Kandungan glikosida jantung dan profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang [Adenium obesun [Forssk. Roem & Schult.] dalam media tumbuh murashige - skoog - USD Repository

  

KANDUNGAN GLIKOSIDA JANTUNG DAN

PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG

( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. )

DALAM MEDIA TUMBUH MURASHIGE - SKOOG

  SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Melissa Wijaya NIM : 038114112

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

  The fear of the LORD is the beginning of knowledge, But fools despise wisdom and instruction.

  ( Proverbs 1 : 7 ) Trust  in the LORD with all your heart,  

  And  lean not on your own understanding.  In  all your ways acknowledge HIM,   And

   He shall direct your paths.  (  Proverbs 3 : 5‐6 )  I can do all things through Christ who strengthens me.

  ( Philippians 4: 13 ) I dedicated this masterpiece to : My Savior Jesus Christ

  My beloved Dad and Mom My Brother Samuel My Benny Bear My Almamater

  

PRAKATA

  Puji syukur kehadirat Allah Bapa di surga, atas limpahan berkat dan kasih-Nya yang tak terhingga, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) Dalam Media Tumbuh Murashige-Skoog”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Skripsi ini dapat terselesaikan karena bantuan, bimbingan, saran, dukungan, cinta dan doa yang tulus dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada:

  1. Kedua orang tua penulis, Kusnadi Widjaja dan Tuti Setiawati, dan kakak penulis, Samuel Wijaya, terima kasih atas doa, cinta, kasih sayang dan pengorbanannya.

  2. Rita Suhadi M, Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  3. Ign.Y. Kristio Budiasmoro, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah berkenan membimbing, mengarahkan dan memberikan saran kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

  4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk menguji dan memberi saran dalam skripsi ini.

  5. Christine Patramurti, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk

  6. Benny Sugientoro, S.Farm., buat cinta, dukungan, doa, perhatian, semangat dan kasih sayangnya.

  7. Mas Sigit, Mas Wagiran, Mas Andri dan Pak Mukmin yang banyak membantu penulis selama bekerja di laboratorium.

  8. Mbak Christin, Mbak Mina, Mbak Vero, Mas Didit, Donny, Ko Vekeh, Pak Eko dan Ci Vivien, terima kasih atas semua doa, dukungan dan bantuannya.

  9. Teman-teman angkatan 2003 teristimewa kelas C, terima kasih buat kasih persahabatan dan kebersamaannya selama ini.

  10. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah mendukung dalam penyusunan skripsi ini.

  Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih ada kekurangan yang harus diperbaiki, oleh karena itu saran dan kritik yang bersifat membangun sangat diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak

  Yogyakarta, Februari 2007 Penulis

  

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. iv PRAKATA ................................................................................................. v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...................................................... vii DAFTAR ISI .............................................................................................. viii DAFTAR TABEL ...................................................................................... xii DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xiii DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xiv

  INTISARI................................................................................................... xv

  

ABSTRACT .................................................................................................. xvi

BAB I PENGANTAR ................................................................................

  1 A. Latar Belakang ..............................................................................

  1 1. Rumusan Permasalahan ..........................................................

  2 2. Keaslian Penelitian ..................................................................

  3 3. Manfaat Penelitian ..................................................................

  3 B. Tujuan Penelitian ............................................................................

  4 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................

  5 A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang ..................................................

  5

  B. Kultur Jaringan Tanaman .............................................................

  5 1. Eksplan ......................................................................................

  7 2. Media.........................................................................................

  9 3. Lingkungan................................................................................

  21 C. Glikosida Jantung ............................................................................

  23 D. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................

  25 E. Landasan Teori ...............................................................................

  28 F. Hipotesis..........................................................................................

  29 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ...................................................

  30 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................

  30 B. Definisi Operasional .......................................................................

  30 C. Alat dan Bahan Penelitian ...............................................................

  31 1. Alat penelitian ...........................................................................

  31 2. Bahan Penelitian........................................................................

  33 D. Tata Cara Penelitian .......................................................................

  35 1. Determinasi tanaman .................................................................

  35 2. Pembuatan stok ..........................................................................

  35 3. Pembuatan media .......................................................................

  37 4. Sterilisasi alat dan ruangan ........................................................

  38 5. Sterilisasi dan penanaman eksplan ...........................................

  38 6. Pengamatan waktu inisiasi kalus ...............................................

