntikkan melalui injektor, kemudian terlarutkan oleh fase gerak, yang kemudian dibawa ke dalam kolom dimana pemisahan berlangsung [Khopkar, 1990]. Pemisahan dapat terjadi karena molekul sampel tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh fase gerak. Hal ini tergantung pada sifat - sifat senyawa tersebut terhadap kedua fase ini. Setelah terpisah molekul – molekul tersebut bergerak menuju detektor untuk dideteksi satu per satu, lalu kemudian keluar menuju pembuangan.

  Contoh proses terjadinya pemisahan ditunjukkan pada gambar (2.2), misalnya ada molekul A dan B yang terdapat dalam suatu sampel, sampel tersebut dimasukkan ke dalam sistem. Kedua senyawa tersebut akan terdistribusi di antara fase gerak dan diamnya menurut sifat masing – masing. Komponen yang tertahan kuat akan berjalan lambat, sebaliknya yang tertahan lemah akan berjalan cepat. Karena perbedaan mobilitas inilah komponen – komponen sampel akan terpisah – pisah yang kemudian dapat dideteksi dan dianalisa dengan detektor.

Gambar 2.2. Proses pemisahan pada kolom

  Sampel yang terdiri dari molekul A dan B diinjeksikan pada saat t0, sampel mulai memasuki kolom lalu pada saat t1 sampel mulai terpisah. Pada saat t2 jarak antara molekul A dan molekul B mulai terlihat, molekul B bergerak lebih cepat dibandingkan dengan molekul A. Pada saat t3 molekul B telah sampai di detektor sedangkan molekul A masih berada di dalam kolom. Pasa saat t4 molekul A baru sampai di detektor. Hasil dari proses pemisahan tersebut akan berupa grafik dengan dua puncak yang ditunjukkan oleh gambar (2.3). Masing – masing puncak mewakili molekul tertentu.

  Ke luaran de te ktor Molekul A Molekul t3 w aktu t0 t1 t2 t4

Gambar 2.3. Grafik pemisahan

  Dilihat dari jenis fase gerak dan fase diamnya ada dua metode pemisahan pada HPLC, yaitu pemisahan fase normal dan pemisahan fase terbalik.

  Pada metode pemisahan fase normal, fase diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Sedangkan pada metode pemisahan fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar.

  Terjadinya pemisahan ditandai dengan didapatkannya waktu retensi yang berbeda antara molekul yang satu dengan yang lain. Dalam proses pemisahannya HPLC menggunakan laju alir dan tekanan tertentu. Untuk penelitian analitis pada HPLC, laju alirfase gerak yang digunakan berkisar antara 0.5 – 5 ml/min [Johnson dan Stevenson, 1991].Semakin rendah laju alirnya maka kemampuan untuk memisahkan komponen – komponen akan semakin tinggi serta menghemat penggunaan fase gerak dan waktu yang dibutuhkan untuk analisis akan semakin lama. Besar waktu retensi suatu molekul dipengaruhi oleh laju alir fase gerak, tekanan, parameter kolom serta sifat – sifat molekul itu sendiri.

  Kolom pada HPLC tersusun atas bagian - bagian penyusun kolom. Ketika ada suatu molekul tertentu yang melewati kolom maka terjadi interaksi antara molekul yang lewat dengan bagian – bagian penyusun kolom. Interaksi yang terjadi dipengaruhi oleh jenis kolom dan molekul yang lewat. Jika jenis kolomnya tetap maka besar waktu retensi bergantung pada molekul yang lewat.

  Besar waktu retensi satu jenis molekul yang melewati kolom pada suatu tekanan tertentu ditunjukkan oleh persamaan (2.1) di bawah ini [Willard, et. al., 1988].

