ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI DENITRIFIKASI SEBAGAI AGEN BIOREMEDIASI NITROGEN ANORGANIK
Isolasi dan karakterisasi bakteri denitrifikasi sebagai ..... (Khairul Syahputra)
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI DENITRIFIKASI SEBAGAI AGEN BIOREMEDIASI NITROGEN ANORGANIK * ) * * ) * * ) Khair ul Syahput r a , Im an Rusm ana , dan Ut ut Widyast ut i
- )
Loka Riset Pem uliaan dan Teknologi Budidaya Perikanan Air Tawar Jl. Raya 2 Sukam andi, Subang, Jawa Barat 52613
E- m ail: khairul_syahputra@yahoo.com
- )
Inst it ut Pert anian Bogor Jl. Raya Darm aga, Kam pus IPB Darm aga, Bogor 16680
(Naskah diterima: 11 Juni 2010; Disetujui publikasi: 25 Juli 2011)
ABST RAK
Den i t r i f i k asi m er u p ak an sal ah sat u p r oses u t am a yan g m en g u r an g i k an d u n g an sen yawa n i t r o g en an o r g an i k d i l i n g k u n g an . Pr o ses i n i d ap at d i g u n ak an u n t u k m engat asi k elebihan senyawa nit r ogen anor ganik yang t inggi di k olam budidaya perikanan. Penelit ian ini bert ujuan unt uk m engisolasi dan m engkarakt erisasi isolat bakteri denitrifikasi sebagai agen biorem ediasi senyawa nitrogen anorganik. Sebanyak 21 isolat bakteri pereduksi nitrat berhasil diisolasi dari m edium pengkayaan dengan k onsent rasi nit rat 100 µM dan 1500 µM. Sebanyak 6 isolat m erupak an k elom pok bakt eri denit rif ikasi (f erm ent at if negat if ) dan 15 isolat t erm asuk kelom pok bakt eri f erm ent at if . Berdasarkan hasil seleksi didapat kan isolat HNF5 dan LNF m em punyai kem am puan reduksi nitrat yang tinggi. Aktivitas reduksi nitrat terjadi dari awal inkubasi, di m ana akt ivit as paling cepat t erjadi pada fase eksponensial pert um buhan bakt eri.
- 1
Isolat HNF5 dan LNF m em iliki kecepatan m aksim um reduksi nitrat (Vm aks) 0,17 m M.h
- 1 dan 0,16 m M.h dengan nilai konstanta Michaelis- Menten (Km ) 0,40 m M dan 0,28 m M.
Ident if ikasi dengan sekuen 16S- rRNA m em perlihat kan bahwa isolat HNF5 dan LNF m em punyai kem iripan dengan Pseudomonas aeruginosa.
KATA KUNCI: denit r if ik asi, nit r ogen anor ganik , r eduk si nit r at ABST RACT : I so l a t i o n a n d ch a r a ct e r i z a t i o n o f d e n i t r i f i e r b a ct e r i a a s b i o r e m e d i a t i o n a g e n t o f i n o r g a n i c n i t r o g e n . By : Kh a i r u l Syah p u t r a, I m an Ru sm an a, an d Ut u t Wi d yast u t i Denitrification is one of the major processes of inorganic nitrogen removal in the environments. This processes can be used to remove high in-organic nitrogen compounds in aquaculture ponds. The research was aimed to isolate and characterize denitrifier bacteria isolates as bioremediation agents of in-organic nitrogen compounds. Twenty one isolates of nitrate reducing bacteria isolated from enrichment medium with 100 µM and 2000 µM nitrate, 6 isolates were denitrifier and 15 isolates were dissimilative nitrate ammonifier bacteria. HNF5 and LNF isolates had the higher nitrate reducing activity. The activity of nitrate reduction was started in the first hour of incubation and the highest nitrate reducing activity occured during the
- -1
exponential phase. The Vmax value of HNF5 and LNF isolates were 0.17 mM.h , 0.16
- -1
mM.h , respectively. While Km values were 0.40 mM, 0.28 mM, respectively. Based on
16S-rRNA sequence similarity, HNF5 and LNF isolates were closely related to Pseudom onas aer uginosa.
KEYWORD S: d en i t r i f i cat i on , i n - or g an i c n i t r og en , n i t r at r ed u ci n g
PENDAHULUAN
Senyawa nit rogen di perairan alam i dan kolam - kolam budidaya ditem ukan dalam dua bentuk yaitu nitrogen anorganik dan organik. Pad a k o l am b u d i d aya, sen yawa n i t r o g en anorganik m enjadi pent ing unt uk dipelajari karena merupakan bagian dari parameter mutu kualit as air. Senyawa- senyawa ini dihasilkan dari transformasi nitrogen secara biologis dan ab i ol og i s, secar a b i ol og i s d i h asi l k an d ar i ak t i vi t as m ak r ob i ol og i d an m i k r ob i ol og i . Senyawa nitrogen anorganik meliputi amonia, nitrit, dan nitrat bersifat toksik bagi organisme akuat ik bila dit em ukan dalam jum lah yang tinggi dalam perairan.
J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.2 Tahun 2011: 197-209
BAHAN DAN METODE
2 O) yang merupakan
gas pot ensial rum ah kaca. Produk yang di- hasilkan selam a proses denit rif ikasi t ersebut t ergant ung dari jenis bakt eri yang didukung d en g an k el en g k ap an en z i m sel am a ak t i - vitasnya (Burlage et al., 1998). Pada penelitian ini mencoba mendapatkan bakteri denitrifikasi d en g an ak t i v i t as r ed u k s i n i t r at y an g m enghasilkan gas nit rogen sebagai produk akhirnya bukan berupa nit rit oksida m aupun dinit rous oksida, bakt eri ini nant inya dapat d i g u n ak an seb ag ai ag en b i o r em ed i asi sen yawa n i t r og en an or g an i k yan g r am ah l i n g k u n g an p ad a k o l am - k o l am b u d i d aya p er i k anan. Penel i t i an i ni b er t uj uan unt uk m eng isolasi d an m eng k ar ak t er isasi isolat bakteri denitrifikasi sebagai agen bioremediasi senyawa nit rogen anorganik.