  39 7. Subkultur....................................................................................

  39

  9. Analisis pertumbuhan kalus.......................................................

  41 10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang .......

  43 11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang ........................

  43 12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang..................................

  44

  13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman asalnya. .........................................................................

  44 E. Analisis Hasil .................................................................................

  44

  1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus ...............

  45

  2. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya .............................................................................

  45 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................

  47 A. Determinasi Tanaman .....................................................................

  47 B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman..............................

  47 C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus ......................................

  50 D. Subkultur dan Panen........................................................................

  52 E. Profil Pertumbuhan Kalus ...............................................................

  54

  1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. ..............

  54 2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari. ................

  58 F. Persen Kadar Air Kalus...................................................................

  58 G. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................

  60

  A. Kesimpulan .....................................................................................

  64 B. Saran ...............................................................................................

  64 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

  65 LAMPIRAN ...............................................................................................

  68 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

  82

  

DAFTAR TABEL

I. Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang.........................

  51 II Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF dan

  254 v

  fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 / v ) ......................

  61

  

DAFTAR GAMBAR

1.

  69

  49

  52

  56

  59

  61

  62

  69

  Foto daun kamboja jepang ................................................................ Foto kalus siap subkultur .................................................................. Foto kalus siap panen........................................................................ Foto kalus basah................................................................................ Foto kalus kering............................................................................... Foto serbuk kalus .............................................................................. Foto hasil KLT secara visual ............................................................ Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% ) ........... Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde ................................

  70

  70

  70

  70

  70

  71

  72

  24

  Persen kadar air kalus daun kamboja jepang .................................... Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat (97 %) .. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde ...................... Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) ..............................................................................

  2.

  9.

  3.

  4.

  5.

  6.

  7.

  8.

  10.

  Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun ................................... Inisiasi kalus daun kamboja jepang .................................................. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah..............................................................................

  11.

  12.

  13.

  14.

  15.

  16.

  17. Strukur glikosida jantung..................................................................

  73

  

DAFTAR LAMPIRAN

1. Surat Determinasi Tumbuhan ..............................................................

  2. Foto-foto Hasil Penelitian ....................................................................

  3. Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ) ...........................

  4. Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam media tumbuh MS ................................................................................

  5. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah ...........................................................................................

  6. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering ..........................................................................................

  7. Data persen kadar air kalus kamboja jepang........................................

  68

  69

  74

  76

  77

  79

  81

  

INTISARI

  Tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) selama ini biasanya digunakan sebagai tanaman hias. Penggunaan kultur jaringan untuk menghasilkan metabolit sekunder dari tanaman bertujuan untuk membuktikan bahwa jaringan dapat menggantikan tanaman asal secara fungsional, termasuk menghasilkan metabolit sekunder. Dalam penelitian ini, metabolit sekunder yang diteliti yaitu glikosida jantung dari kalus daun kamboja jepang.

  Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang pertumbuhan

  

in vitro kalus daun tanaman kamboja jepang dengan cara mengukur waktu inisiasi

  kalus dan profil pertumbuhan kalus serta membandingkan kandungan kimia kalus dengan tanaman asal. Eksplan untuk menghasilkan kalus didapat dari jaringan daun kamboja jepang yang ditanam secara in vitro pada media tumbuh MS (Murashige-Skoog) dengan penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4- Diklorofenoksiasetat (analog auksin). Kalus kemudian diekstrak dengan campuran

  v

  kloroform-metanol (1 : 10 / v ) Analisis profil pertumbuhan kalus dilakukan berdasarkan bobot kalus basah dan bobot kalus kering. Uji KLT dilakukan dengan membandingkan harga

  Rf bercak-bercak hasil pengembangan ekstrak kalus daun kamboja jepang dengan ekstrak daun kamboja jepang dalam fase diam silika gel GF 254 , fase gerak etil

  v asetat : metanol : aquadest ( 81 :11 : 8 / v ) dengan jarak pengembangan 10 cm.

  Deteksi yang digunakan yaitu sinar UV 254 dan 365 nm, serta pereaksi Kedde dan pereaksi asam sulfat berdasarkan acuan (Wagner,1984).

  Dari hasil penelitian, diketahui bahwa waktu inisiasi kalus adalah 10,3 hari. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang mengikuti pola pertumbuhan sigmoid fase lag, fase eksponensial dan fase stasioner. Hasil KLT yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Kata kunci : Adenium obesum , kalus, glikosida jantung.

