BIOTEKNOLOGI dan yang id bab 1
Transformasi tanaman obat
Hyocyamus muticus
penghasil alkaloid tropane
dengan penembakan partikel
Hakim H.K
Nurul Fazri
Rahmi Fitriana
Abstrak
Kami melaporkan sistem transformasi seluruh tanaman yang
efisien untuk hyocyamus muticus, merupakan tanaman obat
yang penting dari keluarga solanaceous. Kami mengembangkan
sistem menggunakan plasmid membawa nptII dan gen gusA ,
yang disampaikan ke eksplan daun dengan penembakan partikel.
Sepuluh persen dari dibombardir eksplan daun terbentuk tahan
kanamisin kalus , dari mana tanaman transgenik putatif itu
ditemukan. Gen nptII resistansi kanamisin ditemukan dimasukkan
ke dalam genom semua tanaman transgenik disaring. Lebih dari
50% dari tanaman yang tahan kanamisin menunjukkan ekspresi
yang kuat dari gen gusA yang tidak dipilih. Mayoritas tanaman
transgenik jatuh tempo, dapat melalukan penyerbukan sendiri,
dan menghasilkan biji subur. Sebuah sistem transformasi seluruh
tanaman sederhana dan efisien untuk tanaman obat ini
merupakan langkah penting dalam memajukan pemahaman kita
dalam produksi alkaloid tropane pada tanaman.
Hyocyamus muticus spp
Umumnya dikenal sebagai semacam tumbuhan, juga
dikenal sebagai nightshade bau atau semacam
tumbuhan hitam, adalah tanaman dari keluarga
Solanaceae yang berasal dari Eurasia, meskipun
sekarang didistribusikan secara global.
Tumbuhan penghasil bahan obat-obatan yang telah
dikenal sejak ribuan tahun. Sebagai anggota suku
Solanaceae, tumbuhan ini masih sekerabat dengan
datura, tumbuhan hias dengan bunga berbentuk
terompet yang besar. Kecubung biasanya berbunga putih
dan atau ungu, namun hibridanya berbunga aneka
warna.
Sumber:
http://www.riyawan.com/2014/07/hyoscyami.html#.VDy
33dmULDc
Hyocyamus muticus
Diperkirakan tanaman ini pertama kali dipakai
sebagai obat-obat pada abad kesepuluh.
Kecubung ada yang berasal dari Asia Tenggara,
namun ada juga yang berasal dari Benua
Amerika. Kecubung tumbuh di tempat yang
beriklim panas dan dibudidayakan di seluruh
belahan dunia karena khasiat yang dikandungnya
dan juga untuk tanaman hias. Pertama kali
diperkenalkan oleh Linnaeus pada tahun 1753,
tapi secara botani masih belum tepat mengenai
gambaran dan penjelasan tentang kecubung.
Wilayah asal yang menjadi sumber tanaman ini
tidak dapat diketahui secara pasti. Bagian-bagian
kecubung, tetapi terutama bijinya, mengandung
alkaloid yang berefek halusinogen.
Saat ini satu-satunya sistem transformasi seluruh
tanaman tersedia untuk hyocyamus spp. adalah
Agrobacterium Transfer rhizogenes dimediasi gen
ke hyocyamus muticus (sevon et al., 1995).
Namun, sistem ini memiliki keterbatasan terkait
dengan manipulasi alkaloid metabolisme karena A.
rhizogenes
gen
rol
memiliki
terbukti
mempengaruhi metabolisme alkaloid tropane.
Gen rol muncul untuk meningkatkan produksi
alkaloid dalam akar rambut sambil menghambat
produksi alkaloid dalam seluruh tanaman (sevon
et al., 1997). Penggunaan A. rhizogenes jelas
bermasalah untuk penelitian masa depan pada
manipulasi jalur metabolik sekunder karena sulit
untuk memantau efek disebabkan oleh gen
Agrobacterium
dan
yang
disebabkan
oleh
manipulasi genetik.
Kami menemukan bahwa penembakan partikel
pada
eksplan daun adalah prosedur yang lebih
sederhana dan efisien untuk transformasi H.
muticus.
Produksi
kalus
tahan
kanamisin
transgenik
terjadi
mudah
dengan pemboman. Tidak seperti Nicotiana
tabacum
(Leech et al., 1998) H. muticus tidak membentuk
tunas
langsung dari pemboman eksplan daun, meskipun
plantlets H. muticus pulih dari kalus dengan
efesiensi yang tinggi.