  Dengan v = kecepatan linear fase gerak (ml/min) d = diameter kolom bagian dalam (µm)

  c

  ε = faktor porositas kolom L = panjang kolom (mm) t =waktu yang diperlukan oleh molekul untuk melewati kolom

  R

  (min) V = volume kolom

  col Waktu retensi (t ) berbanding lurus terhadap volum kolom (V ) serta

  R col

  faktor porositas kolom ( ε) dan berbanding terbalik terhadap kecepatan fase gerak

  (v). Kecepatan fase gerak (v) pada persamaan (2.1) dapat disebut juga sebagai jumlah volume fase gerak per satuan waktu.Besar volum kolom bergantung pada ukuran kolom.Besar faktor porositas kolom bergantung pada jenis kolom [Willard, et. al., 1988]. Laju alir berpengaruh terhadap waktu retensi, untuk laju alir yang tinggi akan didapatkan waktu retensi yang singkat sedangkan untuk laju alir yang rendah akan didapatkan waktu retensi yang lama.

  Dalam proses kerja sistem HPLC digunakan tekanan. Tekanan pada sistem HPLC dihasilkan oleh pompa.Penurunan tekanan yang terjadi pada kolom pada suatu laju alir tertentu ditunjukkan oleh persamaan (2.2) [Kuwana, 1980].

  Dengan ΔP = penurunan tekanan pada kolom (bar) Ø = faktor resistan kolom

  = viskositas fase gerak (mbar s) η L = panjang kolom (mm) v = laju alir fase gerak (mm/min) d = diameter bagian - bagianpenyusun kolom (µm)

  p

  Penurunan tekanan (ΔP) berbanding lurus terhadap faktor resistan kolom berbanding terbalik terhadap kuadrat diameter bagian – bagian penyusun kolom

  2 (d ). p

BAB III EKSPERIMEN A. Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan Maguwoharjo Depok Sleman Yogyakarta. B. Alat dan Bahan

1. Alat – alat:

  a. Satu unit HPLC, yang terdiri dari:  Pompa HPLC Pompa yang digunakan adalah pompa LKB – BROMA tipe 2150. Pompa ini memiliki 2 buah kepala pompa. Fase gerak selalu bergerak melalui kedua kepala pompa dalam satu arah. Pompa ini bertugas memberikan tekanan sehingga mendorong fase gerak masuk ke dalam kolom. Tekanan tertinggi yang bisa diberikan oleh pompa ini adalah 400 bar.

   Injektor Injektor merupakan tempat untuk memasukkan sampel. Sampel dimasukkan dengan cara disuntikkan. Injektor memiliki tuas dengan 2 buah kondisi yaitu LOAD dan INJECT. Sampel diinjeksikan ketika tuas berada pada posisi LOAD. Sampel akanbergerak masuk ke dalam kolom ketika tuas berada pada posisi INJECT. Injektor ini mampu menampung sampel sebanyak 20 μl.  Kolom Kolom yang digunakan adalah kolom CPTM sphere C-18 (Oktadesil Silica) dengan panjang 100 mm dan diameter sebesar 4,6 mm.

   Detektor Detektor yang digunakan adalah detektor Spectroflow 757. Detektor ini berfungsi untuk mendeteksi molekul – molekul yang telah terpisah. Prinsip kerja detektor ini berdasarkan prinsip serapan cahaya. Detektor ini mengubah besaran cahaya menjadi besaran listrik,memiliki sumber lampu deuterium (190 nm – 380 nm) dan tungsten (380 nm – 800 nm).

   Perekam dan penampil data Untuk merekam dan menampilkan data digunakan recorder BD Kipp zonen.

  Komponen – komponen tersebutdirangkaimengikuti Gambar 3.1.

  injektor Injeksi sampel recorder Pompa 2150 kolom Fase gerak Detektor SF 757 pembuangan Gambar 3.1.Skema rangkaian alat yang digunakan dalam eksperimen.

  b. Perangkat penyiapan larutan  Pipet skala dan tetes  Labu ukur  Beaker glass  Refrigerator ultrasonic UR 275  Milipore  Neraca digital

2. Bahan – bahan :

  a. Methanol Methanol berfungsi sebagai fase gerak dan pelarut. b. Sampel Sampel yang digunakan adalah campuran larutanParasetamol dan Kafein.