  

ABSTRACT

Kamboja jepang ( Adenium obesum ( Forssk.) Roem & Schult.) during the

  time is usually used as decorative plant. Usage of tissue culture to provide secunder metabolit from plant aim to prove that the tissue can act as a complete plant system functionally, including provide secunder metabolit. The experiment’s secunder metabolite is cardiac glycoside from callus of kamboja jepang leaf.

  The purpose of this experiment is to get information of growth callus

  

kamboja jepang by in vitro by measuring callus initiation time and profile of

  callus growth and also compare chemical content of callus with the whole plant leaf. Explan to yield callus got from kamboja jepang leaf planted by in vitro at media growth MS ( Murashige-Skoog) with addition regulator of growth 2,4- Dichlorophenoksiacetate (an auxin analogue). Then, callus be extracted with

  

v

mixture of chloroform-methanol ( 1 : 10 / v ).

  Analysis of growth profile of callus based on wet callus weight and dry callus weight. Test of KLT be done by comparing Rf value of KLT spots of extract callus and the whole plant leaf at silica gel GF 254 as stationary phase, ethyl

  

v

  acetate: methanol : aquadest ( 81 : 11 : 8 / v ) as mobile phase with distance of elution is 10 cm. The detection include UV 254 and 365 light, and Kedde reagent and sulphate acid reagent according to Wagner (1984). From the result of experiment, it be known that callus initiation time is 10,3 days. Callus growth profile follow sigmoid pattern which consist of lag phase, exponensial phase and stasioner phase. From the result of TLC indicate that extract of callus kamboja jepang leaf which conducting by in vitro do not contain cardiac glycoside like its herbs.

  Keywords: Adenium obesum , callus, cardiac glycoside.

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) selama ini

  lebih dikenal sebagai tanaman hias ( Soenanto, 2005). Pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D- thevetoside, neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe, 1990 ). Ekstrak dari daun tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung yang memiliki efek sitotoksik yang berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura

  

et.al ., 2000). Ekstrak akar dan kulit batang dari kamboja jepang juga berpotensi

  sebagai agen terapeutik untuk pengobatan trypanosomiasis ( Atawodi, et al., 2003; Freiburghaus et al., 1996). Ekstrak kulit batang kamboja jepang juga berpotensi sebagai acaricidal ( Mgbojikwe dan Okoye, 2001).

  Di dalam pencarian metode produksi metabolit sekunder dari tumbuhan berkhasiat obat, pendekatan bioteknologi, khususnya kultur jaringan, berpotensi sebagai alternatif di dalam produksi metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk skala industri ( Ramachandra dan Ravishankar, 2002).

  Kultur jaringan tanaman merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan menggunakan potongan kecil jaringan atau sel atau organ, yang dipelihara dalam suatu medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik. Organ, jaringan Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena daun lebih mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan memiliki jaringan parenkim yang akan berdediferensiasi serta mudah untuk disterilisasi.

  Eksplan yang telah ditumbuhkan dalam media dapat membentuk kalus yaitu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ). Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil organ, jaringan atau sel tersebut dilakukan berdasarkan teori totipotensi sel yaitu : setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang utuh, jika kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ). Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Murashige-Skoog (MS) karena menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) media tersebut cocok sebagai media kultur untuk membudidayakan tanaman hias.

  Penelitian ini bertujuan untuk mengkulturkan tanaman kamboja jepang dari bagian daun serta mengidentifikasi metabolit sekunder glikosida jantung yang dihasilkan oleh kalus yang dibentuk dari hasil budidaya in vitro. Kultur kalus yang dihasilkan oleh teknik kultur jaringan ini diharapkan memiliki profil pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan kandungan glikosida jantung yang optimum.

1. Rumusan Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang yang telah disebutkan di atas, dapat a. Apakah eksplan yang berasal dari daun kamboja jepang dapat menghasilkan kalus jika dikembangkan secara in vitro dalam media Murashige-Skoog ( MS ) ?

  b. Bagaimana pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang yang dikulturkan? c. Apakah kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya ?

  2. Keaslian Penelitian

  Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang kandungan glikosida jantung dan profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) dalam media tumbuh MS belum pernah diteliti.