Bahan & Metode
Plants Material & Tissue Culture
Hyocyamus muticus L. (strain Kairo, Solanaceae)
tanaman ditanam di rumah kaca di bawah lampu
natrium untuk mempertahankan 16-h panjang hari
minimum, dan dengan rezim suhu 24°C/20°C
hari/malam. Daun muda dikumpulkan dan disterilkan
dalam larutan 10% pemutih rumah tangga (Vortex,
Proctor & Gamble, UK) selama 15 menit. Setelah
mencuci menyeluruh dalam air steril, daun dipotong
menjadi 0,5 cm2 kotak, menghindari pembuluh darah,
dan ditempatkan pada media MS (Murashige & Skoog,
1962) ditambah dengan 3% sukrosa dan 0,8% Difco
bacto agar. Mereka diinkubasi pada 25°C selama 1 hari
sebelum pengeboman (12jam penyinaran, 2600 lux).
Vektor transformasi dan penembakan partikel
Plasmid digunakan untuk partikel pemboman
(PNP GUS, Gambar 1) mengandung gen nptII, yang
memberikan resistensi kanamisin, dan Escherichia
coli gusA encoding gen reporter b-glucuronidase
(GUS). Struktur konstruk adalah sebagai berikut:
CaMV 35S Promotor: Pemimpin amv: gusA: NPA +
nopaline synthase (NOS) -promoter: nptII: NPA.
Plasmid DNA untuk penembakan partikel diisolasi
dari rekombinan E. coli
Setelah pemboman, eksplan daun diinkubasi pada 25
C selama 24 jam dalam gelap. Eksplan kemudian
dipindahkan ke medium basal MS yang mengandung
3% sukrosa, 0,8% agar dan ditambah dengan 1napthalene asam asetat (NAA; 2mg ml-1) dan 6
benzilamino purin (BAP; 0.5mg ml-1). Mereka
diinkubasi selama 48 jam (12-h penyinaran) tanpa
seleksi.seleksi dilakukan 72 jam setelah
penembakan.
Pewarnaan histokimia GUS
GUS aktivitas ditentukan dengan menggunakan alat
tes histokimia (Jefferson et al., 1987). Bahan tanaman
berada dibahan tanaman berada di cubated dalam
buffer yang mengandung X-gluc pada 37 C selama 18
tangan destained selama 24 jam dengan 96% etanol.
Ekspresi gusA Transient dinilai 24 jam setelah
penembakan dengan menggunakan mikroskop stereo.
Kegiatan GUS di tunas dianalisis dengan pewarnaan 2
Segmen daun 4mm dipotong dari tunas muda sebelum
rooting. Tidak ada aktivitas GUS ditemukan pada
tanaman kontrol atau eksplan (yaitu mereka tidak
dibombardir dengan transformasi plasmid pNPT-GUS).
Analisis Southern blot
Daun dikumpulkan dari tanaman yang telah tumbuh dalam
rumah kaca selama 3 bulan. Genomic DNA diekstraksi dengan
menggunakan Tanaman DNAzol Reagent (Gibco BRL Life
Technologies, UK) dengan modifikasi berikut untuk instruksi dari
pabriknya: bahan tanaman diinkubasi selama 30 menit, dengan
reagen DNAzol, dan langkah tambahan akhir dilakukan di mana DNA
diendapkan dengan etanol dan spooled
(A) transformasi Seluruh tanaman
dan sistem regenerasi untuk H.
muticus. (B) histokimia pewarnaan
dibombardir
eksplan
daun
menunjukkan aktivitas GUS transien
pada kecepatan pemboman yang
berbeda (tekanan helium setara
dalam psi). (C) Kalus yang muncul
dari dibombardir eksplan setelah 6
minggu pada medium induksi kalus.
(D) Tembak regenerasi dari kalus 2-3
bulan setelah subkultur pada media
regenerasi. (E) tunas regenerasi pada
media auksin. (F) pembentukan akar
oleh regenerasi tunas 1-3 bulan
setelah transfer ke media perakaran.
(G) histokimia pewarnaan daun yang
terluka dari tanaman transgenik
menunjukkan aktivitas GUS. (H)
histokimia pewarnaan untuk kegiatan
GUS tanaman regenerasi pada tahap
ketika
pot
ke
dalam
tanah
berlangsung (4-10 bulan setelah
pemboman).