C. Metode Eksperimen

  1. Penyiapan fase gerak

  Fase gerak yang digunakan adalah methanol. Sebelum fase gerak dimasukkan ke dalam wadah yang akan digunakan, maka terlebih dahulu wadah tersebut dibilas dengan methanol. Untuk menghindari adanya partikel – partikel asing maka methanol disaring dengan menggunakan milipore yang berukuran 0,45 µm. Setelah itu, untuk menghilangkan gelembung – gelembung udara maka dilakukan degassing pada methanol menggunakan refrigerator ultrasonic UR 275.

  2. Penyiapan sampel

  Sampelakan dimasukkan dengan cara disuntikkan ke dalam injektor menggunakan syringe. Langkah pertama adalah pembuatan larutan induk dari Parasetamol dan Kafein. Bahan standarParasetamol dan Kafein berbentuk serbuk sehingga harus dilarutkan terlebih dahulu dalammethanol. Setelah didapatkan larutan induk Parasetamol dan Kafein maka bisa dilakukan pengenceran untuk mendapatkan kadar larutan yang diinginkan dengan menggunakan persamaan (3.1). Dengan C = kadar larutan induk (ppm)

  1 V = volume larutan induk yang diambil (ml)

  1 C = kadar yang diinginkan (ppm)

  2 V = volume larutan yang diinginkan (ml)

  2 Untuk menghindari adanya partikel – partikel asing maka larutan Parasetamol

  dan Kafein tersebut disaring dengan menggunakan milipore yang berukuran 0,45 µm.

3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul

  Suatu campuran dikatakan terpisah jika molekul - molekul penyusun campuran tersebut memiliki waktu retensi yang berbeda. Waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein harus diketahui terlebih dahulu. Sebab, waktu retensi akan menunjukkan identitas suatu molekul pada saat pemisahan.

  Sampel yang digunakan dalam eksperimen tahap ini adalah larutan standar Parasetamol dan Kafein.Kedua larutan tersebut disuntikkan ke dalam injektor satu per satu.Besar waktu retensi dapat diketahui dengan mengukur selang waktu yang dibutuhkan oleh molekul mulai pada saat penyuntikan hingga akhirnya terdeteksi oleh detektor.Hasil yang didapatkan pada eksperimen ini adalah nilai waktu retensi masing – masing dari molekul

  

4. Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju

alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu.

  Sampel yang digunakan adalah campuran larutan Parasetamol dan Kafein. Hasil data yang akan didapatkan adalah nilai waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan bervariasi pada laju alir tertentu.

  Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan tertentu, dilakukan dengan laju alir fase gerak 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min pada tekanan 100 bar.

  Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar.

  Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan bervariasi pada laju alir tertentu, dilakukan dengan tekanan 100 bar, 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar pada laju alir 0,55 ml/min. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min.

  Untuk analisa seluruh datadigunakan program Origin 6.0.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan alat yang

  bekerja berdasarkan prinsip kromatografi yang berguna untuk memisahkan komponen –komponen zat yang terdapat di dalam suatu campuran. Salah satu tujuan dari penelitian ini adalah untuk memahami cara kerja HPLC dalam memisahkan molekul – molekul.Terjadinya suatu pemisahan ditandai dengan didapatkannya nilai waktu retensi yang berbeda. Proses pemisahan molekul – molekul menggunakan HPLC dipengaruhi oleh banyak faktor. Sehingga dalam penelitian ini dilakukan percobaan mencari pengaruh laju alir dantekananterhadap waktu retensi.

  Proses pemisahan menggunakan HPLC terjadi di dalam kolom. Oleh karena itu kolom disebut sebagai jantung HPLC. HPLC sebagai sebuah sistem terdiri dari beberapa komponen seperti yang terlihat pada gambar (2.1), yaitu: pompa, injektor, kolom, detektor, dan penampil data. Cara kerja sistem HPLC adalah sebagai berikutfase gerak oleh pompaakan didorong masuk, melewati injektor, lalu ke kolom, ke detektor, dan akhirnya keluar di pembuangan. Sampel disuntikkan ke dalam injektor dengan menggunakan syringe. Sampel dan fase gerak akan bertemu dan saling bercampur pada salah satu pipa di injektor, lalu kemudian bergerak bersama menuju kolom. Pada kolom terjadi pemisahan antar molekul, setelah terpisah molekul – molekul tersebut akan masuk ke dalam detektor satu per satu. Detektor akan mendeteksi molekul – molekul tersebut satu per satu. Setelah terdeteksi molekul tersebut dengan sendirinya akan keluar menuju pembuangan. Prinsip kerja dari detektor yang digunakan adalah serapan cahaya oleh molekul penyerap yaitu sampel. Sehingga proses pendeteksian dilakukan pada satu nilai panjang gelombang analisis. Panjang gelombang analisis merupakan panjang gelombang dimana kedua zat mengalami serapan yang baik.