  3. Manfaat Penelitian

  Penelitian ini diharapkan memiliki beberapa manfaat antara lain:

  a. Manfaat Teoritis Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam mengembangkan bidang ilmu kefarmasian, khususnya dalam mengeksplorasi kandungan glikosida jantung dari tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) yang ditumbuhkan secara in vitro.

  b. Manfaat Praktis Penelitian ini juga diharapkan dapat membantu para peneliti selanjutnya untuk mempelajari secara lebih mendalam mengenai kultur jaringan tanaman sehingga mempermudah dalam produksi metabolit sekundernya.

B. Tujuan Penelitian

  Tujuan penelitian ini adalah : a. Menumbuhkan kalus dari eksplan daun kamboja jepang.

  b. Mengetahui pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang.

  c. Membuktikan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang Kamboja jepang dengan nama spesies Adenium obesum (Forssk) Roem & Schult berasal dari famili Apocynaceae dan memiliki nama sinonim yaitu Plumeria rubra L.cv. acutifolia.( Anonim, 2006 ). Secara morfologis tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) memiliki akar yang mampu membesar seperti umbi dan

  diselimuti oleh rambut-rambut akar yang sangat banyak; berbatang lunak dan tidak berkayu; daunnya berbentuk lanset dengan ujung membulat, tebal dan berserat, berwarna hijau, tampak mengkilap dan licin; bunganya berwarna merah muda sampai merah tua, memiliki 5 helai mahkota bunga yang bagian tengahnya berwarna putih; buahnya tumbuh secara berpasangan, terletak di ujung tunas, berbentuk pipih panjang, berwarna hijau waktu masih muda dan kemudian berangsur-angsur berubah menjadi cokelat; bijinya berada dalam buah, berwarna cokelat. Tanaman ini dapat tumbuh hingga dua meter ( Soenanto, 2005).

  Tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside, neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe, 1990 ).

B. Kultur Jaringan Tanaman

  Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Maka kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat yang sama dengan induknya ( Dixon, 1985).

  Kultur jaringan in vitro (mikropopagasi) adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan potongan kecil jaringan atau sel yang dipelihara dalam satu medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik ( Katuuk, 1989).

  Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil jaringan atau organ muncul dari pendapat bahwa tanaman tinggi terdiri dari sekumpulan sel. Sel-sel yang sama membentuk jaringan yang melakukan tugas tertentu pada setiap organ dalam tubuh tanaman. Sel-sel ini mempunyai kemampuan untuk melakukan seluruh proses hidup. Kemampuan sel ini disebut “totipotency” ( Katuuk, 1989).

  Teori totipotensi sel dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden pada tahun 1838. Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang utuh, jika kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ).

  Kultur jaringan dalam skala besar ditemukan sebagai pendekatan alternatif yang menarik terhadap metode penanaman tradisional dimana kultur jaringan dapat menyediakan metabolit-metabolit sekunder yang terkontrol ( Sajc et al., 2000 ).

  Keuntungan dari sistem kultur jaringan ini sebagai berikut:

  a. Kandungan–kandungan zat yang berguna dapat diproduksi di bawah kondisi b. Hasil kultur akan terbebas dari mikroba dan serangga.

  c. Sel-sel kebanyakan tumbuhan mudah untuk berkembangbiak dalam menghasilkan metabolit-metabolit yang spesifik.

  d. Kontrol automatis dari pertumbuhan sel dan proses pengaturan metabolit yang rasional dalam bioreaktor akan mengurangi biaya tenaga kerja dan meningkatkan produktivitas.

  e. Substansi organik dapat diekstrak dari kultur kalus. ( Dicosmo dan Misawa, 1995 ).

  Faktor-faktor yang menentukan keberhasilan dalam kultur jaringan tanaman antara lain:

1. Eksplan

  Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan. Berhasil tidaknya pengkulturan eksplan tergantung pada faktor yang dimiliki oleh eksplan itu sendiri. Faktor-faktor itu meliputi: a. Ukuran eksplan.

  Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian tanaman yang dikerat masih mengandung suplai makanan serta hormon untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Ukuran eksplan bervariasi, tergantung pada material tanaman yang dipakai serta jenis tanaman ( Katuuk, 1989). b.Umur eksplan.

  Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis. Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada bagian meristematik. Dari semua jenis tanaman bagian inilah yang paling banyak berhasil. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan

  

juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk

  beregenerasi tetap ada, sedangkan sel-sel tua, kesanggupan untuk beregenarasi sudah berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik yang berkurang, jaringan yang sudah tua ada kemungkinan sudah mengandung banyak patogen ( Katuuk, 1989 ).

  c. Sumber eksplan.

  Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman yang sehat, yang bertumbuh baik / normal. Pengaruh perubahan suhu, cahaya, musim serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk berkecukupan zat hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon tumbuh. Pendek kata pertumbuhannya harus optimum ( Katuuk, 1989 ). d.Genotip eksplan.

  Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro (Katuuk, 1989 ).

2. Media

  Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Murashige dan Skoog mempublikasikan formulasi media MS (singkatan dari Murashige dan Skoog) yang sampai sekarang terbukti cocok untuk kultur jaringan banyak tanaman dan banyak digunakan di laboratorium kultur jaringan di seluruh dunia ( Yusnita, 2003 ).

  Komponen media kultur yang digunakan dalam kultur jaringan adalah sebagai berikut : a. Air.

  Air memegang peranan penting dalam proses kultur jaringan karena 95% dari media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan dalam media serta dalam seluruh proses kultur jaringan adalah air suling. Hal ini karena di dalam air ledeng atau air sumur terlarut sejumlah kontaminan yang dapat merusak proses perkembangan kultur eksplan. Kontaminan yang dimaksud disimpan dalam kondisi steril dengan tidak memberi peluang pada bakteri untuk hidup dan berkembang ( Katuuk, 1991 ).

  b. Garam anorganik.

  Beberapa garam anorganik yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah takaran yang banyak dikenal sebagai unsur makro. Unsur makro adalah unsur yang dibutuhkan dalam jumlah yang besar. Jenis-jenis yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Sulfur (S), Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg). Unsur NPK adalah unsur yang mutlak dibutuhkan oleh tanaman, yang berarti harus selalu tersedia sedangkan unsur S,Ca, dan Mg boleh ada dan boleh tidak. Namun, karena fungsinya sangat mendukung pertumbuhan jaringan maka akan lebih baik apabila unsur-unsur tersebut juga tersedia ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

  Adapun kegunaan dari unsur makro tersebut adalah unsur N dipergunakan terutama untuk pertumbuhan vegetatif tanaman dan juga berperan di dalam pembentukan hijau daun yang mana berguna untuk proses fotosintesis dalam menghasilkan karbohidrat; unsur P dibutuhkan tanaman untuk pembentukan karbohidrat; unsur K berfungsi berguna untuk pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat; unsur S berperanan untuk pembentukan beberapa jenis protein seperti asam amino dan vitamin B

  1 ; unsur Ca bertugas

  merangsang pembentukan bulu-bulu akar dan bersama-sama dengan Mg akan memproduksi cadangan makanan sedangkan unsur Mg dapat meningkatkan kandungan fosfat yang berguna untuk pembentukan sejumlah protein ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

  Selain unsur makro, ada pula unsur mikro, yaitu unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah sedikit namun harus tersedia. Unsur- unsur tersebut adalah Besi(Fe), Mangan(Mn), Boron (B), Seng (Zn), Cobalt (Co), Tembaga(Cu), dan Molibdenum (Mo) ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

  Kegunaan dari unsur mikro tersebut adalah unsur Fe berfungsi dalam pembentukan hijau daun (chlorophyl); unsur Mn berguna untuk pemebentukan membran kloroplas; unsur B memegang peran penting dalam perombakan gula; unsur Zn berperan dalam pembentukan protoplas; unsur Co berguna untuk mengikat N dan untuk pembentukan asam inti; unsur Cu berperan dalam konversi energi; unsur Mo berperan dalam pembentukan klorofil ( Katuuk, 1989 ).

  Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH

  4 NO 3 , KNO 3 ,

  CaCl

  2 .2H 2 0, MgSO 4 .7H

2 O dan KH

  2 PO 4 . Sedangkan unsur-unsur mikro

  biasa diberikan dalam bentuk MnSO

  4 .4H

  2 O, ZnSO 4 .4H

  2 O, H

  3 BO 3 , KI,

  NaMo .2H O, CuSO .5H O dan CoCl .6H O ( Hendaryono dan Wijayani,

  4

  2

  4

  2

  2

  2 1994).

  c. Sumber karbon dan energi.