; 0,5 g MgSO
Dalam pengendalian senyawa- senyawa ini dapat m em anf aat kaan proses biologis dari bak t eri sepert i nit rif ik asi dan denit rif ik asi. Pengendalian dengan nit rif ik asi saj a t idak ef ek t i f u n t u k m en g h i l an g k an sen yaw a- senyawa t ersebut dari badan perairan karena akan m enghasilkan senyawa baru yang juga b er u p a p en cem ar . Ni t r i f i k asi m er u p ak an proses oksidasi senyawa am onia yang m eng- hasilk an senyawa nit rit dan nit rat , sepert i d i k et ah u i sen yawa t er seb u t j u g a b er u p a pencem ar yang akan t et ap berada di badan perairan (Ef f endi, 2003). Unt uk dapat m eng- hilangkan senyawa nit rogen anorganik dari badan air dapat memanfaatkan proses lainnya yait u d enit r if ik asi k ar ena p r oses ini ak an m elepask an senyawa- senyawa t ersebut k e udara bebas. Denit rifikasi m erupakan proses reduksi nit rat , m elalui senyawa int erm ediat nitrit dan nitrik oksida, menjadi nitrous oksida at au gas dinit rogen. Proses ini m elepaskan senyawa nit rogen pada lingkungan, di m ana nit r at dir eduk si m enj adi bent uk gas yang dilepas ke atmosfir (Zumft, 1997).
7. Medium padat kom posisinya sam a dengan m edium cair, hanya dit am bahkan Bact o agar
2 O; dengan salinit as 2% dan pH
.2H
2
; 0,1 g CaCl
4
2 PO
2 O; 0,2 g KH
.7H
4
4
Penelit ian dilakukan pada bulan Februari sam pai dengan Sept em ber 2007. Penelit ian ini dilakukan di Laborat orium Mikrobiologi Dep ar t em en Bi o l o g i FMIPA, Kam p u s IPB Baranangsiang Bogor. Sampel air dan sedimen diambil dari muara Sungai Cisadane Kabupaten Tangerang. Sam pel diam bil pada t iga lokasi dengan m enggunak an bot ol sam pel st er il untuk sampel air dan sedimen core steril untuk sam pel sedim en. Pada setiap lokasi dilakukan penguk uran beberapa param et er f isik dan kualitas air yang m eliputi: pH, suhu, salinitas, d an k an d u n g an o k si g en t er l ar u t d en g an m enggunakan Water Quality Checker yang d i l ak u k an s ec ar a in-situ, s ed an g k an kandungan senyawa am onia, nitrit, dan nitrat d i an al i si s d i Lab o r at o r i u m Mi k r o b i o l o g i Dep ar t em en Bi o l o g i FMIPA, Kam p u s IPB Baranangsiang Bogor.
2 HPO
Mesk i p u n d ap at m el ep ask an sen yawa nitrogen dari badan perairan ke udara, proses d en i t r i f i k asi j u g a d ap at b er ak i b at b u r u k t erhadap lingkungan karena dari prosesnya berpot ensi m enghasilk an gas nit rit ok sida (NO) dan nitrous oksida (N
4
2 SO
)
4
; 3,0 g yeast ekstrak; 0,5 g(NH
3
Bakteri denitrifikasi diisolasi dengan teknik p en g k ayaan p ad a k o n d i si an aer o b i k d an m enggunakan m edium cair dan padat . Media yang digunakan unt uk isolasi t erdiri at as dua macam yaitu media yang mengandung miskin nit rat (100 µM) dan m edia yang m engandung kaya nit rat (1500 µM) dengan kalium nit rat sebagai sumber nitrat. Media cair denitrifikasi dibuat dengan komposisi: 10 g natrium asetat; 5,0 g KNO
Isolasi dan Karakterisasi Morf ologi Bak teri Denitrif ik asi
Penentuan kadar amonia dilakukan dengan m et ode phenat e (Hut agalung et al., 1997). Kadar nitrit ditentukan dengan m etode sulfa- nilam ide (Cleseri et al., 1989). Met ode yang digunakan untuk analisis senyawa nitrat adalah m et ode brusin (Cleseri et al., 1989).
Analisis Kandungan Senyawa Amonia, Nitrit, dan Nitrat Media Inkubasi Bak t er i
; 0,9 g K
20 g per liter (Rodina, 1972). Sebanyak 40 m L medium tersebut dimasukkan ke dalam tabung r eak si yan g b er u k u r an 5 0 m L. Ko n d i si anaerobik dibuat dengan cara m em asukkan gas nit rogen bebas oksigen m elalui jarum (syringe) steril ke dalam tabung reaksi selam a 5- 10 menit.
Kinetika Reduksi Nitrat
C. Isolat yang t erbaik dipilih berdasarkan kem am puannya m ereduksi senyawa nit rat , jum lah nit rit yang terbentuk, dan jum lah gas yang dihasilkan.
Kem am puan isolat dalam pem bent ukan gas dapat diket ahui dengan uji pem bent ukan gas. Sat u lup inok ulan isolat d enit r if ik asi t erseleksi diinokulasikan pada t abung yang berisi m edium cair denit rif ikasi di m ana di dalam nya t erdapat t abung durham . Inkubasi dilak uk an pada suhu 28
o
C- 30
o
C selam a 1 m inggu. Pem bent ukan gas diam at i dengan m elihat ada t idaknya gelem bung gas pada tabung durham.
Unt uk pengujian kinet ika reduksi nit rat , inok ulan disiapk an dengan m enum buhk an isolat pada 40 mL medium cair denitrifikasi dan diinkubasi pada suhu 28
C- 30
o
C- 30
o
C selam a t iga hari. Kult ur bakt eri dibuat pelet dengan cara disentrifugasi pada 5.000 rpm selama 15 menit. Pelet dipisahk an dan diresuspensi dengan m edium denitrifikasi tanpa nitrat. Sebanyak 4 m L kult ur bakt eri diinokulasi ke dalam bot ol yang berisi 35 mL medium denitrifikasi dengan konsent rasi nit rat : 0, 100, 500, 1.000, 2.000 µM. Inkubasi dilakukan selam a 9 jam . Pada set iap int erval 3 jam dilakukan analisis kadar nitrat. Analisis kinetika reduksi nitrat dilakukan dengan m enggunak an persam aan k inet ik a Michaelis- Menten (White, 2000).