  Data yang dikeluarkan oleh detektor berupa nilai tegangan. Besarnya nilai tegangan, menunjukkan besarnya nilai absorbansi.Mekanisme proses pemisahan ini ditunjukkan pada gambar (2.2).

  Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein dalamkondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alirtertentu. Ada beberapa set pada alat yang dibuat bervariasi, namun ada juga yang dibuat tetap. Set pada alat yang dibuat tetap adalah: a. Pompa LKB-Broma 2150

  : 000 bar  Lower limit pressure

  b. Detektor Spectroflow 757  Panjang gelombang analisis : 263 nm

  : 1 s  Filter rise time Skema rangkaian HPLC yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Langkah kerja yang telah dilakukan pada penelitian:

  1. Penyiapan fase gerak

  Fase gerak yang digunakan adalah methanol pro analis, yaitu methanol yang sudah dibersihkan dari pengotor – pengotor. Walaupun demikian, untuk memastikan methanol yang digunakan benar – benar bersih maka sebelum dialirkan masuk ke dalam pompa, terlebih dahulu methanol tetap harus disaring dengan menggunakan milipore yang berukuran 0.45 µm.Milipore merupakan penyaring yang terbuat dari sejenis kertas khusus yang memiliki pori –pori berukuran tertentu. Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya penyumbatan pada saluran – saluran pompa dan kolom, karena jika terjadi penyumbatan akan mengganggu proses pemisahan yang terjadi.

  Setelah dilakukan penyaringan, makaselanjutnya dilakukan degassing selama 15 menit menggunakan refrigerator ultrasonic UR275.

  

Degassing merupakan proses penghilangan gelembung – gelembung udara.

  Adanya gelembung udara akan menyebabkan timbulnya ruang – ruang kosong pada larutan. Sehingga gelembung udara harus dihilangkan karena dapat mengganggu proses pemisahan dan pendeteksian.

  2. Penyiapan sampel

  Bahan standarParasetamol dan Kafein berbentuk serbuk.Kedua standartersebutmasing – masing dilarutkan ke dalam methanol, sehingga didapatkan larutan induk Parasetamol dan Kafein.Larutan induk ini diencerkan menjadi larutan standar Parasetamol dan Kafein sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan, pengenceran dihitung dengan menggunakan persamaan (3.1).

  Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan campuran antara larutan Parasetamol danKafein. Sampel yang akan disuntikkan ke dalam HPLC harus dipastikan bebas dari kotoran. Oleh karena itu sebelum diinjeksikan, dilakukan penyaringan terlebih dahulu dengan menggunakan milipore yang berukuran 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk menghindari penyumbatan pada saluran – saluran dalam pompa dan kolom.

3. Penentuan waktu retensi dari masing – masing molekul

  Waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan molekul mulai pada saat injeksi sampai terdeteksi oleh detektor. Sehingga dapat dikatakan bahwawaktu retensi merupakan waktu lamanya sampel berada di dalam kolom.

  Waktu retensi merupakan hal yang penting dalam kromatografi, karena waktu retensi menunjukkan identitas suatu molekul. Jika dua buah molekul memiliki waktu retensi yang berbeda berarti molekul – molekul tersebut telah mengalami pemisahan.Molekul yang akan dipisahkan dengan menggunakan HPLCadalah molekul Parasetamoldan Kafein. Sehingga sebelum melakukan proses pemisahan, waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein perlu diketahui terlebih dahulu.