  Media kultur jaringan memerlukan bahan sebagai sumber tenaga. Biasanya yang merupakan sumber tenaga adalah bahan kimia organik yang pati, dan selulosa. Karbohidrat memiliki 2 fungsi utama yaitu sebagai sumber energi untuk jaringan dan untuk menjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial minimum dalam media. Ada banyak jenis karbohidrat yang dipakai dalam kultur jaringan namun yang paling banyak digunakan adalah sukrosa atau D-glukosa ( Katuuk, 1989).

  d. Myo-inositol, Vitamin dan asam amino.

  Penambahan myo-inositol pada media bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myo-inositol diberikan bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus ( Hendaryono dan Wijayani, 1994).

  Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan antara lain adalah Tiamin (vitamin B

  1 ), Piridoksin (vitamin B 6 ), dan asam

  nikotinat. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat. Asam nikotinat juga penting dalam reaksi-reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Sedangkan fungsi dari vitamin B

  6

  adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia dalam proses metabolisme ( Katuuk, 1989 ).

  Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda- beda. Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena dapat menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam- asam amino baru dalam jaringan ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

  e. Hormon dan zat pengatur tumbuh.

  Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur jaringan adalah mutlak karena budidaya kultur jaringan adalah budidaya terkendali. Proses tumbuh dan berkembangnya eksplan dapat disesuaikan dengan harapan, menjadi kalus saja, organogenesis ataupun embryogenesis.

  Pengaturan ini dapat dilakukan dengan mengatur macam dan konsentrasi zat pengatur tumbuh sehingga menghasilkan kombinasi yang tepat sesuai dengan harapan. Macam hormon dan zat pengatur tumbuh yang sudah dikenal hingga saat ini adalah sebagai berikut : 1) Auksin

  Auksin pertama kali ditemukan oleh Went, dan diketahui sebagai asam indolasetat (IAA). Selanjutnya, nama auksin digunakan untuk nama kelompok hormon dan zat pengatur tumbuh yang menimbulkan respons khas IAA. Tumbuhan mengandung tiga senyawa lain yang mirip dengan IAA baik struktur maupun respon yang diakibatkannya, yaitu : asam 4-kloroindolasetat (4kloroIAA), asam fenilasetat (PAA), dan asam indolbutirat (IBA) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

  Hormon sintetik atau zat pengatur tumbuh yang digolongkan sebagai auksin yaitu : asam a-naftalenasetat (NAA), asam 2,4- diklorofenoksiasetat (2,4-D), asam 2-metil 4-klorofenoksiasetat (MCPA), asam 2-naftalosiasetat (4-CPA), asam p-klorofenoksiasetat (PCPA), asam 2,4,5-triklorofenoksiasetat (2,4,5-T), asam 3,6- dikloroanisik (dikamba), asam 4-amino 3,5,6-trikloropikolinik (pikloram) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

  Dalam aktivitas kultur jaringan, auksin berperan menginduksi terjadinya kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau tunas, mendorong proses embryogenesis, dan mempengaruhi kestabilan genetis tanaman ( Santoso dan Nursandi, 2001 ). 2) Sitokinin

  Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuhan yang sangat penting sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan. Seperti auksin, selain sitokinin alami juga terdapat sintesisnya yang tergolong dalam zat pengatur tumbuh. Sitokinin sintetik yang umum digunakan dalam kegiatan kultur jaringan adalah FAP (6-

  

furfurilaminopurin ), BAP (Benzylaminopurin), Thidiazuron (N-phenil-

N-1,2,3-thiadiazol-5-penylurea ) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

  Dalam kegiatan kultur jaringan sitokinin berperan di dalam menstimulasi terjadinya pembelahan sel, proliferasi kalus, pembentukan tunas, menghambat pembentukan akar, mendorong pembentukan klorofil pada kalus ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

  3) Gibberilin (GA) Gibberilin merupakan kelompok lain dari ZPT atau hormon yang dapat mempengaruhi pemanjangan batang atau ruas batang, mendorong pembungaan, induksi buah, dan tumbuhnya mata tunas yang dorman. Secara umum dalam kegiatan kultur jaringan tanaman tanpa penambahan GA, sesungguhnya kegiatan telah dapat berjalan dan proses induksi serta diferensiasi dapat dilakukan, meski demikian tidak menutup kemungkinan bahwa GA endogen dalam eksplan walaupun dalam kadar yang relatif kecil diduga tetap merupakan komponen yang essensial, contoh GA sintetik adalah gibberillic acid (Santoso dan Nursandi, 2001). 5) ABA (Abcisic acid)