Identif ikasi dan Karakterisasi
Unt uk m engident ifikasi isolat bakt eri dari h asi l i sol asi p er l u d i l ak u k an ser an g k ai an pengujian f isiologi kim ia dan analisis sekuen gen 16S rRNA at au gen penyandi nar dan nap u n t u k b ak t er i p er ed u k si n i t r at . An al i si s sekuensing dilakukan dengan m enggunakan produk PCR dan dengan sekuen tersebut dapat dit ent uk an k ek erabat an dari isolat bak t eri denitrifikasi. Dalam analisis kekerabatan dapat d i g u n ak an p r o g r am EBI (Eu r o p ean Bioinf orm at ics Insit ut e) yang dapat diakses m elalui situs http:/ / www.ebi.ac.uk.
o
o
Sebanyak 5 mL sampel air dan 1 mL lumpur sedim en (cam puran sedim en dan air = 1:1) diinokulasikan dengan jarum sunt ik (sryinge) steril ke dalam medium cair anaerob, kemudian diinkubasi pada suhu 28
Seleksi Aktivitas Bakteri Denitrifikasi
o
C- 30
o
C selama 7- 10 har i. Bak t er i denit r if ik asi diisolasi dengan m et ode gores kuadran pada m edia agar dan k em udian diink ubasi dalam Anaerobic Jar (Ox oid, England). Isolat - isolat m urni yang diperoleh dit um buhkan pada m edium agar miring sebagai biakan stok.
Isolat murni hasil isolasi diamati morfologi koloninya yang m eliput i: bent uk, warna, dan t epiannya. Morf ologi sel diam at i di bawah m ikroskop dengan perbesaran 400x . Unt uk reaksi Gram dari tiap isolat ditentukan dengan teknik pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1993).
Un t u k m em ast i k an i so l at m er u p ak an bakt eri denit rif ikasi at au bakt eri f erm ent at if dilakukan uji fermentatif/ oksidatif. Isolat hasil i so l asi d i i n o k u l asi k an p ad a m ed i u m u j i fermentatif dengan sumber karbonnya adalah g l u k osa d an b i r u m et i l seb ag ai i n d i k at or k easam an p ad a t ab u n g r eak si . In k u b asi dilakukan selam a dua m inggu pada kondisi anaerob (Hugh & Leif son, 1953). Uji posit if dit unjukkan dengan berubahnya warna m e- dium dari biru menjadi bening.
Seleksi tahap awal dilakukan untuk melihat pola pertum buhan isolat bakteri denitrifikasi. Sebanyak 0,1 m L kult ur yang berum ur 3 hari d ar i m asi n g - m asi n g i so l at yan g t er p i l i h diinokulasikan pada botol sam pel 50 m L yang berisi 10 m L m edium denit rif ikasi. Inkubasi dilakukan selam a 7- 10 hari secara anaerob pada suhu 28
Sel ek si b er i k u t n ya yai t u m en g an al i si s kem am puan isolat bakt eri denit rif ikasi t er- sel ek si d al am m er ed u k si sen yawa n i t r at . Sebanyak 1 m L kultur isolat denitrifikasi yang b er u m u r 3 h ar i (f ase ek sp o n en si al ) d i - inokulasikan pada 40 mL medium denitrifikasi dengan konsent rasi nit rat ± 1,5 m M. Inkubasi d i l ak u k an sel am a 7 h ar i d en g an k o n d i si anaerob pada suhu 28
o
C- 30
o
C. Setiap 2 hari diukur nilai
Optical Density (OD) m asing- m asing isolat
dengan m enggunakan spekt rofot om et er UV- 120- 02 Shim adzu pada panjang gelom bang 5 4 0 n m . Pr o f i l n i l ai OD t er seb u t m em - perlihat kan pola pert um buhan isolat bakt eri d en i t r i f i k asi h asi l i so l asi d an d i g u n ak an sebagai dasar penent uan wakt u pengam at an pada uj i selek si k em am puan pem anf aat an senyawa nit rat .
Isolasi dan karakterisasi bakteri denitrifikasi sebagai ..... (Khairul Syahputra) Tahapan awal unt uk m enganalisis gen- gen yang t erlibat dalam proses reduksi nit rat adalah mengamplifikasi gen- gen tersebut dari sem u a i so l at t er sel ek si . Seb el u m m en g - amplifikasi gen maka terlebih dahulu dilakukan isolasi DNA genom t ot al, kem udian hasil PCR divisualisasi dengan elek t rof oresis sepert i yang t elah dipaparkan oleh Sam brook et al. (1989). Amplifikasi gen dilakukan dengan PCR m eng- gunakan prim er spesifik nar, nap, dan
16S- rRNA yaitu seperti tertera pada Tabel 1.