  Dalam penentuan waktu retensi Parasetamol dan Kafein, larutan yang digunakan adalah larutan standar dari masing – masing molekul. Larutan standar Parasetamol diinjeksikan ke dalam sistem HPLC, bersamaan dengan itu recorder dijalankan.Parasetamol kemudian bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di kolom, Parasetamolakan berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom. Parasetamol terus bergerak hingga akhirnya keluar dari kolom.Setelah itu, Parasetamol terdeteksi oleh detektor.Saat Parasetamol belum terdeteksi oleh detektor, recorder hanya memunculkan garis lurus.Ketika Parasetamol terdeteksi oleh detektor, grafik pada recorder membentuk sebuah puncak.Puncak tersebut menunjukkan molekul Parasetamol yang telah terdeteksi.Proses ini juga berlaku untuk Kafein. Besar waktu retensi dihitung dengan menggunakan stopwatch. Stopwatch dijalankan saat larutan diinjeksikan ke dalam injektor dan dihentikan saat larutan terdeteksi oleh detektor yang ditandai dengan timbulnya puncak pada grafik

  Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan dua buah grafik yang masing – masing menunjukkan waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein.Dua buah grafik tersebut ditunjukkan oleh gambar (4.1) dan (4.2).

Gambar 4.1. Grafik waktu retensiParasetamol Dari gambar (4.1) dan (4.2)terlihat bahwaParasetamol memiliki waktu retensi yang lebih singkat dibandingkan dengan Kafein. Waktu retensi Parasetamol adalah 4,38 menit sedangkan Kafein adalah 7,71 menit. Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa dalam pemisahan antara molekul Parasetamoldan Kafein, Parasetamolakan terdeteksi terlebih dahulu.

  

4. Pengukuran waktu retensi molekul Parasetamol dan Kafein dalam

kondisi laju alir yang bervariasi pada tekanan tertentu dan tekanan yang bervariasi pada laju alir tertentu.

  Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi laju alir bervariasi pada tekanan tertentu, dilakukan dengan laju alir fase gerak 0,55 ml/min; 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min pada tekanan 100 bar.

  Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk tekanan 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar.

  Pengukuran waktu retensi Parasetamol dan Kafein dalam kondisi tekanan bervariasi pada laju alir tertentu, dilakukan dengan tekanan 100 bar, 125 bar, 150 bar, 175 bar, 200 bar, 225 bar, dan 250 bar pada laju alir 0,55 ml/min. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk laju alir 0,7 ml/min; 0,85 ml/min; 1 ml/min; 1,15 ml/min; 1,3 ml/min; 1,45 ml/min; 1,6 ml/min; 1,75 ml/min; dan 1,9 ml/min.

  Sampel yang digunakan merupakan campuran antara larutan standarParasetamol dan Kafein.Sampel tersebut diinjeksikan ke dalam sistem HPLC.Sampel bergerak memasuki kolom.Pada saat berada di dalam kolom, sampel berinteraksi dengan bagian – bagian penyusun kolom.Sampel terus berjalan hingga akhirnya terdeteksi oleh detektor.Grafik yang dihasilkan pada recorder menunjukkan dua buah puncak.Masing – masing puncak menunjukkan nilai waktu retensi yang berbeda.Waktu retensi yang berbeda menunjukkan bahwa sampel mengalami pemisahan menjadiParasetamol dan Kafein.Hasil yang didapatkan dalam eksperimen ini adalah nilai waktu retensi dari Parasetamol dan Kafein.Parasetamol dan Kafein dapat diidentifikasi dengan melihat nilai waktu retensi yang didapatkan.

  Dari eksperimen yang telah dilakukan didapatkan beberapa grafik yang menunjukkan proses pemisahan antara Parasetamol dan Kafein. Grafik – grafik tersebut ditunjukkan oleh gambar (4.3) dan (4.4)

Gambar 4.4. Grafik pemisahan Parasetamol dan Kafein pada tekanan 100 bar dan laju alir 1,9 ml/min

  Suatu peristiwa pemisahan akan menghasilkan grafik hubungan antara keluaran detektor dan waktu retensi. Grafik tersebut berupa puncak – puncak.

  Puncak – puncak ini menunjukkan molekul – molekul yang telah berhasil dipisahkan. Satu puncak mewakili satu molekul.