Hasil & DIskusi
Hyocyamus muticus
penghasil alkaloid tropane
dengan penembakan partikel
Hakim H.K
Nurul Fazri
Rahmi Fitriana
Abstrak
Kami melaporkan sistem transformasi seluruh tanaman yang
efisien untuk hyocyamus muticus, merupakan tanaman obat
yang penting dari keluarga solanaceous. Kami mengembangkan
sistem menggunakan plasmid membawa nptII dan gen gusA ,
yang disampaikan ke eksplan daun dengan penembakan partikel.
Sepuluh persen dari dibombardir eksplan daun terbentuk tahan
kanamisin kalus , dari mana tanaman transgenik putatif itu
ditemukan. Gen nptII resistansi kanamisin ditemukan dimasukkan
ke dalam genom semua tanaman transgenik disaring. Lebih dari
50% dari tanaman yang tahan kanamisin menunjukkan ekspresi
yang kuat dari gen gusA yang tidak dipilih. Mayoritas tanaman
transgenik jatuh tempo, dapat melalukan penyerbukan sendiri,
dan menghasilkan biji subur. Sebuah sistem transformasi seluruh
tanaman sederhana dan efisien untuk tanaman obat ini
merupakan langkah penting dalam memajukan pemahaman kita
dalam produksi alkaloid tropane pada tanaman.
Hyocyamus muticus spp
Umumnya dikenal sebagai semacam tumbuhan, juga
dikenal sebagai nightshade bau atau semacam
tumbuhan hitam, adalah tanaman dari keluarga
Solanaceae yang berasal dari Eurasia, meskipun
sekarang didistribusikan secara global.
Tumbuhan penghasil bahan obat-obatan yang telah
dikenal sejak ribuan tahun. Sebagai anggota suku
Solanaceae, tumbuhan ini masih sekerabat dengan
datura, tumbuhan hias dengan bunga berbentuk
terompet yang besar. Kecubung biasanya berbunga putih
dan atau ungu, namun hibridanya berbunga aneka
warna.
Sumber:
http://www.riyawan.com/2014/07/hyoscyami.html#.VDy
33dmULDc
Hyocyamus muticus
Diperkirakan tanaman ini pertama kali dipakai
sebagai obat-obat pada abad kesepuluh.
Kecubung ada yang berasal dari Asia Tenggara,
namun ada juga yang berasal dari Benua
Amerika. Kecubung tumbuh di tempat yang
beriklim panas dan dibudidayakan di seluruh
belahan dunia karena khasiat yang dikandungnya
dan juga untuk tanaman hias. Pertama kali
diperkenalkan oleh Linnaeus pada tahun 1753,
tapi secara botani masih belum tepat mengenai
gambaran dan penjelasan tentang kecubung.
Wilayah asal yang menjadi sumber tanaman ini
tidak dapat diketahui secara pasti. Bagian-bagian
kecubung, tetapi terutama bijinya, mengandung
alkaloid yang berefek halusinogen.
Saat ini satu-satunya sistem transformasi seluruh
tanaman tersedia untuk hyocyamus spp. adalah
Agrobacterium Transfer rhizogenes dimediasi gen
ke hyocyamus muticus (sevon et al., 1995).
Namun, sistem ini memiliki keterbatasan terkait
dengan manipulasi alkaloid metabolisme karena A.
rhizogenes
gen
rol
memiliki
terbukti
mempengaruhi metabolisme alkaloid tropane.
Gen rol muncul untuk meningkatkan produksi
alkaloid dalam akar rambut sambil menghambat
produksi alkaloid dalam seluruh tanaman (sevon
et al., 1997). Penggunaan A. rhizogenes jelas
bermasalah untuk penelitian masa depan pada
manipulasi jalur metabolik sekunder karena sulit
untuk memantau efek disebabkan oleh gen
Agrobacterium
dan
yang
disebabkan
oleh
manipulasi genetik.
Kami menemukan bahwa penembakan partikel
pada
eksplan daun adalah prosedur yang lebih
sederhana dan efisien untuk transformasi H.
muticus.
Produksi
kalus
tahan
kanamisin
transgenik
terjadi
mudah
dengan pemboman. Tidak seperti Nicotiana
tabacum
(Leech et al., 1998) H. muticus tidak membentuk
tunas
langsung dari pemboman eksplan daun, meskipun
plantlets H. muticus pulih dari kalus dengan
efesiensi yang tinggi.