  ABA merupakan hormon tanaman yang secara alamiah disintesis tanaman bila tanaman berada dalam keadaan stress. ABA tergolong dalam zat penghambat tanaman atau inhibitor karena kerjanya berlawanan dengan hormon pendorong seperti auksin, sitokinin, dan giberelin. Dalam kultur jaringan, ABA dapat menghambat proses inisiasi dan pertumbuhan sel ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

  f. Bahan pemadat media Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media sedangkan media padat adalah media cair tersebut dengan ditambah zat pemadat ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

  Zat pemadat yang digunakan untuk membuat media padat adalah berupa agar-agar. Agar adalah campuran berbagai polisakarida dari galaktosa yang diekstrak dari ganggang laut, terutama Gellidium amansii dan ganggang lain dari golongan Rhodophyta. Umumnya agar dapat membentuk gel pada suhu 40-45°C dengan titik cair 80-90°C. Kemampuan agar dalam memadatkan media tergantung pada cara pengekstrakannya dari ganggang dan pH larutan media sebelum diautoklaf. Dalam larutan media dengan pH rendah (kurang dari 4,5), gel yang terbentuk oleh agar sangat encer, sedangkan larutan dengan pH tinggi (lebih dari atau sama dengan 5,5) akan berbentuk padat ( Yusnita, 2003 ).

  Media kultur jaringan merupakan sumber makanan yang baik untuk bakteri dan fungi, semua prosedur in vitro harus memuat pencegahan terhadap kontaminasi mikroba ( Wetherell, 1982 ). Beberapa teknik sterilisasi yang lazim digunakan dalam kultur jaringan tanaman, yaitu: a. Sterilisasi panas basah

  Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah autoklaf. Hampir semua mikroba mati sesudah diberi uap air dengan suhu 121

  °C selama 10-15 menit. Cara sterilisasi ini dapat digunakan untuk mensterilkan media kultur, air, alat / instrumen, gelas serta peralatan plastik yang tahan akan suhu panas. Lama waktu 15-20 menit, media 75-500 ml dibutuhkan waktu 20-25 menit, media 500-5000 ml dibutuhkan waktu 25-35 menit, yang semuanya dilakukan pada suhu 121

  °C; sedangkan untuk mensterilkan peralatan gelas dibutuhkan waktu 30 menit dengan suhu 130 °C ( Katuuk, 1989 ).

  Manfaat dari sterilisasi ini adalah prosesnya cepat, sederhana, dan sanggup membasmi virus tertentu. Namun autoklaf juga mempunyai kekurangan, yaitu: 1) Bila pemanasan terlalu tinggi, gula akan membatu sehingga dapat menjadi racun dalam media.

  2) Bila terlalu lama disterilkan, garam akan mengendap sehingga terjadi dipolimerisasi agar.

  3) Dapat menurunkan pH sekitar 0,3 - 0,5 unit. 4) Dapat merusak substansi yang mudah menguap, misalnya ethrel dan ethylene ( Katuuk, 1989 ).

  b. Sterilisasi panas kering Cara sterilisasi panas kering adalah dengan menggunakan suhu tinggi dan dalam kondisi kering. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah oven. Oven digunakan untuk mensterilkan alat- alat yang tidak mudah terbakar, antara lain: alat-alat gelas dan alat-alat dari logam. Namun dalam keadaan tertentu dimana suhu tidak terlalu panas, alat dapat dibungkus dengan kertas kemudian disterilkan. Bukan pula berarti semua alat dari bahan logam harus disterilkan dengan cara ini. Alat-alat seperti pisau serta skalpel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak ketajaman pisau / alat ( Katuuk, 1989 ).

  Lama pemanasan tergantung pada suhu. Biasanya sterilisasi untuk suhu 160 °C, memerlukan waktu 45 menit, 170°C-18 menit, 180°C-7,5 menit, dan 190

  °C selama 1,5 menit. Suhu harus dikontrol, sebab pada suhu 170 °C, kertas mulai hancur. Setelah selesai disterilisasi, alat / instrument dikeluarkan dan dibawa ke ruang transfer, dimana mereka dapat disterilkan lagi dengan menggunakan sinar ultraviolet ( Katuuk, 1989 ).

  c. Sterilisasi dengan pemijaran Alat / instrument berupa pisau dan skalpel, dikeluarkan dari bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70% dan dilewatkan pada nyala lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer (LAF) ( Katuuk,1989).

  d. Sterilisasi dengan bahan kimia Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba dengan jalan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk mensterilkan permukaan saja, yang meliputi: material tanaman dapat disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air brom, sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% ( Katuuk, 1989 ).