TAY TTY YTN HSN AAR ATH ATG TAY GG
16S-rRNA
J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.2 Tahun 2011: 197-209
7.7 Lo k asi ( Loca t ion ) Paramet er Pa r a m et er s Sa t uan U n it
n M 16 .9 7 .1
C 32 .6 3 2 .6 3 2.6 Amo n ia (Ammonia ) mg / L 1.1 9 0 .64 0 .0 9 Nitrit (Nitrite ) mg / L 0.1 4 0 .05 0 .0 4 Nitrat (Nitrate ) mg / L 0.1 5 0 .09 0 .0 9 N
0.5 Su h u (Temperature ) o
6.9 Oksig e n te rlarut (Dissolved ox y gen ) mg / L 6.2 0 0 .56 0 .4 0 Salin itas (Salinity ) % 3 .5 1 .0
7 .5 7 .3
III pH
I II
16S-rRNA CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC 13 8 7r
HASIL DAN BAHASAN Kondisi Kualitas Air Tempat Pengambilan Sampel
napA V6 7 r napA DAT NGG RTG CAT YTC NGC CAT RTT 63 f
TAY GTS GGC CAR GAR AA narG 2 6 59 r narG TTY TCR TAC CAB GTB GC napA V6 7 f napA
Pri mer Pr im er Ge n t a rg e t T a r g et g en e Sek uen ( 5 ’ ke 3 ’ ) Seq uen ce (5' t o 3 ') narG 1 9 60 f narG
Table 2. Water quality condition at the location of water and sediment samplings
* International Union for Bacteriology codes for bases:Y, C or T; R, A or G; M, A or C; K, G or T; S, G or C; W, A or T; H, A, C, or T; D, A, G, or T;
and N, A, C, G, or TTabel 2. Kondisi kualitar air pada lokasi pengambilan sampel air dan sedimen
Table 1. Primer sequence for PCR amplification
Tabel 1. Sekuen primer yang digunakan pada amplifikasi PCR
k ond isi p er air an b er sif at anaer ob ik m ak a terjadi proses reduksi senyawa kim ia di m ana hasil dari proses t ersebut m enghasilkan zat - zat beracun. Ef f endi (2003) m enam bahkan bahwa k adar ok sigen t erlarut k urang dari 4 m g / L m en i m b u l k an ef ek yan g k u r an g menguntungkan bagi hampir semua organisme akuatik.
sampling II dan III. Menurut Hem (1979), bila
Kondisi perairan m uara Cisadane dapat dikatakan bersifat anaerob karena kandungan ok si g en yang t er l ar ut nya sang at t er b at as y ai t u < 2 m g / L k h u su sn y a p ad a l o k asi
Kond isi k ualit as air d i p er air an m uar a Sungai Cisadane tem pat pengam bilan sam pel dapat dikat akan kurang baik bagi organism e ak uat ik . Ini t erlihat dari hasil penguk uran beberapa parameter kualitas air yang disajikan pada Tabel 2. Beberapa param et er kualit as yang mengindikasikan muara Sungai Cisadane t ercem ar adalah t ingginya kandungan nit rit dan amonia terlarut.
GGG CGG WGT GTA CAA GGC
2 O
Rendahnya k andungan ok sigen t erlarut sal ah sat u d i an t ar an ya d i seb ab k an ol eh ak t ivit as d ek om p osisi b ahan or g anik d an ok sidasi bahan or ganik yang m em anf aat - kan oksigen oleh m ikroba, di m ana proses oksidasi bahan organik m eningkat dengan m eningkat nya suhu (Boyd, 1990). Suhu pada lok asi pengam bilan sam pel relat if hangat , t i n g g i n ya su h u m u ar a Su n g ai Ci sad an e d ik ar enak an k ond isi p er air an yang r elat if dangkal.
Tabel 3. Isolat bakteri hasil isolasi
5 HNF1, HF1, HF2, HF3, & HF4
5 LF4, LF5, LF6, LF7, & LF8
7 HNF2, HNF3, HNF4, HNF5, HF5, HF6, dan HF7
21 T o t al ( T ot a l )
Sediment (1.5 mM) Nitrat rendah (Low nitrate ) (0.1 mM)
(1.5 mM) Nitrat rendah (Low nitrate ) (0.1 mM) Sedimen Nitrat tinggi (High nitrate )
Air Nitrat tinggi (High nitrate) Water
Table 3. Isolated bacteria Jenis samp el T ypes of sa m ple M ed ia p eng kayaan En r ich m en t m ed ium Jumlah iso lat Num b er s of isola t e Ko d e iso lat Isola t e n a m e
Karakteristik morfologi koloni isolat- isolat yang berhasil diisolasi pada um um nya ber- bent uk bundar cem bung dan bent uk t om bol dengan warna koloni m eliput i put ih, krem , kuning, dan m erah m uda. Morf ologi sel dari set iap isolat adalah sebagian sel berbent uk bulat dan sebagian lagi berbent uk bat ang, seluruh isolat yang didapat kan bersif at gram negat if (Tabel 4). Pada um um nya kelom pok b ak t er i d enit r if ik asi b er sif at gr am negat if berbent uk bulat at au bat ang (Buchanan & Gibbon, 1974).
Kandungan senyawa am onia dan nit rit di lokasi pengam bilan sam pel t ergolong t inggi. Kadar am onia pada perairan alam i biasanya kurang dari 0,1 mg/ L, kadar amonia yang tinggi m er u p ak an i n d i k asi ad an ya p en cem ar an b ah an o r g an i k yan g b er asal d ar i l i m b ah d o m est i k , i n d u st r i , d an l i m p asan p u p u k pert anian. Nit rit pada perairan alam i sekit ar 0,001 mg/ L dan sebaiknya tidak melebihi 0,06 mg/ L (Canadian Environmental Quality Guide-
pantotrophus, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas denitrificans, dan Pseudomonas aeruginosa m em iliki nit rat redukt ase t erikat membran (Nar) dan periplasmik (Nap).
m em iliki gen nar akan lebih dom inan, dan sebaliknya bila kondisi nit rat sedikit hanya bak t eri yang m em ilik i gen nap yang ak an mampu memanfaatkan nitrat sebagai penerima elekt ron t erakhir unt uk m endapat kan energi. Rusmana (2006) menyatakan bahwa beberapa b ak t er i d en i t r i f i k asi sep er t i Paracoccus
nap. Dalam kondisi nit rat t inggi bakt eri yang
Dalam perlakuan pem berian nit rat t inggi dan rendah diharapkan akan terisolasi bakteri pereduksi nit rat yang m em iliki gen nar dan
isolat bakteri pereduksi nitrat berhasil diisolasi dari t iga lokasi sampling (Tabel 3).