Bahan & Metode
Plants Material & Tissue Culture
Hyocyamus muticus L. (strain Kairo, Solanaceae)
tanaman ditanam di rumah kaca di bawah lampu
natrium untuk mempertahankan 16-h panjang hari
minimum, dan dengan rezim suhu 24°C/20°C
hari/malam. Daun muda dikumpulkan dan disterilkan
dalam larutan 10% pemutih rumah tangga (Vortex,
Proctor & Gamble, UK) selama 15 menit. Setelah
mencuci menyeluruh dalam air steril, daun dipotong
menjadi 0,5 cm2 kotak, menghindari pembuluh darah,
dan ditempatkan pada media MS (Murashige & Skoog,
1962) ditambah dengan 3% sukrosa dan 0,8% Difco
bacto agar. Mereka diinkubasi pada 25°C selama 1 hari
sebelum pengeboman (12jam penyinaran, 2600 lux).
Vektor transformasi dan penembakan partikel
Plasmid digunakan untuk partikel pemboman
(PNP GUS, Gambar 1) mengandung gen nptII, yang
memberikan resistensi kanamisin, dan Escherichia
coli gusA encoding gen reporter b-glucuronidase
(GUS). Struktur konstruk adalah sebagai berikut:
CaMV 35S Promotor: Pemimpin amv: gusA: NPA +
nopaline synthase (NOS) -promoter: nptII: NPA.
Plasmid DNA untuk penembakan partikel diisolasi
dari rekombinan E. coli
Setelah pemboman, eksplan daun diinkubasi pada 25
C selama 24 jam dalam gelap. Eksplan kemudian
dipindahkan ke medium basal MS yang mengandung
3% sukrosa, 0,8% agar dan ditambah dengan 1napthalene asam asetat (NAA; 2mg ml-1) dan 6
benzilamino purin (BAP; 0.5mg ml-1). Mereka
diinkubasi selama 48 jam (12-h penyinaran) tanpa
seleksi.seleksi dilakukan 72 jam setelah
penembakan.
Pewarnaan histokimia GUS
GUS aktivitas ditentukan dengan menggunakan alat
tes histokimia (Jefferson et al., 1987). Bahan tanaman
berada dibahan tanaman berada di cubated dalam
buffer yang mengandung X-gluc pada 37 C selama 18
tangan destained selama 24 jam dengan 96% etanol.
Ekspresi gusA Transient dinilai 24 jam setelah
penembakan dengan menggunakan mikroskop stereo.
Kegiatan GUS di tunas dianalisis dengan pewarnaan 2
Segmen daun 4mm dipotong dari tunas muda sebelum
rooting. Tidak ada aktivitas GUS ditemukan pada
tanaman kontrol atau eksplan (yaitu mereka tidak
dibombardir dengan transformasi plasmid pNPT-GUS).
Analisis Southern blot
Daun dikumpulkan dari tanaman yang telah tumbuh dalam
rumah kaca selama 3 bulan. Genomic DNA diekstraksi dengan
menggunakan Tanaman DNAzol Reagent (Gibco BRL Life
Technologies, UK) dengan modifikasi berikut untuk instruksi dari
pabriknya: bahan tanaman diinkubasi selama 30 menit, dengan
reagen DNAzol, dan langkah tambahan akhir dilakukan di mana DNA
diendapkan dengan etanol dan spooled
(A) transformasi Seluruh tanaman
dan sistem regenerasi untuk H.
muticus. (B) histokimia pewarnaan
dibombardir
eksplan
daun
menunjukkan aktivitas GUS transien
pada kecepatan pemboman yang
berbeda (tekanan helium setara
dalam psi). (C) Kalus yang muncul
dari dibombardir eksplan setelah 6
minggu pada medium induksi kalus.
(D) Tembak regenerasi dari kalus 2-3
bulan setelah subkultur pada media
regenerasi. (E) tunas regenerasi pada
media auksin. (F) pembentukan akar
oleh regenerasi tunas 1-3 bulan
setelah transfer ke media perakaran.
(G) histokimia pewarnaan daun yang
terluka dari tanaman transgenik
menunjukkan aktivitas GUS. (H)
histokimia pewarnaan untuk kegiatan
GUS tanaman regenerasi pada tahap
ketika
pot
ke
dalam
tanah
berlangsung (4-10 bulan setelah
pemboman).
Hasil & DIskusi