  Banyak jenis bahan pencuci yang boleh digunakan untuk sterilisasi material tanaman. Banyak kali terjadi bila terlalu lama dan dengan konsentrasi bahan pencuci yang tinggi, berakibat bukannya mematikan mikroba tetapi bahkan merusak jaringan tanaman yang disterilkan. Di samping itu bahan pencuci hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila tidak demikian, sisa zat pencuci ini akan tetap pada material tanaman, yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan ( Katuuk, 1989 ).

  e. Sterilisasi dengan sinar ultraviolet Ruang dan kotak transfer sukar untuk disterilkan hanya dengan menggosok dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu digunakan lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium yang sudah memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan maksud agar semua bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan sinar ultraviolet adalah pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya, proses sterilisasi tidak terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu mematikan bentuk fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora (Katuuk, 1989 ).

  Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium cair yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu, tergantung spesiesnya akan terbentuk massa kalus yaitu suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ).

  Kalus terbentuk melalui 3 tahapan, yaitu : induksi, pembelahan sel dan diferensiasi. Untuk memelihara kalus, maka perlu dilakukan subkultur secara berkala, misalnya setiap 30 hari ( Yuwono, 2006 ).

  Subkultur adalah usaha mengganti media tanam kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau protokormus dapat terpenuhi. Subkultur pada media padat mudah dilakukan dengan cara meletakkan kalus yang sudah terbentuk di atas cawan petri, kemudian membelah-belahnya menjadi bagian-bagian kecil lagi. Setelah menjadi potongan kecil, kalus dimasukkan kembali dalam media yang memiliki komposisi sama dengan media lama. Proses ini juga dilakukan dalam suasana steril ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

  Ada 3 tahapan perkembangan dan pertumbuhan kalus, mulai dari waktu subkultur atau penaburan inokulum, yaitu: induksi pembelahan sel, pembelahan sel aktif dan tahap pembelahan sel lambat atau sel berhenti membelah. Laju pertumbuhan kalus umumnya ditetapkan secara kuantitatif dengan parameter indeks pertumbuhan bobot kalus basah. Pertambahan bobot kalus basah merupakan selisih antara bobot kalus basah pada periode tertentu dikurangi bobot kalus mula-mula atau bobot inokulum. Selanjutnya dari kurva pertumbuhan kalus yang menyatakan hubungan antara pertumbuhan bobot kalus basah dengan umur dapat diketahui fase-fase pertumbuhan kalus antara lain: a. Fase lag, yaitu fase dimana belum terjadi pertumbuhan secara nyata, merupakan waktu adaptasi kalus dengan media yang baru. Pada fase ini pertambahan bobot kalus hanya sedikit dan terlihat hampir mendatar pada kurva.

  b. Fase eksponensial, yaitu fase dimana mulai terjadi pertumbuhan kalus.

  Pertambahan bobot kalus mulai terlihat nyata dan diikuti fase linier dimana pertumbuhan kalus terus menaik secara eksponensial seperti garis lurus ke atas dan berhenti.

  c. Fase stasioner, yaitu fase dimana pertumbuhan kalus sama dengan kematian sel-sel kalus. Kalus tidak dapat bertahan hidup pada fase ini dalam waktu yang lama. Sel-sel mulai mati, media pertumbuhan kelebihan muatan dan nutrien telah habis digunakan, sehingga kematian sel menjadi lebih cepat ( George dan Sherrington, 1984 ).

3. Lingkungan

  Faktor lingkungan utama yang harus dipenuhi antara lain : a. Cahaya.

  Cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut fotomorfogenenesis. Jenis cahaya yang paling sering digunakan dalam kultur jaringan adalah cahaya dari lampu neon. Hal ini disebabkan oleh kemampuannya yang dapat menyebarkan cahaya yang lebih luas dan merata, serta lebih hemat pemakaian listrik ( Katuuk, 1989 ). b. Suhu.

  Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-30°C. Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada setiap spesies, serta jenis eksperimen ( Katuuk, 1989 ).

  c. pH.