Alteromonas, Pseudomonas, Erythrobacter, Alcaligenes, dan Aquaspirillum. Sebanyak 21
Pen g g u n aan m ed i a p en g k ayaan yan g sel ek t i f d i h ar ap k an b ak t er i yan g t u m b u h m erupakan bakt eri denit rif ikasi karena pada media isolasi nitrat digunakan sebagai sumber nit rogen t unggal dan aset at sebagai sum ber k ar b o n n ya yan g h an ya m en u n j an g b ag i p er t u m b u h an b ak t er i d en i t r i f i k asi . Zu m f t (1992) m engatakan bahwa terdapat beberapa jenis kelompok bakteri denitrifikasi yang hidup pada perairan m uara dan laut ant ara lain:
Isolasi dan Karakterisasi Morf ologi Bakteri Pereduksi Nitrat
lines, 2002).
4 LNF, LF1, LF2, dan LF3 Isolasi dan karakterisasi bakteri denitrifikasi sebagai ..... (Khairul Syahputra) Tabel 4. Ciri morfologi sel dan koloni isolat hasil isolasi
Table 4. Morphological characteristics of cell and colony of isolates Be nt uk Sh a pe Wa rna Col our
Um bonate, Entire HF5 Circular,
Entire LF8 Circular, Convex ,
Entire LF2
Circular, Convex , Entire LF3
Circular, Convex , Entire LNF Circular, Convex ,
Entire LF1 Circular,
Um bonate, Entire HF6 Circular,
Um bonate, Entire HF7 Circular, Convex ,
Entire HF4 Circular,
Um bonate, Entire HF2
Circular, Convex , Entire LF5 Circular,
Circular, Um bonate, Entire HF3 Circular, Convex ,
Entire HNF5
Circular, Convex , Entire HF1
Circular, Convex , Entire Circular, Um bonate, Curled
HNF3 Ne gat if N egative Circular, Raised,
Undulate HNF4 Circular,
Um bonate, Entire M o rf o l o g i k o l o ni Col on y m or ph ol og y
HNF1 Circular, Convex , Entire
Ko d e i so l a t I sol a t e n a m e Be nt uk se l Sh a pe of cel l Uj i f e rme nt a t i f Fer m en t a t i ve t est HNF2
Um bonate, Entire LF7 Circular, Convex ,
Entire LF4
Bat an g Ne g at if Pu t ih ke ab u -ab u an Rod N egative Gray ish-white
Coccus Positive Flax en Bu lat Po sit if Kre m
Bu lat Ne g at if Kre m Coccus N egative Cream Bat an g Pu t ih ke me rah an
Rod Reddish white
Bat an g Ne g at if Me rah mu d a Rod N egative Pink
Bat an g Ne g at if Ku n in g ke h ijau an Rod N egative Sulfur
Bu lat Po sit if Kre m Coccus Positive Cream Bat an g Po sit if Kre m
Rod Positive Cream Bu lat Po sit if Kre m
Coccus Positive Cream Bu lat Po sit if Pu tih su su
Coccus Positive Milky white Bu lat Po sit if Ku n in g mu d a
Coccus Positive Cream Bat an g Po sit if Kre m
Rod Positive Cream LF6 Circular, Convex ,
Rod Positive Cream Bat an g Ne g at if Hijau mu d a
Rod N egative Flax en Bu lat Po sit if Kre m
Coccus Positive Cream Bat an g Po sit if Kre m
Rod Positive Cream Bu lat Po sit if Ku n in g mu d a
Coccus Positive Flax en Bat an g Po sit if Kre m
Rod Positive Cream Bat an g Po sit if Kre m
Rod Positive Cream Bu lat Po sit if Kre m
Coccus Positive Cream Bu lat Po sit if Ku n in g mu d a
Coccus Positive Flax en Bat an g Po sit if Kre m
J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.2 Tahun 2011: 197-209
Keseluruhan isolat yang didapat kan t idak sem u an ya m er u p ak an k el o m p o k b ak t er i d en i t r i f i k asi , ad a j u g a k el o m p o k b ak t er i f er m ent at if yang m elak uk an m et ab olism e respirasi secara anaerob meskipun media yang digunakan m erupakan m edia selekt if unt uk kelom pok bakt eri denit rif ikasi. Berdasarkan hasil uji fermentatif/ oksidatif diketahui bahwa dari 21 isolat yang diperoleh hanya 6 isolat (28,6%) yang m erupakan kelom pok bakt eri denit rif ikasi (f erm ent at if negat if ) sedangkan selebihnya sebanyak 15 isolat (71,4%) m eru- pakan kelompok bakteri fermentatif. Kelompok bakteri fermentatif diketahui dari kemampuan i so l at t er seb u t m em p r o d u k si asam p ad a media yang mengandung glukosa pada kondisi anaerob diindik asik an dengan berubahnya war na b ir u m et hilen p ad a m ed ia m enj ad i kuning. Jenis bakteri Edwarsiella, Citrobacter,
Salmonella, dan Sigella merupakan kelompok
bak t eri f erm ent at if yang bersif at f ak ult at if anaerobik (Buchanan & Gibbon, 1974).
Bak t eri denit rif ik asi m erupak an bak t eri yang m em anf aat kan senyawa nit rat sebagai penerim a elekt ron t erakhir, senyawa nit rat direduksi m enjadi nit rit dan selanjut nya akan m em bent uk gas nit rogen. Selain it u, t erdapat beberapa jenis bakt eri yang m em anf aat kan senyawa nit rat dan m em bent uk am onia yang tergolong pada kelompok bakteri reduksi nitrat m enj adi am onium dissim ilat if . Rusm ana & Ned w el l (2 0 0 4 ) m en yat ak an b ah w a t i p e m et ab ol i sm e r esp i r asi d an r ed u k si n i t r at m enjadi am onium dissim ilatif (DNRA) dilaku- k an o l eh k el o m p o k b ak t er i d en g an t i p e metabolisme fermentatif.
Seb ag i an b esar b ak t er i yan g b er h asi l d i i so l asi m er u p ak an k el o m p o k b ak t er i p er ed u k s i n i t r at m en j ad i am o n i u m . Dominannya bakteri kelompok ini dipengaruhi oleh kondisi perairan m uara Sungai Cisadane yang k aya ak an b ahan or g ani k . Rusm ana (2 0 0 3 c) m en yat ak an b ah w a k em am p u an k om p et isi b ak t er i d alam m er ed uk si nit r at bergant ung pada kondisi lingkungan, pada konsentrasi bahan organik yang tinggi bakteri p er ed u k si n i t r at m en j ad i am o n i u m l eb i h kompetitif daripada bakteri denitrifikasi.
Seleksi Isolat Bakteri Pereduksi Nit r at
Pada t ahap awal seleksi dilakukan unt uk m en car i i so l at b ak t er i d en i t r i f i k asi yan g m ereduk si nit rat t inggi, m em bent uk nit rit sedikit dan menghasilkan gas yang tinggi. Pada proses pengendalian pencem aran diharapkan proses reduksi nit rat m em bent uk nit rit dan am o n i a yan g sed i k i t ser t a m en g h asi l k an produk sam ping bukan berupa N
2 O, karena
produksi N
2 O ini berdam pak t erhadap pem a-
nasan global. N
2 O m erupakan salah sat u gas rumah kaca yang potensial (Rusmana, 2003a).
Begit u juga halnya dengan nit rit dan am onia, dalam konsent rasi yang t inggi akan bersif at toksik bagi organisme akuatik (Effendi, 2003).
Berdasarkan hasil uji reduksi nit rat awal m enunjukkan kem am puan yang berbeda dari set iap isolat dalam m ereduksi senyawa nit rat dengan kemampuan membentuk nitrit, amonia, dan gas yang berbeda pula. HNF5, HF7, LNF, LF1, dan LF6 m erupakan isolat - isolat yang m ereduk si nit rat yang t inggi dengan per- sentase 87,3%; 88,7%; 82,4%; 85,1%; dan 95,7%. Pada isolat HNF3 dan HNF4 t idak t erdet eksi adanya senyawa nitrit yang terbentuk dengan persentase 0 selam a uji, beberapa isolat yang m en g h asi l k an n i t r i t d en g an k o n sen t r asi rendah ant ara lain HNF5, HF3, LNF, dan LF6 seb esar 0 ,2 %; 3 ,6 %; 0 ,4 %; d an 0 ,5 % d ar i senyawa nit rat yang direduksi. Am onia yang t i n g g i d i h asi l k an o l eh k el o m p o k b ak t er i f erm ent at if at au kelom pok bakt eri reduksi nitrat m enjadi am onium dissim ilatif, sedang- kan pada bakt eri denit rif ikasi am onia yang dihasilkan sangat rendah. Isolat HNF1, HNF3, dan HNF4 m erupakan isolat- isolat yang tidak menghasilkan amonia sewaktu uji, ketiga isolat ini m erupakan kelom pok bakteri denitrifikasi. Kem am puan dalam m enghasilkan gas juga berbeda untuk tiap isolat yang diujikan. Isolat yang menghasilkan gas yang tinggi umumnya m er upak an k elom pok bak t er i denit r if ik asi dengan persent ase 48,1%- 100%. Isolat HNF3 dan HNF4 m erupakan bakt eri yang m am pu m enghasilkan gas paling t inggi hingga 100%, isolat HNF5 dan LNF mampu menghasillkan gas sebesar 87,9% dan 86,4% dari senyawa nit rat yang direduksi (Tabel 5).
Sistem metabolisme reduksi nitrat dari tiap isolat sangat beragam, kondisi ini terlihat dari kem am puan bakt eri m ereduksi nit rat t idak b er h u b u n g an d en g an k em am p u an i so l at dalam m enghasilkan gas. Widiyant o (2006) m en yat ak an b ah wa k em am p u an m asi n g - m asing isolat bakt eri denit rif ikasi t erseleksi m em punyai spesif ikasi yang berbeda dalam m ereduksi senyawa nit rat dan m em produksi gas nit rogen. Isolat HNF5 dan LNF m am pu mereduksi nitrat yang tinggi (87,3% dan 82,4%) dan juga m enghasilkan gas t inggi (87,9% dan
Isolasi dan karakterisasi bakteri denitrifikasi sebagai ..... (Khairul Syahputra)
86,4%). Isolat LF6 yang dapat mereduksi nitrat paling t inggi (9 5 ,7 %) hanya m enghasilk an produk gas yang sedikit (6,9%). Rendahnya produksi gas dari isolat LF6 disebabkan karena bakteri ini bersifat ferm entatif atau tergolong k el om p ok r ed u k si n i t r at m en j ad i am on i a dissim ilat if dengan kecenderungan produk akhir berupa am onia. Pada isolat HNF3 dan HNF4 yang m enghasilk an gas yang t inggi (100%), hanya m am pu m ereduksi nitrat relatif sed i k i t (9 , 5 % d an 1 0 , 8 %). Kar ak t er i sasi organism e sebagai bakteri denitrifikasi dapat ditentukan dari kemampuannya menghasilkan N
67.40
85.12
0.13
11.22
0.91
78.01
0.13
10.77 LF2
1.53
1.03
0.35
1.38
34.30
0.50
48.61
0.18
17.09 LF3
1.94
0.54
27.88
0.32
58.73
1.17
86.35 LF1
29.62
34.15
0.28
47.24
0.39
64.62
0.00
0.00 HF7
1.53
1.36
88.72
0.46
0.80
1.19
58.75
0.10
7.10 LNF
1.68
1.38
82.41
0.01
0.42
0.18
13.23
0.16
0.06
0.60
54.23 LF8
6.90 LF7
1.94
0.82
42.35
0.28
34.63
0.09
11.14
0.44
1.94
92.56
1.07
55.50
0.19
18.06
0.91
85.04
0.00
0.00 Est imasi g as t erb ent uk Est im a t ion of pr od uced g a s Nit rat t ered uksi Reduced n it r a t e
Nit rit
t erb ent uk
Pr oduced
n it r it e
Iso lat Isola t e Nit rat aw al In it ia l n it r a t e Amo nia t erb ent uk Pr od uced a m m on ia J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.2 Tahun 2011: 197-209
0.11
1.49
11.65 LF4
0.82
1.40
0.36
25.53
0.19
52.01
0.09
25.63
0.08
22.36 LF5
1.94
42.35
0.54
0.24
29.53
0.09
11.14
0.49
59.33 LF6
1.68
1.60
95.69
0.01
35.84
1.68
2
0.00
23.25
0.25
28.69
0.42
48.06 HNF3
1.94
0.18
9.47
0.00
0.00
45.24
0.00 0.18 100.00 HNF4
1.94
0.21
10.78
0.00
0.00
0.00
0.00 0.21 100.00 HNF5
1.53
1.34
0.20
0.88
0.00
C-31 o
dari reduk si nit rat at au nit rit (Rusmana, 2006). Adanya keragam an dari t iap isolat dalam mereduksi nitrat, membentuk nitrit dan amonia, sert a m enghasilk an gas berhubungan erat pada sist em m et abolism e dengan akt ivit as enzim yang berperan dari isolat- isolat tersebut. Ad a b eb er ap a enz im yang b er p er an p ad a proses m et abolism e bakt eri denit rif ikasi dan reduksi nit rat m enjadi am onium dissim ilat if antara lain: reduksi nitrat m enjadi nitrit (Nap/ Nar); reduksi nit rit m enjadi nitric oxide (Nir); reduksi nitric oxide menjadi nitrous oxide (Nor); reduksi nitrous oxide menjadi gas N
2
(Nos) dan reduksi nitrit menjadi amonium dissimilatif (Nrf) (Zumft, 1997; Richardson, 2000).
Isolat HNF5 dan LNF merupakan dua isolat t erseleksi yang digunakan unt uk uji reduksi nitrat. Selain kemampuan reduksi nitrat, pem- bentukan nitrit, amonia, dan menghasilkan gas, isolat - isolat yang t erseleksi dipilih berdasar-
Tabel 5. Reduksi nit rat oleh isolat bakt eri pereduksi nit rat pada uji reduksi nit rat t ahap awal dengan inkubasi selama 3 hari pada suhu ruang 29
o
C- 31
o
C
Table 5. Nitrate reduction by nitrate reducing bacteria in the early stages of nitrate reduction
test during 3 days incubation at room temperature of 29 oC
1.94
mM % mM % mM % mM % HNF1
1.94
0.64
33.14
0.28
44.24
0.00
0.00
0.36
55.76 HNF2
87.32
0.16
0.00 HF6
0.09
0.09
85.44
0.01
10.93 HF4
1.40
0.24
17.51
0.24
99.04
37.38
0.00
0.00
0.00 HF5
1.94
0.64
33.14
0.32
49.41
0.43
67.64
0.00
3.63
5.52
0.16
0.00
11.94
1.18
87.90 HF1
1.53
0.46
29.88
0.28
61.94
0.18
39.87
0.00 HF2
0.11
1.53
0.30
19.59
0.21
71.42
0.09
30.41
0.00
0.00 HF3
1.94
2 O at au N
kan karakt erist ik dan sif at isolat . Isolat HNF5 m erupakan isolat yang diisolasi dari m edium kaya nit rat dan isolat LNF diisolasi dari m edia miskin nitrat, kedua isolat merupakan kelompok bakteri denitrifikasi (non fermentatif).
O D (
0.2 HNF5 LNF 2 4 4 8 7 2 9 6 1 2 0 1 4 4
0.4
0.6
0.0
0.8
6 n m )
Jam ke- (Hour)
Uji Aktivitas Reduksi Nitrat
Figure 1. Morphology of HNF5 and LNF isolates on denitrification medium
Gambar 1. Morfologi isolat terseleksi HNF5 dan LNF pada media denitrifikasi
Figure 2. Growth pattern of HNF5 and LNF isolates
Gambar 2. Pola pertumbuhan isolat bakteri HNF5 dan LNF
Hubungan antara kecepatan reduksi nitrat dengan t ingk at pert um buhan jelas t erlihat pada isolat (Gam bar 3). Nit rat yang t ereduksi b er hub ungan lur us t er had ap p eningk at an jumlah sel. Penurunan konsentrasi nitrat yang signifikan terjadi pada saat pertumbuhan isolat berada pada f ase eksponensial. Pada f ase ini pertumbuhan sel sangat cepat sekali sehingga m em but uhkan energi yang banyak, sum ber ener gi yang didapat ber asal dar i senyawa n i t r at yan g d i b er i k an seb ag ai p en er i m a elektron terakhir.
Isol at HNF5 d an LNF m em p unyai p ol a pert um buhan relat if sam a, kedua isolat ini memerlukan waktu 6- 12 jam untuk mencapai aw al f ase ek sp o n en si al sed an g k an f ase st asi o n er d i cap ai p ad a 7 2 j am i n k u b asi . Kepadat an sel t ert inggi isolat HNF5 dan LNF juga relat if sam a dengan kerapat an opt ik 0,5 (Gam bar 2). Pert um buhan adalah perubahan populasi sel atau pertambahan jumlah dan atau massa sel melebihi yang ada di dalam inokulum asalnya (Pelczar & Chan, 2006).
Isolasi dan karakterisasi bakteri denitrifikasi sebagai ..... (Khairul Syahputra) Hasil uji reduksi nit rat pada pengam at an int erval wakt u 12 jam m enunjukkan bahwa akt ivit as reduksi nit rat m ulai t erjadi di bawah wakt u 12 jam , karena konsent rasi nit rat yang d i b er i k an t el ah m u l ai h ab i s. Pen u r u n an senyawa nitrat paling cepat terjadi pada waktu inkubasi 12 jam dengan persent ase hingga 87%. Pada saat k onsent rasi nit rat m enipis pert um buhan bakt eri m ulai m em asuki f ase st asioner, ini m enunjukkan bahwa senyawa n i t r at yan g d i b er i k an m er u p ak an su m b er energi tunggal bagi aktivitas metabolisme dari isolat yang diuji.
Selam a uji akt ivit as senyawa nit rit yang dihasilkan oleh isolat HNF5 dan LNF relat if kecil. Nit rit yang dihasilkan selam a inkubasi relat if kecil di bawah 300 µM dari nit rat yang direduksi (Gam bar 4). Rendahnya konsentrasi nit r it yang t er uk ur selam a ink ubasi dik a- r en ak an sen yaw a n i t r i t t er seb u t d i u b ah m enj ad i b ent uk g as at au am oni a d eng an akt ivit as enzim yang berbeda. Ini m engindi- kasikan bahwa bakt eri m em iliki kelengkapan enz im d engan k em am p uan ak t ivit as yang seimbang sehingga nitrat yang direduksi dapat langsung direduksi menjadi gas ataupun dalam b ent uk am onia. Enz im yang b er t anggung jawab m ereduksi nit rit m enjadi gas adalah enzim Nir yang dimiliki oleh kelompok bakteri denitrifikasi, sedangkan reduksi nitrit menjadi am onia dilakukan oleh enzim Nrf yang um um dijumpai pada kelompok bakteri reduksi nitrat m en j ad i am on i u m d i ssi m i l at i f (Ru sm an a, 2003b). Gambar 3. Hubungan antara pertumbuhan dan aktivitas reduksi nitrat dari isolat HNF5 dan LNF.
Jam ke- (Hour)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2 K o n se n tr a si
Concentration ( m M )
2.0
0.2 N it ra t (Nitrate ) (m M )
1.5
1.0
0.5 HNF5 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 Nitrat tereduksi Nitrit terbentuk Amonia terbentuk
K o n se n tr a si
Concentration ( m M )
Jam ke- (Hour)
2.0
1.5
1.0
0.5 LNF 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 Nitrat tereduksi Nitrit terbentuk Amonia terbentuk
1.8 HNF5 OD 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 Nitrat
0.4
Bar merupakan standar eror
0.2 N it ra t (Nitrate ) (m M )
Figure 3. Relationship between growth and nitrate reduction activity of HNF5 and LNF iso-
lates. Bars are the standard errorGambar 4. Profil senyawa nitrat direduksi, nitrit dan am onia yang dihasilkan dalam uji aktivitas reduksi nit rat dengan int erval pengam at an 12 jam oleh isolat HNF5 dan LNF. Bar merupakan standar eror
Figure 4. Profile of reduced nitrate, produced nitrite and produced ammonia on the nitrate
reduction activity test with 12-hour observation intervals of HNF5 and LNF isolates.Bars are the standard error O D (
6 n m )
Jam ke- (Hour)
0.8
0.6
0.4
1.8 LNF OD 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 Nitrat
0.6
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2 O D ( 6 n m )
Jam ke- (Hour)
0.8
J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.2 Tahun 2011: 197-209
Senyawa am onia yang dihasilkan selam a uj i r elat if r end ah. Rend ahnya k onsent r asi am onia yang t erukur pada uji karena isolat bakt eri HNF5 dan LNF m erupakan kelom pok bakt eri denit rifikasi yang t idak m enghasilkan amonia dari aktivitas reduksi nitrat.
0.20 Konsentrasi nitrat Nitrate concentration (m M)
0.05
0.10
0.15
Kinetika Reduksi Nitrat
0.20 Konsentrasi nitrat
Reduction rate (mM/hour)
K e ce p a ta n r e d u k si ( m M / ja m )
1
e ce p a ta n r e d u k si ( m M / ja m )
Reduction rate (mM/hour)
LNF
0.5
0.15
0.10
0.05
pada DNA genom isolat HNF5 dan LNF belum d ap at t er am p lif ik asi. Pad a hasil runing d i gel elekt rof oresis (Gam bar 6) t erlihat bahwa kedua isolat t idak m enunjukkan adanya hasil amplifikasi untuk gen nap dan nar, namun pada k on t r ol p osi t i f t er j ad i am p l i f i k asi . Bel u m berhasilnya gen nap dan nar t eram plif ikasi diduga karena prim er yang digunakan dalam penelit ian ini belum sesuai dengan keem pat isolat bakt eri t ersebut .
Reaction (PCR) untuk gen spesifik nap dan nar
Hasil analisis dengan Polymerase Chain
Karak terisasi Molek ular Isolat Bakteri Terseleksi
Nilai konstanta Michaelis- Menten (Km) dari kedua isolat menunjukkan afinitas enzim yang berbeda dari t iap isolat . Nilai Km yang paling rendah dim ilik i oleh isolat LNF sedangk an isolat HNF5 m em punyai nilai Km yang paling besar dari keem pat isolat (Tabel 6). Nilai Km m erupakan t et apan kecepat an reaksi pem - bentukkan komplek enzim substrat (Poedjiadi, 1994). Bila harga Km rendah berarti kecepatan reaksi pembentukan kompleks enzim substrat at au af init as enzim t erhadap subst rat sangat bagus.
Hasil uji kinet ika reduksi nit rat dari kedua isolat m enunjukkan kecepat an reduksi nit rat yang berbeda dari tiap isolat pada konsentrasi yang berbeda. Pada konsent rasi nit rat yang rendah isolat LNF m em iliki kecepatan reduksi n i t r at yan g l eb i h t i n g g i (0 ,0 4 4 m M/ j am ) dibandingkan dengan yang isolat HNF5. Kece- pat an reduksi yang t inggi ini m enunjukkan kemampuan kompetisinya pada sumber nitrat yang rendah, kem am puan kom pet isi isolat LNF didukung dengan kecepat an m aksim um (Vm aks) enzim dalam m ereduksi nit rat yang tinggi (0,16 m M/ jam ). Pada konsentrasi nitrat yang tinggi, isolat HNF5 m em punyai kem am - puan kompetisi yang lebih baik karena memiliki kecepat an reduksi nit rat yang t inggi (0,15 m M/ jam ) dan kecepat an m aksim um (Vm aks) enzim dalam mereduksi nitrat yang juga tinggi (0,17 mM/ jam) (Gambar 5 dan Tabel 6).
0.1
2 K
0.28 Km ( mM ) Iso lat Isola t e
0.16
0.40 LNF
0.17
HNF5
Table 6. Kinetics of nitrate reduction of HNF5 and LNF isolates
Vmaks ( mM / jam) Vm a x. (m M/ h our )Tabel 6. Kinetika reduksi nitrat isolat HNF5 dan LNF
Figure 5. Nitrate reduction rate of HNF5 and LNF isolates. Bars are the standard error
0.1
0.5
1